Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Разработка средств и методов лабораторной диагностики болезни Ауески

Р Г {иинисШЬтш сельского хозяйства российской федерации

Всероссийский научно-исследовательский институт • 3 / 1 ¡10/1 ^ защиты животных

На правах рукописи УДК 619: 576.853:633. ОЗо. 1

дО?1ЕШПШ £г3012» !йот>лгевиа

разработка средств и 1.сзт0д0в лаесраторноя дмгност1шн болезни ауески

16.00.03 - ветеринарная микробиология, бирусология, эпизоотология, микология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на сойскание ученой степени кандидата ветеринарных наук

■Владимир, 1993

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте зашиты животных МСХ РФ

Научные руководители: доктор ветеринарных наук, старший научный сотрудник Мищенко Е А.

кандидат ветеринарных наук, старший научный сотрудник Белоконь ас.

Официальные оппоненты:

- Черняев Юлий Александрович, доктор ветеринарных наук. профессор (ВШИЗЖ, Владимир);

- Куриннов Виктор Васильевич, кандидат ветеринарных наук, старший научный сотрудник (ЕШШВБиМ, Покров).

Ведущее учреждение: Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт, Казань

Защита состоится (_1993 года в 10'

часов на заседании специализированного совета К 120.60.01 по защите диссертации на соискание ученой степени кандидата наук при Всероссийском научно-исследовательском институте зашиты животных по адресу: 600900, Г.Владимир, п/о Юрьевец,

вниизж.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке инсти- .

тута

Автореферат разослан 'Ш-0//&- 1993 года

Ученый секретарь специализированного совета -"ЕЛ. Узюмов

- 1 -

1.0Б2АЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

' Актуальность те!ЯА в настоящее время лабораторная диагностика вирусных болезней предусматривает использование иммунохишческих методов,а основным методом диагностики болезни Ауескн з нашей стране является реакция нейтрализации .(ГОСТ 25763-83, ЕЕСюрин с соавт. , 1991). Недостатками этого теста является: трудность и длительность выполнения, необходимость поддержания соответствуют}: культур клеток и стаммов вируса, а также специальных вирусологических лабораторий. Для диагностики болезни Ауески разработала реакция пассивной гемагглеткнацпи (Юсупов Р.X, Ильясова Г.X., 1975),. но этот метод ке получил широкого применения из-за отсутствия промышленного выпуска диагностикумов. 3 последние годы многими авторами разрабатывается иммуноферментный метод для индикации вируса и скрининга антител. Шесте с тем практическая ветслулйа не имеет в своем распоряжении этих диагностикумов.

•Биологические предприятия, выпускающие вакцины против болезни Ауески, не располагают методами контроля вирусного сырья, кроме установления титра инфекционности. Но поскольку встала необходимость изготовления икактивированной вак-Ш1ны, то возникла потребность в разработке методов контроля инактивированного сырья на" определенных этапам его изготовления. "

Активность и специфичность- диагностических препаратов в соответствующих реакциях зависит от качества гиперкммун-ной сыворотки, получаемой на определенный антиген. Судэст-.вУет много схем и методов иммунизации доноров, которые отличаются друг от друга количеством инъекций, количеством а качеством вводимого антигена и применяемыми адъивантами. Часто схемы получения гипериммунных сывороток подбираются к какому-то определенному диагностическому методу. В доступно? литературе описаны схемы получения диагностических сы-

вороток, с помощью которых можно выявить вирус болезни Ауески ео всех известных серологических реакциях, на белых крысах (Ильясова Г. X., 1975) и свиньях (Сюрин В.Н., 1991). Все это свидетельствует о необходимости разработки методов и средств индикации вируса болезни Ауески, позволяющих в короткий срок обнаруживать возбудитель и определять количество вирусспецифического белка

Цель и задачи ксслздования; Целью наших исследований являлась разработка средств и методов лабораторной диагностики болезни Ауески. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- разработать способ изготовления высокоочишенного, концентрированного и инактивированного антигена вируса болезни Ауески. пригодного для иммунизации доноров и для постановки иммунохимических реакций;

- разработать способы получения высококачественных диагностических гипериммунных сывороток на кроликах и морских свинках;

- оптимизировать постановку реакции связывания комплемента (РСК). твердофазного иммуноферментного анализа (ТФЙФА) для обнаружения вируса болезни Ауески;

- модифицировать методику определения количества вирусспецифического белка в исследуемом материале к вирусу болезни Ауески; ■ ■

- изучить диагностическую ценность иммунохимических методов индикации вируса болезни Ауески в объектах ветеринарного надзора .

Научная новизна. Изучены и определены оптимальные параметры изготовления универсального антигена из высокоочи-ценного. концентрированного и инактивированного вируса болезни Ауески.

Разработана схема иммунизации кроликов . позволяющая получать высокоактивные гипериммунные специфические сыво-псткн. Предложена схема иммунизашгл морских свинок и получения гкпешммунных сывороток к вирусу болезни Ауески. Оп-

ределена диагностическая ценность, полученных сывороток в иммунохимических методах.

• Определены условия постановки качественного й количественного методов РСК и твердофазного иммуноферментного анализа для обнаружения вирусного антигена и определения количества специфического бедка вируса болезни Ауес:си.

Изучена диагностическая ценность разработанных иммунохимических методов для лабораторной диагностики болезни Ауески.

