Диагностическое значение реакций клеточного иммунитета при туберкулезе крупного рогатого скота

Савицкая, Оксана Александровна

Диссертации по ветеринарии → Ветеринарная эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Диагностическое значение реакций клеточного иммунитета при туберкулезе крупного рогатого скота

ДИССЕРТАЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

Савицкая, Оксана Александровна Москва 2004 г.

Ученая степень: кандидата ветеринарных наук

ВАК РФ: 16.00.03

Автореферат диссертации по ветеринарии на тему Диагностическое значение реакций клеточного иммунитета при туберкулезе крупного рогатого скота

На правах рукописи

САВИЦКАЯ ОКСАНА АЛЕКСАНДРОВНА

ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ РЕАКЦИЙ КЛЕТОЧНОГО ИММУНИТЕТА ПРИ ТУБЕРКУЛЕЗЕ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Москва - 2004 г.

Работа выполнена в ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко (ВИЭВ им. Я.Р.Коваленко)

Научные руководители:

доктор ветеринарных наук А.Х.НАЙМАНОВ доктор биологических наук О.А.ВЕРХОВСКИЙ

Официальные оппоненты:

Заслуженный деятель науки РФ, доктор ветеринарных наук, профессор В.А.БУР ЛАКОВ (МГАВМиБ им.К.И.Скрябина)

кандидат биологических наук, Г.И.УСТИНОВА (ВИЭВ им Я Р Коваленко)

Ведущее учреждение:

ФГУ Всероссийский государственный научно-исследовательский институт контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ФГУ ВГНКИ)

Зашита диссертации состоится (:/» ЦСнРНлА, 2004 года в Щ часов на заседании диссертационного совета Д.006.033.01 при ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. ЯР Коваленко по адресу: 109428, г Москва, Рязанский проспект, 24/1, ВИЭВ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ ВИЭВ им Я.Р Коваленко

Автореферат разослан « 9ЛЛлЗи\ 2004 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор ветеринарных наук,

профессор__э Н.П.Овдиенко

Зхог - \

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Туберкулез продолжает оставаться одной из наиболее сложных проблем инфекционной патологии в большинстве стран мира, включая Россию. Несмотря на проводимые профилактические и оздоровительные мероприятия, эпизоотическая ситуация по этой болезни остается напряженной и даже чревата осложнениями.

Тем не менее, и в настоящее время прижизненная диагностика туберкулеза крупного рогатого скота имеет две главные противоположные проблемы: с одной стороны - перевыявление, т.е. выявление здоровых животных с «парааллергическими» реакциями на туберкулин в благополучных по туберкулезу хозяйствах, а с другой стороны - недовыявление зараженных туберкулезом животных в неблагополучных по туберкулезу хозяйствах. Поэтому, при проведении исследований на туберкулез в благополучных хозяйствах следует повысить специфичность, а в неблагополучных - чувствительность диагностических исследований. По этой причине прижизненная диагностика туберкулеза крупного рогатого скота одной внутрикожной туберкулиновой пробой не может быть идеальным диагностическим средством. Поэтому изыскание новых, современных дополнительных методов диагностики туберкулеза животных является весьма актуальным и перспективным и на сегодняшний день.

Известно, что при диагностике туберкулеза большое значение имеют иммунодиагностические методы, направленные на оценку функциональной активности Т-лимфоцитов. Это положение обусловлено тем, что исследованиями C.J.Thorns and J.A.Morris (1983) установлено, что при инфицировании млекопитающих M.bovis доминирующим является клеточный иммунный ответ. Дальнейшие исследования по изучению туберкулеза человека, крупного

| рос национальная

библиотека

о 1 _ с Петербург

х | xmfPK

и чбчи

рогатого скота и других видов животных подтвердили эту концепцию (Wood P.R, Rothel J.S.,1994; Neill S.D. et al., 1994 и др.).

Основными диагностическими методами оценки Т-клеточного иммунного ответа при туберкулезе являются внутрикожная туберкулиновая проба, реакция бластгрансформации лимфоцитов (РБТЛ) и разработанный сравнительно недавно (Rothel J.S.et al., 1990) «сэндвич»-ИФА на основе монокло-нальных антител, предназначенный для выявления у-интерферона (у-ИФН) в крови инфицированных животных (у-ИФН ИФА). Все методы предполагают использование ППД туберкулина в качестве антигена, стимулирующего пролиферацию Т- клеток in vivo (ВТП) или in vitro (РБТЛ и у-ИФН ИФА).

Внутрикожная туберкулиновая проба уже более 100 лет остается основным методом прижизненной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота. В основе метода лежит реакция организма на внутрикожное введение туберкулина сенсибилизированному животному, являющаяся наиболее ярким примером гиперчувствительности замедленного типа и представляющая собой иммунологически специфическую воспалительную реакцию, обусловленную Т- клетками. Метод ВТП характеризуется высокой чувствительностью, однако основным недостатком этого метода является достаточно большой процент ложноположительных реакций, возникающих вследствие перекрестной реактивности между антигенами разных видов микобактерий.

РБТЛ является высокочувствительным методом определения специфического иммунного ответа на ППД-туберкулин для млекопитающих и оценки реактивности Т-клеток у инфицированных М. bovis животных. Однако длительность постановки реакции, необходимость выделения лимфоцитов из крови и использования радиоактивной метки для определения уровня клеточной пролиферации являются серьезными ограничениями для использования этого метода в клинической практике.

Достижения в области биотехнологии и иммунохимии сделали возможным применение метода ИФА для выявления и количественного определения уровня цитокинов (интерлейкинов, интерферонов, клеточных факторов, кемокинов и др.)- продуктов секреции различных типов клеток иммунной системы. Это направление интенсивно развивается и одной из наиболее показательных и успешных разработок является у-ИФН ИФА - один из новых перспективных методов прижизненной диагностики туберкулеза.

В настоящее время этот метод наряду с ВТП является узаконенным методом диагностики туберкулеза крупного рогатого скота в Австралии, Новой Зеландии и Румынии.

будителя туберкулеза в организме исследуемого животного. Для получения более достоверных результатов прижизненных диагностических исследований на туберкулез, большинство авторов рекомендуют использовать комплексный метод диагностики, т.е. одновременно два метода: внутрикожную туберкулиновую пробу и у-ИФН ИФА.

Высокая чувствительность и специфичность у-ИФН ИФА была подтверждена при проведении широкомасштабных диагностических исследований в США, Ирландии, Испании, Аргентине, Бразилии и других странах мира (D.L.Whipple et al., 1995, 2001; M.Monaghan et al., 1997; O. R.Gonzalez Llamazares et al., 1999; T.J.Ryan et al., 2000; J.M.Pollock et al., 2000; B.M.Buddle et al., 2001; R.K.Katial et al., 2001; A.M.Perez et al., 2002 и др.).

К сожалению, в нашей стране этот метод совершенно не известен. Поэтому вопросы, связанные с изучением Т-клеточного иммунного ответа при туберкулезе крупного рогатого скота и возможности использования у-ИФН ИФА в качестве метода прижизненной диагностики туберкулеза на территории России, являются весьма актуальными и представляют значительный интерес как в научном, так и в практическом аспектах.

Цель работы. Сравнительная характеристика и оценка диагностической ценности реакций клеточного иммунитета при диагностике туберкулеза крупного рогатого скота. Изучение возможности применения у-ИФН ИФА для прижизненной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота.

Основные задачи исследований:

1.Отработать методику постановки и учета результатов «сэндвич» -ИФА предназначенного для детекции у-ИФН в образцах крови крупного рогатого скота. Провести сравнительную оценку отечественных и голландских ППД-туберкулинов для млекопитающих и ППД-туберкулинов для птиц, используемых в диагностике туберкулеза и определить возможность использования отечественных туберкулинов в коммерческом наборе «BOVIGAM™» (CSL Veterinary, Австралия) для стимуляции ТН1 -клеток крови m vitro.

2. Изучить динамику формирования Т- клеточного иммунного ответа у экспериментально зараженных M.bovis телят. Для этого с помощью «сэн-двич»-ИФА определить уровень у-ИФН в крови зараженных туберкулезом животных в процессе постинфекционного иммуногенеза.

3. Провести сравнительное изучение диагностической ценности внутрикожной туберкулиновой пробы и у-ИФН ИФА при диагностике туберкулеза крупного рогатого скота в благополучных и неблагополучных по туберкулезу хозяйствах РФ.

4. Изучить возможность применения у-ИФН ИФА для дифференциации неспецифических реакций при диагностике туберкулеза крупного рогатого скота в благополучных по туберкулезу хозяйствах.

Научная новизна работы.

Впервые проведена сравнительная оценка голландских и отечественных ППД- туберкулинов дом млекопитающих и ППД- туберкулинов для птиц и показана возможность использования отечественного ППД- туберку-

лина для млекопитающих и ППД- туберкулина для птиц в коммерческом наборе «BOVIGAM™» для стимуляции ТН1-клеток крови in vitro.

Комплексными исследованиями с использованием ВТП и у-ИФН ИФА изучена динамика формирования Т- клеточного иммунного ответа у экспериментально зараженных М. bovis телят. Получены новые данные о сроках появления и максимального содержания у-ИФН в крови зараженных туберкулезом животных в процессе постинфекционного иммуногенеза.

Впервые в РФ проведены сравнительные испытания ВТП и у-ИФН ИФА при диагностике туберкулеза крупного рогатого скота в благополучных и неблагополучных по туберкулезу хозяйствах. Установлена высокая специфичность метода у-ИФН ИФА с использованием голландского ППД- туберкулина для млекопитающих и ППД-туберкулина для птиц при исследовании животных после предварительно проведенной туберкулинизации отечественным аналогом.

Установлена возможность применения у-ИФН ИФА для дифференциации аллергических реакций на туберкулин в благополучных по туберкулезу хозяйствах.

Практическая значимость исследований.

Метод у-ИФН ИФА целесообразно использовать как дополнительный метод прижизненной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота для дифференциации неспецифических реакций на туберкулин в благополучных по туберкулезу хозяйствах Российской Федерации. Установленные временные показатели диагностического появления у-ИФН в крови, могут служить ориентиром при оценке иммунного ответа животных, инфицированных М. bovis.

Полученные результаты являются основой для дальнейших исследований механизмов формирования иммунного ответа основных популяций Т-лимфоцитов на различные антигены или виды микобактерий.

По результатам экспериментов разработаны «Методические рекомендации по определению у-интерферона методом иммуноферментного анализа (у-ИФН ИФА) для диагностики туберкулеза крупного рогатого скота» рассмотренные на заседании Ученого совета института и утвержденные директором ВИЭВ.

Основные положения, выносимые на защиту.

Полученные экспериментальные данные позволяют вынести на защиту следующие основные положения:

• результаты экспериментов по изучению динамики формирования Т-клеточного иммунного ответа у экспериментально зараженных M.bovis телят и определению уровня у-ИФН в крови зараженных туберкулезом животных в процессе постинфекционного иммуногенеза;

• результаты сравнительных исследований по определению диагностической ценности ВТП и у-ИФН ИФА в качестве методов прижизненной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота в благополучных и неблагополучных по туберкулезу хозяйствах РФ.

Апробация работы.

Основные положения диссертационной работы доложены на:

• 6-м Международном симпозиуме по ветеринарной иммунологии, Швеция, Уппсала, 2001;

• Международной научно-практической конференции «Современные проблемы диагностики и профилактики туберкулеза животных», Москва, 2003;

• Межлабораторном совещании сотрудников ВИЭВ, Москва, 2004.

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано пять научных работ.

Объем и структура диссертации.

