Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Эмульсионная инактивированная концентрат-вакцина против болезни Ауески (технология изготовления, лабораторное и производственное испытание)

£>УКРАТГНСЪКА АКАДЕМ1Я АГРАРНИХ НАУК ° тксТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГ I КЛ1Н1ЧНОГ О ВЕТЕРИНАРНОТ МЕДИЦИНИ

. —""Г----

ч

На правах рукопису

Б1ЛОК1НЬ Вштор Степанович

ЕМУЛЬС1ЙНА 1НАКТИВ0ВАНА КОНЦЕНТРАТВАКЦИНА ПРОТИ ХВОРОБИ АУ6СК1

(технолопя виготовлення, лабораторне 1 виробниче випробування)

16.00.03—ветеринарна мшроб'юлопя, в1русолопя, ешзооголопя, мшолопя та ¡мунолопя

АВТОРЕФЕРАТ

дисертаци на здобуття наукового ступени доктора ветеринарних наук

Хармв—1997

Дисертащею е рукопис-

Робота виконана в 1нституп експериментально! 1 клппчноТ ветеринарией медицини УААН 1 Всеросшському науково-дослишому ТкституП захисту тварин.

Офдайш опоненти:

1. Доктор ветеринарнпх наук, старший науковий сщвробггник

ПРИСКОКА Вштор АндрШович. 2 Доктор ветеринарнпх наук, старший науковий сшвроб1тник

ЧЕЧОТК1НА Натал!я Павл1вна. 3- Доктор ветеринарнпх наук, професор ПУСТОВАР Олександр Янович-

Провши оргашзацш — Сумський шльськогосподарський шетитут Мшс1ль-госипроду УкраТни, м. Суми-

на засщант Спещал1зовано! вчено! ради Д 02.32.01 при 1нституп експериментально! I клшчно! ветеринарно! медицини УААН:

Харшв-23, вул. Пушкшська, 83.

3 дисертащею можна ознайомитись в б1блютец! 1нституту експериментально! I клшчно! ветеринарно! медицини. Харк1в-23, вул. Пушкшська, 83.

Автореферат розклано « ^ » 5*- (у ^ Н. Я^-1997 р.

Захист дисертацп в1дб>деться « ^ » у^ _1997 року

Вчений секретар Спец!алЬовано1 вчено? Ради,

доктор ветеринарнпх науу' Л К. Ь-

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТЙ

Актуальность проблеми

В сучасних умовах боротьба з хворобою AyecKi здп1снюеться на основ! застосування специф1чних засоб1в та комплексу ветери-нарно-саштарних заход1в. При цьому найбичьш ефективним та iKOHOMi4HO обгрунтованим е вакцинащя, яка дае можл1шсть ;творити ¡мункет в популяцп сприйнятливнх тварин. Вакцинащя 3ano6irae розвитку тяжких клшчних симптоьпв i загибел1 тварин, ¡нижуе eKonoMi4ni збитки. Що стосуеться ¡муногенезу, то вва-жають, що бустерна вакцинащя забезпечуе в oprani3Mi необхщну ильюсть антигену Bipycy хвороби AyecKi, яка сприяе блокуванню рецептор^ чутливих клтш i захищае вщ ураження поль-овими ятамами Bipycy хвороби AyecKi (Wittmann G., Ohlinge R., 1987). Гаким чином знижуеться здатшсть останнього викликати латент-:iy шфекцш (Van Oirschot J. Т. et al., 1991).

У наций Kpaini та за кордоном для проф1лактики хвороби AyecKi використовують Bipyc та шактивоваш вакцини (Базилев П., 1959; Чобонян М., 1965; Айрапетян В., 1967; Гет-га Г., 1972; Петропавлова Л., 1981; Tdma В., 1982; Сергеев В. га iH., 1983; 1993; Цимбал О. та iH„ 1984; Татаров Г., <Щлов-ський М., 1986; Salaj J. et al., 1986; Kellemen J., 1987; Cook D. et al., 1990; Van Oirschot J. T. et al., 1990; ВаЬпе|щапп H„ 1990; \nderson L., 1991; Anneli J., 1992 та iH.). Протиешзоотична ефек-гившсть цих вакцин практично однакова (Конаржевський К- 6., 1992). На певних етаиах застосування вони зберегли в1д хвороби «¡льйони гол1в чутливих тварин, особливо свиней. Проте, проф1-чактичний ефект при ix застосуванщ досягаеться не менш як nic-тя 2-разового щеплення. OKpiM того, в1русвакцини е еколопчно ¡ебезпечш, осюлыш мають залишкову в1рулентшсть. В результат! цього обмежуеться коло Гх застосування неблагополучними -осподарствами (Toneva V., 1985; Kellemen J., 1987; Vivoli P. et il., 1987; Цимбал О. M. та in., 1987; Конаржевський К. 6., 1992).

В технолог^' виготовлення зазначених вакцин головним недо-пком е використання Bipycy, репродукованого на малопродуктив-шх моношарових первинних або перещеплюваних кл^тинних си-темах.

Широко застосовуваш зараз ¡нактивоващ вакцини, хоча i за-Зезпечують проф1лактичний ефект, проте не позбавляють орга-пзм вщ BipyconociflcTBa (Van Oirschot J., 1991). Це пояснюеться эсобливктю патогенезу repnecBipycnnx шфекщй. Як в1домо, гер-tiecBipycH, до яких належить i збудник хвороби AyecKi, мають здатщсть розмножуватись i персистувати в макрофагах, Л1мфо-*итах, нервових клшшах, нepiдкo в штегрованому сташ. В цей iac вони не шддаються впливу ¡мунно! система оргашзму. Водно-iac repnecBipycn негативно впливають на функщю ¡мунокомпе-гентних кл!тин, посилюючи ¡мунопатолопю, реакщю пперчут-

ливост! (Котов В. та ш., 1973; Конопатин О., 1984; Коломи-цев О та ш 1991). Все це свЦчить про те, що персистенцш збуд-ника хвороби AyecKi в ¡мунному opraHisMi тварин е бюлопчною властив1стю яка поеднуеться з недостатшстю iMynHOi системи, зумовлено'1 Ярусом, а також еколопчними умовами утримування

тварин. . _

У зв'язку Î3 зазначеним, концепцш Ооротьои з хворииию Ki ели будувати з урахуванням особливостей ïï nepeöiry, бюло-ri4Hoï характеристики збудника та ¡муногенезу.

При конструюванш вакцин доцшьною вважаеться технолопя, яка забезпечуе виготовлення бюпрепарату, спроможного викли-кати сильну В1русспеци4»чну вадповщь Т-клтш, шдвищувати pi-вень cTifiKOCTi тварин, знижувати видшення Bipycy, запо-б!гати розвитку латентное^, створювати активний захист молодняка з колостральним ¡муштетом (Sem. Commun Progr Coord.

Agr Res. Brussels, 5—6 july, 1988; Stellman C. et al., 1989 и др.) Головною умовою yenixy в1дм1ченого е створення прогресивно1 технолог^ культивування, очищения, концентрування та шакти-ваца Bipycy хвороби AyecKi. Р1шення цих завдань можливе лише на основ! сучасних шдход1в, розроблених у бютехнелогц виготовлення 6ionpenapaTiB з використанням прогресивних технолопчних кл1тинних систем. В той же час впровадження юптинних систем неможливе без методичного забезпечення належних умов i'x на-

копичення та збереження.

Сучасна технолопя виготовлення 6ionpenapaTÎB ticho повязана з прогресом культивування юптин (Welke G., 1984; Cniep P. та ¡н., 1989). У зв'язку з дим дощльною вважалась розробка нау-кових основ технологи культивування Bipycy i виробництва ви-сокоактивно'1 вакцини проти хвороби AyecKi. Все це визначило тему дисертащйно!' роботи.

Мета роботи. Основною метою наших дослижень була розробка шактивовано!' вакцини проти хвороби AyecKi, BiÄMiTHo'i за ¡муногенною актившетю, та технологи виготовлення ïï на ochobi великомасштабного суспензШного культивування клшш i Bipycy. Завдання дослщжень. Для досягнення зазначено! мети необ-

xiflHo було розв'язати таю завдання:' _ ,

— випробувати, дати оцшку продуктивное^ в залежност1 вщ

cnocoöiB вирощування та визначити перспективну кл1тинну систему для культивування Bipycy хвороби AyecKi;

-розробнти-систему-збереження-в7умовах_крюбанку_1_цито-

лопчного контролю HKOCTi тваринних клггин, що використовуються в бютехнологи;

— розробити техиолопю великомасштабного суспензшного куль-

тивування Bipycy хворобтпАуескц 7

— вивчити репродуктивщ властивост! виробничого штаму Bipycy хвороби AyecKi в умовах суспензшно'1 технологи напрацюван-

ня його бюмаси;

— розробити експрес-методи контролю специф1чност1 i актив-

ност1 в!русвм1щуючого матер1алу в процес! виробництва нашв-фабрикат1в вакцини проти хвороби Ауесш;

— визначити теоретичн; 1 практичн1 основи застосування за-соб!в очищения, концентрування й ¡нактивацЦ' в1русу хвороби Ауесш;

— розробити емульсшну {нактивовану концентратвакцину проти хвороби Ауесш, провести лабораторне та виробниче а випро-бування;

— розробити метод шльшсного контролю ¡муногенност} вакцини проти хвороби Ауесш;

— визначити технолопчну 1 економ1чну ефектившсть промис-лового виробництва шактивованоТ вакцини проти хвороби Ауесш на основ! перещеплюваних юптинних систем;

— розробити [ видати регламент технолог^' промислового ви-готовлення емульсшно\' шактивовано! концентратвакцини проти хвороби Ауесш.

Теоретична 1 практична цшшсть дослщження та його наукова новизна. Теоретично обгрунтованк

— основш параметри технолоичних процеав виготовлення ¡нактивованоТ концентратвакцини проти хвороби Ауесш ¡з засто-суванням економ1чно ефективно!', технолопчноТ лшК перещеплюваних юитин при великомасштабному суспензШному культиву-ванш в!русу;

— концепщя застосування засоб1в очищения, концентрування, шактивацп в1русу 1 використання масляних ад'ювант1в;

— ветеринарно-саштарн1 вимоги 1 методи оцшки {муногенноГ активност! вакцини.

Теоретичн1 положения стверджещ експериментальними даними в лабораториях 1 виробничих умовах, результатами комюйних ви-пробувань [ розрахунками економ1чноГ ефективностГ

За результатами теоретичного 1 експериментального обгрун-тування розроблено нову емульайну ¡нактивовану концентратвакцину проти хвороби Ауеск1 на основ1 великомасштабного суспен-зшного культивування клтш ! в1'русу.

Вперше з позитивним результатом вакцина випробувана на свинях 1 верблюдах, вщповщно, в господарствах УкрзТни 1 Туркмена у перюд гострого спалаху хвороби Ауесш.

Вперше розроблена 1 випробувана в виробничих умовах тех-нолопя виготовлення вакцини, яка забезпечуе великомасштабне культивування в!русу хвороби Ауесш в суспензшнш культур1 клЬ тин ВНК-21/2-17, його очистку, концентрування за допомогою сорбцп аеросилом у присутноеп ПЕГ, шактиващю препаратами азиридинового ряду протягом 24 годин, а також застосування масляних ад'ювагтв.

Запропоноваш способы отримання д!агностичних сироваток кров! до в1русу хвороби Ауесш на морських свинках 1 кролях, визначення спецнф1чност1 1 активное^ в!русу хвороби Ауесш при виготовлещц нашвфабрикат1в вакцини за допомогою 1ФА, МФЗ

I РЗК; кшьк1сний метод визначення ¡муногенноГ активное^ вак-цини (1мД5о); споа'б адаптаци клшгн до нових умов культпву-вання, використання мовосинтезованих крюпротектор!в у середо-виЩ1 для кртконсервування клтш 1 способ обробки крюконсер-вованих кл1тин. Новизна розробок шдтверджена авторськими свЬ доцтвами 1 патентами: № 933703 (1982 р.), № 1089090 !(1984 р.), № 1110168 (1984 р.), № '1192762 (1985 р.), Л% 1448627 1(1988 р.), № 2036660 1 № 2044548 (1995 р.).

Р1вень реал1зац11 та впровадження результатов досл1Дження. Основн1 результати дослщжень узагальнен1 у так! пропозяцп для впровадження та використання ветеринарною медициною 1 нау-ковою практикою:

— Тимчасова ¡нструкщя по виготовленню та контролю емуль-сшно! шактивовано!' концентрованоУ вакцини ВНДЯ1—УНД1ЕВ проти хвороби Ауесю. Затверджена ГУВ МСГ Украши 28 ач-ня 1992 року.

— Техшчн1 умови на емульешну шактивовану концентровану вакцину ВНДЯ1—УНД1ЕВ проти хвороби Ауескь Затверджеш ГУВ МОГ Украши 28 С1чня 1992 року.

— Тимчасова настанова по застосуванню емульешно! ¡накти-вовано! концентровано? вакцини ВНДЯ1—УНД1ЕВ проти хвороби Ауескк Затверджена 28 ачня 1992 року, № 15-9.1/5.

Постшно ддача нормативно-техшчна документащя затверджена ГУВМ МСГП 'Украши 15 листопада 1995 року 1 прийнята .у виробництво вакцини з 1 ачня 1996 року, а саме:

— 1нструкщя по виготовленню 1 контролю емульешно: ¡нак-тивовано! концентратвакцини проти хвороби Ауесю.

— Техшчш умови (ТУУ 046.15.090-95) на емульпйну шакти-вовану концентратвакцину проти хвороби Ауескь

— Настанова по застосуванню емульешно}' ¡нактивованоТ концентратвакцини проти хвороби Ауесю.

Фрагмент дослщжень щодо використання перещеплюваних кл1тин СНЕВ, адаптованих до нових умов культивування, \ ви-робництва в1русноТ бюмаси на основ! цих клшш занесено до нор-мативно-техшчно] документацЦ' на рщку культуральну шактиво-вану вакцину УНД1ЕВ проти хвороби Ауесю свиней, овець \ хут-рових зв1р1в, затверджено! ГУВ при державнШ комки Радм'ну ОР.СР по продовольству 1 закушвл1 12 липня 1990 року.

Розроблет 1 запропоноват:

^^Мегодичгп'фекомендац!!—по-одержуцанню.^лсультнвуваннк: 1 використанню культур клшш 1 тканин тварин.

— Методичщ рекомендацц по консервуванню клшшних культур 1 тканин в умовах низькотемпературних баншв

Метод нчш рекомендацц розглянуп 1 зато ерджен¡—нченою-Ра^ дою 1ЕКВМ УААН, протокол № 26 вЦ 7 грудня 1990 року, ви-користовуються в повсякденнШ робот! вЦдшу в1русних ¡нфекщй ШКВМ 1 в зональних науково-виробничих ветеринарних лабора. тор!ях, . .