Пршгпгческая зтжийелг. Проведенные исследования позволили разработать л предложить: метод получения универсального антигена из вксокоочишенкого, концентрированного и инактивированного ВЕЛ: способы получения гппериммунны:: сывороток на кроликах и морских свинках. Отработаны оптимальные условия постановки следующих шшунологических реакций: РРИЛ, РСК, количественной РСК, ИФА для диагностики болезни Ауески. Разработанные средства и методы били использована для контроля вируссодержакего сырья при изготовлен!-;", опытно-промышленных серий инактивированной вакцины против болезни Ауески.

Составленные на эти методы методики вошли в науч ко-техническую докунэнтация (НТД) на изготовление инактивированной вакцины к ВВА в условия завода "Юрь'евецветбиопге-парат".

Предложенные методы могут использоваться' для диагностики этого заболевания з ветеринарных и научно-исследовательских лабораториях.

Основные шлоаклия диссертационной работы, выдзгягсе; кг на задету:

• - результаты экспериментов по определению оптимальньт-:

условий изготовления универсального антигена, пригодного для иммунизации доноров и постановки иммунохими-

ческих реакций;

• - схемы гипериммунизации кроликов и морских свинок и-л

получения специфических иммунных сывороток, используе-

- 4 -

мых в ишунохишческих реакциях:

- основные параметры постановки реакции связывания комплемента для выявления ББА и антител к нему:

- результаты исследований оптимизации сандвич варианта твердофазного иммуноферментного анализа для индикации вируса болезни Ауески;

- результаты исследований, позволяющие определять количество вирусспецифического бедка в исследуемом материале.

Апробация работы. Основные материалы диссертации доложены на:

- заседаниях методической комиссии и Ученого совета ВНИ-ЯИ 1991; 1992ГГ.;

_ конференции молодых ученых и специалистов Украины (г. Харьков. 1992):

- научной конференции ВЮШВВиМ (г. ГЬкров, 1992);

-опубликованы в журналах "Ветеринария". -К.: Уро:ай.

1992, 1993.

Публикация. 1Ь материалам диссертации опубликовано 7 научных работ.

Объем и структура работ Диссертация изложена на 128 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, собственных исследбваний. обсуждения результатов. выводов и практических предложений, иллюстрирована 28 таблицами чи 3 рисунками. Список Использованной - литературы включает 201 наименование, из них: 98 источников на русском языке и 103 работы зарубежных авторов. В приложении представлены методики,. инструкции, акты комиссионных опытов. 1 таблица. Все изложено на 43 страницах машинописного текста.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

\ 2.1. Материалы и методы

Вирус. В опытах использовали вирулентный штамм УНИИЭВ' "-8Ье" вируса болезни Ауески, выделенный УНИИЭВ в 1962

году от больного поросенка; а также штамм "К" ВБА, ввделен-ный от лисиц и песцов (пггамм получен из ВИЭВ).

• 2ивоткыэ. В процессе получения диагностических гипериммунных сывороток и для экспериментов использовали лабораторных и' естественно-восприимчивых животных: морских свинок массой 400-500.г - 210 голов: кроликов массой 2,0-2.5 кг - 314 голов; подсвинков массой 40 - 50 кг - 25 голов; взрослых свиней - 16 голов.

Культуры клеток. Основные вирусологические исследования выполнены на: производственной сублинии клеток ВНК-21/2-17, первично-трипсинизированной культуре клеток СП, перевиваемой линии клеток почки сибирского горного козерога (ШГК-30); клонированной суспензионно-монослойной культуре клеток почки эмбриона свиньи казанской (ПШ-ббб/17); гонады козы'(С&-91), селекционированной и депонированной во ВНИЙЗЖ; перевиваемых клетках почки кролика (RK-13). .

Раствор« и реактива. Типовые растворы для вирусологических исследований: 0,852 физиологический раствор, рН 7,2-7,4; 0,15 M фосфатно-буферный раствор, рН 7,4 (ФБР); 0,5 M карбонатный буфер, -рН 9,3: 0,01 M ацетат натрия, рН 4,4; 0,5% гидролизат лактальбумина на растворе Зрла или Хенкса, рН 7,4 (поддэрживаш&я среда для культур клеток); поддерживающая питательная-среда Игла; мединал-вероналовый буфер; 1,5-22 раствор агара; 50% раствор полиэтиленглнколя - отечественного производства (ПЭГ-115); 35-40% рздтвор формальдегида;. .18-26% раствор ам5Нозтилэтилеиимика (АЗЭЮ; раствор хлористого цезия с плотностью 1.33-1,34 г/èfA лри-готовленный на 20%'растворе сахарозы; 15-25% растворы саха. розы.'консервант Мигулиной; неполный масляньИ адьювант ВНИ-'ЯИ. серии 3310;. 2-3% растворы аэросила марки А-300.

Наработка и оценка качества вирусной суспензий. Вирус болезни Ауески, . полученный из УНИИЭВ (6 пассаж на культуре клеток СГГЭВ с титром ИЕфекшюннс.сти 7.51 1сгТЦД jq /мл) . ико-' кулировали кролику. Из мозга кролкса, забитого в атональном

состоянии с признаками болезни Ауески, готовили 10% вирусную суспензию и в течении 7-8 последовательных пассаяей адаптировали его к шнослойным культурам: ВНК 21/2-17, ПЗГК-ЗО, ППК-666/17 и СП. Оптимальная доза заражения -0.5-1,0 ТПДзд вируса на клетку. Инкубацию проводили при +37"С и прекращали при наличии в культуре до 70-95 % пора-генных клеток. Вируссодержащую суспензию проверяли на стерильность и определяли титр инфекционности на культуре клеток СП по общепринятой методике. Расчет титра инфекционности проводили по методу Кербера в модификации Ашмарина и выражали в 1к ТЦД 50/мл.