Диссертационная работа изложена на 123 стр. машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, собственных результатов исследований, заключения, выводов, практических предложений, списка цитированной литературы. Материалы диссертации иллюстрированы 15 таблицами и 7 рисунками. Список литературы включает 175 источников (12 отечественных и 163 зарубежных авторов).

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Работа выполнена в 2000-2003 гг. в лаборатории микобактериозов, лаборатории иммунологии и биотехнологии и на опытной базе Вышневолоцкого отдела ВИЭВ, в благополучных и неблагополучных по туберкулезу хозяйствах РФ.

1.1. Антигены микобактерий

В исследованиях использованы ППД- туберкулин для млекопитающих (1 мг/мл) и ППД- туберкулин для птиц (25,000 ед.) выпущенные в Central Veterinary Institute, Lelystad, Нидерланды и любезно предоставленные профессором J.D.Collins (UCD, Ирландия). Также в работе были использованы отечественные ППД- туберкулин для млекопитающих и ППД- туберкулин для птиц производства ФГУП «Курская биофабрика».

Для экспериментального заражения подопытных телят использован вирулентный штамм М. bovis «8».

1.2. Экспериментальные животные

Опыт по изучению динамики формирования постинфекционного Т-клеточного иммунного ответа проведен на 9 телятах сформированных в две группы (опытная и контрольная) по принципу аналогов. Животные первой группы (п=6) были заражены вирулентной культурой М bovis, животные второй (п=3)- служили контролем.

Заражение 6 экспериментальных телят проводили алиментарно, четырехкратно в дозе 0,2 мг культуры М. bovis на кг живого веса животного при каждом заражении, т.е. каждому теленку было введено более 80 мг культуры Mbovis. Первые три введения культуры М.bovis (в дозе 20 мг/животное) про-

водили ежедневно, четвертое - проводили через 7 суток после третьего в той же дозе и тем же способом.

Для изучения динамики Т-клеточного иммунного ответа у экспериментально зараженных животных, аллергические исследования и исследования проб крови проводили в начале опыта, затем через 7-14 суток после последнего введения культуры M.bovis. Далее аллергические исследования методом ВТП и исследования проб крови методом у-ИФН ИФА проводили в динамике, каждые 30-60 суток после заражения (п.з.).

1.3. Благополучные и неблагополучные по туберкулезу хозяйства, аллергические и лабораторные исследования

на туберкулез

Сравнительное изучение внутрикожной туберкулиновой пробы и у-ИФН ИФА, а также оценку диагностической ценности указанных методов провели в трех благополучных по туберкулезу хозяйствах Смоленской и Ярославской областей, в которых установлена сенсибилизация животных атипичными микобактериями, и в одном неблагополучном по туберкулезу хозяйстве Тамбовской области.

Исследования внутрикожной туберкулиновой пробой, патологоанато-мические исследования убитых животных и лабораторные исследования пат-материала от этих животных проводили в соответствии с утвержденным «Наставлением по диагностике туберкулеза животных» (1986) и в соответствии с новым «Наставлением по диагностике туберкулеза животных» (2002).

Симультанную туберкулиновую пробу проводили с использованием ППД-туберкулина для млекопитающих и KAM (комплексного аллергена из атипичных микобактерий).

1.4. у-ИФН ИФА, методика проведения исследований

В опытах использован коммерческий набор (BOVIGAM™ Bovine Gamma Interferon test, CSL Veterinary, Australia), предназначенный для определения у-ИФН в крови животных с помощью «сэндвич»-ИФА и любезно предоставленный профессором J.D.Collins (UCD, Ирландия).

Постановку «сэндвич»-ИФА по определению уровня у-ИФН в крови животных, учет и интерпретацию полученных результатов проводили по методике, рекомендованной фирмой-производителем.

Для исследования использованы пробы крови экспериментально зараженных бычков и крупного рогатого скота из благополучных и неблагополучных по туберкулезу хозяйств, полученные от каждого животного в отдельности, и доставленные в лабораторию при температуре +12°С - +20°С в течение 12-24 часов после взятия.

1.4.1. Подготовка проб для анализа

Каждую испытуемую пробу крови тщательно перемешивали и вносили в три лунки плоскодонной полистироловой 24-луночной панели для культивирования (Nunc, Дания) в объеме 1 мл/лунку. Далее в первую лунку вносили 20 мкл ФБ, во вторую- ППД-туберкулин для птиц, в третью- ППД- туберкулин для млекопитающих. Далее панели аккуратно встряхивали на шейкере в

течение 10 мин для тщательного перемешивания жидкостей в лунках, затем помещали в термостат и инкубировали в течение 18 ч при +37°С. После инкубации, пробы переносили в пластиковые пробирки и центрифугировали течение 10 мин при 2000 об/мин. и комнатной температуре. Плазму, полученную после центрифугирования, аккуратно отбирали микропипеткой и использовали для тестирования, осадок красных форменных элементов крови отбрасывали.

1.4.2. Постановка реакции

В качестве испытуемых образцов служили пробы плазмы крови после инкубации с ФБ (0), ППД-туберкулином для птиц (А) и ППД-туберкулином для млекопитающих (В). Каждая испытуемая проба, исследуемая как О, А и В, тестировалась дважды.

Для проведения ИФА во все лунки 96-луночных микропанелей, сенсибилизированных антителами к у-ИФН крупного рогатого скота, вносили буфер для разведения (БР) в объеме 50 мкл/лунку. Далее в лунки вносили испытуемые образцы плазмы, положительный и отрицательный контроли в равных объемах (по 50 мкл/лунку соответственно) и тщательно перемешивали с буфером. Для положительного и отрицательного контролей использовали по три лунки на каждой панели. Микропанели с внесенными пробами инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре, затем промывали лунки шесть раз промывочным буфером (ПБ), оставляя их заполненными буфером в течение 5 мин после каждого внесения. После отмывания микропанели подсушивали, добавляли в каждую лунку по 100 мкл рабочего разведения конъюгата и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. После инкубации микропанели отмывали шесть раз как описано выше, подсушивали и добавляли свежеприготовленный раствор субстрата в объеме 100 мкл/лунку. Далее микропанели инкубировали в темном месте в течение 30 мин., затем проводили остановку реакции и учет полученных результатов.

1.4.3. Учет реакции и интерпретация полученных результатов

Реакцию останавливали добавлением в лунки по 50 мкл раствора для остановки реакции (0,5 М НгЗОД Результаты ИФА оценивали с помощью фотометра «МиШэкап МСС/340» («ЬаЬзу81етз», Финляндия) при длине волны 450 нм по коэффициенту оптического поглощения (ОП 450). Значения ОП 450 каждой испытуемой пробы, исследуемой как О, А и В были использованы для анализа и интерпретации полученных результатов.

Перед учетом реакции в лунках с испытуемыми пробами проводили оценку реакции в лунках с контролями, входящими в состав набора.

Результаты у-ИФН ИФА считались достоверными если среднее значение ОП 450 (А ОП 450) лунок с положительным контролем превышало 0,7, а А ОП 450 лунок с отрицательным контролем было меньше 0,13.

Результаты у-ИФН ИФА интерпретировали согласно схеме, рекомендованной фирмой-производителем:

Положительный результат: ОП 450 В - ОП 450 О > 0,1 и

on 450 В-on 450 A >0,1

Отрицательный результат: ОП 450 В - ОП 450 О < 0,1 или

ОП 450 В - ОП 450 А < 0,1

Если разница между ОП 450 А и ОП 450 О превышала 0,1 и при этом разница между ОП 450 А - ОП 450 В также превышала 0,1, то результат считался отрицательным с пометкой реакция на ППД- туберкулин для птиц.

При получении сомнительного результата, реакцию повторяли, исследуя такую пробу трижды.

1.5. Электрофорез в ПААГ-ДСН

Опыты по сравнительному анализу белкового спектра всех используемых в экспериментах отечественных и зарубежных ППД- туберкулинов проведены методом электрофореза белков в полиакриламидном геле с додецил-сульфатом натрия (ПААГ-ДСН).

Электрофорез проводили в пластинах полиакриламидного геля размером 100 х 150 х 0,75 мм в буферной системе Laemmli (1970). Все пробы содержали лизирующий буфер с восстановителем (0,125 Мтрис-HCl рН 6,8, 5% ДСН, 0,5% Р -меркаптоэтанола, 10,8% глицерина, 0,01% бромфеноло-вого синего) и были прогреты в течение 10 минут при 100°С. Разделение белков проводили при постоянной силе тока 20 мА и циркулирующем охлаждении. После электрофоретического разделения, белки в гелях окрашивали серебром (Porro М. et al., 1982) и фотографировали в проходящем свете. 1.6. Статистическая обработка результатов

Статистическую обработку результатов проводили общепринятыми методами с использованием программы Excel для Windows. Значение критерия достоверности оценивали по таблице вероятностей Стьюдента-Фи-шера в зависимости от объема анализируемого материала. Вероятность различий считалась существенной при Р < 0,05.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. ОТРАБОТКА ПОСТАНОВКИ у-ИФН ИФА И ВНЕСЕНИЕ ДОПОЛНЕНИЙ В МЕТОДИКУ

Основными целями первого этапа нашей работы были:

• отработка методики постановки и учета результатов у-ИФН ИФА;

• подбор реагента для разведения конъюгата, определение условий хранения и рабочего титра готового препарата;

• изучение возможности длительного хранения испытуемых образцов плазмы крови крупного рогатого скота.

В опытах по отработке методики постановки и учета результатов у-ИФН ИФА были использованы отрицательный и положительный у-ИФН кон-троли (входящие в состав набора), ППД-туберкулин для птиц, ППД- туберкулин для млекопитающих, а также образцы плазмы крови крупного рогатого скота, полученные от клинически здоровых и больных туберкулезом живот-

ных (с подтвержденным диагнозом) и любезно предоставленные профессором J.D.Collins (UCD, Ирландия).

Результаты исследований показали, что М ± m ОП 450 лунок с отрицательным контролем составило 0,092 ± 0, 029 и во всех экспериментах (включая последующие) было меньше 0,130 - контрольного значения определенного разработчиками набора. При этом значения ОП 450 лунок с положительным контролем составили 2,749 ± 0, 371 соответственно, что также соответствует критериям чувствительности и специфичности тест-системы (во всех экспериментах превышало 0,7). Все отрицательные (п=5) и положительные (п=5) пробы, полученные от профессора J.D.Collins, были также отрицательными и положительными в наших исследованиях (100%-ная совпадае-мость результатов). При этом значения показателей ОП 450 В-А для отрицательных и положительных проб составили 0,007±0,013 и 0,625 ±0,420 соответственно. Помимо высокой чувствительности и специфичности, метод характеризуется быстротой постановки реакции (2,5 часа без учета времени инкубации и внесения образцов), возможностью исследования большого количества проб, воспроизводимостью результатов (г между дубликатами лунок на одной микропанели составил 0,95).

В следующих опытах мы подбирали реагент для разведения конъюгата, определяли рабочий титр готового препарата и условия его хранения.

Таблица 1.

Результаты у-ИФН ИФА, полученные с использованием конъюгата и образцов плазмы крови крупного рогатого скота, хранившихся в различных условиях.

№ п/п I Показатели ОП 450 в пробах: П Показатели ОП450 в пробах:

0 А В 0 А В

1 0,089 0,139 0,526 0,095 0,154 0,530

2 0,072 0,114 0,148 0,078 0,112 0,161

Примечание: В таблице приведены средние геометрические значения А ОП 450 положительных (№1, п~5) и отрицательных проб (№2, п=5).