Апробащя та публшащя результатов наукових дослужены Ос-

новш результати досл^жень були представлен! ! обговорен! на VI з"!зд! мжробюлопчного товариства (Донецьк, 1984), науково-виробнич!й республ!канськ!й конференцп «Шдвищення ефектив-ност1 ветеринарного забезпечення промислового свинарства» (Ки-Тв, 1987), трет!й Всесоюзн!й конференцп «Науков! основи промислового виробництва ветеринарних б!олог!чних препара^в» (Москва, 1987), Всесоюзна! науково-техшчшй конференца «Застосуван-ня бютехнологп в тваринництв!, рослинництв! ! ветеринаршй медицин!» (Лешнград, 1988), республ!канськ!н наукови"! конференцп «Стан ! перспективи розвитку бютехнолоп!' в тваринництв!» (Хар-К1в, 1988), республ!канськ!й конференц!! «Ветеринарна медицина: сощальн! ! економ!чн! проблеми» (Харшв, 1990), науково-вироб-нич!й конференцп «Нов! методи селекцп ! бютехнологп в тваринництв!» (Кшв, 1991), Всесоюзнш науков1й конференцп, присвя-чешй 140-р!ччю Харк!вського зооветеринарного ¡нституту ¡м. М. М. Борисенка (Харк!в, 1991), науков!й конференц!!' ВНД1ВВ!М кСправи ветерннарно! в!русологи, мжробюлоги ! етзоотологп» (Покров, 1992), IV М!ждержавщй конференц!! «Науков! ! при-кладш проблеми паразитоценологи» (Ки1в— Харюв — Луганськ, 1993), Всерос!йськ!й науково-практичшй конференцп «В!русн! хво-эоби с1'льськогосподарських тварин» (Владимир, 1995), Млжна-родн!й науков!й конференц!'! «Загальна еп!зоотолог!я: ¡мунолопч-1И, еколог!чн! ! методолопчн! проблеми» (Харк!в, 1995), заеданиях ! звшшх сеаях вчених Рад 1ЕК.ВМ УААН (Харк!в, 1980— 1995 рр.) ! ВНД13Т (Владимир, 1990—1995 рр.).

Технолопчш аспекта, зокрема по вппробуванню запропоновано!" технологи виготовлення емульайно! шактивовано! концентрат-вакцини проти хворобн Ауесш та ¡муногенних властивостей дослш-ио-промислових сер!й вакцини зпдно з наказом N2 3 ГУВ МСГ Украпш в1д 28 ачня 1992 року пройшли ком1сшн! перев!рки, вщ-товщно, на бюшдприемств! «Юр'Гвецьветбшпрепарат» ! на свино-тогол!в'1 в господарствах Украши, автономно! Республши Крим, Росшсько! Федерац!!', на норках ! песцях у Рос!йськ!й Федерацп [ одногорбих верблюдах у Туркменп.

Д'1атер!али по телп дисертацЦ опублшован! в 39 статтях ! по-в!домленнях, серед яких 27 в центральних виданнях, 7 винахо-дах, 2 рекомендащях ! 3 — матер!алах конференц!й.

Структура та обсяг дисертацшноТ роботи. Дисертац!я вклю-1ае вступ, матер!али ! методи дослщження, 2 розд!ли, як! вм1-дують л^ературш дан!, особистий ексиериментальний матер!ал, юго обговорення 1 висновки, узагальнене обговорення експери-иентальних досл!джень, висновки, список Л1тератури з 658 дже-эел, серед яких 345 заруб!жних автор!в, ! додатки.

Обсяг дисертацп — 487 стор!нок машинописного тексту. Тек-;туальна частина викладена на 286 сторшках, ¿люстрована 67 таб-тицями ! 9 рисунками.

В додатках на 119 сторшках наведен! документа, яш шдтверд-

кують результат», наукову новизну ■ практичи, значущШь осу розробку „ауко.их^та-

™ ,„п «иносяться на захист. Основна методична 1 експеримен Гал'ьГ робота шшо!Ганаса м ост1 й н о. Частина результат» отри-мана в ВНД13Т в сшвавторсгв! з науковим консультантом, доктором ветеринарних наук, професором ищ^и. й. ^ засоСНв контролю специф1чност1 в1русних напшфабрнкатш вакци-II-РЗК 1ФА способ!в одержування специфшних сироваток кро^ до в!русу хвороби Ауеск!, випробування дослщно. вакцини на свинях хутрових зв1Рях в государствах РФ 1 верблюдах в Туркмена), кандидатом ветеринарних наук Дуднжовим А . роз-ппбка ыльшсного методу контролю ¡муногенност! вакцини 1 за ^осування масляних а&вантГв), доктором ветеринарних наук Конаржевським К 6. I кандидатом ветеринарних наук Цимба-лом О М (вивчення репродуктивное активности в.русу хвороби Ауеси на культур! перещеплюваних клггин С'НЬВ).

На захист виносяться сл1дуюч1 положения:

- методичн! шдходи застосування ыитинних систем в технологи промислового виготовлення шактивованих вакцин проти хво-

РОб1Ат^еорэтичне 1 експериментальне обгрунтування основних тех-нолопчних процеав культивування, очистки, концентрування 1

¡нактявовано! ксшц^т-

випробування емуль-

С1ЙН01 Шактивовано! концентратвакцини проти хвороби Ауеск!,

- технолоична 1 економ1чна ефектившсть промислового вн-робництва шактивовано! вакцини проти хвороби Ауеск! на осно-в1 перещеплюваних клшшшх систем.

ВЛАСН1 ДОСЛ1ДЖЕННЯ

Матер^али 1 методи доЫджень

1 розробки шактивовано! вакцини використовувалп ш-р р - ■ альськогосподарських тварин В1-

В процес!

пулентний для лабораториях i альськогоснодар^ил рус хвороби AyecKi, штам УНДШВ-18 «в»,

^„^".„..^...niTuuV.HER-J^IiiceiiKo I. ГкЦимбал О. М., 1984).

теплюваних-кл1тин-СНЕВ-,(Ллсепко_1._1Ь^и^'^л и. т., ^ -

УнфекцШна актившсть л!офшзо™ ^

Т11П^/см3, летальна—6,5 lg ЛКДбо/см . „■„,„„„,,,

В рус культивували на первинних! перещеплюваних кл!тинних

системах. l^mn^

модифГкованим Youngner J. (1954) методом Dulbecco R i Vogt R. 1954) Вихщним матер1алом для трипсшшацп були легещ i нир-к и плодД в вел и ко i рогато! худоби, свиней, кролш, ембрюни курен та шдиюв i Ix хорюналантснст оболонки.

3 перещеплйваннх клЬин досл{джещ СНЕВ, НО-2, НТ, RK-13, ГК, RS-88, НПК-666/17 i BHK-21/2J17.

Культур» первинних i перещеплюваних клшш вирощували на живильних середовищах N 199, 1гла, 0,25—0,5% ферментативного м'язового пдрол1зату, 0,5—5% пдрол1зату 61лк1в KpoBi, 0,5% пдрол1зату лактальбумшу.

Моношарово-суспензшш клони перещеплюваних клшш культи-вували в живильних середовищах за прописом ВНД13Т, яш ство-рювались на ochobi 1гла або пдрол1затних середовищ з кори-гуванням амшокислот i в1тамшв.

Субкультивоващ та перещеплюваШ клшши шдтримували шляхом сер1Йних nepecißiB i крюконсервування. Крюзахисн: середо-вища готували на ocnoBi живильних середовищ, на яких вони ви-рощувались, з додаванням до ix складу крюпротектор1в. 3 идею метою дослшжещ ДМСО, гл1церин, ПЕО-400 i новосинтезоваш в ГПК1К HAH Украши оксиетильоваш глщерин (ОЕГ) i ацетам1д (ОЕА).

Повноцшшсть кл1тинно1 популяци при культивуванш, а та-кож теля довгочасного збереження визначали за допомогою фар-бування трипановим сишм. Диттездатшсть кл1тин оцшювали за прол1феративиою актившетю i р1внем м^отичного шдексу.

Репродуктивну здатшеть кл1тин визначали за р1внем приросту ix бюмаси на заЫвшй плошд культурально! посудини i за тер-мшами формування моношару або в певному oö'eMj живильного середовища. Мгготичну актившеть оцшювали за числом клшш, ЯК1 знаходяться на стадЦ деления, вспоено загалыкп К1Лькост1 эбрахованих (з розрахунку на 1000 клшш) i виражених у промилле (%о), а число патолопчних MiT03iB—у вщеотках (Алов I., 1972).

Одночасно життезд1тшсть охолоджуваних кл1тин оцшювали за актившетю сукщнатдепдрогенази (Nachlas М., 1957).

В1рулентшсть виробничого штаму УНД1ЕВ-18 «вс» Bipycy хво- " эоби AyecKi i 1муногенн1сть вакцини внвчали на лабораторних i ¡пльськогосподарських тваринах. У досадах використано 240 мор-ських свинок масою 300—400 г, 120 крол!в масою 1,8—2 кг, 72 норки 6—7-м1сячного в1ку, 30 овець 2—4-Л1тнього вшу, 90 шд-:виншв масою 30—45 кг i 49 mniB велико! рогато! худоби.

В!русвм1щуючу культуральну суспензда очищали за допомогою фиродно! седиментацп i центрифугування. Bipyc концентрували :орбщею на пдроксид1 алюмиию i аеросши, осадженням ПЕГ-115, i також за методом ультрафктьтрацп.

Одержаннй концентрат Bipycy ¡нактивували формалшом, амЬ юетилешмшом i брометилешмшом при 2-х температуриих режимах (26 i 37 °С).

Контроль стерильности, специф1чносп i залишковоТ в1рулент-iocTi натвфабрикат!в; стерильиост1 вакцини здШ'снювали по за-?ершенШ кожного технолопчного циклу виавами на МПБ, МПА, п'оглжольове середовище, середовище Сабуро. Гнокулящя Bipyc-

вмЫуючим матер1алом клггинних культур ВНК-21/2-17, СНЕВ, СН [ заражения крол1в (3—5 т/ив на пробу) дозволяли судити про наявшсть залишково! в1рулентност1 або повно! шактивацп в1-

Специф1чшсть одержуваних нашвфабрикатш вакцини визна-чали за допомогою РЗК, 1ФА 1 МФЗ.

Нешкщливкть 1 ав1рулентшсть вакципн контролювали внут-ршньом'язовим введениям 5 кролям (на кожний зразок або серю вакцини) 1 см3 вакцини з подалыиим наглядом за тваринами протягом 10 д!б.

1муногеншсть вакцини вивчали юльюсним методом, випробо-вуючи захисш властивост! нерозбавленого бюпрепарату 1 в роз-веденнях 1 : 10 1 1 : 100 з визначенням 1мД50 (п'ятидесятипроцент-нрХ ¡мушзуючо! дози вакцини) при контрольному зараженш в1ру-лентним в1русом хвороби Ауеск! тварин через 21 день теля !! щеплення. 1мД5о розраховували за формулою:

де, ^ О—логарифм максимально! дози, — логарифм крат-ност! розбавлення, 21 — шльюсть захищених тварин, N — шль-юсть тварин у дослщах на кожне розведення вакцини. За таблицею антилогарифм!в визначали отриман1 показники 1мДзо-

СуслензШне кулътпвуваяяя клшш } в!русу здшенювали в скля-них культиваторах К'С-6,5; КС-36; КС-50-60 (конструкщя ВНД13Т), а також у металевих культиваторах КМ-250, КМ-630, КМ-1000-2000, оснащених нашвавтоматичною системою контролю I регулю-вання процеав культивування.

Охолодження 1 заморожування клЬин проводили за допомогою апарату програмного заморожування бюлопчних об'ект1В, розроб-леного \ виготовленого в 1ПКдК НА'Н Украши.

Статистичну обробку даних експериментальних дослщжень проводили за методом вар1ащйного знаку дослщжуваних тканин (у нашому випадку числа кл1тин, одержаних з тканини оргашв за допомогою трипсишзацп, або кшькост; клш-ш при зшманн1 1 пе-реавах перещеплюваних кл!тин), керуючись елемеитами матема-тичного анал!зу (Меркур'ев 6., 1964). Квадратнчщ вщхилення 1 середне арифметичне вираховували для ус1е'1 сукупност1 постав-лених дослццв. За таблицею Стьюдента знаходили р1вень 1мов1р-

НОСТ1 (р).

Вивчаючипнфскц!й!;у-актив1исть-в!русу-;-)'.муиогс1ппсть__вакцН; ни, отримаш результати шддавали статистичшй обробЩ за методом Кербера у модифжацп Ашмарша I (1962).

РЕЗУЛЬТАТИ Д0СЛ1ДЖЕНБ

Вивчення продуктивних властивостей кл'иинних систем,

використовуваних для культивування Bipycy хвороби Ауесю

Досл1Дження i оцшка продуктивное^ кл1тинних систем мають суттеве значения, осшльки кл1тини являють собою головну ланку бютехнолопчного иродесу виготовлення бюпрепарат1в. Р1знома-HiTHicTb засоб1в одержування i культивування створюе сприйнят-лив1 умови для 1х використання.

Анал1зуючи накопичений досв1д вирощування юитинно! бюма-си i Bipycy хвороби AyecKi, ми прийшли до висновку, що жодна ¡з запроваджених у наций Kpaini технологш цього виробництва не вщповщае св!товому технолопчному р1вню.

Наведет нами дат характеризують дв1 клггинщ системи, най-б1льш nornnpeni у теперштй час в практичиш в1русологп й бю-технологй'. Вони стосуються, перш за все, ощнки продуктивное^ первинно трипсишзованих i перещеплюваних кл1тин.

В результат! пор1вняльного вивчення цих систем встановлена залежшеть накопичення ix бюмаси вщ способу культивування i BHxiflHoi" концентрацп. При статичному вирощуванн1 3i зСНльшен-ням 1щльносп вис1ву вщ 105 до 6—8Х105/см3 i вище, скорочува-лись термши формування моношару з 5—6 до 2—3 д\б. Але при-picT клшшно! бюмаси зменшувався не Т1льки за рахунок шдви-щення концентрат!, а також внасл^док пригтчення ix функцю-нально! життездатност1 продуктами метаболизму, що накопичува-лись навколо хштин.

Ролерне культивування сприяло б1льш ефективному виробни-цтву клтшно! бюмаси, у пор1внянн1 з вирощуванням у матрасах, первинних кл1тин у 1,3 рази i перещеплюваних — у 1,5 рази з роз-рахунку на одиницю об'ему живильного середовища. В той же час, як свичать даш, перещеплюваш клшши мали перевагу перед первинними за приростом ix бюмаси. 1з зб1лыпенням коефь щента сшввщношення заавпо! nosepxHi до об'ему живильного середовища (Ks/v) шдвищувалась економ1чшсть культивування кл1тин. В ролерних бутлях емшетю Зл Ks/v досягав 2 см2/см3, про-ге при ix використашН значно зростала трудоемкють технолопч-иого процесу. До того ж, за даннми В. П. Панкратова (1983), эптимальна утшпзащя живильних речовин середовища в ролерних посудинах досягаеться при Ks/v = 4 см2/см3.

НайбНлын оптимальщ умови накопичення юитинноТ бюмаси забезпечувало суспеизшне культивування перещеплюваних клтш RS-88, НПК-666/17 i ВНК-21/2-17, шдекс прешферацн яких при зирощуванщ в суспендованому стащ досягав 4,8—5,2. Продуктив-ia життед1яльшсть_суспензшних клошв також залежала В1Д складу живильного середовища, до якого вони були адаптоваш, i ви-вдно! концентрат!. Щшьшсть ,внс1ву клтш у межах 0,45—0,57 или/см3 сприяла розмноженшо i не менш як 4-разовому приросту

Характеристика виробничоГ лшн культури кл!тин ВНК-21 /2-17

Таблиця 1

Показчики

Одиниця вимфу

Допустим! параметри

Концентраш! клггин у

розмороженш ампул!

Час формува

ння моношару

ЭДнцева кон дентращя

КС

!ндекс прол1 Час гснерац Лереживанн лри наявнос

•36, КМ-250—КМ-2000 jiepauiï Ï

i при збе;)еженщ в умовах 4—6 "С

п ж ив их

вирощених кл1тин у моно-

шаровш Kyj bTypi на (1 пасаж! теля поновлення

Кшьшсть КЛ1ТИН при суспензШному культивуван-т\ в КС-6

млн/см3 годин

тис/см2 млн/см3 1,8—2,3

1.8—2,5 млн

КЛ1ГИН

10—40 36—48

400—600 % жнвих

90—95

91—95

не мепше 5,0 23—25 годин не менше 7 д1б 90—95%

IX бюмаси'в середовищ1 з концентращею водневих юшв у межах 7,0—7,2, парщальному тиску 75—100 мм рт. ст. Перемшування суспензц клшш в реактор1 з швидкютю 45—50 об/хв 1 шногасшня за допомогою 1 % водного розчину шертного синтетичного препарату СЕ-6 (0,3 см3/л) запоб1гали утворенню конгломерат1в I трав-матичшй загибел1 вирощуваних клкин на гран! газ—середовище при барботуванш пов^рям.