Очистка вирусной суспензии. Очистку вирусной суспензии от клеточного детрита проводили промораживанием и осаждением, а также с помощью химических реагентов. Степень очистки определяли по снижению количества белка в пробе. Концентрацию белка в пробах определяли спектрофотометрическим методом при длине волны 280 нм и по методу Лоури.

Киактивациз вируса. Инактивацию вируса теплом проводили при 460°С в течение 1 часа. Кроме того, для икакгивациа вируса использовали формальдегид в концентрации 0,3-0,5 аминозтилэтиленимин 0.15 X. Режим инактивации формальдегидом 5 суток, а АЭЭИ - 18-20 часов при температуре +37° С.

Серологические реакции.

Реакции нейтрализации (РН) осуществляли на первичной культуре клеток СП по общепринятой методике с двукратным разведением исследуемых сывороток и постоянной дозой вируса - 100 ТПД^/мл. (ГОСТ-25763-83). Жммуноферментный анализ (КМ)' проб на наличие антигенов вируса, болезни Ауески проводили сандвич вариантом ТФ ИФА. который предусматривает сенсибилизацию лунок паней иммуноглобулином и выявления антигена антителами конъюгированными с пероксидазой хрена. }.:;-годш-э постановки ИФА аналогична ранее описанной (Миценко

а А. и соавт., 1987) для индикации ящура, ВВС, ВЭС.

Рэахци» дкффузиоЯ преЕрпвоацта! (РДЩ ставили по общепринятой методике, используя 1,5 % раствор агара.

Реакдгта рздаал&ксй г&йукодгзйузйн (РРИД) ставили по сх??/е, ранее предложенной Мищенко Е А. (1976) для определения антител к вирусу ящура

ВЫч&сениэ к »сягкггфжацкя гмруса болсззлз: Ауесгси ул ор~ гггаз и тхакой. Для выделения ВБА из органов и тканей использовали кроликов и мокослойную первичную культуру клеток СЕ Материалом для заражения служила 10 % суспензия из органов и тканей кроликов, свиней. Объем инокулята составлял 0.2 мл для культуры и 1.0 мл для кроликов. Наблюден;:5 за культурой вэли 72-96 часов, з за кроликами - 10 сутск. При появлении Еыраченного ППЯ культуру клеток проморссзшали н исследовали а РРИД, КФА и РСК В случае отсутствия ЦПД проводили 2-3 "слепых" пассажа.

Статистическая обработка результатов ксследозздсст. 11а«-дый опыт проводили не менее трех раз. Для обработки результатов исследований использовали общепринятые в биологии и вирусологии методы статистической обработки (по методу -Клебера в модификации Ашмарина НЕ).

2.2. Результаты »яжлэдгаакка

2. 2.1. Разработка способа хзготозлешгя утпжерсальксго акткгекг. исруса болезхи Ауссхн Исследование чувствительности.различных культур клеток для размножения ВБА показало, что на культуре клэто;: ПСГК-30 вирус размножался быстрее, чем на других культура:. #однако титр инфекционной активности оставался относительно невысоким - 7.5-7.58 1к ТЦД^/мл. Более стабильные результаты по накоплению вируса были получены на культуре клеток ВЦК-21/2-17, где титры инФекционности достигали 7. 01~6,'гЗ 1'к ТПДдр/Ш! к обладали наивысшей КС-активностью. Спы-.'ы наказами что "урезай" ВВА с 3 по 7 пассаж на культура

- ' . - 8 - • Л -

ЗНК-21/2-17 можно использовать для изготовления универсального антигена.

Изучая динамику накопления вируса болезни Ауески в процессе суспензионного культивирования в культуре клеток ЕНК-21/2-17. установили, что использовать вирус для изготовления универсального антигена необходимо при 78,4+1,3% гибели клеток. По времени культивирования это составляет 40-42 часа. Дальнейшее культивирование не приводило к повышению КС-активности вируса и незначительно повышало титр инфекционности. (Работу проводили совместно с технологом ЦЗЛ завода "Юрьевецветбиопрепарат" Корпуеовой Т.И.).

Поскольку вопросы очистки ББА от клеточных белков пока являются нерешенными, то в наших исследованиях по изготовлению универсального антигена, вирус подвергали различным •методам очистки, применяя, как физические, так и физико-химические способы освобождения от балластных белков. Оказалось. что центрифугирование при 3000 е: (20-30 минут).малоэффективно, так как степень очистки составила 32,3+1,61, при 10 ООО й (15-20 минут) процент очистки значительно повышался до 83,96±0,6%. Максимальной степени очистки вирусных частиц от примесей достигали с помощью совмещения скоростного и изопикнического центрифугирования, используя двойной градиент (хлористого цезия и сахарозы). С этой целью 100-кратный вирусный концентрат наслаивали на линейный градиент плотности СБС1-сахарозы (502 СбС1^=1.3 г/ыл; 15% сахарозаводе г/мл объем на объем) и затем центрифугировали в течение 6 часов при 98 ООО е в бакет роторе АН-627 (6x36) центрифуги 0ТД-65В.

Фракционирование- содержимого пробирок проводили с по- . мэшью проточного спектрофотометра ЧЫсогс! II" при длине волны 254 нм. • ' ■ . . ....

Электронно-микроскопические исследования показали, что. полученная ^суспензия имела достаточно высокую степень очистки и содержала большое количество полиморфных вирусных частиц размером 180-190 нм.

- 9 - :.

Таким образом полученные препараты имели высокую степень очистки 99,97±0.02Z и сохраняли иммукологичемкие свойства ВБА. Количество специфического белка составило 7.5

ЮТ/МЛ.

Установлено.что наиболее эффективно вирус инактивиро-Еался ижюэтилэтиленкмиком при 37 С - 18-20 часов. Последующее концентрировать в 100 раз гюдизтшенгхкколем и очистка концентрата при 10000 к 15-20 минут способстБов;ии получению универсального антигена, активность которого была в РСК 5,0-8,0 логА, а вируса на культуре клеток СП на 1,5-1,75 ТПД^/ул зше. чем в исходном.

2.2.2. Разргбокса erccaöon пждпятт™ .-.гбсргторг&к ; «г^от-ньк для голуч'зюгя rJ3i.px?2.iyina« аа-рсток к ESA

При использовании схемы иммунизации свиней (Сюрин В. IL и соавт.. 1991) были получены гипориммункые сыворотки к ВБА, , активность которых составила в РСК - 8.66+0.38 лог?_; РДП - 6,0±0,01 лоп, : РРИД - 9,95+0.37 лог, ; РН - 10.25+0.15 лог? . Однако, полученные от свилей диагностические сыворотки имеет оуиественный недостаток, 'гзклхгрлошйся в том, что они могут содержать антитела не только к ВБА, но и к другим вирусам, которыми латентно контгмикировань: доноры. Диагностические препараты,' полученные из таких сывороток, могут ■ привести к ложным результатам. Поэтому мы режили испытать в глчестЕе доноров специфических сывороток кроликов и морских свинок.

В большинстве случаев имеющиеся схемы иммунизации кроликов ' разрабатывались или подбирались к какому-то определенному диагностическому методу. Основной недостаток этих схем - это длительность процесса получения сывороток.

Предлагаемый способ получения диагностических сывосо-ток включает трехкратную и!.й^унизаш:ю кроликов ямудьгисован-' ным антигеном ВБА, который готовили из инактивтосваннсго

- 10 -

концентрированного культурального вируса.

Согласно предлагаемой схеме иммунизации первую инъекцию антигена проводили в межпальцевые пространства задних конечностей кроликов в дозе 2,0 мл. Вторая инъекция на 8-10 день после первой в подколенные лимфоузлы по 1,0 мл. Третья инъекция спустя 19-25 дней с момента первого введения -внутривенно по 1,5-2,0 мл. Обескровливание животных проводили на 29-35 день после первой иммунизации. Для сравнения эффективности предлагаемой схемы иммунизации параллельно иммунизировали кроликов идентичным антигеном ББА, по способу описанному Карди и соавт. С1990), предусматривавшим четырехкратное внутримышечное введение инактивированного эмульгированного антигена в дозе 2,0 мл на животное, интервал между инъекциями составлял 2 нежели. Срок получения целевого продукта 60 дней. Результаты исследований полученных сывороток представлены в табл. 1.

Таблица 1

Активность гипериммунных кроличьих сывороток, полученных с использованием различных схем иммунизации

I---1-1----1

I Иммунизация |Кол-во| Активность сывороток (лог^) п=3 I доноров' | живот-Н---1-—г~-1-

ных I РДП I РРИД | РСК I РН —-i--i--i--h--

I lío предложен- II | II

Iному способу | 10 14,3±0,0817,63±0,13|б,О +0|7,25+0,03

I По способу. II I II

¡описанному | | | | |

¡Карди И соавт. I 10 |3,5±0,0916,9 +0,1115,35+016,9 ±0,04

!---1-1-1___i_i_!_i

\

Получек;,je данные свидетельствуют о том, что разработанный способ гипериммунизацш кроликов позволяет получать

за 29-35 дней специфичные, высокоактивные иммунные сыворотки. которые можно использовать для изготовления диагностических препаратов.

Известно, что морские свинки, как доноры диагностических сывороток для' РСК при ящуре, превосходят многие другие виды'лизотньж (СеСко А. И. 'и соавторы. 1958-1974). Исходя из отого. было ресено испытать морских 'сзинок. как доноров диагностических сывороток при болезни Ауески. Предлага-

Таблица 2

Результаты опытов по получению диагностических сывороток к ВБА на морских явннках

~г

IХарактеристика антигена, применяемого NN | для иммунизации

п/п| Штамм! Система | А;ггивность вируса

I ВБА I репродукции |-1-

I I ,|на культуре СП| в

I

I

.(1йТИЛ^,/мл) 1РСК

Н-

15.0

17.0

|5,0

18,0

15.0

Количество

доно-роз

Средний титр сывороток в РСК (лог4)

п=3

1 IУНИЙЭ-В1МонослойнаяI 8.98+0,14

|"18Вс"1ВНК-21/2-17) •

.2 I-" - (СуспензиоТй-1 9,25+0 I . {ная ВНК-21/1 ' I- 12-17 I

3 1-"- |Шкослойная| 8,89+0,13 I ■ 1ШГК-30 I

4 1ВЮВ - Юуспенэиок-1 9.75Ю |"К" |ная ВНК-21/)