В опыте I исследовали образцы плазмы свежеполученных проб крови крупного рогатого скота с использованием конъюгата, растворенного в БК и хранившегося при 4°С (рабочее разведение 1:100); в опыте П исследовали эти же образцы плазмы с использованием конъюгата, растворенного в БК и глицерине (рабочее разведение 1:50). Все используемые во втором опыте реагенты хранились при температуре -20°С в течение 6-ти месяцев после проведения опыта I.

Результаты исследований показали, что при разведении конъюгата глицерином («Sigma», США) в соотношении 1:1 (50%-ный конечный раствор) препарат без снижения активности и специфичности может храниться при температуре -20°С в течение 2 лет (срок наблюдения). Установлено, что ра-

бочее разведение такого коньюгата составляло 1:50, в то время как конъюгат, растворенный в буфере (БК) и хранившийся при температуре 4°С, использовали в разведении 1:100 (согласно наставлению по применению набора).

В этих же экспериментах была изучена возможность длительного хранения испытуемых образцов плазмы крови крупного рогатого скота и установлено, что все испытуемые О, А и В пробы каждого животного после инкубации с соответствующим антигеном могут храниться при температуре -20°С без снижения показателей ОП 450 в течение 2 лет (срок наблюдения).

Результаты проведенных экспериментов приведены в таблице 1.

Второй задачей данного раздела работы было определение возможности применения отечественного ППД-туберкулина для млекопитающих и ППД-туберкулина для птиц в наших основных экспериментах с использованием набора «BOVIGAM™».

Анализ структурного состава исследуемых аллергенов методом электрофореза в ПААГ-ДСН показал, что белковый спектр голландского ППД-туберкулина для млекопитающих практически идентичен белковому спектру отечественного аналога. Однако концентрация некоторых белков в аллергенах различна. Так в оба аллергена входят 5 белков с различной концентрацией и с молекулярной массой (М.м.) в диапазоне от 10 до 25 кД. При этом белок с М.м. 21-25 кД является доминирующим в голландском ППД-туберкулина для млекопитающих, где его концентрация составляет 85-90% от общего содержания белка. В отечественном ППД-туберкулине для млекопитающих также преобладает белок с аналогичной молекулярной массой, однако его концентрация значительно ниже по сравнению с общим содержанием белка и концентрацией этого белка в зарубежном аллергене. Второй по содержанию белок голландского ППД-туберкулина для млекопитающих имеет М.м. 17-19 кД и по своей концентрации сопоставим с содержанием белка аналогичной молекулярной массы в отечественном ППД- туберкулине для млекопитающих.

Кроме того, в оба аллергена входят три белка с различной молекулярной массой в диапазоне 10-16 кД. По результатам нескольких экспериментов нами установлено, что концентрация этих белков в отечественном ППД- туберкулине для млекопитающих несколько выше по отношению к концентрации аналогичных по молекулярной массе белков, содержащихся в голландском ППД-туберкулине для млекопитающих.

Белковый профиль отечественного и зарубежного ППД-туберкулинов для птиц практически одинаков. В состав обоих аллергенов входят 4 белка с молекулярной массой в диапазоне 15-22 кД, однако их концентрация выше в голландском туберкулине.

Следующие эксперименты были посвящены подбору оптимальных концентраций отечественного ППД-туберкулина для млекопитающих и ППД- туберкулина для птиц для антигенной стимуляции in vitro в сравнительном аспекте с зарубежными аналогами. Д ля этого, пробы крови крупного рогатого скота, полученные от ВТП-негативных и ВТП-позитивных животных, инкубировали с отечественным ППД- туберкулином для птиц и ППД-туберкулином для млекопитающих, взятыми в различных дозах. Контролем

служили эти же пробы, стимулированные голландскими туберкулинами, взятыми в рекомендованной производителем дозе - 20 мкл/мл (20 мкг/мл).

Анализ полученных результатов свидетельствует о том, что для постановки у-ИФН ИФА оптимальной дозой отечественных ППД-туберкулинов для млекопитающих и ППД-туберкулинов для птиц, использующихся в качестве антигенов, стимулирующих пролиферацию Т- клеток, является доза 50 мкл туберкулина/мл крови животного. Использование отечественных тубер-кулинов в меньших (20 мкл/мл) или больших (100 мкл/мл) дозах могут приводить к некоторому снижению или повышению величин ОП 450 и даже к изменениям в интерпретации результатов реакции.

Результаты сравнительных экспериментов по использованию в наборе «BOVIGAM™» отечественных ППД-туберкулинов для млекопитающих и ППД- туберкулинов для птиц в установленной дозе свидетельствуют о положительной корреляции результатов полученных с использованием голландских и отечественных туберкулинов (г=0,7-0,8 в разных опытах, Р<0,05) и отсутствии статистически достоверных различий при интерпретации результатов реакции.

2.2. ДИНАМИКА ПОСТИНФЕКЦИОННОГО Т-КПЕТОЧНОГО ИММУННОГО ОТВЕТА У ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО ЗАРАЖЕННЫХ M.bovis ТЕЛЯТ

Одна из главных задач нашей работы заключалась в изучении динамики формирования постинфекционного Т- клеточного иммунного ответа у экспериментально зараженных телят и сравнительном изучении диагностической ценности внутрикожной туберкулиновой пробы и у-ИФН ИФА в экспериментальных условиях.

Для решения поставленной задачи был проведен опыт по экспериментальному заражению телят вирулентной культурой М. bovis с последующими прижизненными и посмертными диагностическими исследованиями на туберкулез. Прижизненные методы исследования Т-клеточного иммунного ответа были проведены в динамике, методами ВТП и у-ИФН ИФА, посмертные - были направлены на подтверждение результатов заражения туберкулезом.

Прижизненные исследования животных.

В процессе постинфекционного иммуногенеза были проведены сравнительные исследования с использованием внутрикожной туберкулиновой пробы и «сэндвич»-ИФА по определению уровня у-ИФН в крови животных. Исследования проводили на 0, 7, 14, 21, 28, 35, 65, 85, 110 и 135 сутки после заражения. После взятия крови проводили туберкулинизацию каждого теленка.

Посмертные исследования животных.

Все подопытные животные (опытные и контрольные) были убиты через год после заражения. После убоя каждое животное было подвергнуто па-тологоанатомическому исследованию, затем были взяты пробы патматериала (лимфатические узлы, участки паренхиматозных органов), которые достав-

ляли в лабораторию и исследовали индивидуально. Весь отобранный патма-териал исследовали культуральным методом, высевая на среду Левенштейна-Йенсена и среду ФАСТ-3 л (по 5 пробирок среды на каждую пробу) и биологическим методом - подкожным введением суспензии патматериала морским свинкам (по 2 свинки на каждую пробу).

Анализ посмертных исследований телят опытной и контрольной групп позволил установить следующее. На основе результатов патологоанатомиче-ского исследования, положительный диагноз на туберкулез был поставлен двум телятам опытной группы из шести зараженных. У этих животных в бронхиальном и средостенном лимфатических узлах были обнаружены единичные очажки величиной с просяное зерно. При гистологическом исследовании патматериала в бронхиальном и средостенном лимфатических узлах обнаружены характерные гранулемы, представляющие собой узелки с округлыми краями и центром в виде некроза, при этом хорошо выражен слой эпи-телиоидных, лимфоидных и гигантских клеток. При проведении культу-ральных исследований наблюдали рост кислотоустойчивых микроорганизмов в виде мелких и гладких колоний. При биологическом исследовании материала наблюдали развитие туберкулезного процесса у всех зараженных морских свинок.

Результаты патологоанатомического исследования телят контрольной группы и лабораторных исследований отобранного от них материала были отрицательными. Результаты прижизненных исследований животных контрольной группы методами ВТП и у-ИФН ИФА были также отрицательными в течение всего периода эксперимента.

Таким образом, на основании анализа полученных результатов патологоанатомического исследования убитых животных и бактериологического исследования посмертно отобранного материала был сделан вывод о том, что телята опытной группы заразились туберкулезом, а телята контрольной - остались здоровыми.

Результаты по определению динамики содержания у-ИФН в крови телят опытной группы в процессе постинфекционного иммуногенеза представлены на рисунке 1.

Анализ материалов представленных на рис. 1 свидетельствует о том, что Т-клеточный иммунный ответ, выражающийся в синтезе у-ИФН и обнаружении его в крови зараженных животных, формируется у всех телят опытной группы. Однако сроки обнаружения у-ИФН методом ИФА у телят различны. Как видно из представленных данных, достоверное увеличение содержания у-ИФН в крови зарегистрировано у теленка №1 на 35-е сутки п.з., у телят №2, №4 и №6 - на 65-е сутки п.з., у теленка №5 - на 85-е сутки п.з. и у теленка №3 - на 110-е сутки п.з. соответственно. При этом относительный уровень у-ИФН (о нем можно судить по показателю ОП 450 В-А) в крови также отличается у разных животных. Так, самое высокое содержание у-ИФН установлено у теленка №1 на 65-е сутки п.з. (ОП 450 В-А равен

Теленок №2

Теленок №3

Теценок №4

Теленок №5

Теленок №6

7 14 21 28 35 65 Время после заражения, сутки

85 85 110 135

——I-1-1-1-1-1-1-1-1-г

О 7 14 21 28 35 65 85 110 135 Время после заражения, сутки

-1-1-1-1-1-1-1-I-

7 14 21 28 35 65 85 110 135 Время после заражения, сутки

Рисунок 1. Динамика содержания у-ИФН в крови зараженных телят в процессе формирования постинфекционного Т-клеточного иммунного ответа Представлены показатели ОП 450 клеточного ответа на ФБ (О), ППД -туберкулина для птиц (А) и ППД-губеркулина для млекопитающих (В).

0,754), у теленка №4 - на 110-е сутки п.з. (ОП 450 В-А равен 0,56) и у телят №2 и №6 - на 135-е сутки п.з. (ОП 450 В-А равны 0,763 и 0,95 соответственно). Уровень у-ИФН в крови телят №3 и №5 был значительно ниже по сравнению с аналогичными значениями у других животных, и на 110-е сутки п.з. показатели ОП 450 В-А этих телят достигали своих максимальных значений и были равны 0,3 и 0,44 соответственно.

Представленные данные также свидетельствуют о том, что в процессе постинфекционного иммуногенеза у телят №1, №4 и №5 наблюдалась тенденция к снижению содержания у-ИФН в крови (после достижения своего максимального значения на 65-е и 110-е сутки п.з. соответственно), у телят №2 и №6 - к увеличению, и у теленка №3 уровень у-ИФН в крови после достоверного повышения оставался постоянным на относительно низком уровне.

Одновременно с проведением исследований по изучению динамики формирования постинфекционного Т- клеточного иммунного ответа у зараженных телят, на этой же экспериментальной модели решалась вторая основная задача данного опыта - оценка диагностической ценности внутрикож-ной туберкулиновой пробы и у-ИФН ИФА. Статистически обработанные результаты опыта с использованием ВТП и у-ИФН ИФА в экспериментальных условиях приведены в таблице 2.

Таблица 2.

Сравнительный анализ результатов исследований телят, экспериментально зараженных М. bovis, методами у-ИФН ИФА и ВТП.

Время Результаты у-ИФН ИФА, Результаты ВТП,

ПЛ., количество животных количество животных

сутки Положитель- Отрицатель- Положитель- кожная Отрицатель-

ных ных ных реакция (мм) ных

0 0 6 0 - 6

7 0 6 0 - 6

14 0 6 0 - 6

21 0 6 0 - 6

28 0 6 0 - 6

35 1 5 0 - 6

65 4 2 0 - 6

85 5 1 2 5-8 4

110 6 0 4 6-10 2

135 6 0 6 6-12 0

Из данных табл.2 видно, что на 135-е сутки п.з. все животные реагировали на внутрикожное введение ППД- туберкулина для млекопитающих. У двух телят (№4 и №6) положительная реакция зарегистрирована на 85-е сутки

п.з., у двух - на 110-е сутки п.з. и у телят №3 и №5 - только в завершающей стадии эксперимента.