Зазначен! параметри суспензшного культивування сприяли от-риманню стаб!лъних результат вирощування 1 накопичення бю-масн з кшцевою концентращею до 2,5 млн кл1тин/см3 живиль-ного середовища за 48—72 годнни, дозволяли регулювати специ-ф1чн; функцп клшга, шдтримуючи Гх у стащ постшноТ прол1фе-рацп, коли клшши мали найбшыи високий р1вень синтезу специ-ф!чного продукту при вирощуванш в1русу.

Суспензшна культура перещеплюваних клтш ВНК-21/2-17 на вда-пну в1д НПК-ббб/17 1 1^-88 характеризувалась бьлын ста-бьчьними властивостями щодо термшв ! р1вня накопичення бю-маси та мономорфност1 клтш.

Експериментальне обгрунтування основних параметр1в техно-лопчного продесу накопичення кл1тинно! бшмаси визначило до-щ'льшсть проведения подальших дослщжень по вивченшо репро-дуктивних властивостей в1русу хвороби Ауеси та створенню шак-тивовано! вакцини на основ1 суспенз1йного клону перещеплюваних клтш ВНК-21/2-17 (таблиця 1).

Система збереження 1 цитолопчний контроль кл!тин, застосовуваних в бютехнологи*

Постшне використання кл1тинних систем у промислових умо-вах, коли шльюсть пасаж1в може бути безсистемним, особливо при культивуванш клтш способом в1дбирпння-доливання, потре-буе створення Гх виробничого резерву.

Апробоваш нами р!зщ засоби збереження первинних 1 перещеплюваних клпин за методом сершних переав1в, показали необ-Х1дш'сть ведения дублжат1в, що запоб^гало втрату щптин внасль док старшня, контамшащю або шин причини. Це досить трудо-мютка робота, економ1Чно недощльна.

Перетримка дублп\ат1в моношарових клтш при плюсових температурах (18—22 1 4—6°С) забезпечувала короткочасне збер!-гання Гх житт,ездатност1 (вщповцшо, 20—25 1 25—30 д1б). Замша середовища дозволяла збшьшитн термши збереження клтш на 10—15 д!б. У суспендованому стан! термш збер1гання на 5—10 д!б менший, причому, чим вища концентращя клтш в суспензи, тим скор}ше наступала Тх загибель.

Зниження температури збер^гаиня до 4—6 °С шдвищувало термш виживання клтш до 2 мкящв без замши живильного се-

*Робота виконана за науковими консультациями доктора ветеринарних наук професора, академта УААН Красикова Г- А.

редовища. Р1вень збережених клпин залежав в!д складу живиль-середовищ i концентраци водневих юшв. Зменшення об ему

них

сироватки кров; в живнльному середовищ, давало позитивнии ефект збер!гання юптин при кшнатнш температур! за рахунок зниження поживних речовин i, як наслиок Цього метабол чних процеав. В умовах понижено! температуря (4—6 С) це призво-

1П П10 1110 пояс-

ДИЛО ДО СКОрОЧеННМ icjJiviimD ......" '

нюеться негативним впливом температуря. У даному випадку сироватка кров! мала захисне значения як крюпротектор.

При концентраци водневих ¡ошв у межах 7,2—7,4 пятидесятипроцентна загибель кл1тин, що збер1гались в суспендованому ста-нГ при температур! 4-6 °С, наставала через 45-60 даб. При ниж-чих значениях концентраци водневих ютв (рМ = to,/—тер-мши зберкання життездатних клггин скорочувались до 25—dU дао.

Негативний вплив охолодження шдтверджено при вивченш ок-сидацшно-вшновлюваних процеав в клшшах. Охолодження одно-добово! культури перещеплюваних клпин протягом 24 годин ви-кликало зниження сукцшатдепдрогенази, одного з ^центральних фермент енергетичного обмшу, з р1внем якого зв язують жит-тездатшсть кл!тин (Нахлес М. М., 1957). Щ змши корелювали 13 зниженням до Ю°/о0 м^отичного ¡ндексу. Але вони мали зво-ротний характер, оскшьки при наступному культивуванш охолод-жуваних кл1тин поступово нормал1зувались. На 3 день культиву-вання при 37 °С при пстох1м1чному доыпдженн! фермент вияв-лявся у вигляда поодиноких гранул. М1тотичний шдекс досягав контрольного piBHH.

Таким чином, результата цих дослав свщчать про те, «о плюсов! температури не забезпечують тривалого збереження кл,тин-мх систем внасл!док неповного пригшчення метаболшних проце-ciB i тимчасового блокування життевого циклу кл1тин.

Кращ! результати по збереженню юитинних систем булл от-риман1 в умовах мшусових температур. Заморожування ,збережен" кл1тинних систем в умовах низьких температур залк» али в!д фЫолопчного стану кл!тин, !х концентраци, складу захисних середовищ, крюпротектор1в i !х концентраци, режимш охолодження i Б1д1гр1вання.

Що стосуеться функционального стану, то наикраии результати низкотемпературного консервування отриман, на культу

-рах кл!тин-в^ащшарн1й:фаз!,кл;тшп1ого никлу, у ^ L

найоптимальшша крюстшгасть при концентращП0-40 млн/см .

У пор1вняльних доыидженнях новосинтезованих крюпротекто-piB з ДМСО, ПЕО-400 i глщерином встановлено що вони в 5 о

концентраци проявляли виражений^озаи«яши-€фв1Я-(9Я-Я» А») ■ При цьоРму, як з'ясувалось, ОБГ i ОЕА мали меншу ™ксичн1Сть i на в1дм1ну в!д ДМСО, (ПЕО-400, глщерину не потребували ви-далення перед вис1вом деконсервораних клпин в культуральш по^ судини (таблиця 2), 12

Таблиця 1

Характеристика захисних властнвостей кр!опретоктор1в

Концентра-Кршпротектор %

Видалення крюпротек-тора BiA-миванням

PiBeiib поновле-

НИХ ЩНТИН. %

Формування моно шару на третю

добу, %

дмсо

Гл1церии ОЕГ

ЭЕА

10 10 3 5 10 15 3 5 10 15

+ +

+

92,0 ±1,5 91,5±1,5 72,5+3,5 96,0.+1,0 97.0±,1,5 94,5+1,5 78,5 ±2,5

99,0± 1,0 9810±1,9 85,0 ±1,0 99,0 ±1,0 98.0 ±'1,5 96,0±2,0 85,5 ±3,5 98,5+1,5 99,5±0,5 98,0+: 1,5

96,8 ±1,6

97,0 ±1,0 90,5 ±1,5

Приметка: -)- видалення крюпротектора вимиванням клтш 2—3-разовим

3 доотджених режим1в охолоджеиня з температурною зупин-сою i без не! при консервуванш як первинних, так i перещеплю-заних клЬин кращий ефект одержано при 2-стушнчатому способ!, з,е на першому еташ швидюсть понижения температуря складала 1—2°/хв до —25—30 °С, а на другому—10—,15°/хв. При досяг-[енн! температури —70 °С контейнери з клшшами переносили в л'дкий азот.

Застосування новосинтезованих крюпротектор1в дозволило :простити склад крюзахисних середовищ (А. с. 1192762), змен-иити у 2 рази витрати живильних середовищ i крюпротективних )ечовин при забезпеченщ високого р1вня збереження життездат-1их клтш.

Незважаючи на запропонован1 оптимальш режими заморожу-1ання i дефростаца, ефективний склад крюзахисного середови-ца, постшно спостер1гали зниження прол1феративноГ активност1 игконсервованих клтш. Мпотична актившсть клтш у культург асля в1д1гр1вання в nepmi 24 години росту значно менша в nopiB-iHHHi з контролем. В культурах клтш, заморожуваних шд за-систом глщернну i ДМСО, вона складала 5,0± 1,5%оД4(7±1,6%о, пдповщно, а ПЕО-400—3,7±1,0%о, в той час, як шд захистом [овосинтезованих кртпротектор1в, за винятком OEM, вона була 3—5 раз1в вищою i майже знаходилась на piBHi контролю.

Наслщком негативного впливу ироцеав заморожування-роз-юрожування було також порушення м1тотнчного циклу, що про-влялось зб1льшенням числа патолопчних форм д1лення кл^тин, Ki супроводжувались шдвищенням шлькост1 метафаз з розки-;аними i гшерсшрал1зованими хромосомами у вигляД1 К-штозш, пуллметафаз», mictkIb, а також три- i багатополюсних мшшв. 1,омшуючою формою MiT03iB був колхшцинопод1бний, так званий \-м1тоз. М1ж тим вважають, що (К-м1този i «пуллметафази» яв-

центрифугуванням.

ляють собою наслшок часткового блокування крюпротективнимй речовинами кл!тин на стада метафаз, осильки шсля деюлькох пасаж1в кл'ини, у процеа яких вони в!дмиваються вщ крюпро-тектора, сшвв!дношення фаз мдозу поновлюеться (Пушкарь М. С., Бшоус А. М.; 1984). На наш погляд, зниження ьптотичного шдек-су б1льше пов'язане з пошкоджуючою д1ею глибокого заморожу____________________ч.чл.шп т/т'тттн «я ллнпму !з етатв

вання, а виявлсна зтримли -----.,

IX мгготичного циклу була шчим ¡ншим, як природного регуля-щею прол1феративно1 активное^ клггин в результат! змши умов, тобто 1х адаптащею. Це шдтверджено поновленням м^отичного шдексу 1 кшьюстю патолопчних м1тоз1в у процеа 3-х посл1дую-чих перес1в1в п1сля розморожування.

Наведен! результати експеримент!в консервування клотин свщ-чать що збереження при +4-6 °С не впливало суттево на про-л!феративну активн!сть кл!тин, що мае практичне значения, ос-юльки дозволяе швидко поновлювати р!ст кл!тин, не удаючись до використання матрично! культури. Необх!дн1СТь збереження кл!тин при ц!й температур! обумовлена технолопчними процеса-ми де обов'язковою умовою е змша ростового середовища, яку здШснюють за методом вЦстою клп-инно! суспензи при цьому

температурному режим1.

Якщо при +4—6°С термш збереження кл1тин обмежувався

2 м!сяцями, то при м!нусов!й температур! вш досягав деюлькох ооив Протягом 5—10 ромв ми працювали з виробничими лшш-ми перещеплюваних кл!тин СНЕВ, ВНК-21/2-17 ! шшими, ям збер1гались у рщкому азот! при життездатност1 90—9Ь/0.

За допомогою цитолопчних досл!джень е можлившть контро-лювати як!сть використовуваних клтш за ргвнем пролхфератив-Г"ктиТност! ! па'толо/чних. м!тоз!в.

тивного р!вня патолопчних М1тоз1в у межах 11-зи/0 для пер винних культур кл!тин ! 5-15% для перещеплюваних необхщю

3 астосовуз ат из а хо ди щодо замши таких культур або впявляти ирцчини що негативно впливають на Тх фшолопчну функцда.

Конструювання та вивчення ¡муногенних властивостей емульсШно!' 1нактивовано1 концентратвакцини проти хвороби Ауесм*

-Адаптащя-1-вивчення-репродуктивних_властивостей виробни

чого штаму в1русу хвороби Ауеск!. При конструюванщ шактиво вано\ вакцини особливу увагу придшяли вивченпю шр^ентнос т! та ¡муногенност! культурального вфусу хвороби Ауесм, осиль ки вщомо, що змша сицтемгтгепредукц^еже^егативко-вшш: нути на щ властивост!.

»Робота виконана за науковими консультации доктора ветеринарних наук професора, академжа УААН Бусола В. О-

14

При розробщ технологи промислойого культивування ш'русу хвороби Ауеск1 проведено пор^вняльне внвчення властивостей в1-зусу хвороби Ауес1а на 2 кл1тинних системах: первинно трипси-пзованих 1 перещеплюваних з урахуванням способу вирощуван-1я 1 застосування.

Одержат матер1али свщчать, що репродукция його залежа-1а вщ багатьох фактор1в, серед яких перш за все ели вщзна-шти пристосовувашсть. Остановлено, що з шдвшценням р1вня 1асаж1з в1русу на клггинах скорочувалнсь термши репродукци I 60—72 до 15—36 годин. Стабшзащя ЦПД в клтшах насту-гала на 4—6 пасажь 3 посиленням адаптацп в1русу до нових :л1тинних систем шдвищувався титр шфекщйност1 до 5,96+0,29— -■8,75±0,05 ^ ТЦДбо/см3 (в залежност1 вщ чутливост1 клтга).

Характер ЦПД в1русу на дослщжуваних моношарових куль-урах первинних (ФЕК, СН, НПК, НК) 1 перещеплюваних (СНЕВ, 1Т, НО-2, ГК, 1Ж-13) не в1др1знявся. Разом з тим4 у моношаро-их культурах, як! включали два типи клшш, цитопатичн! змши початку виявлялись серед епггел1альних клтш, а пот1м уража-ись 1 ф1бропласти.

Швидюсть репродукци 1 урожай в1русу залежали вЦ чутли-ост1 клтш, способу 1х культивування 1 множинност1 заражен-я. 3 шдвшценням множинност1 заражения з 0,01 до 10 ЦПД50/ Л1тину скорочувалнсь термши розвитку ЦПД, але множиншеть араження не вщбивалась на шфекщйноеп в1русу хвороби Ауеск1 культура Найб1льш висою показники репродуктивноУ активное^ ¡русу виявлено в клшшах первинних культур ФЕК. (7,15+0,11 ?ТЦД50/см3), СН (7,85±0,05 Ы ТЦД5о/см3), НК (7,68+0,15 ЦД5о/см3), серед перещеплюваних — СНЕВ (7,60+0,05 ЦДзо/см3), ГК (8,15+0,25 ^ ТЦД50/см3), ИК-ГЗ (7,91+0,30 ^

ЦД50/см3).

На первинних \ перещеплюваних клггинах жуйних (НПК, НТ, Ю-2) репродуктивна актившеть в1русу хвороби Ауеск1 знаходи-ась в межах 5—6 ^ ТЦД50/см3, що поясшоеться нижчою чут-ивютю 1 невисоким р1внем адаптоваиост1 в1русу.

Слщ в1дзначити, що культуральний в1рус хвороби Ауеск1 збе-¡гав в1рулентшсть для морських свинок 1 крол1в.

При адаптацИ в1русу хвороби Ауеск1 до нових умов культи-ування на перещеплюваних клшшах 1^-88, НПК.-'666/17 1 ВНК-1/2-17 виявлена така ж Ч1тка законолпртсть розвитку цитопа-ичних змш, яка спостер1галась в моношарових культурах, але пециф!чна деструкшя клшш наступала на 10—12 годин шзш-[е. Це поясшоеться, перш за все, мехашзмами репродукци в1-усу. В моношарових культурах шеля адсорбцп в1русу шфекщя озвивалась х поширювалась—контактним шляхом з клкини на л1тину, що шдтверджувалось виявленням локальних делянок пециф1чного ураження клтш 1 1х поширенням, 1 через середо-ище. СуспензШне культивування взбивалось на термшах ад-

сорбцц бфусу,.яка стримувалась й результат! переы!шування кл!-тин, доки не наставало р^вногшрне поширення в1русу в середо-вищ1, тобто ¡нфекщя поширювалась ильки через середовище.

. Оптимальн1 результата накопичення в1русу хвороби Аует в суспензшних культурах спостер1гались при множинност1 заражения 0,5—1 ТЦДбо/клггину 1 концентраци кл1тин 1,8—2,6 млн/ см3 —1?5-88—8,00±0,0б 1й ТЦД50/см3; НПК-666/17—8,75±0,00 ^ ТЦД?0/см3 1 ВНК-21/2-17—8,75+0,15 ТЦД50/см3 (таблиця 3).

Кллыисть в1руссиециф1чного б!лка шдвищувалась по м1р1 адаптацн в1русу до кл1тин ВНК-21/2-17 з 18,90+0,06 до 20,0± ±0,36 мкг/см3, НПК-666/17 з 18,40+0,06 до 23,0±0,09 мгк/см3, К5-88 з 17,40±0,09 до 18,40+0,05 мкг/см3. Проте не виявлено ч1тко! законом1рно! залежност1 м1ж шльыстю в!русспециф1чного бтлка 1 титрами ¡нфекцшност! в!русу в клггинних культурах.

Важливим фактором активное™ репродукш! в1русу хвороби Ауеск1 в суспензшних культурах був склад середовища 1 концентрация водневих юшв. При суспензшному культиву-ванн1 кл!тин обов'язкова наявшсть сироватки кров! велико!' рогато! худоби, яка мютить необх1дн1 для росту клтш пожив1И речовини. При' культивуваши в]'русу хвороби Ауесю' сироватка кров1 в 10% концентраци в середовишл пригн1чувала його репрО' дукщю на 1 — 1,5 ТЦДбо/см3. Шдтитруванням и кшькосп в сёредовишД встановлено оптимальний об'ем (5%), який не вплп вав негативно на репродукщю 1 накопичення бюмаси в1русу.

Таблица с

Показники репродуктивноТ активносг) трусу хвороби Ауесю' при суспензшному культивуванш

о >>

СО о.

с «

Культура клшш

1

3 6 1 3 6 1 3 6

ВНК-21/2-17

НПК-666/17

КБ-88

Доза заражения, ТЦДго/ кл1тииу ТермШи репраду-кцп, год. Титр ¡нфекщй- , НОСТ1, ¿¿ТЦД5!>/ем3 ■Вмют в1-русного бшка, мкг/см3

1,0 60 8,33 ±0,19 18,90 ±0,04

60 8,66±0,08 18,40 ±0,06

48 8,75 ±0,01 20,00±0,36

1,0 54 8,50±0,00 18,40 ±0,06

52 8,50 ±0,15 18,32+0,08

52 8,75±0.Ю 23 00 ±0,09

1,0 50 7,90 ±0,10 17,40 ±0,09

48 8,05±0,15 17,25±0,П

48 8,Ш±0,01 18,40±0,05

Найб1льш оптимальн! умови репродукци в1русу в суспензш них культурах перещеплюваних клшш забезпечувало середови

з кпнпрнтрящею водневих юшв 7,0—7,2. В слабокислш зон (рН=6,8—7,0) на 5—6 годин скорочувались термтац-репродук ци в1русу.

При перев1рщ властивостей репродукованого на ¡штинах > суспендованому стаЩ в1русу встановлено, що вш збер1гав в1ру 16

лентшсть для тварин. Титр в!русу в дослщах на морських свинках складав 3,15±0,15 ^ ЛД50/см3, кролях— 8,75±0,25 ЛКД50/ см3, в1вцях — 4,75 ±0,15 Л'Д5о/см3.

Таким чином, штам УНДШВ-18 «вс» в1русу хвороби Ауесш, адаптований до культивування в культур! суспендованих кл^тин, за властивостями в!дпов1'дае вимогам щодо в1рулентност1 вироб-ничих штам1в, як\ повинш мати ¡нфекщйшсть не нижче 7 ТЦД50/см3, що, за даними Хараламб!ева X. (1968), Мауг А. ег а1. (1988), Конаржевського К. €. (1992), гарантуе виготовлення високо1муногенно1 вакцини (табилця 4).

Таблиця 4

Характеристика виробничого штаму УНД1ЕВ-18 «вс> вфусу хвороби Ауеск!

Показании

Одиниця вим!ру ^араметри

Оптимальна доза заражения Т1ДД5о/кл1тину 0,5—1,0

Час репродукци в моношаров1'й культур; суспен- годин 18—35

ЗИ"ШОГО «ЛОНУ КЛ1ТИН

Час репродукци в суспензи клйин годин 36—48

Эптимальне значения концентрацп водневих 10Н1в 7,0—7,2

Оптимальна температура репродукци вирусу °С 36,5—37,5

Гитр ¡нфекшйност1 теля репродукци в суспензи ТЦДго/см3 7,15—7,75 <лшш з койцентрашею 1,8—2,5 млн/см3

Очистка 1 концентрування в'фусу хвороби Ауескь Шсля В1Д-працювання системи культивування 1 накопичення б1омаси в1ру-;у хвороби Ауеск!, досл^дження були направлен! на розробку «етод1В 1 засоб1в очистки, концентрування та шактивацц в1рус-тоГ суспензи. В результат! теоретичного 1 експериментального об-"руитування основних параметров цих процес!в встановлено, що зисокошвидюсне центрифугування на проточних ультрацентрифу-•ах з продуктившстю 250—300 л/год забезпечувало отримання трозороГ в!русвм!щуючо1 суспенз!!', не нижче як 84% по в1дно-иенню до прозорост! днстильованоГ води (стушнь очистки сонтролювали за допомогою фотоелектрокалориметра) проти 52—33% при седиментаци ! 44—45% при низькошвидшсному сентрифугуванн!. 3 шдвищенням ступеня очищения в1русно\° сус-генз11 в!д кл!тинного детриту зменшувалась шлыисть загального !!лка з 2200 до 375 мкг/см3 (за методом Лоур!).

Найбълыи ефективне концентрування В1русу хвороби Ауеск1 юсягалось" при використанн! 0,03% аеросилу в ком{5шаци з 8— 0% ПЕГ-115, що сприяло не тыьки збшьшенню виходу В1русу, |ле й прискорювало цей процес. Якщо за допомогою аеросилу отрШно було 48 годин для завершения повноТ сорбцп в!русу, то I присутносп ПЕГ цей процес завершувався за 24 години. Ком-1нац1я аеросилу з ПЕГ дозволила досягти найб!льш високоТ :онцентрацп' в!русу хвороби Ауеск! з мш!мальними втратами

П—129%) Це пояснюеться, по-перше, високою здатшстю аеро-силу адсорбувати в!рус (до 89,3% в!д вихщного проти. 32,4 А у Ндроксида алюмИпю) 1, по-друге, додатковим прискоренням осад-ження сорбованого в1русу за допомогою 11Ы -11Ь.

Висок! результати отриман! при концентруванн, вфусу за допомогою ультраф!льтрацп (100—200-раз1в), але^вона поступалась за продуктившстю перед зазначеним вище спосоиим. _

Вивчення режиму {нактиваци вирусу хвороби Ауеск!. При ви-готовленщ ново! вакцини вивчена шактивуюча дш препарапв азирщцшового ряду. Повиа шактивашя вфусу хвороб»¡Ауеск, за 6—14 годин досягалась за допомогою АЕЕ1 1 БЕ1 в 0,1Ь /о кон Центра™ при температур! 37°С. Зниження температурного режиму до 26 °С спов!льнювало процес ¡нактиващ! на 2-6 годин. ПриУ!нактивац!! азиридинами збер!галась антнгешк. актившсть в 1ФА ! РЗК в той час як при ¡нактиваци вфусу хвороби Ауеск, фопмальдег дом спостер!гали протягом 4-5 д!б залишкову }н-феЕ^сть ? зниження активност! антигену, що проявлялось ио-

го антикомплементарн!стю в РЗК. „„„„„:„ ;иаИТипппя-Виготовлення 1 лабораторш досл.дження зразк.в нактивова но, концентровано! вакцини проти хвороби Ауесш. Очищении, кон-вднтрованиТГв 50-60 раз!в, ¡нактивовапий азиридинами антигея вирусу хвороби Ауеск! зм!шували в р!вних об'емах э масляним ад'ювантом за прописом ВНД13Т. Виконана робота по експери-Ментальному обгрунтуванню застосування масляних ад'ювантш е продовженням досл!д^ень Дудшкова А. I. по виго=ипо про. тиящурних вакцин ! подальшого застосування за нашою участю, прГрозробц! вакцини проти хвороби Ауеск!. Як з'ясувалось пр вкготовленн! емульс!йних вакцин важливе значения мала форма одержуваного препарату, осильки в!д його стаб1Льност, залежала игаидюсть ¡муногенно! перебудови в орган.зм! щепленихцими вакцинами тварин. На приклад! протиящурних б10ПРепаР^^сятпа-новлено, що емульсШна вакцина типу «вода-масло» викликала розвиток б!льш напруженого ! тривал!шого ¡муштету, Н1Ж вакцина типу «масло—вода» (Дуднжов А. I., 1992). Масла, як, вхо-дять до складу емульсШно! шактивовано, концентратвакцини проти хвороби Ауеск!, мають низьку к!нематичну в язюсть (при 20 °с 13—18 мм2/с) Р1вень м1сцевих запалень при IX застосу-ванн! не перевшцував 30%. Температура застигання при -ЗЬ-60 °С сприяла застосуванню биопрепарату при мшусових темпе--ратурах-зовшшнього-середовища.-- ттт1п ..■—■,•-;

Спочатку були виготовлен! лабораторн! зразки емульсшно,, сопбованоЛнактивовано! концентровано! вакцини проти хвороб!

Ауеск? з Ырусу репродукованого на сусиензшних перещеплюва.

нихкаинах' ¿'¿б^Н^^ тяти 7тосл!дження !муногенних властивостеи 1 контролю якосп св[дч атьщодос л! джу в а ш зразки вакцини були стерильними ам-пуленгаишг Г нешюдливими. 1муногенн!сть емульсшних зразки Ьт^тивовано! концентровано! вакцин,, проти хвороби Ауеск, бу-

ла у 1,5—2,0 рази вищою, шж у сорбованих. Щ результати совпадали з даними дослщжень титру антитш у сироватШ кров1 крол!в 1 свиней, яш виявлялись уже в перил дн{ (6—7 доба) шсля вакцинацп 1 на 21-й день досягали 5—б лог2.

Дослужен! зразки емульсШно! 1 сорбовано! вакцини створю-вали напружений ¡муштет у щеплених ними тварин. 1мД50 емуль-сшних зразив вакцини на морських свинках, кролях 1 свинях складала 0,01 см3, що вщповщало 100 ПД50. У сорбованих зраз-ив вакцини при досл1дженн; на кролях 1 свинях 1мД50 дор!вню-вала 0,03—0,08 см3, ПД50—12,5 1мД50, але для морських свинок вона не в1др!знялась В1д 1мД50 емульайних зразив.

Поряд з цим, шд час лабораторного випробування встановлено, що зразки емульсшно!" ¡нактивованоТ концентрованоТ вакцини проти хвороби Ауеск!, яш були виготовлен1 з в1русу, репродуко-ваного на р1зних суспензшних кл1тинах (1?5-88, НПК-666/17 1 ВНК-21/2-17), за ¡муногенними властивостями не В1др1знялись м!ж собою, але перевищували з цих показнишв зразки сорбова-Н01 вакцини. Незалежно в1д цього, ус1 дослщжеш зразки вакцини М1стили в щеплювальному об'ем1 не менше 10 1мД5о, що забезпе-чувало формування в ор_гашзм1 щеплених щею вакциною тварин напруженого 1муштету, здатного иротистояти заражению в1ру-лентним в1русом.

Юльюсний метод визначення ¡муногенност] дозволив з'ясува-ти дози вакцини в об'емному вираженш (см3), що захищали вщ захворювання 1 з1гибел1 50% щеплених ними тварин, 1 число п'я-тидесятипроцентних захисних (протективних) доз в щепному об'е-м1. Отримаш результати характеризують яюсн! показники випро-буваних лабораторних зразюв емульсшнох 1 сорбовано! ¡накти-вовано'1 концентратвакцини проти хвороби Ауескь Оцшка ¡муно-генност1 доповнена результатами визначення титр1в антшчл у си-роватщ кров1 щеплених вакцинами тварин.

Виготовлення досл1дно-промислових сер1й емульсШноТ ¡нактивованоТ концентратвакцини проти хвороби Ауесю. Матер1али що-до виготовлення 1 лабораторного доашдження зразшв ¡нактиво-вано'1 концентрованоТ вакцини були узагальнен! 1 представлен! у вигляд| тимчасового регламенту, який шсля узгодження в КФ ДНДК1 ветеринарних препарат1в 1 кормових добавок затвердже-но ГУВ МСГ Украши. Зпдно з наказом № 3 ГУВ МСГ УкраТ-нив1д28с1чня 1992 року I його проханням, на завод1 «Юр'Твець-ветбюпрепарат» проведено ком1сшне випробування технологи промислового виробництва емульшйно!' 1нактивовано! концентратвакцини проти хвороби Ауескл, шд час якого виготовлено 3 дос-лщно-промислов! серп ц1еГ вакцини загальним об'емом 310 тисяч доз.

Технолопя виготовлення вакцини передбачала вйкористання В1рулентного в1русу хвороби Ауесш. репродукованого в суспен-зшшй культур! перещеплюваних клтш ВНК-21/2-17, очищеного високошвидюсним центрифугуванням, концентрованого ультра-

фшьтращею або осадженням сорбованого на аеросил! в присут-ност! ПЕГ, ¡нактивованого препаратами азиридинового ряду, ЗМ1-шаного з масляним ад'ювантом.

Згщно з регламентом, отримання розплшш вфусвм1щуючого матер1алу починали з поновлення лшфшзованого в1русу на кровлях, який у подальшому культивували на моношаровш (3 пере-с!ви), а попм суспензшнш культур! ВНК-21/2-17 до накопичен-ня необхщного об'ему для заражения клтш в мetaлeвиx культиваторах. Всього напрацьовано 5890 л культурально! в!русвм1-щуючо! суспензи, з яких для виготовлення дослщно-промислово! серЛ вакцини № 1 використано ;3240 л, № 2—1550 л 1 № 3—11100 л.

1нфекщйна акъившсть в1русвм1щуючо1 суспензи для виготовлення дослодно-промислових сер!й вакцини № 1, 2 1 3 досягала, вщповщно, 8,33±0,12 ТЦД5о/см3, 8,00±0,15 ^ ТЦД50/см3 I 8,00±0,00 ТЦДбо/см3.

Для виготовлення досл1Дно-промислово1 сер!! № 1 використа-ли антиген, концентрований ультрафшьтращею, а № 2 ] 3 — ком-бшованим засобом сорбцп аеросилом у присутност1 ПЕГ.

1нактивований 50-кратний концентрат в1русу хвороби Ауеск1 змшували за допомогою коло!дних млин!в з р!вним об'емом масляного ад'юванту до отримання гомогенно! быувато! емульси, злегка в'язко! консистенци. Уа три дослшш-промислов! серИ' вакцини перев!рещ на стерильшсть, нешюдлив1сть, ав1рулентн1сть на кролях 1 {муногеншсть на кролях 1 свинях. 3 шею метою го-тували середню пробу, для чого в1дбирали флакони з вакциною на початку, в середин! та в кшц! фасування, зливали 1 зм!шували в стерильней посудин!.

При досуидженн! ¡муногенност! дослщно-промислових серой вакцини брали по 15 крол1в ^ пщсвинюв, серед яких 12 пипв ¡мушзували внутр!шньом'язовим введениям бшпрепарату в доз! 1 см3, а 3—залишали контрольними.

На 21-й день п!сля щеплення вакцини уах тварин заражали в1рулентним в!русом; крол1в внутр!шньом'язово в доз! 100 ЛКД50, а п!дсвинк!в штрацеребрально в доз! 1000 ЛКДго- За шфжова-ними тваринами вели спостереження протягом 10 (крол!в) ! 15 (свиней) тб. У п!дсвинк!в вим!рювали щоденно температуру т!ла.

В результат! проведеного контролю встановлеио, Що дослщ-но-промислов! сер!Г емульсшно! ¡нактивовано! концентратвакцини проти хвороби Ауеск! були стерильними, нешшдливими, ав!ру-лентними! ¡муногенними. В щеплювальн!й доз! вони мостили, _в1дпов1дно~17~57"П32-1мД55^для-крол! в110—20-!-12-1мД50г^ля-свиней, яш викликали утворення напруженого ¡муштету в орга-шзмо щеплених ними тварин.

-Ня пт/утав} птр-иманих результат!в ком!сшного випробування

технолог!! о контролю якост! виготовлених дослодно-промислових" сер!й бшпрепарату вона визнана технолог!чною, прийнятою для промислового виробництва. Дослодно-промислов! сер!! вакцини рекомендован!, для виробничого випробування, 20

Виробниче випробування досл!дно-промислових сер!й емуль-ЫйноТ 1нактивовано1 концентратвакцини проти хвороби Ауескк

Зпдно з розпорядженням ГУВМ МСГП Украши 1 Департаменту ветеринара МСГ Росшсько! Федерацн виробнич; випробування проведено на 218150 свинях р1зних вп<ових гурт1в у 19 господар-ствах Украши, автономно! Республши Крим, 2 господарствах Ро-сшсько! Федерат'!, на 72 норках I 2200 песцях (Росшська Феде-ращя), а також вперше у св1тов1й практинл на 420 одногорбих верблюдах (Туркмешя).

Виробнич1 випробування емульсшно! ¡нактивовано! концентратвакцини проти хвороби Ауеск! проведен^ в господарствах з р1зною ешзоотичною ситуащею. В основному ще були господар-ства, неблагополучщ або загрозлив1 щодо хвороби Ауескл,,спалахн яко! виявляли щор1чно або з деяким пром1жком часу. В двох господарствах хвороба Ауеск! не рееструвалась.

В 1—2 господарствах кожного району, де проводились ко-м!сшн1 випробування вакцини, були сформован! гурти по 10 гол1в р1зних в1кових груп свиней, що знаходились шд постшним нагля-дом протягом року 1 у яких вшбирали проби кров! до { через 1, 3, 6, 9 ! 12 мюящв шсля ¡мушзацп для' контролю стану гуморального !мун1тету.

Вакцину вводили внутр1шньом'язово в доз1 1 см3 незалежно В1д вшу тварин. У перш| 15 Д1'б т'сля вакцинаца за щепленими вакциною тваринами вели пост1йний нагляд з виб1рковою термо-метр1'ею.

Нешшдлившть вакцини оцшювали за показниками загального стану, апетиту, температуря 1 наявноеп м!сцевих реакцш.

Як свщчать дан1 виробничого випробування емулыпйно! ¡нактивовано! концентратвакцини проти хвороби Ауеск!, ускладень у вигляд! загально! реакцп тварин (шдвищення температури, зни-ження апетиту [ шип) ш в одному випадку не зареестровано. За-гибель серед щеплених вакциною поросят не перевищувала в1д-х1д серед контрольних (щеплених в1русвакциною ВДНК1 або ие ¡мушзованих в тих господарствах, де хвороба не рееструвалась). М1'сцев1' реакца виявлен1 у 1—3% новонароджених поросят, яким щепили вакцину з 3—5-денного в1ку внутршньом'язово з внутр1ш-ньо! сторони стегна в доз1 1 см3. У них спостер1галась кульгавкть в першг 3—5 дшв шсля ¡мушзаци з утворенням масляних грану-льом, як1 являли собою затвердшня в м'язах розм1ром до 3 см. У поросят, яким вакцина щеплена з 20-денного ! старшого вжу, ознак кульгавосп не спостер1'гал.и, хоча \ виявляли вакцин^ гра-нульоми розм1ром в1д 0,5 до 1—2 см, як! згодом, через 1—3 мь сяц1, розсмоктувались. У дорослих свиней, яким вакцину вводили в м'язи ши! за вухом, м1сцевих та загальних реакшй не виявлено.

В зв'язку з м1сцевими реакщями, що спостер1гались у 1—3% новонароджених поросят, в подальших додаткових досл!дах встй-новлена оптимальна доза вакцини 0,5 см3 1 м1сце !! введения в м'язц ШИ1.

У ¡мушзованих свиней вакцина викликала утворення специ-<|нчних антпл, як; виявлялися на 6—7-й день шсля и введения в титрах 1,01 ±0,25—1,89±0,29 лог2, що тдв надувались на 3-му мкяц] до 6—8 лог2 1 утримувались на цьому р1вш до 9—10-го мкяця, з подалыиим иоступовим зниженням до 0—4 логг через 12 мкящв теля щеплення вакцини (рисунок).

Динамка титру антитш проти в!русу хвороби Ауеск! у свиней в поствакциналышй пер!од

м1с.

а — титр антитш 1ФА; б — титр антитш в РН.

При спостереженн1 за щеиленим дослишо-промисловими сериями вакцини свинопогол1в'ям протягом року { контрол! еп!зоотич-ттог^итуац1т_в^оспадарствлх^11_в~одному^ипадку^е^ареестро--вано спалаху хвороби Ауесю. Що стосуеться пор1вняльних даних вдаосно 1'муногенност1 дослщно-промислових серШ вакцини, слЦ вщзначити, що вони не в!др1знялись м1ж собою за критер1ями нешюдливост! 1 1муногенностк

В 3-х господарствах дослщно-промислова сер1я № 2 емуль-айно! шактивовано! концентратвакцини проти хвороби Ауесш була застосована в перюд гострого спалаху цього захворювання,

В результат! вимушено! вакцинаци свиней неблагополучних гур-TiB припинилось вщцлення хворих тварин i pi3Ko скоротився вщ-Х1д поросят. На Ыших свинофермах цих господарств, де хвороба не була виявлена, шсля проф1лактичного щеплення uieio вакциною захворювання не рееструвалось весь перюд спостереження.

Аналопчн! результати по випробуванню досл1дно-промисло-внх cepifl № 1 i 2 емульспшо! ¡нактивовано! концентратвакцини проти хвороби AyecKi отримаш сшввиконавцями з ВНД13Т (Mi-щенко В. О., Дудншов А. I., Захаров В. Мч 1995) на свиноиого-л!в'! в господарствах РосШсько! Федерацп. Як свщчать спостереження, протягом року в цих господарствах хвороба AyecKi не рееструвалась. Вакцина шдукувала високий р1вень антшчл в ор-raHi3Mi щеплених нею тварин (5,33±0,34—8,35+0,35 лог2), що забезпечувало напружений ¡муштет. LJi дат шдтверджеш в до-сл!дах контрольного заражения свиней через 1 i 6 мГсящ'в ш'сля вакцинаци, в яких спостер1гали захист в1д захворювання, вьдпо-вщно, 83,3 i 100% {мушзованих тварин при 100% загибел! ¡нтакт-них.

В м1жшститутських комюйних випробуваннях досл1дно-про-мисловоГ cepii № 3 емульсшно! ¡нактивовано! концентратвакцини проти хвороби Ауеск! на 72 норках на зв!роферм1 1нституту хутрового зв1р1вництва i крол1вництва im. В. Афанасьева Pocift-сько'1 ФедерацГ! встановлено, що вона не викликае патолопчних зм1н в opraHi3Mi норок, не впливае на як!сть шкурок i хутра в Micui введения. 1мушзоващ норки збер1гали апетит, жвавкпъ. При контрольному внутршньо-м'язовому i оральному зараженШ на 21-й день шсля ¡мушзацп спостер1гали на 4-й день загибель 33 i 30% норок, яким вакцина, виповшю, щеплена в доз1 0,5 i 1 см3.

Результати випробування емульсшно! ¡нактивовано! концентратвакцини проти хвороби AyecKi на норках показали високу ¡му-HorenHicTb, яка забезпечувала утворення напруженого ¡муттету i захист як при внутршньом'язовому, так i при ал1ментарному зараженш вфулентним BipycoM.

Внутршньом'язове застосування вакцини в доз1 1 см3 запобь гало захворюванню песця протягом 100—130 дшв при постшному годуванш сирою свининою (термш спостереження). За цей час згодовано 64 т сиро! свинишп не виявлено захворювання. Поствак-цинальних ускладнень теж не спостернали.

Випробувана вакцина в1дзначалась високою ефектнвшстю для велико! рогато! худоби i овець. Вона захищала в1д заражения контрольним BipycoM в досить масивних дозах (7,24 lg ТЦД50) через м1сяць шсля I! щеплення 83,3% вакцинованоТ велико! рогато! худоби i '100% овець. Через 12 мкящв шсля вакцинаци заражению протистояли Т1льки 50% ¡мушзованих овець. Антитша в титрах 1,98±0,56 лог2 виявлеш вже на 7 день теля вакцинаци, вони зростали до 5,64 ±0,29 лог2 через 2 мкящ i збершались на piBHi 4,96±0,18 — 5,45±0.26 лог2 протягом 11 мкящв. Hi дат корелюють з результатами вивчення динамжи антител у свиней

при виробничому випробуванш дослшю-промислових cepift вакцини проти хвороби AyecKi. Аналопчт результата отриман! М1щен- • ком В. О. (1955) при випробуванш антигенних властивостей емуль-ciftiio! шактивовано! концентратвакцини проти хвороби AyecKi при !! гострому спалаху серед одногорбих верблкдав. Як i в дослщах шд час спалаху хвороби AyecKi серед свиней, вакцина сприяла

« ... л fr . • _ _ ___ЛТ ...

оориву 1нфекци на о—/ день, а також загиоел1 ьеролюдш. с ии-роватц1 KpoBi через 2 мкящ шсля щеплення щею вакциною вер-блкадв титри антшчл виявлялись в РН на piBHi 4,8+0,57 логг, 1ФА—5,05+0,52 лог2 i МФЗ—4,9+0,33 лог2.

Отримаш результата свщчать, що емульсшна шактивована концентратвакцина проти хвороби AyecKi активуе в opraHi3Mi щеп-лених нею тварин компонента iMyHHOi системи. Бона нешкщлива, ав1рулентна для свиней, хутрових 3BipiB i жуйних, еколопчно без-печна, мае високу ¡муногеншсть. У виробничих умовах вакцина проявляв виражену протиешзоотичну ефектившсть, забезпечуючи захист ¡мушзованих тварин вщ ураження хворобою AyecKi протя-гом року (TepMin спостереження), в ешзоотичних вогнищах сприяе швидкому обриву шфекщ!. Вона не викликае поствакцинальних загальних ускладнень в оргашзм1 тварин. Характерним для ще! вакцини, як i для ycix емульгованих 6ionpenapaTiB, е утворення вакцинних масляних гранульом у М1сщ введения, яи являють собою депо KynipoBaHoro препарату, що забезпечуе б1льш трива-лу реакцш на введений антиген.

В результат! позитивного виробничого випробування емульсшно!. шактивовано! концентр атвакцини проти хвороби Ауеск! на pi3-них видах тварин в господарствах Укра!ни, автономно! Республжи Крим, Росшсько! Федерат! KOMicin рекомендувала впровадити '!! у виробництво i практику ветеринарно! медицини.

Розробка постшноТ нормативно-техшчноТ документащ! на емульсшну ¡¡нактивовану концентратвакцину проти/хвороби Ayecni.

На шдстав1 виробничого випробування ¡муногенних властивостей досл^но-промИслових серш емульсшно! шактивовано! концентрат-вакцини проти хвороби Ауесю розроблена нормативно-техшчна документами, в основу яко!покладено тимчасовий регламент вироб-ництва биопрепарату, який забезпечив виготовлення на завод1 «Юр'!вецьветбюирепарат» дослщно-проимслових cepifi нешюдливо!, ав1рулентно!, високо1муногенно! вакцини. Отримаш додатков1 екс-периментальш дат щодо дози вакцини i М1сця введения-iнбвона7" родженим поросятам включен! в «Настанову по застосуванню емульсшноТ шактивовано! концентратвакцини проти хвороби Аур-гк}» «Тнгтруктм'я пп виготпвленнт i контролю емульсшно! ¡няк-тивовано! концентратвакцини проти хвороби AyecKi» доповнена матер!алами технолопчних процеав культивування клггин ВНК-21/2-17 i Bipycy хвороби AyecKi в металевих культиваторах иро-мислового призначення (КМ-250 — КМ-2000). ГНдготовлений коми-24

лект норма'тийно-техшчно! документаци узгоджено в КФ ДНДК1 ветеринарних препарат1в I кормових добавок 1 затверджено ГУВМ МСГП Украши 15 листопада 1995 року. 3 1 ачия 1996 року ця документащя прийнята на бюшдприемств1 ВНД13Т для вироб-ництва емульсшно! {нактивовано! концентратвакцини проти хвороби Ауесш.

Методи експресмндикаци та визначення активное™ В1русу хвороби Ауеск1

Розробка способу одержування специфично! сироватки кров1 до в1русу хвороби Ауескь Ефектившсть виявлення 1 ¡дентифшацц вь русу хвороби Ауесш в серолопчних та 1мунох1м1чннх реакщях залежить в1д активное™ шдикаторних тест-систем, головним компонентом яких е специф1чш антитша. При !х одержуванш поепйно прщиляеться особлива увага антитшогенезу у донор1в специф1ч-них сироваток кровь

На основ1 анал1зу використання р1зних тварин-донор1в специ-ф1чних до в1русу хвороби Ауеск1 антитш, недол1к1в 1 схем 1мушза-ци ми оптим1зували, перш за все, споаб введения антигену. Для ¡мушзаци; використали очищений, концентрований 1 шактивований за розробленою нами методикою в1рус хвороби Ауеск1 з масляним ад'ювантом у сшввщношенш 1:1.

Ппер1мунш сироватки кров1 одержували за схемами 3-разового внутршньом'язового введения антигену в доз1 1 см3 морським свинкам 1 кролям в м1жпальцевий проспр, л1мфатпчш вузли 1 вну-тршньо-м'язово в доз1 2, 1 { 2 см3, в1дпов1дно. Весь процес гшер-¡мушзаци завершували на морських свинках за 35—40, кролях — 29—35 дшв.

Прискорення процесу отримання гшер1мунно! сироватки досяг-нуто за рахунок оптим1зацп термипв ¡н'екщ! 1 м1сць введения антигену. За даними Вершигори О. 6. (1975), перша ш'екщя антигену викликае ком1тування. клтш пам'ят1 1 пперплазпо л1мфатич-них вузл1в внасгпдок збшыиення популяци антитшоутворюючих клш-ш. Враховуючи це, мп вважали, що повторна ш'екщя антигену повинна шдсилитп початково досягнутнй ¡мунолопчний -ефект введения антигену в сеисибшзоваш л1мфатичш вузли на фош подраз-нення масляним ад'ювантом. Цьому сприяла також форма застосо-вуваного антигену, який шсля емульгування в масляному ад'юван-т1, утворював складну лшопротешову структуру. Остання, за даними Вершигори О. 6., по ф1зико-х1м1чним властивостям щентична л1зосомам, завдяки чому змеишуеться штенсившсть перетравлення ¡мушзуючого антигену. М1ж тим, ведомо, що чим нижче це перетравлення, тим б1лын виражена ¡мунна в1дпов1дь оргашзму донора.

Чистота одержуваних сироваток забезпечувалась за рахунок чтого, що ¡мушзували морських свинок 1 крол!в, яш у природних умовах не сприйнятлив1 до хвороб свиней, ¡, як наслщок цього, у

ййх не спостер!гаеться продукщя чужорщних антйтш. Виеока активнкть досягалась використанням концентрованого антигену В1русу I ефективного масляного ад'юванту, достатньо стимулюючо-го ¡мунокомпетентш системи, що шдтверджено результатами гю-ргвняльного дослщження сироваток, одержаних гшер1мушзаидею сорбованим антигеном, титри антит1л яких були на порядок ниж-чими (таблица 5). Вшсористания запропоновано! схеми ¡мушзацп дозволяе при-скорити процедуру отрнмашя специфично)' сировини I зменшити и соб1вартгсть за рахунок скорочення витрат на утри-мання донор1в.

Таблиця 5

Пор1Вняльна оцшка активное™ «сироватки ;кров1 крол1в,

¡мун!зованих антигеном в!русу хвороби Ауеск! на Основ! масляних)(1) сорбованих (2) ад'ювант!в

Актившсть сироватки, лог2 _,

Антиген РН РР1Д РСК

1 8,00 ±0,04 8,13±0,15 6,70 ±0,11

2 6,54±0,15 5,35±0,08 4,96±0,04

РеакЩя зв'язування комплементу. Маючи високоактивну гшер-¡мунну сироватку кров1, титр антит1л яко! в РН досягав 8,00± 0,04 лог2 (крол1) ¡,7,15±0,06 лог2 (морсыи свинки), ми приступили до розробки метод!в експрес-виявлення 1 ¡дентифжацп в1русу хвороби Ауесю. Перш за все, оптим^зували РЗК, яка вважаеться най-бьльш ушверсальною I доступною для лабораторно! практики. Враховуючи недолжи юнуючо! методики РЗК, яю стримували 11 вировадження для д1агностики хвороби Ауесш (несгандартшсть компоненте, нев}дтворювашсть результате), про що повщомляе Сюрш В. М. з сшвр. (1986; 1991), ми дослщили схему ц постановки за модифжованим методом РЗК, яка застосовувалась при д1-агностищ грипу (Смородшцев О. О., 1952) ¡ ящуру (Швецова Р. В., 1971). Збшьшення юлькоеп дослщжуваного антигену призвело до шдвшцення титр1в в!русу хвороби Ауесю, що виявляються, 1 числа позитивно реагуючих проб, в той час, як збшыиення у 4 рази дози специф1чно1 сироватки кров1 не викликало достов1рного шдвищен-ня титр1в дослщжуваного антигену.

Небезпечшсть застосування нативного в1русу хвороби Ауесю -в-РЗК-викликала-необх!дн1-сть-вивчення-можливост1-використання— ¡нактивованого антигену. В цих дослщах установлено, що прогрЬ вання при 60 СС не впливало на актившсть в1русу 1 достов1ршсть результате.

3 метою шдвшцення стандартное™ постановки РЗК 1 достов1р-нсхт отриманих результате визначена значущють якост1 застосо-вуваних компоненпв гемолкично! системи. Позитивш результати отримаш при використанш консервованих .еритрощтв барана у 26

розчиш М1гулино1. Це дозволило унйкнути колйвань результат!в РЗК, осмльки використовувались одш i ti ж еритроцити протягом мкяця, яш збер!гались при 4—6°С, причому в роботу брали еритроцити тшьки через 4—5 дшв теля 1х одержувания i консерву-вання.

Результатившсть визначення антигеиних властивостей Bipycy Хвороби AyecKi залежала також вщ дози комплементу. Найбьлып висок1 титри антигену виявляли в РЗК з 2 одиницями комплементу.

Наведет результата показали, що РЗК у щй модифшацп дозволяе щентифжувати Bipyc хвороби AyecKi. Бона мала ряд пе-реваг у пор1внянн1 з бюпробою i подальшою ¡дентифшащею Bipycy в РН за часом отримання результату анал1зу проби протягом 2—3 годин проти 3—5 д\б \ зниження BapTocTi дослщжень в 2—5 раз1в.

Це дозволило запропонувати для практики «Тимчасову наста-нову по шдикацп' Bipycy хвороби AyecKi в реакцп зв'язування комплементу».

Метод флюоресцентних зошМв. Одним з шформативних метод!в раннього виявлення Bipycy хвороби AyecKi е МФЗ. Вщомо, що BipycHa ¡нфекщя иочинаеться з адсорбци збудника на KniTiiHi-Mi-nieHi, яка npoTiKae протягом короткого часу (не б!лыпе 30 хви-лин) i викликае мшроструктурш i функцюнальш змши у склад! клпинних мембран. В цей час змшюеться мехашзм перетворення клЬинно! eHepri'i та електропотенщал!в (Костнжов В. А. з cniB-авт., 1986). Реестращя останшх досягаеться по збшьшешио штен-сивност1 свГтшня флюоресцентного зонду (Мвденко В. О. з сшв-авт., 1992).

При з'ясуванш можливссп використання МФЗ для експрес-шдикаци Bipycy хвороби AyecKi дослщження проводили на первин-но трипсишзованих (СН) i перещеплюванпх клтшах ВНК-21/2-17, НПК-666/17, СНЕВ. 3 BipyciB як контрол! дослщжеш також збуд-ники ящуру, IPT i ВД. Для ¡дентнфшацп BipyciB використовували комерцшш i експерименталып д!агностичш сироватки KpoBi, як! були отримаш на лабораторних (морськ! свинки, ,кро.тп) i альсько-гооподарських (свит, велика рогата худоба) тваринах за загалыю-прийнятими методами.

Як флюоресцентш зонди використалп синтезован! Дубуре Р. Р. (1нститут орган!чного синтезу. Рига. Латв!я) 4-/п-днметиламшо-стир1л/-1-метилшридшй-п-толуолеульфонат i 4-/п-диметиламшости-р!л/-1-гексилшридшш-п-толуолсульфонат.

3 метою вщпрацювання техшкн постановки i обл!ку реакци по шдикаци Bipycy хвороби AyecKi МФЗ дослшкено близько 500 проб штактних кл!тин для вивчення штенсивноеп флюоресцен-uii по вщношенню до евтння шфшованих кл1'тин. Це дозволило встановити, що при адсорбци Bipycy на клггини вщзначаеться за-коном1рне збмьшення на 50—250% штенсивносп флюоресценцп, в той час, як у ¡нтактних кл!тин, або оброблених баластними бш-

ками, штенсившсть. флюоресценцП постшна i не мшяеться. При нейтрал1заца ßipycy хвороби Ayecni гомолопчними антитшами штенсившсть флюоресценца ствпадала з свтнням штактн.их шп-тин. ¡нтенсившсть свтння клггин, на яких адсорбувався Bipyc хвороби AyecKi, збкьшувалась у 2,1—2,9 раз!в в пор1внянн| з iH-тактним контролем.

Контрольш вфусн ящуру, iPT i ВД викликали р!зну по штен-сивност1 флюоресценщю. При наявнокгп гомолопчно! системи Bipyc -f анпшло наступала нейтрал^защя BipyciB i вщповщно бло-кування сорбци Ix на клтшах, внасл1док чого флюоресценщя знаходилась на pieni свтння штактних клтш.

Отримаш результатн дослщжень показали можливнггь шдика-ца та ¡дентифжаца ßipycy хвороби AyecKi на стада адсорбца на клггинах за допомогою зонду. Чутливкть МФЗ не поступалась перед чутливГстю 6ionpo6n, а за ¡нформативним часом анал1зу проб (35—60 хвилин) перевнщувала i"i у 80—100 раз1в.

1муноферметний метод шдикацй' ßipycy хвороби Ayecni. Зараз у лабораторшй д1агностищ найбшьш ¿нформативним вважаеться 1ФА, який застосовуеться як для кшькюного, так i для яысного визначення антигешв i антипл. Найбшьш поширеною модифжа-щею цього методу е «-сендв1ч»-вар1ант для виявлення специф!чного антигену. Це досить високочутливий шформативний метод, який дозволяе на въдмшу вЩ РЗК, PH i шших реакцш виявляти антн-. ген на pißni 10 нг/см3, а антшчл — 0,03—0,1 мкг/см3.

Нами разом ¡з сшввиконавцями з ВНД13Т розроблявся твердо-фазний BapiaHT 1ФА для оцшки якосп нашвфабрикат1в при виго-товленш вакцини проти хвороби AyecKi. Суть цього вар1анту ио-лягае у виявленш 'специф1чного комплексу «антит1ло + антиген», що утворюеться на твердому Hocil (сорбент^, за допомогою ферменту пероксидази хрону, актившсть котро! проявляеться хромо-генним субстратом.

При вивченш антигешв за допомогою «сендв1ч»-вар1анту 1ФМ реакцш -ставили з шкубащею и компонент на першому eTani при 4°'С, а на другому — при 37 °С (Voller А. et al., 1976; Strohmaier К., et al., 1980). На весь анализ потрёбувалось 16—24 години (Leinikki Н. et al., 1976). Незважаючи на високу чутлившть i ви-користання унтверсального кон'югату, який можна застосовувати для анализу р1зних антигешв, (довгочаснГсть проведения анал1зу проб знижувала ix цшшсть.

;По_р1внявши—техн1чну~суть~1~проанал1зувавши-умови-проведен-— ня твердофазного Bapiamy 1ФА, ми переконались, що максимальна чутлив!сть кожно? ¡мунолопчноГ реакца досягаеться у р!вно-MipHOMy режиму що визначае тривалють анал1зу, яка у -середньо-му складала 4—.6 годин. У зв'язку з цим ми слроОували оптймГ зувати умови i час постановки реашщ. Позначена мета була до-сягнута за рахунок того, що кожний етап взаемодП антигену i антипл здШснювали при постшнШ температур! 53 °С i пост1йному 28

перем1шувант компонент реакци на шугтельапарат1, що сприяло прискоренню сорбци на носи 1 видаленшо при вдашвант незв'яза-них компонегтв. Проведения ус1х еташв реакци в умовах шдви-щено! температурн 1 перемшування сприяли створенню р1вном1р-ного режиму 1 скороченню термЫв отримання результату анал1зу дослщжуваних проб завдякн збшьшенню можливост1 контакту антигену 1 антнтш I прискоренню утворення ¡мунних комплекав.

При вгдпрацюванш 1ФМ використаш рашше отримаш кон'гога-ти в1русспециф1чних ацптл з пероксидазою хрону (Мвденко В. О. 1 ш., 1992) з актившстю вщ 1:800 до 1:3000. При досл1дженш куль-турального в1русу хвороби Ауесш встановлено, що 1ФМ дозволяе виявляти тнтри антигену, як1 в 20—60 раз1в перевищують показни-ки в РЗК 1 у 8—10 раз1в показники РР1Д. Результатц пор1вняль-них дослгджень антигену в1русу хвороби Ауесш шдтвердили, що запропонований прискорений метод 1ФА по чутливосп не поступа-еться класичному «сендв1ч»-вар1анту 1ФА, в той же час по експрес-визначенню 1 просит П1ФМ значно перевищував традицШш ва-р1анти.

Шдвшцення температурного режиму до 53 °С 1 забезпечення постшного контакту компонент реакщйно! сум1ип перем1шуван-ням дозволило скоротити час експозици кожного етапу реакци до 5—7 хвилин, а проведения твердофазного 1ФА в щлому — до 30— 60 хвилин. Детал1 реакци викладет в запропоновашй «Тимчасов1й настанов1 по ¡ндикацп антигену в1русу хвороби Ауесю прискоре-ним твердофазним 1муноферментним методом ¡з пероксидазним кон'югатом».

Обгрунтування економ1чноТ 11технолопчно1 ефективност! виробництва ¡нактивованих вакцин проти ¡хвороби Ауеск1 на основ! перещешпованиХ|КЛ1тин

У процеа розробки технологи виготовлення внсоюлмуногенноТ вакцини проти хвороби Ауеск1 нами зроблено анал1з виробництва на основ1 технолопчних операцш ¡з застосуванням резнях клшш-них систем для репродукци в1русу.

1нактивоващ вакцини проти хвороби Ауесю одержують куль-тивуванням виробничих штам1в в1русу на моношарових 1 -суспензш-них кл1*тинних системах. Р!зниця способ{в культивування досить суттева, оскиьки застосовуються р1зш за продуктивтстю юптин-Н1 систем» 1 обладнання, що вщбиваеться на соб1вартост1 продукции

Виробництво шактнвованих вакцин на статичних моношарових культурах вгдноситься до перюдичних проце<пв, бо тут функцюнуе эбладнання перюдично! ди. При цьому кожний тип обладнання з1'дпов1"дае однш операцп, що при ддачш багатостадшносп техно-юпчного процесу визначае високу фондоемисть виробництва. ?1вень мехаш'зацп трудових процеав низький. Питома вага ручно!

пращ при моношаров0му культивуванш клггин 1 в!русу складае 80%.

При глибинному культивуванш використовуються високопродук-тивш клггинш системи, яш розмножуються в еуспендованому стань Вони мають явну перевагу перед культивуванням в!русу в су-спендованих системах клшш [ тканин з обмеженим термшом жнт-тездатпост!. Розмноження клшш в суспензованому стан{ в спетп-альних культуральних пристроях, оснащених автоматичним або нашвавтоматичним регулюванням процеав культивування клшш 1 В1русу, дае можливють безперервного накопичення 5х бюмаси без застосування фондоемких процеав. Доля ручноТ пращ зменшу-еться до мшмуму. Питома вага -ручноТ пращ не перевищуе 25— 45% в залежносп вщ типу системи контролю 1 управлшня про-цесами культивування.

Процес виробництва шактивованих вакцин грунтуеться на велики! кшькост1 р1зноманггних виробничих операцш, яи можна згру-пувати за типовими ознаками: призначення у процес1 виробництва

1 спос1б виконання.

Розробляючи технолопю виготовлення шактивовано! вакцини проти хвороби Ауеск1, ми враховували сшввиношення окремих операщй в !х загальнш юлькость Такий структурний анал13 ви-робничого процесу дозволив виявити ступшь мехашзацп, сшввщ-ношения основних 1 допомтних операцш. Встановлено, що вироб-ничий процес виготовлення шактивовано! вакцини на перещеплю-ваних клтшах екладаеться з 5 стадш: пщготовчо!; виробництва кл1тинно1: бюмаси; виробництва в1русутримуючо! сировини; скла-дання вакцини 1 И контролю за показниками якост1, яи за при-значенням шдроздшяються на технолопчш (66—68%), контрольн! (16—18%) 1 перемщукт (16%).

Р1вень мехашзацп технолопчних процес1в визначае р1вень ви-трат на одиницю продукцп та 11 соб1варт1сть.

Даш хронометричного анал!зу витрат часу на виробництвс 500 л1тр!в культурально! суспензп в1русу хвороби Ауеси на основ:

2 клшшних систем свщчать про явну перевагу суспензшногс культивування. Якщо виходити з нульового циклу накопиченш клшшноТ бюмаси, то для заправлення КС-6 потребуеться 135( млн. кл1тин з розрахунку на 3 л живильного середовища. Пр! моношаровому вирощуванш для вис1ву щрл шлькост! перещеплю ваних кл1тин потр!бно 17 матрас1в; 1,5-лТтрово\' емкост1 (200 см;

^успе1П1Гтсл1тгпг^р1гшос{вн1й^<онцентраци'-4Х|105/сма)—Щоб-отри мати 500 л в1русно1 суспензп,'необхщно виростити клтшну б1о масу в 2500 матрасах.

:-Для напрятовання клтшно! бюмаси в 2500 матрасах при на

вантаженщ переаву клшш по 150 матраав на 2 фах!вщв за робо чу змшу потребуеться 792 години, тобто 33 доби, причому, у про цес1 ц1еТ роботи ручна праця займае значну питому вагу (80%)

При суспензшному накопиченш 1Штинно-культурально'1 бюмас!

витрати часу складають 288—300 годин, з яких на вирощування кл1тин в КС-6 —96 год., КС-50 —96 год., КМ-630 - 96-108 год., тобто 12—13 д1б. До того ж, виконання ще! роботи посильне 2 фах1вцям, осюльки ручна праця зводиться до мшмуму. ПеремЬ щення клтш ¡з одного культиватора в другнй зд1йсшоеться пере-качуванням через систему сифошв.

Таким чином, суспензшне культивування клггин 1 в1русу хворо-би Ауесш бпгсьше, шж утрич1 економить витрати робочого часу на виконання технолопчних процес1в I вданачаеться бглъш високою продуктившстю.

3 економ1чноТ точки зору суспенз1йне культивування ефектив-шше в 9,2 рази. Якщо соб1вартгсть 1 л суспензп в1русу хвороби Ауесш на моношаров1й культур! клшш складае 100,6 гривш, то соб1варпсть виготовлення 1 контролю суспензшного культураль-ного вирусу не перевищуе 10,9 гривш. Економ1чний ефект при ви-готовленш 3-х досл!дно-промислових серп! емульсшно! шактиво-ваног концентратвакцини протн хвороби Ауеск1, визначений на пор1внянш витрат на виро'бництво б1омаси на основ1 базово! моно-шарово! I ново? суспензшноI технологи (розрахунок проведено за методикою Готовцева П. Н. (1985), складае 52856 гривень. Зв1дси окупшсть витрат на виробництво одно! дози складае 1,7 гривш (в цшах на 1.01—01.03. 1996 року).

Перевага отримання в1русу на суспензшно культивованих кл1ти-нах визначаеться не тиьки економ1ею матер1альних витрат 1 часу на виробництво нашвфабрикату вакцини, але 1 яшстю одержанр! продукцп. Яшсним показником у нашому випадку виступае об'ем щеплювально! дози, який залежить в!д вмкту корисно! речовини, тобто концентраци антигену (25-разова). Зниження дози стало можливим завдяки додаткового вкладення антигену в 1 см3 вакцини концентруванням в1русу. Шдвищення вартост1 вакцини вна-сл1*док додаткових витрат на концентрування антигену компенсу-еться зниженням витрат на проведения профьлактичних обробок тварин ироти хвороби Ауесш (одноразове щеплення вакцини).

Кдльшсш показники вакцини також не попршуються. Вм1ст фактичнних 1мД50 в щеплювальнш доз1 в1дповдае вимогам ТУУ 1 складае не менше 10, що забезпечуе певний запас мщност1, яка гарантуе формування ¡мунггету при одноразовому введенш.

За фактичними витратами при виготовленн1 одноГ серп вакцини в об'ем1 120 тисяч доз П соб!варт1сть складала 12 копшок, а опто-ва цша з урахуванням 30% планового прибутку становила 15 ко-п1йок.

Таким чином, результати впровадження розроблено! технологи виготовлення емульайно! шактивованоГ концентратвакцини проти хвороби Ауеск1 на основ! великомасштабного суспензшного культивування клтш 1 в1русу свщчать, що внкористан1 технолопчш процеси досить ефективш1 високоеконом1чш. Технолопчна ефектив-шсть суспенз1йного культивування клтш 1 в1русу переконливо

зумовлена значною [нтенсиф!кащею виробництва вакцини прати хвороби Ауесш, мехашзащею трудових процесса 1 скороченням до 25—45% питомо! ваги ручно! прац!.

Технолопчна лш1я напрацювання клшшно-культурально! бю-маси в1русу хвороби Ауеск1 в суспенза дозволяв здшснювати за-критий цикл виробництва, починаючи з пос1ву 1 закшчуючи зш-манням готово! вфусно! сировини в реактор! промислового об'ему.

висновки

1. Суспенз1йннй клон перещеплюваних клггин ВНК-21/2-17 мае високу прол1феративну актившсть (4,8—5,2) при культивуванш на пдрол1затних середовищах (ФГМ або ГБК) з концентращею вод-невих юшв у д1апазот 6,8—7,4, забезпечуе накопичення клггинно! бюмаси вгд 1,8 до 2,5 млн/см3. Клггини не контамшоваш мшо-плазмами, збер1гають життездатшсть при охолодженш до +4—6 "С 1 заморожуванш в умовах рЦкого азоту.

2. Розроблена система низкотемпературного консервування клпгин, що включае 30-хвилинну еквшбрацда !х у крюзахисному середовииц (А. -с. № 1192762) при +4—6 °С, заморожування за 2-ютушнчатою програмою охолодження: на першому етат з швид-к!стю понижения температуря 1—2°/хв до —25—30 °С, на другому— 10°/хв до —70 °€, перемщення 1 збер1гання контейнер1в з кл1'тинами у рщкому азот1.

3. Встановлено, що оксиетильоваш глщерин (06Г) 1 ацетамгд (ОЕА), використовуваш як крюпротектори (А. с. № 1448627), в 5% концентраца у склад1 крюзахисного середовища забезпечують збереження 96—98% клпин. Вони мають низьку токсичжпть 1 не потребують вгдмивання перед вис1вом деконсервованих кл1тин.

4. Запропоновано цитолопчний метод оцшки якост1 довгочасно культивованих I консервованих заморожуванням клггин за проль феративною активш'стю та кшькютю патолопчних м1тоз!в. Двора-зове зниження прол1фератнвно! активное™ I зб1льшення р1вня патолопчних мггоз1в для первинних клггин понад 11—30%, перещеплюваних— 5—15% е ознакою втрати життездатнос™ викори-стовуваних у виробництв1 клпинних культур.

5. Виробничий штам УНД1ЕВ-18 «вс» в1русу хвороби Ауеск1 мае високу шфекцштсть для первинних (5,96—7,68 ^ ТЦД5о/см3) \ перещеплюваних (5,35—8,75 ^ ТЦД50/см3) кл^тнн. Репродукова-ний в клгтинних культурах в1рус збер1гае в1рулентшсть для лабо-раториих (морсьш свинки—3,15 ЛД50/см3, крол1—8,16 ЛКДяо/см3)

"7 альськогосподарських тварин (в1вц1—4,75 ЛД50/см3). Час репро-дукщ'Г та титр його шфекщ'йносп" в кл1'тинах ВНК-21/2-17 скла-дають 36—48 годин 1 8,25 ^ ТЦД50/см3, в1дпов1дно.

-в. Рочробл'ею експрес-методп^)люоресцент«их-вонд1В;-прискоре=-

ного 1ФА \ РЗК для контролю сиециф!чнос™ 1 активное™ в1русно! сировини у процесс внготовлення вакцини, яю дозволяють ¡дентифпсувати антиген вирусу хвороби Ауеск1 протягом 1 — 3 годин, проти 2 — 3 д 16 - ■ у бшлроб}. на клтшних систе-32

3. "Рекомендации по лечению контагиозной эктимы верблюдов". Утверждены в 1996г Главным Ветеринарным Управлением МСХиП Монголии,

4. "Инструкция по борьбе с чумой 1срупного рогатого скота и яков*. Утверждена в 19% г. Главным Ветеринарным Управлением МСХиП Монголии.

5. "Инструкция по. борьбе с ящуром". Утверждена в 1996 г. Главным Вете-. рннаркым Управлением МСХиП Монголии. —

6. "Инструкция по борьбе с оспой 'верблюдов". Утверждена в 1996 г. Главным Ветеринарным Управлением МСХиП Монголии.

8. /СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ДИССЕРТАЦИИ

1. А.Хохоо. BIOLOGICKE VXASTNOSTI VIRU KONTAGIOZNI EKTIMYVELBLOUDU MoLR. Kandidatska disertaeni prace 1982. 82 BRNO,CSSR

2. A-Xoxoo. BIOLOGICKE VLASTNOSTI VIRU KONTAGIOZNI EKTIMY VELBLOUIJU KoLR.Autoreferat Kandidatska disertaeni prace 1982. 26 BRNO,CSSR . .

- 3. А.Хохоо. Биологические свойства вируса контагиозной эктимы верблюдов в МНР. Автореферат диссертации, 1982 г. стр 26, г Брно, на русском языке.

4. А.Хохоо. Антигенные свойства местных штаммов возбудителя ннфекинонной агалактии ооец и ::оз. Дипломная работа s 1975 г, 60 стр, г Улан-Батор.

5. А.Хохоо, Ц.Дзшцэрзн, Ц.Базарцэрзн, Б.Пурззсурзн, Б.Бямбал, Ж.Бэхочкр. Некоторые вирусные заболевания, кстречагощисся у животных. Улан-Батор, 1987 г, монография, 64 стр.

6. А.Хохоо^ Ветеринарная вирусология, 1994 г. монография , 3 печ листа,

7. А.Хохоо, В.Н.Шуть Болезни гтщ и способы их лечения. Справочник для служебного пользования, 2 печ листа, 19S8 г. ^

8. А.Хохоо. К вопросу об м1учгкии морфологии водбул;!теля контагиозной эктимы не-, рблюдоз. Журнал вгтерянаржетвн, ЧССР, 1982, N6. ■ '

9. А.Хохоо. Ф.Бзртссйхз, Ц.Дашцэрзн, Б.В. Соловьев. К ¡пучению контагиозной гктамы верблюдов. /Kj-ркал "Акта пнрологнка" ! 93-4, N 28/2, стр 122-127.

10. А.Хохоо. Что iuinsrr на образование иммунитета в организме жкэотиого? Журнал "Наука и ккзнь", 1985, N1.

6. Экспериментально установлено, что яки очень чувствительны к вирусу чумы. Чума у этих животных протекает в подострой форме с хараичсуиъшк клкнкчссхиьс: признаками и значительным процентом гибели животных.

7. Характерно то. что красный монгольский скот более устойчив к чуме и во время эпизоотии болеют только отдельные животные и при этом без типичных клинических симптомов и гибели.

3, Исследованиями установлено, что контагиозная эктима верблюдов является самостоятельной нозологической единицей. Контагиозной эктимой болеют только

верблюды и иногда люди.

9. В опытах подтверждено, что переболевшие контагиозной эктимой верблюды

приобретают стойкий пожизненный иммунитет.

10. Изучены основные биологические и физико-химические свойства вируса контагиозной эктимы верблюдов. Вирус имеет размер 320x160 им, относится к семейству вирусов оспы чувствителен к поверхностно-активным веществам, устойчив к

действию эфира. - __

П. Экспериментальными исследованиями установили, что вирус контагиозной эктимы верблюдов в лабораторных условиях адаптируется к ХАО куриных эмбрионов и плохо культивируется на различных клеточных культурах.

П. Разработаны и внедрены в ветеринарную практику рекомендации по профилактике и лечению эктимы верблюдов, которыми предусматриваются стропи карантинно-ограничитеиьные мероприятия при возникновении заболевания (без применения профилактических препаратов) и симптоматическое лечение заболевших животных.

7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

На основании проведенных исследований для использования в практике предлагаются:

1. Стандарт "Метод диагностики ящура животных", Гост-1983-78, Улан-Батор, 1983 г.

2. "Инструкция по борьбе с контагиозной эктимой верблюдов", которая утверждена в 1984 г Главным Ветеринарным Управлением МСХиП Монголии.

мах, 1 зннзити в 3—5 раз!в внтрати на !х проведения. ШФМ за ¡ндикаторною чутливостоо у 20—60 раз1в перевищуе РЗК 1 у 8— 10 раз1в РР1Д.

7. Технолопя промислового виготовлення вакцини протн хворо-би Ауесш включае великомасштабне суспензшне культивування клптш I в!русу, очистку гмрусвмшдуючо! суспензп центрифугуван-ням при 10000 комбоноване концентрування шляхом сорбцп вирусу 0,03% аеросилом А-300 1 осадження 8—10%. ПЕГ-115, шак-.тиващю преператамп азнридинового ряду (0,15% АЕЕ1 або БЕ1) { змшування з масляним ад'ювантом, за прописом ВНД13Т.

8. Розроблена емульсшна шактивована концентратвакцина про-ти хвороби Ауеси ¡з ворусу, репродукованого в суспензшшй культур! перещеплюваних юитин ВНК-21/2-17. Вакцина ¡муногенна, ав1рулентна, нешкодлива, еколопчно безпечна 1 економ1чна. 1мД5о вакцини складае 0,01—0,03 см3, що вщповщае 33—100 ПД50/см3.

9. Теоретично обгрунтована 1 практично пщтверджена залеж-¡псть омуногенност! вакцини вщ концентраци антигену в1русу хвороби Ауеск! в прищеплювальному об'ем! 1 внкористовуваного ад'юванта. Вмкт у вакцин! концентрованого в 25 раз1в антигену в!русу хвороби Ауеск! дозволяе зменшити прищеплювальну дозу до 1 см3 , яка при одноразовому введенш викликае формування напружеиого ¡мунггету у 100% тварин у лабораториях експериментах. 1мД50 емульсшно! вакцини у 1,5—2 рази внще у пор!внянш з сорбованою.

10. За результатами широкого виробннчого випробування дос-л!дно-промкслових сер!й емульсшно! шактивовано! вакцини проти хвороби Ауеск!, проведеного у вщповщност! з дозволом ГУВМ МСГП Украши 1 Департаменту ветеринар!! МСГ РФ на 218150 свинях р!зннх в!кових гурт!в, 30 в!вцях, 49 головах велико! рогато! худоби, 72 норках, 2200 песцях ! 420 одногорбих верблюдах, вона внзнана нешвдливою, що забезпечуе високу профшактичну ефек-тивн!сть.

11. Ьоуштет у ¿мушзованих тварин наступав на 6—7 день шс-ля одноразового введения вакцини у дозо 1 см3 ! тривае про-тягом 12 мкяшв (терм!н досшдження). Вакцина викликае ак-тивие утворешоя в!русспецнф!чних антнт!л, як! виявляються в титрах 1 —1,5 лог2 на 7 день, досягають 4—8 логг через 3 мкящ ! утримуються на цьому р!вн? до 9—10 мгсяця, а штм поступово зннжуються до 0—4 логг через 12 мкящв теля ¡мушзаци тварин.

12. Запропонована технолог!я великомасштабного суспенз!йного культивування кл!тин ! ворусу хвороби Ауеск!, що використовуеться при виготовленш вакцини, в 2,9 рази шдвшцуе продуктивн!сть пращ ! знижуе трудоемкость в середньому в 3,75 раз!в. Економ!чннй ефект вщ впровадження технологи промислового виготовлення емульсшно! шактивовано! концентратвакцини проти хвороби Ауес-и складае 1,7 гривш з ррзрахунку на 1 дозу (у щнах на 1 ачня— 31 березня 1996 року).

Пропозицп для практики

Розроблет 1 рекомендуються для практичного використання-

1. ЕмульсШна шактивована концентратвакцнна проти хворобн Ауескь

2. Постшна нпрмативно-техшчна документащя на вакцину (затверджена ГУВМ МСГП Украши 15 листопада 1995 року):

2.1. 1нструкщя по виготовленню 1 контролю емульсШно! шакти-вовано! концентратвакцини проти хвороби Ауесю.

2.2. ТУУ 046.15.090-95 на емульсшну }нактивовану концентрат-вакцину проти хвороби Ауескь

2.3. Настанова по застосуванню емульсшно! ¡нактивовано! концентратвакцини проти хвороби Ауесш.

3. Тимчасова настанова по шдикаца антигешв в}русу хвороби Ауесш прискореним твердофазним ¡муноферментним методом з пероксидазним кон'югатом (затверджена директорами УНД1ЕВ I ВНДЯ1, 1992 р^к).

4. Тимчасова настанова по шдикаца в1русу хвороби Ауесш в реакца зв'язування комплементу (затверджена директорами УНД1ЕВ 1 ВНДЯ1, 1992 р!к).

5. Способи одержування д1агностичних сироваток кров! до в1ру-су хвороби Ауесп на морських свинках { кролях (патенти РФ на винахщ № 2036660 I № 2044548, опублшоваш у 1995 рощ).

. 6. Спос1б обробки первинно трипсишзованих кршконсервованнх клтш \ шматочюв оргашв для одержування первинних клтш (авторське свщоцтво № 933703, опублшовано у 1982 рощ),

7. Середовище для консервування клггинних культур (автор-сьи свиоцтва № 1192762 { № 1448627, опублшоваш у 1985 1 1988 рощ, вщповщно).

8. Спсоб адаптаца перещеплюваних клшш до нових умов культнвування (занесено до «1нструкца по виготовленню 1 контролю вакцини р1*дкоГ культуральноГ шактивовано! УНД1ЕВ проти хвороби Ауесш свиней, овець { хутрових зв!р1в», затверджено! ГУВ при Державшй Комка Ради М1шстр1в СРСР по продовольству 1 закушвл1 12 липня 1990 року).

9. Методичщ рекомендацп по одержуванню, культивуванню 1 використанню культур клггин 1 тканин (розглянут! 1_зддвердженГ Вченою радою 1ЕКВМ УААН, протокодЗГэ^б-вщ'? грудня 1990 року). —

10^Методичн{-рекбмендащ1 по крюконсервуванню кл1тинних куль^. -тур"Т1танин в умовах низькотемпературних бащдв^^рШГля'нут! ! затверджеш Вченою ряппю протокол № 26 в1д 7 грудня 1990 року)---------

СПИСОК РОБ1Т, опублщованих по тем! дисертацп

1. Белоконь В. С., Берус П. Т., Герус Г. Б. и др. Особенности мнтотического режима культуры клеток СПЭВ после замораживания // Ветеринария.—-М.: Колос.—1981.—№ 6,—С. 28—30.

2. Белоконь В. С., Герус Г. Б., Берус П. Т. и др. ,• Митотическнй режим культивирования клеток после длительного хранения при —196 °С под защитой ДМСО II Криобиология и криомедицнна,—К.: Наукова думка,—198!.—Вып. 9 — С. 61-64.

3. Гл'ушко Т. О., Маркова О. П., Герус Г. Б., Берус П. Т., Бьтокшь В. С., Красиков Г. А. Вплив крюпротекторт 1 процесу заморожування-розморожуваи-ня на ршт клпин у культ'урп СПЕВ // Ветеринар1я — К.: Урожай.—1981.—"-Вии. 54.—С. 54—56.

4. Стегний Б. Т., Красников Г. А., Белоконь - В. С. Низкотемпературное консервирование в условиях жидкого азота первичных клеточных культур эмбрионов кур // Ветеринария,—К.: Урожай,—1982.—Вып. 55,—С. 48—54.

5. Стегний Б',; Т., Красников Г. А., Белоконь В. С. и др. Консервирование клеток и фрагментов тканей животных // Ветеринария,—М.: Колос,—¡983.— Л? 2.—С. 37—39.

6. Стегний Б. Т., Красников Г. А., Белоконь В,5 С.! Подготовка культуры клеток к низкотемпературному консервированию // Ветеринария.—М.; Колос,— 1983— № 7— С. 36—37.

Белоконь С., Герус Г. Б., Берус П. Т. и др. Оценка жизнеспособности клеток СПЭВ после хранения в условиях гипотермии // Ветеринария.—М.: Колос,—1984. № ].—С. 34—36.

8. Белоконь В. С., Берус П.> Т., Стегний Б. Т. и др. Хранение клеточных культур // Ветеринария.—К.: Урожай.—1984,—Вып. 59,—С. 74—76.

9. Глушко Т. А., Строка В, И., Обозная Э. И., Белоконь В. С. и др. Влияние гипотермии на пролиферативную активность культура клеток //' Ветеринария,—К.: Урожай,—1984,—Вып. 59.—С. 76—79.

10. Белоконь В. С., Берус П. Т., Стегний Б. Т. и др. Сравнительное изучение криозащитных сред для консервирования клеточных иультур // Ветеринария.— М.: Колос,—1985,—№ 12,—С. 34—35.

11. Цимбал1 А. М., Лысенко И. П., Конаржевский К. Е., Белоконь В. С. и др. Лабораторное н производственное испытание пнактивированной культу-ральной вакцины УНИИЭВ против болезни Ауески // Шучные основы .профилактики и борьбы с заболеваниями сельскохозяйственных животных. Сб. науч. тр.—К,—1987,—С. 17—23.

12. Цымбал А, М., Конаржевский К* Е., Белоконь В. С. и др. Вирулентные и иммуногенные свойства вируса болезни Ауески, репродуцированного на перевиваемых клетках линии СПЭВ, культивируемых на различных питательных средах // Ветеринария.—К.: Урожай.—1989.—Вып. 64.—С. 3—4.

13. Кортенко Л. С., ВК'кжшь В. С., Берус Г1. Т. та ш. Виачення умов су-спензШного культивування В1русу хвороби Ауесш // Ветеринары.—К.: Урожай,—

1992.—Вин. 67,—С. 23—25.

14. Мищенко В.. А., Корниенко Л. Н„ Белоконь В. С. и др. РСК для обнаружения антигенов вируса болезни Ауески II Ветеринария.—М.: Колос.—1993>— № 3,—С. 54—55.

15. Дудников А. И., Мищенко В. А,, Захаров В. Белоконь В, С: и др. Инактивированные вакцины против болезни Ауески // Ветеринария.—М.: Колос,—

1993.—ОЧа 10,—С. 21—23.

16. Мищенко В, А., Корниенко Л., Н., Костюченко Л1. Г., Конюшкина Т. Б., Белоконь В). С. и др. Иммуноферментный метод при диагностике болезни Ауески II Ветеринария,—М.: Колос,—1994,—№ 3,—С. 32—34.

17. Б1Локшь В. С. Кл1тшш1 системи: отримання, культивування, збереження 1 застосування для в1русолопчних ! бштехнолопчннх щле'й//Досягнеиня науковоТ ветеринарно! медицини у профьтактищ та боротьб1 з хворобами альськогоспо-дарських тварин (до 70-р1ччя 1ЕКВМ). 36. праць,—Харкрв,—1994.—С. 127—137.

18. Мщенко В. О., Бусол В. О., Бшоюнь В. С. та ш. Вивчення бюлопчних, {муногенних 1 вф.улентних властивостей штам1в УНД1ЕВ-18 «в» { «Арський» В1£усу хворобн Ауеск! // Ветеринарна медицина,—<К.: Урожай.—1994.1—Вип. 69.— С. 6—9.

19. Мищенко В, А., Дудников А. И1., Захаров В. М.„ Новожилова В. В., Базаров М, А., Прохорятова Е. В., Смирнов А. Б.. Бабкин В, Ф,, Бело-конь В. С., Кульбит Р. И. и др. Использование флюоресцентных зондов для идентификации некоторых вирусов животных и антител к ним // Вопросы вирусологии.--"!.: Медицина.—1995,—№ 1.—С. 12—14.

20. Мищенко В. А., Захаров В. М„ Дудников А. И:, Белоконь В, С. и др. Инактнвированная вакцина против болезни Ауески для иммунизации сельскохозяйственных животных и пушных зверей // Вирусные и микробные болезни животных. Сб. науч. тр. ВНИИЗЖ — Владимир,—1995— С. 191—201.

21. Мищенко В. А., Дудников А. И., Пузанкова <3. С., Захаров В. М., Белоконь В. С. и др. Иммунизация жвачных животных вакцинами против болезни Ауески II Вирусные и микробные болезни животных.—Сб. науч. тр. ВНИИЗЖ.— Владимир,—1995,—С. 201—204.

22. Мищенко В. А., Корниенко Л. Н., Корниенко Л. Е., Дудников А. П., Белоконь В, С. Иммунобиологические свойства производственного штамма вируса болезни Ауески // Вирусные и микробные болезни животных. Сб. науч. тр. ВНИИЗЖ.—Владимир,—1995.—С. 205—207.

23. Мищенко В.'А., Костюченко М. Г., Смирнов А. Б., Базаров М. А., Бабкин В. Ф„, Белоконь Ц. С. и др. Диагностическая ценность ускоренного им-муноферментного метода // Вирусные и микробные болезни животных. Сб. науч. тр. ВНИИЗЖ.— Владимир,—1995.—С. 143—146.

24. Бшокшь В. С. Конструюванпя та вивчення ¡муногенних властивостей емульайно! ¡нактивовано! концентратвакцини проти хворо.би Ауесш // Ветеринарна медицина. 36. наук, праць 1ЕКВМ.—Харшв.—1996,—72.—С. 3—11;

25. Бшокшь В. С. Розробка ексирес-метешв для оцшки якосп в1русвмщую-чо1 сировини у процес1 виготовлення емульсШно! шактнвовано! концентратвакцини проти хвороби Ауеск! // Ветеринарна медицина. 36. наук, праць 1ЕКВМ.—■ Харшв.—1996,—72.—С. 19—26.

26. Бшошнь В. С. Виробиич1 випробування емульсШно! шактивовано'1 концентратвакцини проти хворобн Ауесш // Ветеринарна медицина. 36. наук, праць 1ЕКВМ.—Харшв.—1996.—72.-С. 12—18.

27. Бшоюнь В. С. Економ1чна 1 технолопчна ефектившеть виробництва шак-тнвовано! вакцинц проти хвороби Ауесю на основ! перещеплюваних клшш// Ветеринарна медицина. 36. наук, праць 1ЕКВМ.—Харшв,—1996.—72,—С. 27—34.

28. Стегний Б. Т., Красников Г. А., Белоконь В. С. Способ обработки крио-консервированных клеток и кусочков органов для получения клеточных культур // Авт. св. № 933703, опубл. 07.06.1982.

29. Ханина Л. А., Линник Т; П., Шраго М: И., Калугин Ю. В., Черныш Е. Н., Белоконь В. С. и др. Н-оксиэтил-гецта/оксиэтиленморфолин в качестве криопротектора //Авт. св. № 1089090, опубл. 03.01.1984.

30. Цымбал А./ М., Лысенко И. П., Конаржевский К. Е., Белоконь В. С. и др. Способ приготовления культуральной вакцины против болезни Ауески // Авт. св. № 1110168, опубл. 22.04.1984. ________—-~—

31. Шраго М. И„ Ханина Л. А,, Калугин_КХ-Втг--Черныш Е. Н., Линник Т. П.. Кощяй С. В., Белоко)1ь-В.-Сги~др7 Среда для консервирования клеточных кул^ММвтгсСТ^П92762, опубл. 22.07.1985.

—-32ГГршценко В. И., Ханина Л. А., Шраго М. И., Калугин Ю. 1В^. Чекана.

ва В. В,, Балан Л. А., Пйвненко Н. С:, Черныш Е. н « пр

Способ получения криопротектора //Авт "ч-—опубл. 01.09.1988.

33. Мищенко В; А1. К-пртдат^г. .11 н Костюченко М. Г., Белоконь В. С., ^ТНИР'"""**1'^ "к получения диагностической сыворотки к вируф бо-

"лезни Ауески // Патент № 2036660, опубл. 09.06.1995.

34. Мищенко В. А* Корниенко Л. Н„ Корниенко Л. Е., Костюченко М. Г., Базаров М А., Смирнов А. Б., Белоконь В. С. Способ получения диагностической сыворотки к вирусу болезни Ауески II Патент № 2044548> опубл. 17.09,1995.

35. Белоконь В. С., Берус Ш Т., Соловьев С. Т. и др. Методические рекомендации по получению, культивированию н использованию культур клеток и тканей.—Харьков,—1993,—12 с.

36. Белоконь В. С., БерУс П. Т., Стегний Б. Т., Кульбит Р. И. Методические рекомендации по криоконсервированию клеточных культур и тканей в условиях низкотемпературных банков.— Харьков.—1993.—19 с.

37. Дуднийов А. И., Мищенко В.: А., Бондаренко А. Ф., Белоконь В. С. и др. Количественная оценка иммуногенности инактивированной вакцины против болезни Ауески // Вопросы вет. вирусологии, микробиологии и эпизоотологии. Мат. науч. конференции ВНИИВВиМ 13—18 апреля 1992 г.--Покров.—I 1992,—С. 194—195.

38. Белоконь В. С<, Корниенко Л. Е., Волкова М.. В. и др: Концентрирование вируса болезни Ауескн с помощью ПЭГ // Вопросы вет. вирусологии, микробиологии и эпизоотологии 13—18 апреля 1992 г.—Покров.—1992.!—С. 195—196.

39. Бусол В. А,1, Белоконь В. С., Мищенко В. А. и др. Современные аспекты вакцинопрофилактики болезни Ауески // Общая эпизоотология: иммунологические, экологические и методологические проблемы. Мат. междУун. науч. конференции 20—22 сентября 1995 г.—Харьков.—1995. С. 418—421.

Белоконь В, С. Эмульсионная инактивированная концентрат-вакцина против /болезни Ауески (технология изготовления, лабораторное и производственное испытание). >

Диссертация на соискание ученой степени доктора ветеринарных наук по специальности 16.00.03 — ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология,, микология и иммунология. Институт экспериментальной и клинической ветеринарной медицины УААН, Харьков, 1997.

Защищается 39 научных работ, в том числе 5 авторских свидетельств и 2 патента, которые отражают теоретические и экспериментальные исследования по конструированию и разработке технологии промышленного изготовления эмульсионной пнактивиро-ванной концентратвакцины против болезни Ауески на основе крупномасштабного суспензионного культивирования клеток и вируса.

Подобрана технологичная клеточная система, обеспечивающая активную репродукцию и высокое накопление биомассы вируса, предложена технология ее консервирования. Определены оптимальные параметры технологических процессов очистки вирус -содержащей суспензии с помощью проточных ультрацентрифуг, 50—60-кратного концентрирования аэросилом в присутствии ПЭГ или ультрафильтрацией, инактивации препаратами азиридинового ряда. Разработаны экспрессметоды и компоненты для индикации антигена вируса болезни Ауески в полуфабрикатах в РСК и УИФА, количественный метод определения иммуногенной активности вакцины.

В лабораторных- и производственных испытаниях на различных видах животных показано, что вакцина безвредна, авирулентна, экологически безопасна, высокоиммуногенна и экономична. При одноразовом введении в дозе 1 см3 активирует в организме приВИТЫХ ЖИВОТНЫХ ВСС компоненты ИММуННОИ 'С истемы, обеспечивая образование вирусцейтрализующих антител в высоких титрах

37

(6—8 лог2) и противоэпизоотическукьзащиту от инфекции на протяжении года.

Разработанная нормативно-техническая документация на вак цину принята к внедрению на биопредприятии ВНИИЗЖ, гд< освоено ее производство.

Ключов! слова: {нактивована вакцина, хвороба AyecKi, клшши cipyc, cycneH3iH> культивування, антиген, збереження, очистка концентрування, шактиващя, масляний ад'ювант, ¡муногеншсть.

Bielokon' V. S. Emulgated inactivated concentrated Aujeszky' disease vaccine ¡(manufacturing technology, laboratory and produc tion test).

Thesis for MVD degree in specialized field 16.00.03 — veterinar microbiology, virology, epizootology, micology and immunology Institute of experimental and clinical veterinary medicine of th Ukrainian Academy of Agrarian Sciences, Kharkov, 1997.

39 scientific works, including 5 author's certificates and 2 pa tents that represent theoretical and experimental investigations с construction and development of technology of commercial pre duction of emulgated inactivated concentrated Aujeszky's diseas vaccine on a basis of large-scale cultivation of cells and virus i suspension are defended.

Readily producible cell system that ensures active reproductio and high accumalation of viral biomass has been selected and il preservation technology is proposed. Optimal conditions of technc logical processes of virus-containing suspension purification b means of flow ultracentrifuges, 50—60-fold concentration wit aerosil in.the presence of PEG or by ultrafiltration, inactivatic with aziridine-type preparation have been determined. Rapid te methods and components for indication of Aujeszky's disease viri antigen in semifinished items in complement fixation test and rap enzymoimmunoassay, quantitative method of vaccine immunogen activity determination have been developed.

Laboratory and production test on different animals demo strated that the vaccine is harmless, avirulent, ecologically sal highly immunogenic and economical one. In case of a single adn nistration in 1 sm3 dose it activates all immune system^coniponen in the body of vaccinated animals that_exisures-geneTation of viru neutralizing antibodiesjrath^iighTjires-^—8 log2) and antiepizoof jroLection-against infection for a year.

Elaborated technical documentation forthejaayne—fr3s Bei accepted for inb-n<w+inn at я pn+prprico 0f AH-Russi;

Research Insiiiute^trf~7\nimai Health Protection where the vaccii —has-been brought into production.