I 12-17 I

5 I- " - Щонослойная! 8,66+0.1 I 1ПСГК-30 I

70 80

20 40

20

6.33Ю.07 7,33+0.11

6.33+0.С8 8,53+0,17

5,бб+о.да

емая схема иммунизации предусматривает трехкратное внутримышечное введение антигена ББА в дозе 1,0 мл на 1, 20 и 28 дни. Целевой продукт получали через 35-40 дней с начата иммунизации. Из всех испытанных антигенов для иммунизации самые активные сыворотки были получены на эмульгированный антиген с масляным адъювантом ВНИЯИ С Дудников А. И. и соавт.), где вирус инактивировали АЭЭИ и концентрировали в 100 раз полиэтиленгликолем. В табл. 2 представлены результаты исследования сывороток, где вирус, используемый для изготовления антигена, нарабатывали на различных культурах и в разных системах культивирования.

Установили, что существует прямая зависимость между активностью антигена и титром диагностических сывороток. Эти данные подтвердились при получении гипериммунных сывороток от морских свинок на дга штамма ВБА - УНШЭВ-"18Вс" и ЕИЭВ-"К".

Таким образом, впервые разработан способ получения гипериммунных, сывороток к ВБА на морских свинках, позволяющий получать специфичные и высокоактивные сыворотки, на основании которых были определены оптимальные условия постановки РСК и ее'количественного варианта Также полученные сыворотки использовали при постановке ИФА, РРИД, РДП, РЕ

2.2.3. Опхийизащи постанозмс! рэакцаа связывшшя ко:,пле-мэгаса (РСК) для индикации вируса болезни Ауесзш

При разработке этого метода предусматривалась цель: определить оптимальные условия постановки РСК для индикации. ВБА и изучить ее диагностическую ценность. Особое внимание. при разработке было уделено подбору дозы комплемента, повы-' шению чувствительности реакции. В результате опытов было установлено, что в реакцию комплемента необходимо брать с избытком в 0.6% от предельного титра, так как такое его количество способствует выявлению антигена Титровать комплемент лучше в гс«системе, а 1 ЕД комплемента равна 0,3%.

- 13 - .

2.2.3.1. ЕьЗор опгаял&вого способа лодготозж! иссдодуекой 1фоби к анализу

Одним из основных требования, предъявляемых к диагностическим средствам и методам, является санитарная безопасность. В этой связи были проведены исследования по изыс!санию простого, быстрого и надежного способа получения азирулентного антигена, пригодного для исследования в РСК и ИФА. Полученные экспериментальные данные по инактивации ВБА формалином свидетельствуют о том, что формальдегид вызывает антикомплементарность антигена. Аминоэтилэтиленимин в концентрации 0.15Х не оказывает влияния на КС-активность вируса. но срочность постановки реакции иногда не позволяет ждать 18-20 часов, в течение которых происходит инактивация. В этой связи изучена возможность использования в РСК антигена ВБА. ивактивированного теплом Установлено, что прогревание ВВА при +60"С а течение 60 минут инактивируэт его, не оказывая отрицательного влияния на КС-активность вируса

2.2.3.2. Дигстюстачоская цэшгоста разрабеташ'гоа POS

Разработанную РСК можно применять для диагностики на любой стадии течения болезни Ауески. В период острого течения болезни - для выявления вируса в суспензиях из органов и тканей, в период выздоровления и -затухания .эпизоотия -для определения уровня КС-антител в сыворотках переболевших животных. РСК' позволяет идентифицировать цитопатогеняый агент в культуре клеток. В табл.3 представлены- результаты исследований культуральных вирусных суспензий, которые свидетельствуют' о том, что РСК позволяет*обнаруживать ВБА при инфекционной активности не менее 5;5- 6.0 lg ТЦД^/мя. РСК имеет ряд преимуществ по сравнению с традиционно пгашнле-

'' Таблица.3

Сравнительная оценка инфекционной и комплементсвязывающей активности ВБА

—I—:—'—;-H—:-;-1

I Ш.1 ВБА, репродуцированный I Активность вируса I

¡п. ni на культуре клеток j----1-1

II- I на культуре клеток I в РСК |

J I Г СП (1кТ1%0/мл) | I

Ь -Ч---1---1-1

I 1 I СП (шнослойная) I 7.33 + 0.09 '! 1:2 I

I g | - .. - - --| 5,37 + 0.1 I H/a, I

I 3 ! -" - " --I 6.75 + 0 ; I ц I

I 4 \ ВНК-21 (монослойная) I 7,65+0,14 I 1:4 I

15 1 - " - " --I 8,06 + 0,09 I 1:8 I

' I 6 I - "--" --I 7,5 ± О I 1:4 |

¡71 - » - « _ j 7,29 ± 0.08 I 1:2 I

I 8 | ВНК-21 (суспензионная)! 8,25 ±0 '" I 1:8 I

19 1 - " - " --! 7,82 + 0,09 Ï 1:8 I

! 10 t -—" --I 8,5+0 , ! 1:8 I

111 I - » -« --| 8,06 t 0,04 I 1:8 I

112 I ПСГК-30 I 7,75 t О I 1: 4 I ¡13 1--» »—- | 7,58 + 0,09 I 1:2 I

114 I - " -"— ! 7,33 ± 0,08 I 1:2 I

115 I -«._>>_ ' | 5.5 ± 0 . I н/а I

■ ■ __■__:__1_I'

Примечание:-"н/а" - не-активен в РСК. ;

мой биопробой и последующей идентификацией вируса в -.реакции нейтрализации, так как сокращаются материальные затраты и сроки постановки диагноза.

. rpiNiaa еыседсна С v—.ETCM nO.TilC!!-кого кмрфицнёнта

- иокемзи

шпибрмочпм крвзая

-1-1--i-----1-1-г

0 025 0,075 0,125 0,175 0,225 0,275

охга о.юз а.1ш> о,;оэ о,25в

4icri0,5 мл

Рис. 1. Коррелятивная зависимость между оптической плотностью и количеством белка ВБЛ

2.2. л. Разработка, количественного метода

вирусного сырья при гззгстоздошэт'зппгкгквй-ровашгах паяция ярж® бэлездо Аусс:а

Для контроля количества вирусного белка в суспензиях, используемых для изготовления инактизироваяных вакцин, был разработан количественный вариант РСК. За основу была взята методика постановки этой реакции, разработанная А, Ф. Бонде-ренко (1980)которую модифицировали для ВБА.

Для определения вирусного белка,- выражнного в весовых единицах; необходимо построить калибровочный' график, который выражает зависимость медду'количеством вирусного белка в весовых-'едишщах и комплементсвязываюшэй активностью baD. Для построения калибровочной кривой использовали концентрированный в 100 раз полиэтиленгликолем подвергали очистке в градиенте хлористого цезия ВБА. Этим методом вирус очистили 'на 99,97+ 0,02%. Определяя общий белок в очищенной суспензии по методу Лоури, установили его содержание, равное 7,5 мкг/мл. Используя схему постановки этой реагами, установили разведение, при котором «D=0,6- 0.7. Затем суспензию разно-

- 16 - • . лили' в 15 раз и из нее готовили- ряд:. разведений, . каждое последующе разведение содержало вирусного белка-на 10% меньше", чем предыдущее.

На основании этих данных был построен график, по которому можно определить количество вирусного белка в исследуемой пробе после определения оптической плотности в количественно?, реакции. Определи*;^ исследуемой пробы, на графике находили соответствующее количество вирусного белка. . Далее расчет вели по формуле

ы- где

0,5

V - количество вирусного белка (мкг/мл);

^- количество вирусного белка (мкг/0.5 мл) при определенной оптической плотности (¿0);

2 - кратность разведений;

1 - перерасчет на 1 шц

0.5 - образец, взятый в реакцию. При замене какого-либо компонента реакции иди использовании эритроцитов от другого донора построение графика необходимо проводить' заново. В связи еэтим мы опрзделили коэффициент зависимости между ^ и который составил 0,37±0,008. Тогда формула примет следующий вид • , ,п „

V

Цо '

Значения по определенному белку были идентичны или близки к-значениям, полученным по методу Лоури. В результате опытов бщо установлено, что в культуральной вирусной суспензии, (не концентрированной) количество вирусного белка составляет '14-20 ьйг/мл. ''.-■'..

2,2.5. Разработка км^унофэ^^энткого' ькгтода для ннди-наци» ВБА

При отработке условий постановки твердофазного иммуно-ферментного анализа для индикащш ВБА установлено, что наи-

более приемлемым является сандвич вариант. В качестве испытуемых антигенов использовали 102 суспензии из органов и тканей животных, а таке культуры клеток СП. ЕНК-21, ПСГК-30, инокулированные вирулентным вирусом болезни Ауески. Иммуноглобулины, необходимые в качестве.препаратов антител . для сенсибилизации твердой фазы и приготовления коньюгатов, выделяли из специфических гипериммунных сывороток от кроликов и свиней. Всего было выделено 8 серий глобулинов: 5 из свиных сывороток и 3 из кроличьих, активность которых составила в РРИД 1:160 до 1:1280. При использовании специфических иммуноглобулинов из сывороток было приготовлено 6.серий пероксидазных конъюгатов, активность которых была в ИФА 1:80 -1:500.

Отрабатывали дозу иммуноглобулина для сенсибилизации, оптимальные разведения специфических пероксидазных конъюгатов. Для определения титров полученных специфических глобулинов и пероксидазных конъюгатов, проводили их "шахматное" титрование со специфическим антигеном и неинфицированной культурой клеток иди другим чужеродным антигеном. Титром специфического конъюгата считали максимальное его разведение, которое выявляет минимальное количество специфического антигена Для постановки сандвич варианта ТФ ИФА их использовали в рабочем разведении, равном удвоенному титру. Диагностические препараты полученные в результате многочисленных опытов позволяют обнаруживать ВБА в органах и тканях с очень низкой активностью 1.7-2,0 ХйТЦД^/мл.- В 'результате исследований установили, что чувствительность этого метода в 10-12 раз выпе. РСК и й 2-3 раза выше РРИД.

2.2.5. Диагисстаческая ценность разработанных средств и ютодол для яцдикацки вируса болезни Ауески

Разработанные нами методы индикации ВБА нашли практическое применение, так как оказались эффективными при диаг-

- 18 - . ноетикй этого заболевания у сельскохозяйственных животных. В лабораторных условиях проведены опыты по выделению вируса из органов и тканей павших и вынужденно убитых животных. Кооме «того, полученные - диагностические препараты были использованы и в производственных условиях при всшжке этого заболевании в хозяйствах Туркменистана

В результате исследований ЕЗА был выделен от подсвинков. норок и кроликов инфкцирс; анных культуральным вирусом. а такке- спонтанно заболевших зеэблюдоп.

Более высокие титры вируса от 3.0б±0.1 до 4,37+0,4 1к ТП2',/ш1 установлены у подсвинков в пробах головного мозга, легкого, печени и подчелюстных лимфоузлов, а у хряков - ь семенниках.

У кроликов в пробах головного мозга, легкого, подчелюстных лимфоузлов вирус обнаружен в титрах 2,52-3,1+0,09 1е тед^/мл.

У норок в головном мозге и печени титр вируса составил 1,9+0,03 -2,2+0,1 ТДД^/мл. У верблюдов более высокий титр вируса, 1,63+0,07 - 1,75±0,1 ТЦД^/мл, установлен в легком и печени, ранные по выделению ВБА из органов и тканей подсвинков, норок и кроликов. а тага© спонтанно заболевши: верблюдов, свидетельствуют о присутствии возбудителя в исследованных объектах, что расширяет диагностические возможности использования как прямого выделения вируса, так и применения для этих целей иммунохимических реакций. Результаты исследований суспензий из органов и тканей от животных, больных болезнью Ауески. в разработанных серологических реакциях представлены в табл. Ч

.Результаты исследований,. представленных в табл. Н, свидетельствуют о разной чувствительности этих реакций. Более чувствительным оказался ЙФА, позволяющий определять'.ВБА при титрах шфекшюнности 1,7-2,0 Из всех применен-

ных нами серологических реакций менее чувствительной оказалась РСК. Однако после биопробы вируса на"культуре клеток в . большинстве случаев и в РСК были получены положительные результаты. ■ .

Таблица Ц

. Исследование патматериала от свиней и кроликов, экспериментально засаженных ВБА

1- 1Ш 1пп. 1 1 » — — ■ —-1 Органы и ткани Кол-во иссл. проб ........... I........... Титр инфек-1 Активность ционности 1 (лог.) (1кШя,/мл) 1-1- 1РСК1 РРИД вируса! в ! ИФА I

1 1 А. ¡Свиньи 1 1 1 !

I 1 (Головной мозг 26 3.8 ± 0,161н/а| н/а 2.5 |

1 2 ¡Легкое 26 4.08 ± 0.091 ц 1 3,35 3,66 |

1 3 ¡Печень 26 3,39 + 0,17|а/к| 3,35 3,66 |

1 4 Шодгл. лимф, узлы 26 3,06 ± 0.1 |а/к| н/а ц 1

1 5 ¡Селезенка 26 1,87 + 0,011н/а| н/а Ц 1

1 6 ¡Почки 26 2,0 ± 0,031н/а( н/а ц !

1 7 1Семенники 3 4,37 + 0,4 I ц I 3.35 4,35 I

1 8 ¡Мышцы 17 2,63 + 0,081н/а| н/а Ц 1

1 9 1Сердце 26 1,7 ± 0,09|н/а| н/а Ц 1

ПО 1 ¡Слизистая к-кз 6 1,5 + 0,061н/а| 1 | н/а н/а 1

I 1 Б. ¡Кролики 1 ( 1 !

1 1 ¡Головной мозг 25 3,1 ± 0,181н/а! н/а ц !

1 2 ¡Легкое 25 3,07 ± 0,09|н/а| н/а ц 1

1 3 ¡Печень 15 1,92 ± 0,2 1н/аI н/а Ц 1

1 4 Шодгл. лимф, узлы 15 2,52 ± 0.041н/а! н/а ц !

1 5 ¡Селезенка - н/и .} н/и 1 н/и н/и I

1 б (Мьпшы 14 0.5 ± 0.1 |н/а| н/а н/а (

1 7 ¡Почки 6 1.0 ± 0,07|н/а) н/а н/а }

I' 8 1 1 Сердце 24 0.5 ± 0,1 |н/а? 1— .. ;.' ______ .,, 1 н/а н/а ( ...... ......1

Поимечания: "н/а" - неактивен:

' "ц" - в цельном виде;

. . "и/и" - не исследовали; .

"а/к" - в РСК антикомплем.

Тага©' установлено, что через 8-10 часов после гибели экспериментально засаженных животных виоус из органов и тканей выделить.не удалось ни на культуре клеток, ни з серологических реакциях. Поэтому для исследования по вирусо-Еыделению необходимо отбирать пробы от животных, убитых в атональном состоянии, или тотчас после их гибели.

-20-■ '■■ 1ЖЩГ •

1. Разработан метод получения универсального антигена вируса болезни Ауески для • иммунизации доноров диагностических сывороток и постановки иммунологических реакций с использованием очистки культурального (БНК-21/2-17, ПСГК-30) вируса центрифугированием, концентрирования полиэ-тиленгликолем и инактивации ашноэтилэтиленимином. .

2.- Предложена схема иммунизации кроликов, которая обуславливает получение в течение 29-35 дней гипериымунных сывороток с активностью в РСК - 6,0 лог^. РДП -. 4,3±0,08 логА. РРИД - 7,63+0,13 лог^ и РН - 7.25+0,03 ло£. Сыворотки пригодны для изготовления диагностических препаратов.

3. Установлено, что морские свинки являются наилучшими, продуцентами гипериммунных сывороток к вирусу . болезни Ауески, используемых для РСК. Разработанный метод иммуниза-г ции позволяет получить сыворотки за 35-40 дней с активностью в РСК - 5,66±0,09 - 8,55*0,17 лог^. РН - 7,05+0,04 логс, РРИД - 6,31+0.03 лог^. ' ' . ■ "...■ '

4. Отработаны оптимальные условия постановки, реакции связывания комплемента для идентификации вируса болезни Ауески в культурах клеток и суспензиях из органов.и тканей животных, инфицированных указанным возбудителем.

. 5. Модифицирована методика постановки количественной РСК. обеспечивавшая возможность определения количества ви-русспецифического'белка в суспензии при промышленном куль-' тивировании вируса-болезни Ауески для изготовления ин'акти-вированных вакцин и диагностических препаратов.

6. Разработан сандвич вариант ТФ ИФА. 'позволяющий выявлять специфический антиген в' вируссодержащих культураль-ных материалах в титрах 3,5-4,0 ХеТПДж/ыл- и в суспензиях из органов и тканей при титре инфэкционности не ниже 1.7-2.0 ХеТЦД^/мл. Метод отличается высокой специфичностью и чувствительностью в 10-12 раз выше РСК И в 2-3 раза выше РРИД. .

- 21 -

7. Предложенный комплекс иммунохимических экспресс-методов - РРИЛ. РСК. количественная РСК. ТФ ИФА - нашел практическое применение для лабораторной диагностики болезни Ауески и контроля количества вирусспецифического белка при изготовлении инактивированных вакцин.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДИШЕНИЯ

На основании экспериментальных исследований составлена следующая научно-техническая документация:

1. "Инструкция по изготовлению и контролю эмульсионной инактивированной вакцины ВНИШ - УНИИЭВ против болезни Ауески из культурального вируса", утвержденная Начальником ГУ МСХ Украины П. П. Достоевским 28 января 1992 года.

2. "Временная инструкция по изготовлению и контролю гипериммунных сывороток морских свинок против болезни Ауески, полученных на инактивированный вирус, для иммунохимических реакций, используемых при болезни Ауескй", утвержденная директором ВНИЯИ 12. 05.1992 года

3. "Наставление по индикации вируса болезни Ауески в реакции связывания комплемента", утвержденное директором ВШИЗЖ 12. 09.1992 года

4. "Временное наставление по индикации гируса болезни Ауески ускоренным твердофазным иммуноферыентным методом с пероксияазным конмогатом", утвержденное-директорами УНИИЭВ и ВНИЯИ б. 02.1992 года ■

5. "Временное наставление по.количественному определению вирусного белка э реакции связывания комплемента пои болезни Ауески". утвержденное директором БШШЗЖ 12.09.1992 года Выше перечисленная документация передана заводу "Юоь-евецветбиопоепарат" для практического применения.

- 22 -

. сзшаж научных работ, опушшованньк по и&териалш

диссертации ' •

1. Велоконь ЕС.., Коояиенко Л.Е. , Волкова М.Е. Бондаренко к. Ф., Ш'.кенга В. А., Корниенко Л. Н. Концентрирование вируса болезни Ауески с помэиью ПЭГ. // В сб. Вопросы ветеринарной вирусологии, микробиологии и эпизоотологии. -

- Покров, 1992. -с. 195-196.

2. Дудникоб А. И., Мищенко Е А.. Бондаренко А. Ф., Волоком. Е С., Корниенко Л. Е. . Костюченко М. Г. , Никитин Е А., Корниенко Л. Е Количественная оценка иммуногенности ^нактивированной вакцины против болезни Ауески на свиньях. // В сб. Вопросы ветеринарной вирусологии, микробиологии и эпизоотологии.- Покров. 1992. -с.194-195.

3. Корниэнко Д. Н., Корниенко Л. Е. , Велоконь Е С. , Мищенко Е А. Получение гипериммунных сывороток к вирусу болезни Ауески на свиньях. // Проблемы ветеринарной медицины по обслуживании животноводства коллективных и фермерских хозяйств. - Харьков, 1992. -с. 20.

4. Корниенко Л. Е , Велоконь ЕС., Ывденко ЕА. Оценка качества вирусного сырья при изготовлении инактивированной-вакцины против болезни Ауески. // Проблемы ветеринарной-медицины по обслуживанию животноводства коллективных и фермерских хозяйств. - Харьков, 1992. -с. 21-22.

5. йэрниенко Л. Е. , Еелоколь ЕС..- Берус П. Г., Бондаренко А. Ф., Мищенко В. А.. Костюченко М. Г.. Корниенко Л. Н.. Ле-' бедева Е М. Изучение условий суспензионного культивирования вируса болезни Ауески. // Ветеринария. -Кг Урожай, 199?: -с. 23-25.

6. Мищенко ЕА.. Корниенко ЛЕ. . Корниенко Л.Е. Дудников А. И.. Костюченко Ы Г. ,• Никитин В. А.Велоконь ЕС.... Тю-

• рина Т. Е Способность инактивированной вакцины ВНИ-ЯИ-УНИИЗВ против болезни Ауески препятствовать носи-тельству патогенного вируса. // В сб. Вопросы ветеринарной вирусологии, микробиологии и эпизоотологии. - Покров,

1992. -с. 191.

7. Мищенко Е А.. Дудников А. И. , Бондаренко А. Ф. , Белоконь В. С. . Корниенко Л. Е . Костюченко М. Г. , Метликина Е А. , Никитин Е А., Захаров ЕII.. Корниенко Л. Е. Оценка имму-ногенной активности инактивированной вакцины против болезни Ауески на кроликах. // В сб. Вопросы ветеринарной вирусологии, микробиологии и эпизоотологии. - Покров, 1992. -с. 194.