Таким образом можно констатировать о 100%-ной совпадаемости результатов ВТП и у-ИФН ИФА только на 135-е сутки п.з. У всех телят диагностическое повышение уровня у-ИФН, установленное методом ИФА, происходило на 20 - 50 суток раньше чем была зарегистрирована внутрикожная реакция после проведения туберкулинизации.

2.3. СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ ЦЕННОСТИ ВНУТРИ-КОЖНОЙ ТУБЕРКУЛИНОВОЙ ПРОБЫ И у-ИФН ИФА В БЛАГОПОЛУЧНЫХ ПО ТУБЕРКУЛЕЗУ ХОЗЯЙСТВАХ

В нашей стране в соответствии с Санитарными и Ветеринарными правилами от 1996 года, все хозяйства, в зависимости от эпизоотического состояния поголовья по туберкулезу, подразделяются на две категории: благополучные и неблагополучные. Согласно этим правилам принято считать, что в неблагополучных по туберкулезу хозяйствах, реагирующие на туберкулин животные, инфицированы возбудителем туберкулеза, поэтому все эти реагирующие животные подлежат изоляции от стада и вынужденному убою. В благополучных по туберкулезу хозяйствах при выявлении реагирующих животных проводят комплекс прижизненных, послеубойных и лабораторных исследований для подтверждения или исключения диагноза на туберкулез. В любом случае, заболевание животных туберкулезом считается установленным, если диагноз подтверждается данными патологоанатомического вскрытия, а при отсутствии характерных для туберкулеза видимых изменений - положительными результатами бактериологического исследования.

Целью данного раздела нашей работы являлось сравнительное изучение диагностической ценности внутрикожной туберкулиновой пробы и у-ИФН ИФА, а также изучение возможности применения у-ИФН ИФА для дифференциации парааллергических реакций на туберкулин при диагностике туберкулеза крупного рогатого скота в благополучных по туберкулезу хозяйствах РФ, где установлена сенсибилизация животных атипичными микобак-териями.

Исследования провели в трех благополучных по туберкулезу хозяйствах, где установлена сенсибилизация животных атипичными микобакте-риями: хозяйство №1 - ФГУП «Смоленское», Смоленского района, Смоленской области; хозяйство №2 - СХПК «Некрасовский», Вяземского района, Смоленской области; хозяйство №3 - АПК «Туношна», Ярославского района, Ярославской области.

Исследования в хозяйствах проводили совместно с представителями ветеринарной службы области, района и ветеринарных врачей данных хозяйств.

После проведения аллергических исследований и учета реакций, от всех реагирующих на туберкулин животных (и от 5-15 нереагирующих животных данного хозяйства - контрольных животных) отбирали пробы крови

и доставляли в течение 24-х часов после взятия в лабораторию иммунологии и биотехнологии ВИЭВ. Время между проведением исследований методом ВТП и у-ИФН ИФА составило 28-35 суток.

Для постановки у-ИФН ИФА использовали: а) в хозяйстве №1 - отечественные и голландские ППД- туберкулины для млекопитающих и ППД- ту-беркулины для птиц; б) в хозяйствах №2 и №3 - только голландские ППД-туберкулин для млекопитающих и ППД- туберкулин для птиц.

В хозяйстве №1 было исследовано внутрикожной туберкулиновой пробой 274 головы крупного рогатого скота. При учете реакции выявлено 5 реагирующих на туберкулин животных с утолщением кожной складки на 4-6 мм. От всех 5 реагирующих на туберкулин животных и 15 нереагирующих на туберкулин животных были отобраны пробы крови и исследованы методом у-ИФН ИФА (табл.3).

Таблица 3.

Суммарные результаты диагностических исследований на туберкулез крупного рогатого скота в хозяйстве №1.

Результат Количество ВТП животных Результат у-ИФН ИФА, количество животных

Положительных Отрицатель- (реагирующих ных на ППД- туб. для птнц)

Положительный 5 0 5 (0)

Отрицательный 15 0 15 (2)

Из материалов, представленных в таблице 3 видно, что при учете результатов исследований у всех 15 нереагирующих на туберкулин (контрольных) животных, получены отрицательные показатели и в у-ИФН ИФА. Все пять реагирующих на внутрикожную туберкулиновую пробу животных показали отрицательный результат в у-ИФН ИФА (значения показателей ОП 450 В-А составляли 0,043 - 0,046 соответственно). При этом была установлена 100% совпадаемость результатов реакции, полученных с использованием голландских и отечественных ППД- туберкулинов для млекопитающих и птиц. Кроме того, наблюдалась положительная корреляция в цифровых значениях показателей ОП 450 В-А, полученных с использованием данных препаратов (г = 0,7, Р < 0,05).

По результатам исследований в хозяйстве № 1, провели диагностический убой трех реагирующих на внутрикожное введение туберкулина коров (с отрицательными показателями в у-ИФН ИФА). Отобранный материал доставляли в лабораторию и исследовали кулыуральным и биологическим методами. При патологоанатомическом осмотре убитых коров характерных для туберкулеза изменений не обнаружили ни в одном случае. При лабораторном исследовании патматериала от убитых коров возбудителя ту-

беркулеза не выделили. Выделили быстрорастущие атипичные микобактерии IV группы по классификации Раньёна.

Таким образом, на основе полученных комплексных результатов сравнительных исследований двух прижизненных диагностических методов, можно констатировать, что в данном случае у-ИФН ИФА в отличие от ВТП не дал ложноположительных результатов при постановке комплексного диагноза на туберкулез.

В хозяйстве № 2 плановые исследования на туберкулез проводили симультанной туберкулиновой пробой с использованием ППД- туберкулина для млекопитающих и КАМ. При исследовании 287 голов крупного рогатого скота выявлено 55 реагирующих на туберкулин животных, из них с большей интенсивностью реакции на ППД- туберкулин для млекопитающих -15 (знак +), с меньшей реакцией - 29 (знак -), с равной реакцией - 11 (знак =). Результат симультанной пробы неопределенный. От этих 55 реагирующих животных и 5 нереагирующих животных данного хозяйства были взяты пробы крови и исследованы методом у-ИФН ИФА (табл.4).

Таблица 4.

Суммарные результаты диагностических исследований на туберкулез крупного рогатого скота в хозяйстве №2.

Результат Всего Результат у-ИФН ИФА,

симультанной животных количество животных

пробы со знаком Положитель- Отрицатель- (реагирующих

+,-,= ных ных на ППД-туб.

для птнц)

+ 15 6 9 (1)

29 9 20 (1)

= 11 3 8 (1)

Итого 55 18 37 (3)

Анализ материалов, представленных в таблице 4, позволил заключить следующее. При учете реакции проб крови от всех 5 нереагирующих на туберкулин животных в у-ИФН ИФА были получены отрицательные результаты (показатели ОП 450 В-А в пределах 0,007-0,057). Совпадение результатов исследований двух диагностических тестов было установлено у 6 (40%) животных с положительными показаниями и у 20 (68,9%) животных с отрицательными показаниями. Из 11 животных с равной реакцией на ППД-туберкулин для млекопитающих и KAM, 3 - дали положительную, 8 -отрицательную реакцию в у-ИФН ИФА.

По результатам проведенных исследований в хозяйстве № 2 провели диагностический убой трех реагирующих коров, реагировавших в большей степени на ППД- туберкулин для млекопитающих и давших положительные показания в у-ИФН ИФА. При патологоанатомическом осмотре у убитых ко-

ров не обнаружили характерных для туберкулеза изменений. Дальнейшие лабораторные исследования патматериала от убитых животных также дали отрицательный результат.

Полученные результаты исследований показывают, что в стадах с сильной степенью сенсибилизации животных атипичными микобактериями у-ИФН ИФА также дает ложноположительные результаты. Тем не менее, отрицательно реагирующих животных по у-ИФН ИФА гораздо больше (29 - по симультанной пробе, 37 - по у-ИФН ИФА). Также следует отметить тот факт, что при применении у-ИФН ИФА нет категории животных «с равной реакцией», то есть учитывая полученные результаты исследований есть основание предлагать у-ИФН ИФА в качестве дополнительного диагностического теста для дифференциации неспецифических реакций на туберкулин при диагностике туберкулеза у крупного рогатого скота.

В хозяйстве № 3 при исследовании внутрикожной туберкулиновой пробой 739 голов крупного рогатого скота было выявлено 24 реагирующих на туберкулин животных с увеличением толщины кожной складки на 3-6 мм. От всех 24 реагирующих коров и 11 нереагирующих на туберкулин были отобраны пробы крови и исследованы методом у-ИФН ИФА (табл.5).

Таблица 5.

Суммарные результаты диагностических исследований на туберкулез крупного рогатого скота в хозяйстве №3.

Результат Количество ВТП животных Результат у-ИФН ИФА, количество животных

Положительных Отрицатель- (реагирующих ных на ППД - туб. для птиц)

Положительный 24 0 24 (2)

Отрицательный 11 0 11 (0)

Данные таблицы 5 свидетельствуют о том, что все 11 ВТП-негативных животных были также отрицательными и в у-ИФН ИФА (показатели ОП 450 В-А: -0,053 - 0,046). 24 реагировавшие на туберкулин коровы дали отрицательные результаты в у-ИФН ИФА (ОП 450 В-А от 0,022 до 0,076). Две из них реагировали на ППД- туберкулин для птиц (-0,11 и -0,896 соответственно).

По результатам исследований провели диагностический убой пяти реагировавших на туберкулин и не реагировавших в у-ИФН ИФА коров. Животные были подвергнуты патологоанатомическому исследованию и от каждой были взяты пробы патматериала.

При патологоанатомическом осмотре убитых коров характерных для туберкулеза изменений не обнаружили. При лабораторном исследовании

патматериала от убитых животных возбудителя туберкулеза не выделили. Выделили нефотохромогенные атипичные микобактерии Ш группы по классификации Ранъёна.

Полученные комплексные результата сравнительных исследований двух прижизненных диагностических методов позволяют сделать вывод о том, что использование метода у-ИФН ИФА в хозяйстве №3, так же как и в хозяйстве №1, позволило исключить ложноположительные результаты ВТП при постановке комплексного диагноза на туберкулез.

2.4. СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ ЦЕННОСТИ ВНУТРИ-КОЖНОЙ ТУБЕРКУЛИНОВОЙ ПРОБЫ И у-ИФН ИФА В НЕБЛАГОПОЛУЧНОМ ПО ТУБЕРКУЛЕЗУ ХОЗЯЙСТВЕ

В соответствии с Санитарными и Ветеринарными правилами от 1996 года, оздоровление неблагополучных по туберкулезу хозяйств проводят двумя методами: методом полной замены поголовья неблагополучного стада здоровыми животными и методом систематических диагностических исследований с выделением и убоем реагирующих больных туберкулезом животных.

В ветеринарной практике нашей страны наиболее часто применяется оздоровление методом систематических исследований и убоем реагирующих на туберкулин животных. При этом, всех животных, начиная с 2-х месячного возраста, исследуют внутрикожной туберкулиновой пробой через каждые 4560 дней. Всех реагирующих на туберкулин животных считают больными и сдают на убой. Аллергические исследования и убой всех реагирующих животных проводят до получения по всему стаду двух подряд отрицательных результатов аллергических исследований.

Заключительный раздел нашей работы посвящен сравнительному изучению диагностической ценности внутрикожной туберкулиновой пробы и у-ИФН ИФА при диагностике туберкулеза крупного рогатого скота в неблагополучном по туберкулезу хозяйстве РФ.

Сравнительные эксперименты проводили с использованием проб крови крупного рогатого скота, полученных из неблагополучного по туберкулезу СПК «Уваровская нива» Тамбовской области (хозяйство №4).

В этом хозяйстве при исследовании 696 голов крупного рогатого скота было выявлено 16 реагирующих на туберкулин животных. Все реагирующие на туберкулин животные были убиты на мясокомбинате и подвергнуты пато-логоанатомическому исследованию. Пробы патматериала были взяты от каждого животного и исследованы в лаборатории. От всех убитых коров были отобраны пробы крови и исследованы методом у-ИФН ИФА с применением отечественных и голландских ППД- туберкулинов для млекопитающих и ППД- туберкулинов для птиц.

Результаты сравнительных диагностических исследований животных с использованием у-ИФН ИФА приведены в таблице 6.

Таблица 6.

Сравнительный анализ результатов ВТП и у-ИФН ИФА полученных при исследовании крупного рогатого скота из хозяйства №4.

Результат Количество ВТП животных Результат у-ИФН ИФА, количество животных

Положительных Отрицатель- (реагирующих ных на ППД - туб. для птиц)

Положительный 16 13 3 (0)

Результаты исследований показали, что при исследовании 16 проб крови от реагирующих на туберкулин коров методом у-ИФН ИФА, результаты были положительными в 13 случаях (совпадаемость результатов двух методов составила 81,2%). При этом показатели ОП 450 В-А у у-ИФН-пози-тивных животных составляли от 0,167 до 2,342 после инкубации с различными антигенами. Пробы от трех коров дали отрицательную реакцию в у-ИФН ИФА (показатели ОП 450 В-А составили от 0,078 до 0,031 соответственно). Следует отметить, что в у-ИФН ИФА с ППД- туберкулином для птиц ни одно животное не дало положительной реакции.

Кроме того установлено, что при трехкратном исследовании каждой пробы крови наблюдалась 100% совпадаемость в интерпретации результатов у-ИФН ИФА с использованием голландских и отечественных ППД- туберку-линов для млекопитающих и ППД- туберкулинов для птиц. Однако в ряде случаев при проведении однократных исследований, несмотря на статистически достоверную положительную корреляцию результатов (г = 0,65, Р < 0,05) наблюдались цифровые расхождения показателей ОП 450 В-А, полученные с применением двух препаратов. При этом в большинстве случаев показатели ОП 450 А и ОП 450 В были значительно выше при использовании отечественных ППД- туберкулинов для млекопитающих и ППД- туберкулинов для птиц.

Для исключения или подтверждения диагноза на туберкулез, все убитые животные были подвергнуты патологоанатомическому исследованию, пробы патматериала исследовали культуральным и биологическим методами.

Анализ посмертных исследований позволил заключит следующее. При патологоанатомическом осмотре убитых коров характерные для туберкулеза изменения были обнаружены в 2-х случаях (обе были положительными в ВТП и у-ИФН ИФА). При лабораторном исследовании патматериала от убитых животных туберкулез подтвержден еще у 5 реагировавших убитых коров (все пять были положительными в ВТП и у-ИФН ИФА). При этом, при патологоанатомическом осмотре и лабораторном исследовании патматериала от 3-х реагировавших на внутрикожное введение туберкулина животных и не

давших положительный результат в у-ИФН ИФА туберкулез не подтвержден ни в одном случае.

3. ВЫВОДЫ

1. Для прижизненной диагностики туберкулеза отработан метод «сэндвич»- ИФА, предназначенный для детекции у-ИФН в пробах крови крупного рогатого скота. Установлено, что метод характеризуется высокой чувствительностью, специфичностью и воспроизводимостью результатов.

2. Проведена сравнительная электрофоретическая оценка структурного состава голландских и отечественных ППД- туберкулинов для млекопитающих и ППД- туберкулинов для птиц. Показана возможность использования отечественного ППД- туберкулина для млекопитающих и ППД- туберкулина для птиц в коммерческом наборе «BOVTGAM™ » для стимуляции Тн1-клеток крови in vitro в дозе 50 мкл/мл.

3. Комплексными исследованиями с использованием внутрикожной туберкулиновой пробы и у-ИФН ИФА изучена динамика формирования Т- клеточного иммунного ответа у экспериментально зараженных М. bovis телят. Определены сроки появления и максимального содержания у-ИФН в крови опытных животных в процессе постинфекционного иммуногенеза. Установлена максимальная 100%-ная совпадаемость результатов ВТП и у-ИФН ИФА на 135-е сутки после заражения. При этом у экспериментально зараженных телят диагностическое повышение уровня у-ИФН в крови происходило на 2050 суток раньше, чем внутрикожная реакция на ППД- туберкулин для млекопитающих.

4. Показано, что в благополучных по туберкулезу хозяйствах, где установлена сенсибилизация животных атипичными микобактериями, у-ИФН ИФА дает в 3 раза меньше ложноположительных результатов по сравнению с внутрикожной туберкулиновой пробой. При этом установлена 100%-я совпадаемость результатов полученных с помощью ВТП и у-ИФН ИФА при исследовании здоровых животных.

5. Установлено, что в неблагополучном по туберкулезу хозяйстве, при исследовании инфицированных туберкулезом коров, результаты исследований с применением внутрикожной туберкулиновой пробы и у-ИФН ИФА совпали в 81,2% случаях.

6. Полученные результаты экспериментальных исследований свидетельствуют об эффективности у-ИФН ИФА в качестве прижизненного (наряду с ВТП) метода иммунодиагностики туберкулеза крупного рогатого скота. Установлено, что эффективность вышеуказанных методов, основан-

ных на реакциях клеточного иммунитета, существенно возрастает при их совместном применении.

4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

у-ИФН ИФА целесообразно использовать как дополнительный метод прижизненной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота в целях дифференциации аллергических реакций на туберкулин в благополучных по туберкулезу хозяйствах Российской Федерации. Исследования с помощью метода у-ИФН ИФА рекомендуется проводить через 7-30 суток после проведения плановой туберкулинизации.

5. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. О.А.Верховский, А.Х.Найманов, О.А.Савицкая, Ю.Н.Федоров, Н.П.Овдиенко. Использование метода «сэндвич»-ИФА для диагностики туберкулеза крупного рогатого скота // Сборник научных трудов ВНИИБТЖ, Омск, 2001, с.173-175.

2. O.A.Verkhovsky, A.Kh.Naymanov, O.A.Savitskaya, Yu.N.Fedorov, N.P.Ovdienko and J.D.Collins. Evaluation of the single intradermal tuberculin test and the commercial y-interferon assay for the detection of Mycobacterium bovis infected cattle in Russia // Abstr. of the 6th International Veterinary Immunology Symposium, Sweden, Uppsala, 2001, p.174.

3. А.Х.Найманов, О.А.Верховский, О.А.Савицкая. у-ИФН ИФА при туберкулезе крупного рогатого скота // Ж. Ветеринарная патология, 2004, №1-2 (9), с.118-121.

4. О.А.Верховский, А.Х.Найманов, О.А.Савицкая. Динамика содержания у-интерферона в крови крупного рогатого скота при туберкулезе // Ж. Ветеринарная патология, 2004, №1-2 (9), с. 121-123.

5. А.Х.Найманов, О.А.Верховский, О.А.Савицкая, Н.П.Овдиенко, Ю.Н.Федоров. Определение у-интерферона для диагностики туберкулеза // Ж. Ветеринария, 2004, №6, с.19-22.

Принято к исполнению 24/05/2004 Заказ № 228

Исполнено 25/05/2004 Тираж 100 экз

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095) 747-64-70 (095)318-40-68 www autoreferat ru

РНБ Русский фонд

2007-4 4786

J i

Оглавление диссертации Савицкая, Оксана Александровна :: 2004 :: Москва

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Туберкулез крупного рогатого скота — проблема инфекционной патологии животных.

2.2. Иммунная система крупного рогатого скота: основные понятия.

2.3. Механизмы иммунного ответа у животных, ^ инфицированных M.bovis.

2.4. Иммунологические методы диагностики туберкулеза крупного рогатого скота.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1. Антигены микобактерий.

3.2. Экспериментальные животные.

3.3. Благополучные и неблагополучные по туберкулезу хозяйства, аллергические и лабораторные исследования на туберкулез.

3.4. у-ИФН ИФА.

3.5. Электрофорез в ПААГ-ДСН.

3.6.Статистическая обработка результатов.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

4.1. Отработка постановки у-ИФН ИФА и внесение дополнений в методику.

4.2. Динамика постинфекционного Т-клеточного иммунного ответа у экспериментально зараженных М. bovis телят.

4.3. Сравнительное изучение диагностической ценности внутрикожной туберкулиновой пробы и метода у-ИФН ИФА в благополучных по туберкулезу хозяйствах.

4.4. Сравнительное изучение диагностической ценности внутрикожной туберкулиновой пробы и метода у-ИФН ИФА в неблагополучном по туберкулезу хозяйстве.

Введение диссертации по теме "Ветеринарная эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология", Савицкая, Оксана Александровна, автореферат

На современном этапе борьбы с туберкулезом крупного рогатого скота основой профилактических и оздоровительных мероприятий была и остается диагностика этой болезни. В настоящее время основным и массовым методом диагностики туберкулеза является внутрикожная туберкулиновая проба (ВТП) с применением ППД-туберкулина для млекопитающих. Однако одной из важных проблем при диагностике туберкулеза ВТП является проблема неспецифических или парааллергических реакций на туберкулин. Проблемам, связанным с разработкой высокочувствительных и специфичных методов диагностики туберкулеза крупного рогатого скота, посвящены многочисленные работы отечественных и зарубежных авторов (П.П.Вишневский, 1937; С.Н.Вышелесский, 1948; М.К.Юсковец, 1965; И.В.Поддубский, 1957, 1967; М.А.Сафин, 1981; А.С.Донченко, 1981, 1994; Б.Я.Хайкин и Л.М.Ходун, 1991; Н.П.Овдиенко, 1991; А.Х.Найманов, 1993; Ю.И.Смолянинов, 1994; Ю.А.Макаров, 1997; Р.А.Нуратинов, 1998; Т.В.Гребенникова с соавт., 1999; А.Н.Шаров с соавт., 2000; L.A.Corner, 1994; L.A.Sechi et al., 1999; R.E.Romero et al., 1999; M.J.Waters et al, 2000; C.Coetsier et al., 2000; H.Park et al., 2000; M. Amadori et al., 2002 и др.). Тем не менее, и в настоящее время прижизненная диагностика туберкулеза крупного рогатого скота имеет две главные противоположные проблемы: с одной стороны - перевыявление, т.е. выявление здоровых животных с «парааллергическими» реакциями на туберкулин в благополучных по туберкулезу хозяйствах, а с другой стороны — недовыявление зараженных туберкулезом животных в неблагополучных по туберкулезу хозяйствах. Поэтому, при проведении исследований на туберкулез в благополучных хозяйствах следует повысить специфичность, а в неблагополучных - чувствительность диагностических исследований. Задачи эти не совсем простые, т.к. при повышении чувствительности ВТП (увеличением дозы, кратности введения туберкулина, изменением критериев оценки реакции и т.д.) одновременно снижается ее специфичность и наоборот, при увеличении специфичности - снижается чувствительность ВТП. Кроме того, известно, что на проявление аллергических реакций влияют многочисленные факторы внешней среды, индивидуальные особенности организма животного, условия кормления и содержания и т.д. Поэтому в целях совершенствования аллергической диагностики туберкулеза можно подобрать наиболее чувствительные и удобные места для введения туберкулина, оттитровать его дозу и усовершенствовать методы введения, подобрать оптимальные критерии оценки аллергических реакций. Однако, учитывая массовость и масштабность проведения исследований на туберкулез стандартизировать организмы всех исследуемых животных по реактивности из-за различных внешних и внутренних факторов вряд ли возможно, т.к. в разных регионах страны с различными климатическими зонами и с разной эпизоотической ситуацией по туберкулезу имеются разные животные с различным проявлением мико-бактериальной инфекции. По этой причине прижизненная диагностика туберкулеза крупного рогатого скота одной внутрикожной туберкулиновой пробой не может быть идеальным диагностическим средством. Поэтому изыскание новых, современных дополнительных методов диагностики туберкулеза животных является весьма актуальным и перспективным и на сегодняшний день.

Основными диагностическими методами оценки Т-клеточного иммунного ответа при туберкулезе являются внутрикожная туберкулиновая проба, реакция бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ) и разработанный сравнительно недавно (Rothel J.S.et al., 1990) «сэндвич»-ИФА на основе монокло-нальных антител, предназначенный для выявления у-интерферона (у-ИФН) в крови инфицированных животных (у-ИФН ИФА). Все методы предполагают использование ППД туберкулина в качестве антигена, стимулирующего пролиферацию Т- клеток in vivo (ВТП) или in vitro (РБТЛ и у-ИФН ИФА).

Внутрикожная туберкулиновая проба уже более 100 лет остается основным методом прижизненной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота. В основе метода лежит реакция организма на внутрикожное введение туберкулина сенсибилизированному животному, являющаяся наиболее ярким примером гиперчувствительности замедленного типа и представляющая собой иммунологически специфическую воспалительную реакцию, обусловленную Т- клетками. Метод ВТП характеризуется высокой чувствительностью, однако основным недостатком этого метода является достаточно высокий процент ложноположительных реакций, возникающих вследствие перекрестной реактивности между антигенами разных видов микобактерий.

РБТЛ является высокочувствительным методом определения специфического иммунного ответа на ППД-туберкулин для млекопитающих и оценки реактивности Т-клеток у инфицированных M.bovis животных. Однако длительность постановки реакции, необходимость выделения лимфоцитов из крови и использования радиоактивной метки для определения уровня клеточной пролиферации являются серьезными ограничениями для использования этого метода в клинической практике.

Теоретической основой разработки у-ИФН ИФА является тот факт, что в крови зараженных туберкулезом животных присутствуют сенсибилизированные Т-лимфоциты, способные к специфическому распознаванию антигенов имеющихся в 1111 Д-туберкулина для млекопитающих. В процессе иммунологического распознавания происходит стимуляция Т-клеток и как следствие этого выделение цитокина- у-интерферона, определяемого в крови методом «сэндвич»-ИФА. Обнаружение у-ИФН свидетельствует о наличии возбудителя туберкулеза в организме исследуемого животного. Для получения более достоверных результатов прижизненных диагностических исследований на туберкулез, большинство авторов рекомендуют использовать комплексный метод диагностики, т.е. одновременно два метода: внутрикож-ную туберкулиновую пробу и у-ИФН ИФА.

Высокая чувствительность и специфичность у-ИФН ИФА была подтверждена при проведении широкомасштабных диагностических исследований в США, Ирландии, Испании, Аргентине, Бразилии и других странах мира (D.L.Whipple et al., 1995, 2001; M.Monaghan et al., 1997; O. R.Gonzalez Llamazares et al., 1999; TJ.Ryan et al., 2000; J.M.Pollock et al., 2000; B.M.Buddie et al., 2001; R.K.Katial et al., 2001; A.M.Perez et al., 2002 и др.).

Основные задачи исследований:

Научная новизна работы.

Впервые проведена сравнительная оценка голландских и отечественных ППД- туберкулинов для млекопитающих и ГТПД- туберкулинов для птиц и показана возможность использования отечественного ППД- туберкулина для млекопитающих и ППД- туберкулина для птиц в коммерческом наборе «BOVIGAM™» для стимуляции Тн1 -клеток крови in vitro.

Комплексными исследованиями с использованием ВТП и у-ИФН ИФА изучена динамика формирования Т- клеточного иммунного ответа у экспериментально зараженных M.bovis телят. Получены новые данные о сроках появления и максимального содержания у-ИФН в крови зараженных туберкулезом животных в процессе постинфекционного иммуногенеза.

Практическая значимость исследований.

Основные положения, выносимые на защиту.

Полученные экспериментальные данные позволяют вынести на защиту следующие основные положения:

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на:

• 6-м Международном симпозиуме по ветеринарной иммунологии, Швеция, Уппсала, 2001;

• Межлабораторном совещании сотрудников ВИЭВ, Москва, 2004. Публикаиии. По материалам диссертации опубликовано две научные работы и три приняты в печать.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 123 стр. машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, собственных результатов исследований, заключения, выводов, практических предложений, списка цитированной литературы. Материалы диссертации иллюстрированы 15 таблицами и 7 рисунками. Список литературы включает 175 источников (12 отечественных и 163 зарубежных авторов).

Заключение диссертационного исследования на тему "Диагностическое значение реакций клеточного иммунитета при туберкулезе крупного рогатого скота"

6. выводы

2. Проведена сравнительная электрофоретическая оценка структурного состава голландских и отечественных ППД- туберкулинов для млекопитающих и ППД- туберкулинов для птиц. Показана возможность использования отечественного ППД- туберкулина для млекопитающих и ППД- туберкулина для птиц в коммерческом наборе «BOVIGAM™ » для стимуляции Тн1 -клеток крови in vitro в дозе 50 мкл/мл.

3. Комплексными исследованиями с использованием внутрикожной туберкулиновой пробы и у-ИФН ИФА изучена динамика формирования Т- клеточного иммунного ответа у экспериментально зараженных M.bovis телят. Определены сроки появления и максимального содержания у-ИФН в крови опытных животных в процессе постинфекционного иммуногенеза. Установлена максимальная 100%-ная совпадаемость результатов ВТП и у-ИФН ИФА на 135-е сутки после заражения. При этом у экспериментально зараженных телят диагностическое повышение уровня у-ИФН в крови происходило на 20-50 суток раньше, чем внутрикожная реакция на ППД-туберкулин для млекопитающих.

7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ у-ИФН ИФА целесообразно использовать как дополнительный метод прижизненной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота в целях дифференциации аллергических реакций на туберкулин в благополучных по туберкулезу хозяйствах Российской Федерации. Исследования с помощью метода у-ИФН ИФА рекомендуется проводить через 7-30 суток после проведения плановой туберкулинизации.

Установленные временные показатели диагностического появления у-ИФН в крови могут служить ориентиром при оценке иммунного ответа животных, инфицированных M.bovis.

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В структуре инфекционных болезней животных туберкулез крупного рогатого скота занимает особое место по своему социальному и экономическому значению, нанося значительный экономический ущерб промышленному животноводству. При этом эффективность противоэпизоотических и профилактических мероприятий при туберкулезе, проводимых в системе мер по предупреждению возникновения и распространения болезни, в значительной степени зависит от своевременной постановки диагноза и удаления больных животных, как основного источника возбудителя инфекции, из оз-доравливаемых стад. Таким образом, ранняя прижизненная диагностика является наиболее эффективным средством борьбы с туберкулезом, о чем свидетельствуют многочисленные данные отечественных и зарубежных авторов (Н.П.Овдиенко, А.Х.Найманов, 1998; Т.В.Гребенникова с соавт., 1999; А.Н.Шаров с соавт., 2000; J.M.Pollock and P.Andersen, 1997; H.M.Vordermeier et al, 1999; M.J.Waters et al, 2000 и др).

В настоящее время, несмотря на проводимые профилактические и оздоровительные мероприятия, эпизоотическая ситуация по этой болезни остается напряженной и даже чревата осложнениями. Во многих экономически развитых странах отмечается увеличение заболеваемости туберкулезом людей и животных, появляются остро прогрессирующие формы болезни и резистентные штаммы возбудителя ко многим противотуберкулезным препаратам. Правительство Российской Федерации постановлением от 11 июня 1998 г. №582 утвердило Федеральную целевую программу «Неотложные меры борьбы с туберкулезом в России на 1998-2004 годы».

Для проведения комплекса противотуберкулезных мероприятий, необходимы высокочувствительные и специфичные лабораторные исследования, роль которых чрезвычайно высока.

Однако, несмотря на развитие и расширение арсенала современных методов исследований, направленных на выделение и идентификацию возбудителя (прежде всего ПЦР и РАЛ), вопросы диагностики туберкулеза остаются до конца нерешенными, что значительно осложняет борьбу с этой болезнью.

В настоящее время ученые из ведущих стран мира большое значение придают не только вышеуказанным методам, но и современным иммуноди-агностическим методам (прежде всего ИФА), направленным на оценку функциональной активности Т-лимфоцитов при инфицировании животных M.bovis (Wood P.R, Rothel J.S.,1994; Neill S.D. et al., 1994 и др.) или на выявление специфических антител к различным антигенам микобактерий (Lya-shchenko К.Р. et al., 1998; Amadori M. et al., 2002 и др.). Это обстоятельство обусловлено, прежде всего, следующим: а) достижениями в изучении иммунной системы крупного рогатого скота и ее роли в иммунопатогенезе туберкулеза; б) достижениями в изучении структурного состава и биологических свойств различных видов микобактерий; в) получением и использованием моноклональных антител заданной специфичности, гомогенных по аффинности и изотипу.

Известно, что иммунологические методы, в основе которых лежит высокоспецифическое взаимодействие антител с антигенами, нашли широкое применение во всех фундаментальных и прикладных исследованиях, требующих индикации любых биоорганических субстанций (вирусов, бактерий, клеток, и т.д.). Последние десятилетия стали периодом интенсивного развития принципиально новых аналитических систем (ИФА, иммунохроматогра-фический метод и др.), которые предполагают применение специальных маркеров, позволяющих с высокой чувствительностью регистрировать минимальные количества образовавшихся в результате реакции иммунных комплексов. Преимущества этих методов заключаются не только в высокой чувствительности и уникальной специфичности, но и в применении инструментального учета результатов, что существенно повышает точность анализа и обуславливает возможность его автоматизации в процессе проведения массовых исследований.

В настоящее время различные модификации ИФА, основанные на применении как поли-, так и моноклональных антител, широко используются для диагностики инфекционных и паразитарных болезней, углубленной характеристики иммунного статуса здоровых и больных людей и животных, идентификации поверхностных антигенов клеток иммунной системы, контроля биологических препаратов.

Однако, если ИФА-методы, направленные на детекцию специфических антител к различным антигенам микобактерий еще находятся на стадии разработки и использования в научно-исследовательских лабораториях, то у-ИФН ИФА несколько лет назад появился на международном ветеринарном рынке в виде коммерчески доступного диагностического ИФА-набора. Этому предшествовал прогресс в изучении иммунной системы крупного рогатого скота и результатов интенсивных исследований, направленных на идентификацию и функциональную характеристику различных субпопуляций лейкоцитов и секретируемых ими продуктов, изучение организации генома и иммунологической роли главного комплекса гистосовместимости и т.д.

В настоящее время метод у-ИФН ИФА наряду с ВТП является узаконенным методом диагностики туберкулеза крупного рогатого скота в Австралии, Новой Зеландии и Румынии. Высокая чувствительность и специфичность метода была подтверждена при проведении широкомасштабных диагностических исследований в США, Ирландии, Испании, Аргентине, Бразилии и других странах мира (D.L.Whipple et al., 1995, 2001; M.Monaghan et al., 1997; O. R.Gonzalez Llamazares et al., 1999; T.J.Ryan et al., 2000; J.M.Pollock et al., 2000; B.M.Buddie et al., 2001; R.K.Katial et al., 2001; A.M.Perez et al, 2002 и др.).

В 2001 г. у-ИФН ИФА рекомендован для использования в США в качестве дополнительного к ВТП метода прижизненной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота.

G. Jungersen с соавт. (2002) и более ранние исследования (H.Billman-Jacobe et al., 1992; J.R.Stabel, 1996; M.T.Collins et al., 1996, 2001 и др.) показали эффективность применения у-ИФН ИФА для диагностики парату-беркулеза крупного рогатого скота.

В связи с этим можно выделить три основные цели нашей работы:

Г11

1.С использованием коммерческого набора «BOVIGAM » определить уровень у-ИФН в крови, экспериментально зараженных M.bovis, телят и изучить динамику формирования Т- клеточного иммунного ответа у животных в процессе постинфекционного иммуногенеза.

2. Провести сравнительное изучение диагностической ценности внутрикожной туберкулиновой пробы и у-ИФН ИФА при диагностике туберкулеза крупного рогатого скота в различных регионах и хозяйствах РФ.

3. На основе полученных результатов изучить возможность применения у-ИФН ИФА в качестве дополнительного метода прижизненной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота на территории Российской Федерации.

Все выше перечисленные цели обусловили выбор опытных моделей настоящего исследования и методических подходов к решению поставленных задач.

На первом этапе необходимо было отработать методику постановки и учета результатов у-ИФН ИФА и определить возможность использования отечественных ППД- туберкулинов для млекопитающих и ППД- туберкулинов для птиц в коммерческом у-ИФН ИФА наборе. В результате проведенных экспериментов была отработана методика постановки у-ИФН ИФА с учетом установленной возможности длительного хранения реагентов и использования туберкулинов отечественного производства при постановке реакции. При этом установлено, что при использовании отечественных ППД-туберкулина для млекопитающих и ППД- туберкулина для птиц в наборе «BOVIGAM™» их оптимальная доза необходимая для стимуляции Т-клеток крови in vitro, составляет 50 мкл/мл. Ранее исследования аналогичной направленности были проведены D.L.Whipple et al. (2001) которые сравнили ППД- туберкулин для млекопитающих и ППД- туберкулин для птиц, изготовленные в США с аналогичными туберкулинами, произведенными в Австралии с целью их возможного использования в коммерческом наборе «ВОVIGAM™». Авторами установлено, что значения ОП 450 при использовании ППД- туберкулина для млекопитающих, изготовленного в США, были выше аналогичных значений полученных с использованием туберкулина произведенного в Австралии, однако сравнительная интерпретация результатов была одинакова в обоих случаях. Это позволило авторам сделать вывод о возможности использования американских ППД- туберкулина для млекопитающих и ППД- туберкулина для птиц в австралийском у-ИФН ИФА наборе и подчеркнуть, что использование данного метода в сочетании ВТП может значительно улучшить диагностику туберкулеза крупного рогатого скота.

Таким образом, обобщив результаты, полученные при проведении первого этапа нашей работы, был сделан вывод о том, что наши исследования подтвердили мнение зарубежных ученых о высокой чувствительности, специфичности, информативности и воспроизводимости метода «сэндвич»-ИФА по определению у-ИФН в пробах крови крупного рогатого скота (J.S.Rothel et al., 1990, 1992; M.Monaghan et al., 1997; S.A.Pottumarthy et al., 1999; S.G.Rhodes et al., 2000, 2001; R.K.Katial et al., 2001; J.M. Pollock et al., 1996, 1997, 2000, 2002 и др.).

Дальнейшие наши исследования были направлены на изучение динамики формирования постинфекционного Т- клеточного иммунного ответа у телят и сравнительное изучение диагностической ценности внутрикожной туберкулиновой пробы и у-ИФН ИФА в экспериментальных условиях. Для этого был проведен опыт по экспериментальному заражению телят M.bovis с последующими прижизненными и посмертными диагностическими исследованиями на туберкулез. Для экспериментального заражения использовали ВТП-негативных телят (п=6), полученных из благополучного по туберкулезу хозяйства, которым перорально 3-х кратно с интервалом в 24 часа вводили вирулентную культуру M.bovis (музейный штамм «8») в дозе 0,2 мг полувлажной бактериальной массы культуры/кг живой массы теленка (приблизио тельно 10 клеток М. bovis). Через 7 суток животным вводили культуру еще раз в такой же дозе. Животных контрольной группы (п=3) не заражали. Прижизненные исследования проводили в процессе постинфекционного иммуногенеза на 0, 7, 14, 21, 28, 35, 65, 85, 110 и 135 сутки после заражения с использованием аллергической пробы и у-ИФН ИФА, посмертные - сразу же после убоя животных (через год п.з.). Результаты патологоанатомических, культуральных и биологических методов исследований свидетельствовали о том, что телята опытной группы заразились туберкулезом. При этом установлено, что все телята контрольной группы оставались здоровыми в течение периода всего эксперимента, что было подтверждено результатами как посмертных, так и прижизненных исследований.

Результаты ИФА по определению динамики содержания у-ИФН в крови телят опытной группы в процессе постинфекционного иммуногенеза свидетельствовали о том, что Т-клеточный иммунный ответ формировался у всех экспериментально зараженных животных. При этом у этих животных установлены различия в сроках появления и относительном содержании у-ИФН в крови. В большинстве случаев (в 4-х из 6-ти) достоверное диагностическое увеличение уровня у-ИФН в крови отмечено на 35-е — 65-е сутки после заражения, в двух других — на 85-е и 110-е сутки п.з. соответственно. Самое высокое содержание у-ИФН установлено также у 4 телят: №1, 4, 2, 6 на 65-е (ОП 450 В-А равен 0,754), 110-е сутки п.з. (0,56) и на 135-е сутки (0,763 и 0,95) после заражения соответственно. У двух телят (№3 и №5) уровень у-ИФН в крови был значительно ниже и на 110-е сутки п.з. показатели ОП 450 В-А составляли 0,3 и 0,44 соответственно. Результаты изучения динамики Т-клеточного иммунного ответа у опытных животных также свидетельствовали о том, что в большинстве случаев после достижения своего максимального значения уровень у-ИФН в крови имел выраженную тенденцию или к своему снижению (у 3-х телят) или к увеличению (у 2-х телят). Только у одного теленка в процессе постинфекционного иммуногенеза уровень у-ИФН в крови после достоверного повышения оставался постоянным и на относительно низком уровне.

Результаты наших исследований по определению уровня у-ИФН в крови животных, экспериментально зараженных М. bovis, совпадают с результатами аналогичных исследований, проведенных зарубежными исследователями в последние годы. Так самые первые опыты, проведенные J.M.Pollock и P.Andersen (1997), показали, что у животных, экспериментально инфицированных М. bovis (п=4), начиная с 3-й недели п.з., формируется выраженный Т-клеточный ответ к антигенам микобактерий. При этом авторами установлено, что относительное количество у-ИФН в крови достигало максимума через 5 недель п.и., далее несколько снижалось к 7-й неделе и оставалось на достигнутом уровне до 16-й недели п.з. (срок наблюдения) с незначительной тенденцией к увеличению в конце эксперимента. S.G.Rhodes et al. (2000) отмечали сильный у-ИФН- иммунный ответ у экспериментально зараженных телят через 4-е недели после инфицирования. По их результатам этот ответ имел тенденцию к увеличению в течение 6-8 недель п.з. D.N.Wedlock et al. (2000) проводили опыты по оценке эффективности вакцинации телят препаратами, состоящими из белков культурального фильтрата М. bovis и рекомбинантного ИЛ-2 крупного рогатого скота, путем последующего инфицирования опытных животных вирулентным штаммом М. bovis Wag201. Исследователями установлено, что уровень у-ИФН увеличивался в крови животных через 2-е недели после иммунизации, через 4-е — достигал своего максимального значения после чего начинал снижаться и на момент экспериментального заражения (13-я неделя) доходил практически до нуля. Через 2 недели после проведения экспериментального заражения в крови животных резко увеличивался уровень у-ИФН, затем этот показатель достигал своего максимального значения (5 недель п.з.), снижался к 10-й неделе п.з. и далее практически не изменялся до 17-той недели п.з. (срок наблюдения). В опытах H.E.Kennedy et al (2002) достоверное увеличение у

ИФН в крови экспериментально инфицированных 6-ти месячных телят, деплетированных по WC1+ у5 Т-клеткам, наблюдалось уже на 19-39 сутки п.з.

Одновременно с проведением исследований по изучению динамики формирования постинфекционного у-ИФН - иммунного ответа у зараженных телят, на этой же экспериментальной модели нами была решена еще одна задача данного опыта - оценка диагностической ценности ВТП и у-ИФН ИФА. Анализ полученных результатов позволил констатировать 100%-ную совпа-даемость результатов двух методов на 135-е сутки п.з., однако диагностическое повышение уровня у-ИФН, установленное методом ИФА, происходило на 20 — 50 суток раньше чем была зарегистрирована внутрикожная реакция животных на ППД- туберкулин для млекопитающих. Эти результаты согласуются с мнением W.Lilenbaum et al (1999) показавших в своих экспериментах возможность более раннего обнаружения (на 60 — 120 суток) животных, инфицированных М. bovis, с помощью у-ИФН ИФА по сравнению с ВТП.

Одной из главных задач, стоящих перед нами в процессе выполнения данной работы, была сравнительная оценка диагностической ценности ВТП и у-ИФН ИФА в качестве методов прижизненной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота в благополучных и неблагополучных по туберкулезу хозяйствах РФ. В качестве опытных моделей для исследований были взяты животные, принадлежащие трем благополучным по туберкулезу хозяйствам (№1, п=20; №2, п=60 и №3, п=35) и одному неблагополучному по туберкулезу хозяйству (п=16).

При планировании и проведении экспериментов был использован опыт цитированных ранее зарубежных ученых проводивших подобные исследования в Австралии, Новой Зеландии, Ирландии, США, Испании, Аргентине, Бразилии и других странах мира. Суммарные результаты сравнительных исследований по определению диагностической ценности ВТП и у-ИФН ИФА представлены на рисунке 7. положительные в у-ИФН ИФА отрицательные в у-ИФН ИФА

0,5

1 1,5

ОП 450 проб А

2,5

Рисунок 7. Суммарные результаты исследований методом у-ИФН ИФА с использованием голландских ППД- туберкулина для птиц и ППД- туберкулина для млекопитающих.

На оси абсцисс представлены показатели ОП 450 проб, стимулированных ППД- туберкулином для птиц; на оси ординат - показатели ОП 450 проб, стимулированных ППД- туберкулином для млекопитающих. В исследованиях использованы пробы (п=131), полученные из четырех животноводческих хозяйств РФ, как положительные (п=100), так и отрицательные (п=31) в ВТП.

Результаты проведенных нами исследований показали, что все животные обследованных хозяйств, не реагирующие на ППД-туберкулин для млекопитающих в ВТП (п=31), были также отрицательными и в у-ИФН ИФА. Эти данные, а также результаты, полученные в опыте по экспериментальному заражению телят музейным штаммом М. bovis, свидетельствуют о том, что метод у-ИФН ИФА не давал ложноположительных результатов при исследовании здоровых животных. Эти данные были подтверждены отрицательными результатами проведенных в дальнейшем посмертных патологоанатомических и лабораторных исследований на туберкулез выборочно убитых ВТП-негативных животных.

Анализируя результаты исследований 16 реагировавших на туберкулин животных, принадлежащих неблагополучному по туберкулезу хозяйству (№4, Тамбовской области) следует отметить, что 13 животных были также положительными и в у-ИФН ИФА. При этом показатели ОП 450 В-А у этих животных составляли от 0,167 до 2,342, что в ряде случаев значительно выше аналогичных показателей, полученных при исследовании экспериментально зараженных телят. Это может свидетельствовать о том, что уровень у-ИФН в крови животных, инфицированных полевыми культурами М. bovis, может быть существенно выше, чем у животных, зараженных музейным штаммом М. bovis в эксперименте. В этих же исследованиях 3 животных дали положительную реакцию в ВТП и отрицательную - в у-ИФН ИФА. Однако результаты посмертных исследований этих животных были отрицательными, что позволило предположить, что они не болели туберкулезом.

При проведении сравнительных исследований животных, относящихся к благополучным по туберкулезу хозяйствам, где установлена сенсибилизация животных атипичными микобактериями (№1 и №3) все 29 животных, положительно реагирующих на ППД- туберкулин для млекопитающих в ВТП, были отрицательными в у-ИФН ИФА при использовании как голландских, так и отечественных туберкулинов для стимуляции Т-клеток in vitro. Дальнейшие исследования послеубойного материала с помощью культураль-ных и биологических методов, направленные на выделение и идентификацию M.bovis, не дали положительного результата. Таким образом, использование метода у-ИФН ИФА в этих хозяйствах позволило исключить ложно-положительные результаты ВТП при постановке комплексного диагноза на туберкулез.

Интересные результаты были получены в хозяйстве №2, где наблюдается достаточно выраженный разброс результатов ВТП и у-ИФН. Поголовье данного хозяйства требует дальнейшего обследования с целью подтверждения или отклонения диагноза. Как уже было отмечено (см. раздел 4.3.) появление в благополучном по туберкулезу хозяйстве большого количества реагирующих на туберкулин животных в ВТП и у-ИФН ИФА - положительных животных, может свидетельствовать либо о возникновении нового очага заболевания или являться о высокой степени сенсибилизации поголовья животных атипичными микобактериями. Ранее зарубежными авторами было установлено, что на результат у-ИФН ИФА существенно влияют следующие факторы: применение вакцины БЦЖ, глюкокортикостероидов и других препаратов, введенных до или после проведения туберкулинизации и способных усиливать или ослаблять Т-клеточный иммунный ответ у животных, что обуславливает необходимость проведения дополнительных разноплановых исследований (О. R.Gonzalez Llamazares et al., 1999; D.N. Wedlock et al., 2000 и др).

Результаты наших экспериментов по оценке диагностической ценности метода у-ИФН ИФА также подтвердили результаты цитированных в настоящей работе зарубежных авторов, установивших возможность дифференциальной диагностики животных, инфицированных микобактериями бычьего вида от животных, сенсибилизированных микобактериями птичьего вида. Так, в наших опытах, экспериментально зараженные M.bovis, телята не реагировали на ППД-туберкулин для птиц в у-ИФН ИФА. При этом, при проведении исследований в хозяйствах, 5 животных, положительно реагирующих на ППД- туберкулин для млекопитающих в ВТП, оказались положительными на М. avium в у-ИФН ИФА.

Наши обобщенные данные в сопоставлении с результатами зарубежных исследований последних лет, подтверждают положение об эффективности применения методов прижизненной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота, основанных на реакциях Т-клеточного иммунитета. Так, О. R.Gonzalez Llamazares et al. (1999) сравнивали методы прижизненной диагностики болезни (ВТП и у-ИФН ИФА) по отношению к посмертным методам (ПЦР, культуральным и биологическим) при исследовании 1136 голов крупного рогатого скота из 85-ти стад Испании и установили следующее. Чувствительность метода у-ИФН ИФА (84,9%) была выше чем ВТП (80,2%), однако комбинация этих методов давала максимальную чувствительность — 92,2%. В своих исследованиях, проведенных в США D.L.Whipple et al. (1995, 2001) определили чувствительность ВТП как 80,4 — 84,4%, а у-ИФН ИФА -55,4 - 97,1% и установили, что максимальная эффективность использования этих двух прижизненных методов диагностики туберкулеза крупного рогатого скота достигается при параллельной интерпретации их результатов.

J.A.Streeton et al (1998) определили чувствительность и специфичность метода у-ИФН ИФА для диагностики туберкулеза у людей после проведения ВТП как 90 и 98% соответственно.

После проведения экспериментов все исследователи рекомендовали использовать метод у-ИФН ИФА для совместного применения с ВТП в Национальных программах по ликвидации туберкулеза крупного рогатого скота в своих странах. В большинстве случаев ученые предлагают исследовать кровь животных методом у-ИФН ИФА через 8 — 30 суток после проведения тубер-кулинизации (M.Monaghan et al., 1997; T.J.Ryan et al., 2000; B.M.Buddie et al., 2001; D.L.Whipple et al., 2001 и др). По их мнению, такая комбинация двух методов позволяет выявить 87 — 95,2% инфицированных M.bovis животных.

Таким образом, резюмируя весь изложенный в представленной работе материал, можно сделать общее заключение о том, что у-ИФН ИФА при совместном применении с внутрикожной туберкулиновой пробой, представляет диагностическую ценность в качестве дополнительного метода прижизненного обнаружения зараженных туберкулезом животных.

Список использованной литературы по ветеринарии, диссертация 2004 года, Савицкая, Оксана Александровна

1. Безгин В.М. Промышленная технология производства биологических препаратов для диагностики туберкулеза и лейкоза крупного рогатого скота. Дисс.доктора биол.наук, М., 1999, 51 с.

2. Бороздин Э.К., Исаев М.К., Овдиенко Н.П., Найманов А.Х. и др. Устойчивость быков некоторых пород и линий к туберкулезу при искусственном заражении / В кн.: Использование высокоценных сельскохозяйственных животных. М., 1988,29-36.

3. Гребенникова Т.В., Грабовецкий В.В., Кальнов C.JI. и др. Дифференциальная диагностика микобактерий методом полимеразной цепной реакции // Ветеринария, 1999, 3, 17-20.

4. Наставление по диагностике туберкулеза животных // М., 1986, 43 с.

5. Найманов А.Х., Косенко В.И., Якушева О.В. Туберкулез крупного рогатого скота при естественном и искусственном заражении // Труды ВИЭВ, 1991, т.69, 144-150.

6. Овдиенко Н.П., Найманов А.Х. Основные направления и достижения науки в борьбе с туберкулезом и паратуберкулезом животных // Труды ВИЭВ, 1998, т.71, 195-214.

7. Трофимов И.Г. Туберкулез сельскохозяйственных животных (tuberculosis)//Лекция, 1997.

8. Туберкулез. Санитарные правила СП 3.1.091-96 Ветеринарные правила ВП 13.3.1310-96 //М., 1996.

9. Федоров Ю.Н., О.А.Верховский. Достижения и перспективы развития ветеринарной иммунологии//Труды ВИЭВ, 1998, т.71, с. 114-124.

10. Шаров А.Н., Ерошенко Л.А., Суханов И.П. и др. ПЦР при диагностике туберкулеза//Ветеринария, 2000, 2, 19-22.

11. Шаров А.Н., Ерошенко Л.А., Суханов И.П. и др. Эффективность методов прижизненной диагностики туберкулеза // Ветеринария, 2000, 2, 16.

12. Amadori М., Lyashchenko К.Р., Gennaro M.L. et al. Use of recombinant proteins in antibody tests for bovine tuberculosis. — Vet. Microbiol., 2002, 85, 379.

13. Andres M. Perez, Michael P. Ward and Viviana Ritacco Simulation-model evaluation of bovine tuberculosis-eradication strategies in Argentine dairy herds. -Preventive Veterinary Medicine, 2002, 54 (4), 351-360.

14. Assoian, R. К., В. E. Fleurdelys, H. C. Stevenson, P. J. Miller, D. K. Mad-tes, E. W. Raines, R. Ross, M. B. Sporn. 1987. Expression and secretion of type P transforming growth factor by activated human macrophages. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:6020.

15. Baliko, Z., L. Szereday, and J. Szekeres-Bartho. 7<TT lymphocytes in Mycobacterium tuberculosis infection. Thorax. 52:375.

16. Bartow, R. A., D. N. McMurray. 1998. Lymphocytes expressing FcT receptors suppress antigen-induced proliferation in cells from guinea-pigs infected with virulent Mycobacterium tuberculosis. Cell. Immunol. 184:51.

17. Bassey, E. O., and M. T. Collins. 1997. Study of T-lymphocyte subsets of healthy and Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis-'mfected cattle. Infect. Immun. 65:4869-4872.

18. Beerwerth, W. 1967. The culture of mycobacteria from feces of domestic animals and their significance for epidemiology and control of tuberculosis. Prax. Pneumol. 21:189-202.

19. Bendixen, P. H. 1978. Immunological reactions caused by infection with Mycobacteriumparatuberculosis. A review. Nord. Veterinaermed. 30:163-168.

20. Bensaid, A., M. Haddam. 1991. Individual antigens of cattle: bovine CD4 (BoCD4). Vet. Immunol. Immunopathol. 27:51.

21. Bland, J. M., and D. G. Altman. 1986. Statistical methods for assessing agreement between two methods of clinical measurement. Lancet i:307-310.

22. Bluestone, J. A., D. Pardoll, S. O. Sharrow, B. J. Fowlkes. 1987. Characterization of murine thymocytes with CD3-associated T-cell receptor structures. Nature 326:82.

23. Boom, W. H., K. N. Balaji, R. Nayak, K. Tsukaguchi, K. A. 1994. Characterization of a 10- to 14-kilodalton protease-sensitive Mycobacterium tuberculosis H37Ra antigen that stimulates human 1ST cells. Infect. Immun. 62: 5511.

24. Boom, W.H., R.S.Wallis and K.A.Chervenak. 1991. Human Mycobacterium tuberculosis-reactive CD4+ T cell clones: heterogeneity in antigen recognition, cytokine production and cytotoxicity for mononuclear phagocytes. Infect. Immun. 59:2737-2743.

25. Brenner, M. В., J. McClean, D. P. Dialynas, J. L. Strominger, J. A. Smith, F. L. Owen, J. G. Seidman, S. Ip, F. Rosen, M. S. Krangel. 1986. Identification of a putative second T-cell receptor. Nature 322:145.

26. Buddie BM, Ryan TJ, Pollock JM, Andersen P, de Lisle GW. Use of ESAT-6 in the interferon-gamma test for diagnosis of bovine tuberculosis following skin testing. Vet Microbiol., 2001, 80 (l):37-46.

27. Buddie, В. M., F. E. Aldwell, A. Pfeffer, G. W. de Lisle, and L. A. Corner. 1994. Experimental Mycobacterium bovis infection of cattle: effect of dose of M. bovis and pregnancy on immune responses and distribution of lesions. N. Z. Vet. J. 42:167-172.

28. Buddie, В. M., G. W. de Lisle, A. Pfeffer, and F. E. Aldwell. 1995. Immunological responses and protection against Mycobacterium bovis in calves vaccinated with a low dose of BCG. Vaccine 13:1123-1130.

29. Chiodini, R. J., W. C. Davis. 1992. The cellular immunology of bovine paratuberculosis: the predominant response is mediated by cytotoxic 7/5 T lymphocytes which prevent CD4+ activity. Microb. