Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Совершенствование методов диагностики, профилактики и лечения при ассоциированном анаплазмозе крупного рогатого скота

На правах рукописи

Козлова Наталья Петровна

Совершенствование методов диагностики, профилактики и лечения при ассоциированном анаплазмозе крупного рогатого скота

16.00.03. — ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

ОМСК-2007

003059694

Работа выполнена в институте ветеринарной медицины ФГОУ ВПО «Омский государственный аграрный университет», ФГУ Омский НИИ природно-очаговых инфекций Роспотребнадзора

Научные руководители:

доктор ветеринарных наук профессор Красиков Александр Пантелеевич

доктор медицинских наук профессор Рудаков Николай Викторович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук профессор

Сидоров Геннадий Николаевич

доктор ветеринарных наук профессор Бажин Михаил Аристоклевич

Ведущее учреждение: ГНУ Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и

Дальнего Востока СО РАСХН

Защита состоится СХ2/^>2? 2007 г в /Р часов на заседании диссертационного совета Д 220 050 03 при ФГОУ ВПО «Омский государственный аграрный университет» в институте ветеринарной медицины ФГОУ ВПО ОмГАУ по адресу 644122, г Омск-122, ул Октябрьская, 92, тел 24-15-35, тел/факс 23-30-31

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке института ветеринарной медицины ФГОУ ВПО ОмГАУ

Автореферат разослан /^¿гУ.Х-2007 г

Ученый секретарь диссертационного сс

кандидат ветеринарных наук, доцент

Жабин

1. Общая характеристика работы Актуальность темы Анаплазмоз крупного рогатого скота - трансмиссивная, природно-очаговая болезнь, протекающая с явлениями глубокой анемии аутоиммунной природы и истощения, вызываемая возбудителями из рода Апаркзша Болезнь распространена во всех частях света и наносит животноводству значительный ущерб в результате резкого снижения продуктивности и гибели крупного рогатого скота (Н А Казаков, 2003)

На территории Южного Урала и Западной Сибири анаплазмоз крупного рогатого скота ранее официально не регистрировался Вместе с тем, в последние годы в ряде хозяйств Омской области периодически отмечались вспышки болезни крупного рогатого скота с клиническими признаками анаплазмоза (В А Стрельчик и др, 2000)

У людей часто регистрируется гранулоцитарный эрлихиоз - это трансмиссивная, остро протекающая лихорадочная болезнь Передающаяся при присасывании клещей и часто приводящая к летальному исходу (Н В Рудаков, 2001)

Весной 2001 г в зоне Южного Урала (Челябинская область) был проведен сбор клещей — 39 особей, в двух из которых были обнаружены не идентифицированные до вида эрлихии (С Н Шпынов и др , 2002, 2004)

По данным отечественной и зарубежной литературы, возбудители анаплазмоза имеют близкое родство с эрлихиями, они относятся к одному и тому же семейству Апар1азта1асеае Не доказано генетическое родство и отличие между ними, не установлено таксономическое положение, которое должны занимать каждый из них Анаплазмоз зачастую протекает в ассоциации с другими инфекционными болезнями (Н А Казаков, 2003)

В связи с выше изложенным весьма актуальным является выяснить распространение анаплазмоза крупного рогатого скота в Южно-Уральском и ЗападноСибирском регионах, роль клещей в передаче инфекции, провести усовершенствование диагностики, профилактики и лечения данной болезни

Цель исследований изучить распространение анаплазмоза крупного рогатого скота и основных переносчиков инфекции в Южно-Уральском и ЗападноСибирском регионах, усовершенствовать диагностику и лечение при данной болезни

Для реализации поставленной цели были определены следующие задачи

• выяснить распространение анаплазмоза крупного рогатого скота в различных нозоареалах Южно-Уральского и Западно-Сибирского регионов и его ассоциаций с другими инфекциями,

• изготовить анаплазмозные антиген и антисыворотку для люми-нисцентной микроскопии,

• приготовить анаплазмозный эритроцитарный диагностикум,

• изучить активность и специфичность полученных антигенов и диагностической сыворотки в РНИФ и РНГА,

• изыскать средства и разработать способы терапии и профилактики при анаплазмозе крупного рогатого скота, в т ч ассоциированном с другими инфекционными болезнями

Научная новизна работы В условиях Западно-Сибирского и ЮжноУральского регионов с помощью разработанных лабораторных методов диагностики установлено широкое распространение анаплазмоза в 90-100% обследованных хозяйств, при высокой инфицированное™ животных Изучены формы проявления анаплазмоза в виде моноинфекции и в ассоциации с другими болезнями Изготовлены антигены и антисыворотки для реакции непрямой иммунофлуоресценции С помощью, которых можно выявлять возбудителей анаплазмоза в клещах переносчиках на различных стадиях их развития, а также антитела в сыворотке крови больных животных и анаплазмоносителей Разработан культуральный метод диагностики анаплазмоза с использованием клеток Vero Получен анаплазмозный эритроцитарный диагностикум для РИГА Разработаны, испытаны в экспериментальных и производственных условиях и предложены ветеринарной практике эффективные схемы лечения больных анаплазмозом животных, в тч ассоциированном и лабораторные методы контроля их эффективности

Теоретическая и практическая значимость работы. Материалы диссертации вносят вклад в изучение переносчиков (клещей) возбудителя анаплазмоза на различных стадиях развития, в совершенствование лабораторной диагностики, профилактики и мер борьбы с данной инфекцией с учетом ассоциаций других микроорганизмов участвующих в инфекционном процессе Разработаны методики получения анаплазмозного антигена и антисыворотки для РНИФ и эритроцитарного диагностикума для РИГА, которые позволят апробировать и внедрить данные экспресс-методы диагностики анаплазмоза крупного рогатого скота в условиях промышленного животноводства Южно-Уральского и Западно-Сибирского регионов На основании проведенных исследований разработаны методические рекомендации «Усовершенствование методов диагностики анаплазмоза крупного рогатого скота» и «Схемы лечения и профилактики при анаплазмозе крупного рогатого скота» Применение усовершенствованных методов диагностики позволит проводить лабораторную диагностику данной болезни в различные периоды ее развития Применение разработанных схем лечения при анаплазмозе крупного рогатого скота создаст условия для более эффективного проведения мероприятий по борьбе с данной болезнью

Апробация работы. Материалы исследований доложены и обсуждены на научных конференциях профессорско-преподавательского состава и аспирантов ИВМ ФГОУ ВПО ОмГАУ 2003-2005гг (Омск) «Роль ветеринарного образования в подготовке специалистов агропромышленного комплекса» (Омск, 2003), «Результаты научных исследований в ветеринарии и зоотехнии в агропромышленном комплексе» (Омск, 2004), «Проблемы ветеринарного образования и научных исследований в агропромышленном комплексе» (Омск, 2005), на Межрегиональных научно-практических конференциях «Эпизоотология, патология и ветеринарно-санитарные мероприятия при инфекционных болезнях животных» (Омск, 2004, СО РАСХН - ВНИИБТЖ), «Актуальные проблемы ветеринарной медицины» (Омск, 2005, СО РАСХН - ВНИИБТЖ), на Международной конференции «Профилактика, диагностика и лечение инфекционных болезней, общих для людей и животных (Ульяновск, 2006),

на Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарии в современных условиях» (Краснодар, 2006)

Внедрение результатов исследований. Результаты исследований вошли в методические рекомендации «Схемы лечения и профилактики при анаплазмозе крупного рогатого скота», рассмотренные и одобренные на заседаниях ученого совета ИВМ ФГОУ ВПО ОмГАУ от 25 05 2005 г, протокол №8 и Центра научного обеспечения АПК Омской области при Министерстве сельского хозяйства и продовольствия Омской области от 26 05 2005 г, протокол №4 и «Усовершенствование методов диагностики анаплазмоза крупного рогатого скота», рассмотренные и одобренные на заседаниях ученого совета ИВМ ФГОУ ВПО ОмГАУ от 28 06 2006 г, протокол №7 и Центра научного обеспечения АПК Омской области при министерстве сельского хозяйства и продовольствия Омской области от 12 09 2006 г, протокол №5 Материалы диссертации используются в учебном процессе на кафедрах эпизоотологии и инфекционных болезней животных и микробиологии, вирусологии и иммунологии Института ветеринарной медицины ФГОУ ВПО ОмГАУ и Института повышения квалификации руководителей и специалистов АПК ОмГАУ, на кафедре микробиологии, вирусологии и иммунологии ОмГМА, а также в курсе лекций Тюменского института переподготовки кадров агробизнеса

Основные положения, выносимые на защиту:

1 Распространение анаплазмоза крупного рогатого скота в Южно - Уральском и Западно — Сибирском регионах и ассоциативные формы его проявления

2 Приготовление опытных серий анаплазмозных антигена и сыворотки для РНИФ и эритроцитарного диагностикума для РИГА

3 Изучение в производственных условиях диагностической ценности РНИФ и РИГА

4 Разработка и испытание в производственных условиях различных схем профилактики анаплазмоносительства и лечения больных животных

Публикации По теме диссертации опубликовано 3 статьи

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 122 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических предложений, списка литературы Работа иллюстрирована 14 таблицами, 7 рисунками Список литературы включает 169 источников, из них 70 зарубежных авторов

2. Собственные исследования 2 1. Материалы и методы

Тема диссертационной работы является самостоятельным разделом комплексной государственной программы «Профилактика (диагностика) и меры борьбы с ассоциативными инфекционными и инвазионными болезнями животных и птиц» и имеет № государственной регистрации 01 2 001100602

Работа проводилась в период с 2002 по 2006 годы в лаборатории микст инфекций кафедры эпизоотологии и инфекционных болезней животных ИВМ ФГОУ ВПО ОмГАУ Часть исследований была выполнена в лаборатории зоонозных инфекций ФГУ Омского НИИ природно-очаговых инфекций Роспотребнадзора

Объектом исследований являлся крупный рогатый скот различных возрастов, принадлежавший хозяйствам Омской, Челябинской области и Республики Башкортостан

Прижизненно от животных исследовали кровь и ее сыворотку, секрет молочной железы, цервиковагинальную и бронхоальвеолярную слизь Кровь для серологических исследований брали из яремной, а для гематологических - из краевой ушной вены

При эпизоотологическом обследовании хозяйств на анаплазмоз крупного рогатого скота учитывали клинические признаки болезни

Изучение морфологических и тинкториальных свойств выделенных микроорганизмов осуществляли при окраске мазков - препаратов по Романовскому-Гимзе Микроскопирование проводили при помощи светового микроскопа МБИ-15 с иммерсионным объективом при увеличении (15x100) Интенсивность пара-зитемии определяли количеством анаплазм в 100 полях зрения (п /з ) микроскопа, в%

Видоспецифические сыворотки к полевому штамму анаплазм получали путем гипериммунизации кроликов по схеме D Schimmel в модификации А П Красикова и Н Н Новиковой (2002) Для постановки РНИФ использовали ослиный антикроличий глобулин, меченный ФИТЦ (флуоресцн изотиоционат натрия)

Для культуральных исследований применяли культуру клеток Vero Для накопления антигенной биомассы, проводили до 8 пассажей анаплазм Культуру клеток с анаплазмами после каждого пассажа просматривали при помощи световой и люминесцентной микроскопии

Больных и анаплазмоносителей (по результатам микроскопии) дополнительно исследовали на ассоциативные формы течения анаплазмоза Для этого применяли стандартные и дополнительные, разработанные в лаборатории микст инфекций кафедры эпизоотологии и инфекционных болезней методы серологической диагностики - прямой и непрямой иммунофлуоресценции (РПИФ и РНИФ) для прижизненного выявления антигенов и антител (А П Красиков, В Э Малошевич, 2005) Фиксацию мазков проводили по методу Моди с соавт (1958), а постановку РНИФ по методике, предложенной Уэллером и Кунсом (1945) В качестве антигенов применяли антигены вакцинных штаммов и стандартные антигены, используемые для постановки РА и РСК, а в качестве антител - гомологичные антигенам кроличьи и бычьи антисыворотки, антивидовые для РНИФ и специфические сальмонеллезные, риккетсиозные, листериозные для РПИФ люминесцентные сыворотки меченные ФИТЦ

Мазки просматривали под люминесцентным микроскопом ЛЮМ Р-8 при увеличении в 900 раз Степень флуоресценции антител оценивали по 4-х крестной системе (Вайтекер и др , 1958) При этом кроличьи сыворотки против возбудителей хламидиоза, диплококкоза, стрептококкоза и стафилококкоза были получены и изучены на специфичность и чувствительность в лаборатории микст инфекций кафедры эпизоотологии и инфекционных болезней (Н В Лобанова, 2004)

Опыт по изучению активности анаплазмозного антигена с гемолимфой клещей, инфицированных возбудителем анаплазмоза крупного рогатого скота проводили совместно с аспирантом Бейсембаевым К К на клещах D reticulatus и D

эПуагиш

Конструирование анаплазмозного эритроцитарного диагностикума проводили по методике изготовления бруцеллезного Я диагностикума для РНГА, модифицированной АП Красиковым (1982)

Реакции непрямой иммунофлуоресценции и непрямой гемагглютинации проводили в экспериментальных и производственных условиях с сыворотками крови крупного рогатого скота из неблагополучных по анаплазмозу хозяйств Южно -Уральского и Западно - Сибирского регионов, РНИФ с материалом от клещей, собранных в указанных регионах

Опыты по сравнительному изучению химиотерапевтической эффективности некоторых препаратов тетрациклинового и фторхинолонового ряда, а также лекарственной смеси спирта с риванолом и азидина с нилвермом проводили в хозяйствах Омской области ЗАО « Колос», СПК « Большевик», АОЗТ «Новороссийское» на спонтанно инфицированном крупном рогатом скоте Производственные испытания проводили на 300 головах крупного рогатого скота в двух хозяйствах Челябинской области и одном хозяйстве Республики Башкортостан, спонтанно инфицированных возбудителем анаплазмоза

Расчет экономической эффективности применения схем лечения при анаплазмозе крупного рогатого скота осуществляли в соответствии с методикой определения экономической эффективности ветеринарных мероприятий, утвержденной Министерством сельского хозяйства и продовольствия РФ, Департаментом ветеринарии, Московской государственной академией ветеринарной медицины и биотехнологии им К И Скрябина (1997)

Статистическую обработку материалов проводили согласно общепринятым методикам (А М Мерков, Л Е Поляков, 1974)

Часть исследований была проведена совместно с сотрудниками ФГУ Омского НИИ природно-очаговых инфекций Роспотребнадзора (И Е Самойленко, В В -Якименко, Г П Юртова), а также с аспирантом ИВМ ФГОУ ВПО ОмГАУ К К Бейсембаевым, которым выражаем глубокую благодарность

3. Результаты исследований 3.1. Распространение анаплазмоза крупного рогатого скота и его ассоциаций с другими инфекциями в зоне Южного Урала и Западной Сибири

Исследования по изучению эпизоотической ситуации по анаплазмозу крупного рогатого скота в зоне Южного Урала (Челябинская область и Белорецкий район Республики Башкортостан, находящийся в угрожаемой по анаплазмозу зоне) и Западной Сибири (Омская область) проводили с применением эпизоотологиче-ского, клинического, микроскопического и серологического методов

Работа по выяснению распространения, сезонности проявления, степени восприимчивости разных возрастных групп крупного рогатого скота и основных путей распространения анаплазмоза, а также вопроса о возможности ассоциативных форм течения анаплазмоза, проведена на 500 головах крупного рогатого скота из 20 хозяйств, спонтанно инфицированных возбудителем анаплазмоза крупного рогатого скота

Для этого, нами было выборочно исследовано 400 коров в возрасте 3-7 лет, 100

телят 4-6 мее возраста, принадлежащие 9 хозяйствам Челябинской области и одному хозяйству Республики Башкортостан, 10 хозяйствам Омской области При этом в Республике Башкортостан ООО «Верхнебельский» Белорецкого района - анаплазмоз обнаружен у 45% животных, в Челябинской области в СПК «Малиновское» Агаповского района, СПК «Выбор», ООО «Искра», ООО «Приморское» - 20%, в ЗАО «Первомайское» - 40%, в ЗАО «Зингейское», ЗАО «Наравчатское», СП «Буранное», ОП «Горный» - 30% Наибольшее количество анаплазмоносителей в зоне Южного Урала приходится на Белорецкий район Республики Башкортостан (45%)

Омской области анаплазмоз выявлен в ЗАО «Курнасово» - 90%, в СПК «Красный Яр» и СПК «Кольтюгино» - 50%, в СПК «Такмык» - 20%, СПК «Большевик» Полтавского района - 70%, в АО «Колос» Павлоградского района - 30 % коров и 60% телят, в АОЗТ «Новороссийское» Нововаршавского района — у 60% коров и 30% телят, в СПК «Семеновка» - 40%, в СПК «Тевриз» - 20% животных. Наибольшее число случаев анаплазмоносительства (90%) среди крупного рогатого скота 3-5 летнего возраста приходится на Большереченский район Омской области

При эпизоотологическом обследовании хозяйств Омской области и Южного Урала регистрировали острое и подострое течение анаплазмоза крупного рогатого скота, главным образом с апреля по октябрь, когда на животных паразитирует большое количество иксодовых клещей

При проведении комплексных исследований по выявлению больных анаплазмозом животных было отмечено, что инфекционный процесс у некоторых животных осложнялся ассоциацией других инфекций

Так в ООО «Верхнебельский» Белорецкого района Республики Башкортостан из 45% реагирующих на анаплазмоз коров 30% приходилось на ассоциативную форму его проявления с лептоспирозом, ИРТ-ПВ, хламидиозом В Челябинской области в СПК «Малиновское» моноинфекция зарегистрирована - у 20% животных, в ЗАО «Первомайское» - у 30% - в ассоциативной форме (хламидиоз, лептоспироз, саль-монеллез), в ЗАО «Зингейское» - у 20% (хламидиоз), в ООО «Искра» - у 40% (хламидиоз, лептоспироз, сальмонеллез, ИРТ-ПВ), в ЗАО «Наравчатское» - у 20% (хламидиоз, лептоспироз), в ООО «Приморское» - у 10% (лептоспироз), в СП «Буранное» - у 10% (лептоспироз), в СПК «Выбор» - у 10% (ИРТ-ПВ), в ОП «Горный» - у 20% (хламидиоз, лептоспироз)

В Омской области в ЗАО «Курнасово» из 90% реагирующих на анаплазмоз коров 30% приходилось на ассоциацию с лептоспирозом и сальмонеллезом В СПК «Красный Яр» моноинфекция зарегистрирована у 50% животных, в СПК «Такмык» - у 10% и 10% - в ассоциативной форме (хламидиоз, лептоспироз, сальмонеллез) В СПК «Большевик» из 70% коров и телят, инфицированных анаплазмами 10% приходилось на долю животных инфицированных в ассоциации с хламидиями, лептоспи-рами, листериями, сальмонеллами, вирусами ИРТ-ПВ и ПГ-3 В ЗАО «Колос» - у 20% взрослого скота анаплазмоз, регистрировали как моноинфекцию и у 10% в ассоциации с сальмонеллезом, у 50% телят в ассоциированной форме (с хламидиозом, лептоспирозом, диплококкозом, сальмонеллезом и ПГ-3) и у 10% телят, как моноинфекцию В СПК «Новороссийском» из числа исследованных животных у 30% взрослого скота инфекционный процесс проявлялся в виде моно — и у 30% в виде ассоциаций с хламидиозом, лептоспирозом, сальмонеллезом, листериозом, а у молодняка в той же ассоциации за исключением замены возбудителя сальмонеллеза на ИРТ-ПВ,

в СПК «Семеновна» - 40% в виде ассоциированной инфекции с хламидиями, леп-тоспирами, вирусом ИРТ-ПВ и листериями В СПК «Кольтюгино» - у 50% из числа обследованных животных инфекционный процесс протекал в ассоциации с хламидиями, сальмонеллами, вирусом ИРТ-ПВ, в СПК «Тевриз» - у 20% животных анаплазмоз зарегистрирован в виде моноинфекции

3.2. Морфологические и тинкториальные свойства возбудителя анаплазмоза и его локализация в клетках крови

Попадая в кровь анаплазмы проникают в эритроциты путем инвагинации клеточной мембраны и образования вакуоли Затем они делятся, формируют тельца включения, содержащие до 8 «начальных телец» располагающихся рядом Тельца включения наиболее многочисленны в острую фазу инвазии, но некоторые могут сохранятся годами (Д Уркхарт и др , 2000)

В ходе наших исследований при микроскопии мазков от крупного рогатого скота, окрашенных по Романовскому-Гимзе были обнаружены тельца включения в эритроцитах розовато-фиолетовые точкоподобные, локализующиеся ближе к переферии эритроцита Аналогичные тельца включения были обнаружены в мазках из крови экспериментально зараженных белых мышей

В качестве биологической модели для культивирования и изучения анаплазм использовали культуру клеток Vero Анализ электронно-микроскопических исследований показал, что культура клеток Vero пораженная возбудителем анаплазмоза крупного рогатого скота нарушена, а цитоплазма содержит большое количество анаплазмозных «морул» различной величины и формы Цитоплазматическая мембрана клетки Vero истончена и местами разорвана Морулы содержащие анаплазмы располагаются как в цитоплазме клеток, так и за ее пределами

4. Усовершенствование методов диагностики и лечения анаплазмоза крупного рогатого скота 4.1. Изготовление опытных серий анаплазмозного антигена и сыворотки для

РНИФ

Из известных в настоящее время и широко доступных для ветеринарных лабораторий серологических реакций остается реакция иммунофлюоресценции

Перед нами стояла задача получить анаплазмозный антиген и диагностическую анаплазмозную сыворотку и изучить их специфичность и активность в РНИФ

Для гипериммунизации использовали восьми суточную культуру полевого штамма A sp Omsk, полученную на культуре клеток Vero Заражение культур клеток Vero проводили приготовленной суспензией из селезенки от больной анаплазмозом коровы Для выделения анаплазм из клеток использовали способ попеременного замораживания (при t 20°С в течение 30 мин) и размораживания при комнатной температуре и центрифугирования клеточной взвеси при 3000 g - 15 мин Для дальнейшей работы использовали супернатант, который дополнительно центрифугировали при 6000 g в течение часа Полученный осадок трижды отмывали стерильным физиологическим раствором, центрифугируя в том же режиме, и доводили до кон-

центрации 1,7x109 микробных тел в 1 мл по ОСМ ГИСК им JI А Тарасевича Гипериммунизацию проводили на 3 кроликах породы шиншилла весом 2,5-3 кг

Титры антител учитывали на 7, 14, 22 и 30 сутки после введения анаплазм в РНИФ, антиген для которой готовили из этого же штамма и использовали после инактивации на водяной бане при 70°С в течение 30 мин в концентрации 1 млрд м т

Полученная анаплазмозная кроличья сыворотка была изучена на специфичность и активность в РНИФ Установлено, что антисыворотка, строго специфична к антигену, против которого она получена Данная сыворотка, в разведении 1 5 давала перекрестную реакцию с микоплазмами, бруцеллами, хламидиями и вирусом ИРТ-ПВ, а в разведениях 1 10- 1 320 была строго специфична к анаплазмам

При этом высокий уровень антител регистрировали на 22-30 сутки после начала гипериммунизации, который колебался в пределах от 160 до 320

4.2. Изучение роли основных переносчиков анаплазмоза крупного рогатого скота - клещей в передаче возбудителя инфекции с помощью РНИФ

В экспериментальных условиях нами установлено, что реакция непрямой имму-нофлюоресценции, является эффективным диагностическим тестом для обнаружения возбудителя анаплазмоза крупного рогатого скота в материале из клещей, выявляя при этом до 55±15,0 - 60±10,0% зараженных особей Выделения возбудителя анаплазмоза крупного рогатого скота в гемолимфе половозрелых клещей (гемолимфо-тест), свидетельствует о персистенции возбудителя в органах и тканях клеща

В связи с этим на втором этапе работы для подтверждения экспериментальных данных, метод по обнаружению анаплазм в клещах, был испытан в производственных условиях

Целью исследований являлось изучение роли клещей в передаче возбудителя анаплазмоза в различных нозоареалах РФ В зоне Южного Урала распространены клещи рода Ixodes Иксодовые клещи (Ixodidae), как и насекомые, служат средой обитания для многих видов микроорганизмов, принадлежащих к разным таксономическим и экологическим группам (Ю С Балашов, 1995)

В ходе проведенных исследований была выяснена связь между численностью клещей и заболеванием анаплазмозом животных Так, на юге Челябинской области и юго-востоке республики Башкортостан (Белорецкий район), также как и в Омской области, анаплазмоз регистрируется с апреля по октябрь, когда иксодовые клещи проявляют максимальную активность

Наибольшее количество иксодовых клещей наблюдали в лесостепной (Челябинская область), подтаежной (Омская область) и горно-лесной (Белорецкий район Республики Башкортостан) зонах В ходе выполнения данной работы было собрано 200 клещей, в зоне Южного Урала и Западной Сибири Производственные испытания РНИФ проводили на материале от клещей собранном в выше указанных зонах на территории хозяйств, в которых периодически наблюдали заболевание анаплазмозом животных

При этом из 100 исследованных экземпляров клещей в Западно - Сибирском регионе уровень инфицированное™ составил 40±10,9, а в Южно - Уральском -35±10,7 (табл 1)

Таблица 1 Исследование гемолимфы клещей в РНИФ

Название зоны исследования Количество исследованных экз клещей Уровень инфицированности,%

Западная Сибирь 100 40±10,9

Южный Урал 100 35±10,7

4 3. Изготовление анаплазмозного эритроцитарного диагностикума

В качестве клеточной основы для приготовления диагностикума были выбраны эритроциты барана, а для стабилизации 20% формалин При формалинизации эритроцитов использовали свежую дефибринированную кровь барана - донора, которую разводили 1 1 буферным физ раствором рН - 7,2 (0,137 М ЫаС1, 0,001 М двузаме-щенный фосфорнокислый калий на 1л дистиллированной воды) Фиксацию эритроцитов проводили по методу Фили в модификации А П Красикова (1982), которая заключалась в более щадящем способе воздействия формалина на эритроциты и одновременно обеспечивающая хорошую их фиксацию При данном способе фиксации эритроциты, по данным автора, сохраняют свои сорбционные свойства в течение пяти лет (срок наблюдения)

Для нагрузки формалинизированных 2,5-3% эритроцитов делали различные разведения инактивированного при I 70°С в течение ЗОмин антигена (1 1-1 8) на буферном физ растворе рН - 6,4, которыми сенсибилизировали эритроциты в соотношении 2 1 (2 обьема антигена 1обьем эритроцитов), сенсибилизацию проводили на водяной бане при I 70°С в течение 30 мин , при перемешивании взвеси через каждые 5 минут За 10 минут до конца сенсибилизации для закрепления антигена на эритроцитах добавляли 1% формалина

Для определения активности полученного эитроцитарного диагностикума проводили постановку РИГА Реакцию ставили макрометодом в обьеме 0,5мл в полистироловых пластинках положительную анаплазмозную сыворотку разводили 1 101 160 В качестве разбавителя применяли фосфатный буфер рН - 6,4

Наиболее показательным был эритроцитарный диагностикум, сенсибилизированный анаплазмозным антигеном в разведении 1 4, который выявлял антитела в сыворотке кролика в титре 1 80 на ++, аналогичная полученная нами сыворотка в РНИФ реагировала в титре 1 320

4 4. Изучение в сравнительном аспекте диагностической ценности РНИФ, РИГА и световой микроскопии

Для изучения сравнительной оценки РНИФ, РНГА и световой микроскопии были отобраны пробы крови из 10 хозяйств неблагополучных по анаплазмозу, принадлежащих Челябинской области, Республике Башкортостан и Омской области При этом от одних и тех же животных проводили исследования крови в световой микроскопии и сыворотки крови в РНГА и РНИФ Во всех случаях положительные результаты световой микроскопии подтверждались в РНИФ и РНГА Однако в РНИФ дополнительно к световой микроскопии в пяти хозяйствах выявлено 5 - 10%

реагирующих животных, а в РНГА 10% При сравнении РИГА и РНИФ между собой более чувствительным методом оказалась РНИФ, с помощью, которой в одном хозяйстве дополнительно к РНГА выявлено 5% реагирующих на анаплазмоз животных При сравнительной оценке РНИФ (90,5%), РНГА(90%) и световой микроскопии (86%) преимущество имеют первые две реакции (табл 2) Кроме того, они являются более технологичными по отношению к световой микроскопии и могут применяться -- одновременно с проведением массовых серологических исследований крупного рогатого скота на бруцеллез, лейкоз и другие инфекционные болезни

Таблица 2 Сравнительная оценка чувствительности методов диагностики анаплазмоза

№ п/п Хозяйства Кол-во ж-х Реагировало, в%

свет микр РНИФ РНГА

1 ЗАО «Наравчатское 30 100 100 100

2 ЗАО «Первомайское» 30 100 100 100

3 СПК «Большевик» 20 100 100 100

4 ООО «Верчнебельский» 20 80 90 90

5 АО «Колос» 40 100 100 100

6 АОЗТ «Новороссийское» 30 60 65 60

7 ЗАО «Курнасово» 30 80 90 90

8 ЗАО «Зингейское» 40 100 100 100

9 СПК «Семеновка» 30 50 60 60

10 СПК «Кольтюгино 30 90 100 100

Итого 300 86 90,5 90

4.5. Испытание в производственных условиях различных схем профилактики и лечения при анаплазмозе крупного рогатого скота

В Омской области опыты по сравнительному изучению терапевтической эффективности комплексных препаратов тетрациклина - ПВП, тетраэритросульфина — ПЭГ, левоэритроциклина - ПЭГ, тилоциклина - ПЭГ, левотетрасульфина - ПЭГ, лекарственных смесей спирта с риванолом, азидина с нилвермом и силовета проводили в 3 базовых хозяйствах на 116 головах крупного рогатого скота ЗАО «Колос», СПК «Большевик» и АОЗТ «Новороссийское» на спонтанно инфицированном крупном рогатом скоте

После проведения опытов по результатам клинических, гематологических исследований было установлено, что бактериостатическое действие на анаплазмы оказывают тетрациклин - ПВП, тетраэритросульфин - ПЭГ, силовет, тилоциклин - ПЭГ, лево-эритроциклин - ПЭГ, а схемы лечения с применением спирта с риванолом, азидина с нилвермом и левотетрасульфина - ПЭГ оказывают бактерицидное действие При этом две последние являются более экономичными и технологичными

Наиболее эффективные схемы лечения при анаплазмозе животных азидин с нилвермом, препарат левотетрасульфин - ПЭГ были применены для лечения в производственных условиях на 300 головах крупного рогатого скота больного анаплазмо-

зом из двух хозяйств Челябинской области и одного Республики Башкортостан в возрасте от 1,5 до 3,5 лет, лечение проводили с осуществлением контроля эффективности действия препаратов не только по отсутствию анаплазм, но и других ас-социантов участвующих в инфекционном процессе Для производственного испытания были подобраны хозяйства ООО «Верхнебельский», ЗАО «Наравчатское», СПК «Выбор», в которых регистрировали анаплазмоз в ассоциации с возбудителями других инфекционных болезней (хламидиоз, лептоспироз, ИРТ-ПВ) в различных сочетаниях, при этом в последнем анаплазмоз протекал в виде моноинфекции

После применения азидина с нилвермом анаплазмы в крови и сыворотке не регистрировались, при лечении животных левотетрасульфином - ПЭГ анаплазмы в крови отсутствовали, также не были выявлены возбудители хламидиоза, лептос-пироза, ИРТ-ПВ в секрете молочной железы и цервиковагинальной слизи В то время как у нелеченных животных наблюдали клинические признаки анаплазмоза, в крови были обнаружены анаплазмы (10-15%), РИГА и РНИФ с сывороткой крови дали положительный результат, РНИФ с секретом молочной железы и цервиковагинальной слизью выявила наличие возбудителей хламидиоза, лептоспиро-за, ИРТ-ПВ

Экономический ущерб от анаплазмоза крупного рогатого скота в ЗАО «Колос» составил - 70725 руб , в ЗАО «Наравчатское» - 56625 руб (за 2004- 2005гг соответственно) Применяя 5 и 6 схемы лечения в хозяйствах при анаплазмозе крупного рогатого скота, сумма предотвращенного экономического ущерба составила -591378,3 руб и 444099 руб, экономический эффект от проведенных лечебно-профилактических мероприятий равен 571854,9 руб и 421074 руб, а экономический эффект на один рубль затрат составил - 29,29 руб и 18,3 руб (в ценах 2004 -2005 гг соответственно)

Таблица 3 Схемы и результаты лечения анаплазмоза крупного рогатого скота в производственных условиях_

1 № схемы | Количествово животных Схемы лечения коров и нетелей 1,5-3,5 лет Интенсив ность паразитемии анаплазмами в 100 пз, в% до/после Результаты исследований (-отр , + полож) на анаплазмоз до/после Результаты исследований в РНИФ (-отр , + полож ) до/после

свет микр РНИФ РНГА Хламидиоз лептоспироз ИРТ-ПВ

ООО «Верхнебельский»

6 90 Левотетрасульфин-ПЭГ 1мл/10кг внутримышечно двукратно с интервалом 4 дня 6±2/ 0±0 +/- +/- +/- +/- +/- +/-

10 Контрольная группа нелеченных ж-х 6±2/ 12,4±0,9 +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+

СПК «Выбор»

5 90 Азидин+нилверм 15 мл/гол подкожно трехкратно с интервалом 10 дней 6,8±1,5/ 0±0 +/- +/- +/-

10 Контрольная группа нелеченных ж-х 6,8±1,5/ 12,4±0,9 +/+ +/+ +/+ - - -

ЗАО «Наравчатское»

6 90 Левотетрасульфин-ПЭГ 1мл/1&кг внутримышечно двукратно с интервалом 4 дня 10,2±1,5/ 0±0 +/- +/- +/- +/- +/- +/-

10 Контрольная группа нелеченных ж-х 6±2/ 12,4±0,9 +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+

выводы

1 Распространенность анаплазмоза в хозяйствах Омской области составляет 90%, Южного Урала - 100% от числа обследованных, при инфицированности животных от 20 до 90% и от 20 до 45% соответственно При этом анаплазмоз протекает в виде моноинфекции (10 - 60% и 10 - 20%), и в ассоциации (10 - 50% и 10 - 30%), соответственно Число ассоциантов у взрослого скота достигает четырех, у молодняка - до пяти, в различных сочетаниях с хламидиями, лептос-пирами, вирусом ИРТ, вирусом ПГ-3, листериями, сальмонеллами

2 Культуральный метод выделения анаплазм с использованием клеток Vero способствует накоплению биомассы с последующим изготовлением антигенов для РНИФ и РИГА

3 Получены анаплазмозные сыворотка и антиген, которые активны и специфичны в РНИФ, с помощью анаплазмозного антигена дополнительно к световой микроскопии выявлено анаплазмоносительство у 5 - 10% животных

4 Экспериментально показана роль клещей в передаче анаплазмоза на различных стадиях развития (имаго, личинка, нимфа) При этом заболевание анаплазмозом напрямую связано с периодом активности клещей-переносчиков в исследуемых регионах (с апреля по октябрь) РНИФ с анаплазмозной сывороткой является эффективным диагностическим тестом для обнаружения возбудителя в материале из клещей (гемолимфотест) В Западно - Сибирском регионе уровень инфицированное™ исследованных клещей составил 40±10,9, а в Южно -Уральском - 35±10,7

5 Сконструированный эритроцитарный диагностикум для РНГА в производственных условиях дополнительно к световой микроскопии выявляет 10% реагирующих на анаплазмоз животных

6 Сравнительная оценка РНИФ, РНГА и световой микроскопии дает преимущество первым двум тестам, из которых наиболее чувствительной является РНИФ - 90,5% , несколько ниже - 90% РНГА, световая микроскопия - 86% РНИФ и РНГА являются более технологичными по отношению к световой микроскопии и могут применяться одновременно с проведением массовых серологических исследований крупного рогатого скота на бруцеллез, лейкоз и другие инфекционные болезни

7 Экономичными и технологичными являются схемы лечения животных с использованием левотетрасульфина - ПЭГ и азидина с нилвермом Применение, которых в производственных условиях в трех хозяйствах Южного Урала дало хороший терапевтический эффект первого препарата как при моноинфекции, так и при ассоциированном анаплазмозе, а лекарственной смеси азидина с нилвермом только при анаплазмозе При этом экономический эффект от внедрения схем лечения в базовых хозяйствах Омской области и Южного Урала на один рубль затрат составил - 29,29 руб и 18,3 руб соответственно (в ценах 2004 -2005гг)

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Для практического применения разработаны методические рекомендации «Схемы лечения и профилактики при анаплазмозе крупного рогатого скота», рассмотренные и одобренные на заседании ученого совета ИВМ ФГОУ ВПО Ом-ГАУ от 25 05 2005 г, протокол №8 и на заседании Центра научного обеспечения АПК Омской области при Министерстве сельского хозяйства и продовольствия Омской области от 26 05 2005 г, протокол №4 и «Усовершенствование методов диагностики анаплазмоза крупного рогатого скота», рассмотренные и одобренные на заседании ученого совета ИВМ ФГОУ ВПО ОмГАУ от 28 06 2006 г, протокол № 7 и на заседании Центра научного обеспечения АПК Омской области при министерстве сельского хозяйства и продовольствия Омской области от 12 09 2006 г, протокол №5

Материалы диссертации могут быть использованы

• в учебном процессе при чтении лекций и проведении лабораторно - практических занятий по микробиологии, эпизоотологии,

• в научно-исследовательских институтах и учреждениях ветеринарной медицины при решении вопросов диагностики, профилактики и лечения анаплазмоза крупного рогатого скота

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Анаплазмоз крупного рогатого скота и ассоциативные формы его проявления / А П Красиков, К К Бейсембаев, Ю М Гичев, Н П Бронникова // Проблемы ветеринарного образования и научных исследований в агропромышленном комплексе материалы уч - мет и научн - произвол конференции, посвященной 10-летию ОмГАУ Сб научн тр - Омск Изд-во ИВМ ОмГАУ, 2004 - С 177-182

2 Изыскание средств терапии и профилактики при анаплазмозе крупного рогатого скота / К К Бейсембаев, А П Красиков, Н П Бронникова, С В Савицкий // Актуальные проблемы ветеринарной медицины материалы IV межрегиональной научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения заслуженного ветеринарного врача РФ Ильи Владимировича Окунцова Сб науч тр СО РАСХН ВНИИБТЖ - Омск, 2005 - С 42-46

3 Усовершенствование методов диагностики анаплазмоза крупного рогатого скота/А П Красиков, Н В Рудаков, Н П Бронникова, К К Бейсембаев// Ветеринарная патология -2007 - №1(20) - С 122-124

На правах рукописи

Козлова Наталья Петровна

Совершенствование методов диагностики, профилактики и лечения при ассоциированном анаплазмозе крупного рогатого скота.

16 00 03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

ОМСК-2007

Сдано в набор 20 02 07 Подписано в печать 19 02 07

Формат 60x84/16 Гарнитура Times New Roman Уел печ л 1,25 Печать - оперативная Тираж 100 экз

_Лицензия ЛТ №020074_

Отпечатано с оригинал - макета В типографии ООО «Вариант-Сибирь» 644122, г Омск, ул Яковлева, 5 Тел/факс 25-03-54

1.2. Общая характеристика работы Актуальность темы. На современном этапе развития агропромышленного комплекса перед работниками ветеринарной службы ставятся ответственные задачи, а именно, профилактика и борьба с болезнями инфекционной этиологии для обеспечения выпуска высококачественной, безопасной в санитарном отношении продукции. Среди инфекционных болезней, которые до настоящего времени изучены недостаточно хорошо, особое место занимают трансмиссивные инфекции.

Анаплазмоз крупного рогатого скота - трансмиссивная, природно -очаговая болезнь, протекающая с явлениями глубокой анемии аутоиммунной природы и истощения, вызываемая возбудителями из рода Anaplasma. Болезнь распространена во всех частях света и наносит животноводству значительный экономический ущерб в результате резкого снижения продуктивности и гибели крупного рогатого скота (Н.А.Казаков, 2003).

У людей выявляют гранулоцитарный анаплазмоз человека (ГАЧ) -трансмиссивную зоонозную, остро протекающую лихорадочную болезнь, передающуюся при присасывании клещей и часто приводящую к летальному исходу, связанную с Anaplasma phagocytophila. Клинические признаки болезни: синдром интоксикации, поражения органов и гематологические нарушения, зависят от вида возбудителя (Н.В.Рудаков и др., 2001). До относительно недавнего времени эрлихии были известны как возбудители болезней животных на ряде континентов, а проблема эрли-хиозов интересовала только ветеринарных работников. В 1910 г Тейлер (Theiler) описал A. marginale - клещевой патоген крупного рогатого скота, поражающий бычьи эритроциты. Далее представителями ветеринарной медицины были описаны Cowdria ruminantium- возбудитель сердечной водянки крупного рогатого скота (Cowdri,1925), Ehrlichia canis

Donatien and Lestoquard, 1935), E. phagocytophila (Gordon, 1940). В 1945 г. было утверждено родовое название Ehrlichia в честь немецкого ученого микробиолога Пауля Эрлиха (Paul Ehrlich). В настоящее время доказано развитие у человека трех болезней, вызываемых эрлихиями -эрлихиоза Сеннетсу (Ehrlichia sennetsu), моноцитарного эрлихиоза (Ehrlichia chaffeensis) и гранулоцитарного эрлихиоза (Anaplasma. phagocytophila), Исследования в отношении анаплазмозов и эрлихиозов человека в России начаты в конце 90-х годов XX века и к настоящему времени носят фрагментарный характер. Вместе с тем, выявление Ehrlichia muris и гранулоцитарных анаплазм в клещах Ixodes persulcatus в ряде регионов России, а также ретроспективная серологическая верификация диагнозов МЭЧ и ГАЧ (МЭЧ-моноцитарный эрлихиоз человека и ГАЧ-гранулоцитарный анаплазмоз человека) в Уральском, Сибирском и Дальневосточном федеральном округах, свидетельствуют об актуальности этой проблемы в Российской Федерации.

В последнее время благодаря широкому внедрению методов генетического анализа пересмотрена филогенетическая позиция представителей семейства Anaplasmataceae с исключением деления на трибы и выделением четырех родов - Ehrlichia, Anaplasma, Neorickettsia и Wolba-chia. Вследствие этого E.phagocytophila - этологический агент ГАЧ была реклассифицирована и помещена в соседний род Anaplasma под названием Anaplasma phagocytophila (Н.В.Рудаков и др., 2001).

Вид анаплазм в световом микроскопе напоминает кокковидные формы риккетсий. Анаплазмы, как и риккетсии, являются внутриклеточными паразитами, однако, первые размножаются в эритроцитах, а вторые - в эндотелиальных и мезотелиальных клетках (В.М.Петешев-1975). Они располагаются в эритроцитах (преимущественно на периферии, иногда ближе к центру). В одном эритроците может быть от 1 до 4 анаплазм. Пораженность эритроцитов составляет 3 - 40% , иногда до 80% (А.ИЛтусевич и др.-2001).

Весной 2001г. в зоне Южного Урала (Челябинская область) был проведен сбор клещей - 39 особей, в двух из которых были обнаружены не идентифицированные до вида эрлихии (С.Н.Шпынов и др.-2002,2004).

По данным отечественной и зарубежной литературы, возбудители анаплазмоза имеют близкое родство с эрлихиями, они относятся к одному и тому же семейству Anaplasmataceae. Не доказано генетическое родство и отличие между ними и их эпидемиологическое значение, также не установлено таксономическое положение, которое должен занимать каждый из них. Анаплазмоз зачастую протекает в ассоциации с другими инфекционными болезнями (Н.А.Казаков, 2003).

В связи с этим весьма актуальным является: выяснить распространение анаплазмоза крупного рогатого скота в Южно-Уральском и Западно-Сибирском регионах, роль насекомых в передаче инфекции, провести усовершенствование диагностики, профилактики и лечения при данной болезни.

Цель исследований: изучить распространение анаплазмоза крупного рогатого скота и основных переносчиков инфекции в ЮжноУральском и Западно-Сибирском регионах, усовершенствовать диагностику и лечение при данной болезни.

Для реализации поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

• Выяснить распространение анаплазмоза крупного рогатого скота в различных нозоареалах Южно-Уральского и ЗападноСибирского регионов и его ассоциации с другими инфекциями.

• Изготовить анаплазмозные антиген и антисыворотку для люминесцентной микроскопии и эритроцитарный диагностикум

• Изучить активность и специфичность полученных антигенов и диагностической сыворотки в РНИФ и РНГА.

• Изучить в производственных условиях диагностическую ценность РНИФ и РНГА.

• Изыскать средства и разработать способы терапии и профилактики при анаплазмозе крупного рогатого скота, в т.ч. ассоциированном с другими инфекционными болезнями.

Научная новизна работы. В условиях Западно - Сибирского и Южно - Уральского регионов с помощью разработанных лабораторных методов диагностики установлено широкое распространение анаплазмоза в 90-100% обследованных хозяйств, при высокой инфицированности животных. Изучены формы проявления анаплазмоза в виде моноинфекции и в ассоциации с другими болезнями. Изготовлены антигены и антисыворотки для реакции непрямой иммунофлуоресценции. С помощью, которых можно выявлять возбудителей анаплазмоза в клещах переносчиках на различных стадиях их развития, а также антитела в сыворотке крови больных животных и анаплазмоносителей. Разработан культуральный метод диагностики анаплазмоза с использованием клеток Vero. Получен анаплазмозный эритроцитарный диагностикум для РНГА. Разработаны, испытаны в экспериментальных и производственных условиях и предложены ветеринарной практике эффективные схемы лечения больных анаплазмозом животных, в т.ч. ассоциированном и лабораторные методы контроля их эффективности.

Теоретическая и практическая значимость работы. Материалы диссертации вносят вклад в изучение переносчиков (клещей) возбудителя анаплазмоза на различных стадиях развития, в совершенствование лабораторной диагностики, профилактики и мер борьбы с данной инфекцией с учетом ассоциаций других микроорганизмов участвующих в инфекционном процессе. Разработанные методики получения анаплазмозного антигена и антисыворотки для РНИФ и эритроцитарного диаг-ностикума для РНГА, позволят апробировать и внедрить данные экспресс-методы диагностики анаплазмоза крупного рогатого скота в условиях промышленного животноводства Южно - Уральского и Западно -Сибирского регионов. На основании проведенных исследований разработаны методические рекомендации «Усовершенствование методов диагностики анаплазмоза крупного рогатого скота» и «Схемы лечения и профилактики при анаплазмозе крупного рогатого скота». Применение усовершенствованных методов диагностики позволит проводить лабораторную диагностику данной болезни в различные периоды её развития. Применение разработанных схем лечения при анаплазмозе крупного рогатого скота создаст условия для более эффективного проведения мероприятий по борьбе с данной болезнью.

Апробация работы. Материалы исследований доложены и обсуждены на научных конференциях профессорско-преподавательского состава и аспирантов ИВМ ФГОУ ВПО ОмГАУ 2003-2005гг. (Омск): «Роль ветеринарного образования в подготовке специалистов агропромышленного комплекса» (Омск, 2003), «Результаты научных исследований в ветеринарии и зоотехнии в агропромышленном комплексе» (Омск, 2004), «Проблемы ветеринарного образования и научных исследований в агропромышленном комплексе» (Омск, 2005), на Межрегиональных научно-практических конференциях: «Эпизоотология, патология и вете-ринарно-санитарные мероприятия при инфекционных болезнях животных» (Омск, 2004, СО РАСХН - ВНИИБТЖ), «Актуальные проблемы ветеринарной медицины» (Омск, 2005, СО РАСХН - ВНИИБТЖ), на Международной конференции «Профилактика, диагностика и лечение инфекционных болезней, общих для людей и животных (Ульяновск, 2006), на Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарии в современных условиях» (Краснодар, 2006)

Внедрение результатов исследований. Результаты исследований вошли в методические рекомендации «Схемы лечения и профилактики при анаплазмозе крупного рогатого скота», рассмотренные и одобренные на заседании ученого совета ИВМ ФГОУ ВПО ОмГАУ от 25.05.2005 года, протокол №8 и на заседании Центра научного обеспечения АПК Омской области при Министерстве сельского хозяйства и продовольствия Омской области от 26.05.2005, протокол №4 и «Усовершенствование методов диагностики анаплазмоза крупного рогатого скота», рассмотренные и одобренные на заседании ученого совета ИВМ ФГОУ ВПО ОмГАУ от 28.06.2006года, протокол № 7 и на заседении Центра научного обеспечения АПК Омской области при министерстве сельского хозяйства и продовольствия Омской области от 12 .09. 2006, протокол №5. Материалы диссертации используются в учебном процессе кафедр эпизоотологии и инфекционных болезней животных и микробиологии, вирусологии и иммунологии Института ветеринарной медицины ФГОУ ВПО ОмГАУ и Института повышения квалификации руководителей и специалистов АПК ОмГАУ, на кафедре микробиологии, вирусологии и иммунологии ОмГМА, а также в курсе лекций Тюменского института переподготовки кадров агробизнеса.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Распространение анаплазмоза крупного рогатого скота в Южно -Уральском и Западно - Сибирском регионах и ассоциативные формы его проявления.

2. Приготовление опытных серий анаплазмозных антигена и сыво- п ротки для РНИФ и эритроцитарного диагностикума для РИГА.

3. Изучение в производственных условиях диагностической ценности РНИФ и РИГА.

4. Разработка и испытание в производственных условиях различных схем профилактики анаплазмоносительства и лечения больных животных.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 3 статьи.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 122 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических предложений, списка литературы. Работа иллюстрирована 14 таблицами, 7 рисунками. Список литературы включает 169 источников, из них 70 зарубежных авторов.

7. ВЫВОДЫ

1. Распространенность анаплазмоза в хозяйствах Омской области составляет 90%, Южного Урала - 100% от числа обследованных, при инфицированности животных от 20 до 90% и от 20 до 45% соответственно. При этом анаплазмоз протекает в виде моноинфекции (10-60% и 10-20%), и в ассоциации (10 -50% и 10 - 30%), соответственно. Число ассоциантов у взрослого скота достигает четырех, у молодняка - до пяти, в различных сочетаниях с хламидиями, лептоспирами, вирусом ИРТ-ПВ, вирусом ПГ-3, листериями, сальмонеллами.

2. Культуральный метод выделения анаплазм с использованием клеток Vero способствует накоплению биомассы с последующим изготовлением антигенов для РНИФ и РНГА.

3.Получены анаплазмозные сыворотка и антиген, которые активны и специфичны в РНИФ, с помощью анаплазмозного антигена дополнительно к световой микроскопии выявлено анаплазмоносительство у 510% животных.

4.Экспериментально показана роль клещей в передаче анаплазмоза на различных стадиях развития (имаго, личинка, нимфа). При этом заболевание анаплазмозом напрямую связано с периодом активности клещей - переносчиков в исследуемых регионах. РНИФ с анаплазмоз-ной сывороткой является эффективным диагностическим тестом для обнаружения возбудителя в материале из клещей (гемолимфотест). В Западно - Сибирском регионе уровень инфицированности исследованных клещей составляет 40±10,9, а в Южно - Уральском-35± 10,7

5. Сконструированный эритроцитарный диагностикум для РНГА в производственных условиях дополнительно к световой микроскопии выявляет 10% реагирующих на анаплазмоз животных.

6.Сравнительная оценка РНИФ, РНГА и световой микроскопии дает преимущество первым двум тестам, из которых наиболее чувствительной является РНИФ - 90,5%, несколько ниже - 90% РНГА, световая микроскопия - 86%. РНИФ и РНГА являются более технологичными по отношению к световой микроскопии и могут применяться одновременно с проведением массовых серологических исследований крупного рогатого скота на бруцеллез, лейкоз и другие инфекционные болезни.

7. Экономичными и технологичными являются схемы лечения животных с использованием левотетрасульфина - ПЭГ и азидина с нилвермом. Применение, которых в производственных условиях в трех хозяйствах Южного Урала дало хороший терапевтический эффект: первого препарата как при моноинфекции, так и при ассоциированном анаплазмозе, а лекарственной смеси азидина с нилвермом только при анаплазмозе. При этом экономический эффект от внедрения схем лечения в базовых хозяйствах Омской области и Южного Урала на один рубль затрат составил -29,29 руб. и 18,3 руб. соответственно (в ценах 2004-2005гг).

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Для практического применения разработаны методические рекомендации: «Схемы лечения и профилактики при анаплазмозе крупного рогатого скота», рассмотренные и одобренные на заседании ученого совета ИВМ ФГОУ ВПО ОмГАУ от 25.05.2005 года, протокол №8 и на заседании Центра научного обеспечения АПК Омской области при Министерстве сельского хозяйства и продовольствия Омской области от 26.05.2005, протокол №4 и «Усовершенствование методов диагностики анаплазмоза, рассмотренные и одобренные на заседании ученого совета ИВМ ФГОУ ВПО ОмГАУ от 28.06.2006года, протокол № 7 и на заседании Центра научного обеспечения АПК Омской области при министерстве сельского хозяйства и продовольствия Омской области от 12 .09. 2006, протокол №5. Материалы диссертации могут быть использованы:

• в учебном процессе при чтении лекций и проведении лабо-раторно-практических занятий по микробиологии, эпизоотологии;

• в научно-исследовательских институтах и учреждениях ветеринарной медицины при решении вопросов диагностики, профилактики и лечения анаплазмоза крупного рогатого скота.

2.6. Заключение

Анаплазмоз крупного рогатого скота - трансмиссивная, природно-очаговая болезнь, вызываемая возбудителем из рода Anaplasma (Н. А.Казаков-2003).

Сейчас уже нет сомнений относительно того, что анаплазмоз рогатого скота - повсеместно распространенная очаговая болезнь (а на заре изучения считалась только южной болезнью), диагноз которой зачастую определяется несвоевременно (особенно при паразитоценозах), вследст-вии чего животноводство несет значительные экономические потери (Н.А.Казаков-2003).

Возбудители семейства Anaplasmatacea -обязательные внутриклеточные бактерии с уникальной специфичностью к клеткам хозяина. В зависимости от бактериальной разновидности инфицируют определенные клетки: гранулоциты, эндотелиальные клетки, моноциты, макрофаги, красные клетки крови, и клетки костного мозга. Эта уникальная специфичность к клеткам хозяина была главным препятствием, для выращивания этой группы бактерий. Поскольку эти бактерии не могут жить вне хозяина, когда-то вышедшие из клеток хозяина, они должны быстро стимулировать сигналы для внедрения в другую клетку хозяина, уникальную к каждой разновидности. Когда эти бактерии взаимодействуют с клетками хозяина, сигналы преобразованные внутри бактерий, позволяют им точно настраивать их метаболизм и физиологию в новой окружающей среде клетки хозяина, пока они не достаточно размножились (Y. Rikihisa, 2003). Электронно-микроскопическими исследованиями установлено, что анаплазмы окружены плотной непроницаемой морулой (двухслойная цитоплазматическая окружность), внутри которой находятся «инициальные тельца», каждая из которых окружена тонкой наружной и внутренней мембраной. Такие скопления паразитов назвали колониями (В.М. Петешев, 1969) или микроколониями (Л.П. Дьяконов, А.А. Авакян, 1970). Мелкие микроколонии состоят из одного - двух особей, а более крупные из нескольких. При наличие двух паразитов колония имеет вытянутую форму, трёх - треугольную, четырёх - четырёхугольную, свыше четырёх - кругловатую.

Анаплазмы размножаются простым делением и почкованием, формируя колонии из 2 - 8 особей (М.Ш. Акбаев, 1998). Анализ результатов электронно-микроскопических исследований показал, что анаплазмы формируют поперечные трубчатые структуры и перетяжки, что указывает на деление анаплазмозных клеток.

Ультраструктура анаплазмозных клеток представлена протопласти-ческими пучками в периплазмотическом пространстве, скоплениями рибосом (тёмные свободные пространства), тонкими нитями ДНК (светлое свободное пространство), трубчатыми и везикулярными образованиями (К.К.Бейсембаев, 2005).

Предполагается, что первоначально риккетсии были облигатными паразитами или симбионтами клещей. Их циркуляция могла обеспечиваться не только путем трансовариальной передачи, но и благодаря хищничеству. В дальнейшем, некоторые виды риккетсий попали от клещей в организм теплокровных животных и приобрели способность к размножению в них (Ю.С.Балашов, 1971). Значение облигатных внутриклеточных прокариотов определяется результатами генетических исследований, свидетельствующих об эволюционном родстве риккетсий и митохондрий эукариотов, наличии у них общего предка - внутриклеточного эндосимбионта (В.В.Емельянов, 2000).

Взаимоотношения между иксодовыми клещами и риккетсиями свидетельствуют о древних связях между ними. Эти отношения имеют паразитический характер, хотя степень патогенности риккетсий для клещей не высока. Заражение клещей приводит к пожизненному сохранению возбудителя в их организме без возникновения значительного вреда для беспозвоночного хозяина (И.Ржегачек и А.Б.Дайтер, 1989).

Anaplasma marginale развивается внутриклеточно в пределах вакуоли и специфически связана с циклом жизненного развития беспозвоночного хозяина (К.М.Косап, 1986).

В настоящее время работами отечественных и зарубежных ученых установлено, что переносчиками возбудителя анаплазмоза могут быть клещи 22 видов из семейства Ixodidae и 1 вид из семейства Argasidae.

В организме однократно переболевшего крупного рогатого скота возбудители сохраняются практически всю жизнь. После клинического проявления болезни она переходит в анаплазмоносительство, сопровождаемое периодическими рецидивами. Всем стадиям болезненного процесса, особенно в клинический период при рецидивах, присуще гиперактивное состояние костного мозга, заканчивающееся в итоге его аплазией, т.е. неспособностью к кроветворению, приводящее нередко животное к гибели. Часто анаплазмоз протекает в ассоциации с другими инфекционными болезнями (лептоспироз, бабезиоз, пастереллез и др.).

Анаплазмоз наносит огромный экономический ущерб животноводству, который складывается из снижения мясомолочной продуктивности, снижения качества и количества продуктов животного происхождения, ущерб от недополучения молодняка и гибели животных.

Чтобы успешно бороться с анаплазмозом рогатого скота, важно установить не только этиологическую причину моноинфекции (моноинвазии), но и установить структуру того или иного паразитоценоза. Для этой цели необходимы эффективные диагностические исследования, позволяющие быстро разобраться в ситуации (Н.А.Казаков, 2003).

При постановке диагноза учитывают эпизоотологические данные, клинические признаки, а также исследуют мазки крови, окрашенные по Романовскому - Гимзе, на наличие анаплазм. Разработаны серологические методы диагностики (РА, РСК, РИФ). Для определения животных носителей используются тесты фиксации комплемента и агглютинации; также РНИФ и проба ДНК (Г.Уркхарт и др., 2000).

Лечение не является идеальным методом борьбы с анаплазмозом, однако при отсутствии адекватных эффективных средств профилактики оно приобретает особую актуальность. А если учесть, что из более 200 испытанных в мире препаратов выраженным лечебным эффектом обладают в большей степени лишь тетрациклиновые антибиотики, то важность проблемы, в плане расширения эффективных лечебных средств, приобретает особую актуальность. Конечно же, важнейшим моментом в мероприятиях по борьбе с анаплазмозом крупного рогатого скота, является воздействие (искусственное управление) на одно из звеньев эпизоотической цепи - механизм, пути и факторы передачи возбудителя инфекции. И одним из механизмов передачи возбудителя анаплазмоза крупного рогатого скота являются - членистоногие насекомые (клещи, слепни и т.д.) - переносчики данной болезни.

Многолетний опыт борьбы с иксодовыми клещами показал, что из всех предложенных мер борьбы, применяемых в России, наиболее эффективными оказались: проведение агромелиоративных мероприятий на пастбищах, смена пастбищ и уничтожение клещей на теле животных путём применения акарицидных средств. Этими мероприятиями создаются неблагоприятные условия для существования и дальнейшего развития клещей в их биотопах.

Профилактика и борьба с анаплазмозом крупного рогатого скота должна занимать большое место в системах ветеринарии и санитарно-эпидемиологического надзора, требует детальных знаний этой сложной проблемы и знакомства с ней не только специалистов, но и населения (Н.А.Казаков, 2003).

3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1. Материалы и методы

Тема диссертационной работы является самостоятельным разделом комплексной государственной программы «Профилактика (диагностика) и меры борьбы с ассоциативными инфекционными и инвазионными болезнями животных и птиц» и имеет № государственной регистрации 01.2.001100602.

Работа проводилась в период с 2002 по 2006 годы в лаборатории микст инфекций кафедры эпизоотологии и инфекционных болезней животных. Отдельные исследования были выполнены в лаборатории зоо-нозных инфекций ФГУ Омского НИИ природно-очаговых инфекций Роспотребнадзора и ОГУ «Магнитогорской районной ветеринарной лаборатории».

Объектом исследований являлся крупный рогатый скот различных возрастов, принадлежавший хозяйствам Омской, Челябинской области и Республики Башкортостан.

Прижизненно от животных исследовали кровь и её сыворотку, секрет молочной железы, цервиковагинальную слизь, бронхоальвеолярную слизь. Кровь для серологических исследований брали из ярёмной, а для гематологических - из краевой вены уха.

При эпизоотологическом обследовании хозяйств на анаплазмоз крупного рогатого скота учитывали клинические признаки болезни.

Из общих методов исследования использовали осмотр, пальпацию, термометрию, подсчет пульса и количества дыхательных движений.

Изучение морфологических и тинкториальных свойств выделенных микроорганизмов осуществляли при окраске мазков - препаратов по Романовскому-Гимзе. Микроскопирование проводили при помощи све

41 РОССИЙСКАЯ I

ОСУДДРСТВЕННАЯ

БИБЛИОТЕКА I тового микроскопа МБИ-15 с иммерсионным объективом при увеличении (100x15). Интенсивность паразитемии определяли количеством анаплазм в 100 полях зрения (п./з.) микроскопа, в %.

Для посмертного исследования использовали материал из паренхиматозных органов (селезенка, печень, лимфатические узлы) из которого готовили мазки-отпечатки и окрашивали по Романовскому-Гимзе.

Видоспецифические сыворотки к полевому штамму анаплазм получали путём гипериммунизации кроликов по схеме D. Schimmel в модификации Красикова А.П. и Новиковой Н.Н. (2002). Для постановки РНИФ использовали ослиный антикроличий глобулин, меченный ФИТЦ (флуоресциин изотиоционат натрия).

Для культуральных исследований применяли культуру клеток Vero. Для накопления антигенной биомассы, проводили до 8 пассажей анаплазм. Культуру клеток с анаплазмами после каждого пассажа просматривали при помощи световой и люминесцентной микроскопии.

Больных и анаплазмоносителей (по результатам микроскопии) дополнительно исследовали на ассоциативные формы течения анаплазмоза. Для этого применяли стандартные и дополнительные, разработанные в лаборатории микст инфекций кафедры эпизоотологии и инфекционных болезней методы серологической диагностики - прямой и непрямой иммунофлуоресценции (РПИФ и РНИФ) для прижизненного выявления антигенов и антител (А.П. Красиков, В.Э. Малошевич, 2005). Фиксацию мазков проводили по методу Моди с соавт. (1958), а постановку РНИФ по методике, предложенной Уэллером и Кунсом (1945). В качестве антигенов применяли: антигены вакцинных штаммов и стандартные антигены, используемые для постановки РА и РСК, а в качестве антител -гомологичные антигенам кроличьи и бычьи антисыворотки, антивидовые для РНИФ и специфические сальмонеллезные, риккетсиозные, лис-териозные для РПИФ люминесцентные сыворотки меченные ФИТЦ.

Мазки просматривали под люминесцентным микроскопом ЛЮМ Р-8 при увеличении в 900 раз. Степень флуоресценции антител оценивали по 4-х крестной системе (Вайтекер и др., 1958). При этом кроличьи сыворотки против возбудителей хламидиоза, диплококкоза, стрептококко-за и стафилококкоза были получены и изучены на специфичность и чувствительность в лаборатории микст инфекций кафедры эпизоотологии и инфекционных болезней (Н.В. Лобанова, 2004).

Опыт по изучению активности анаплазмозного антигена с гемолимфой клещей, инфицированных возбудителем анаплазмоза крупного рогатого скота проводили совместно с аспирантом Бейсембаевым К.К. на клещах D. reticulatus и D. silvarum.

Конструирование анаплазмозного эритроцитарного диагностикума проводили по методике изготовления бруцеллезного R диагностикума для РИГА, модифицированной Красиковым А.П. (1982).

Реакции непрямой иммунофлуоресценции и непрямой гемагглюти-нации проводили в экспериментальных и производственных условиях с сыворотками крови крупного рогатого скота из неблагополучных по анаплазмозу хозяйств Южно-Уральского и Западно-Сибирского регионов, РНИФ с материалом от клещей, собранных в указанных регионах.

Опыты по сравнительному изучению химиотерапевтической эффективности некоторых препаратов тетрациклинового и фторхинолоно-вого ряда, а также лекарственной смеси спирта с риванолом и азидина с нилвермом проводили в хозяйствах Омской области: ЗАО « Колос», СПК « Большевик», АОЗТ «Новороссийское» на спонтанно инфицированном крупном рогатом скоте. Для формирования опытных групп в данных хозяйствах провели обследование на анаплазмоз 116 голов крупного рогатого скота разных возрастных групп. По клиническим признакам (анемия, гипотония преджелудков, истощение), а также по положительным результатам гематологических исследований (микроскопия мазков крови из краевой вены уха) по принципу аналогов было сформировано 9 опытных групп по 5 голов и две контрольные группы по 10 животных. Производственные испытания проводили на 300 головах крупного рогатого скота в двух хозяйствах Челябинской области и одном хозяйстве Республики Башкортостан, спонтанно инфицированных возбудителем анаплазмоза.

Расчёт экономической эффективности применения схем лечения при анаплазмозе крупного рогатого скота осуществляли в соответствии с методикой определения экономической эффективности ветеринарных мероприятий, утверждённой Министерством сельского хозяйства и продовольствия РФ, Департаментом Ветеринарии, Московской государственной академией ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина (1997).

Статистическую обработку материалов проводили согласно общепринятым методикам (А. М. Мерков, J1.E. Поляков, 1974).

Часть исследований была проведена совместно с сотрудниками ФГУ Омского НИИ природно-очаговых инфекций Роспотребнадзора (И.Е. Самойленко, В.В. Якименко, Г.П. Юртова), а также аспирантом ИВМ ФГОУ ВПО ОмГАУ К.К.Бейсембаевым, которым выражаем глубокую благодарность.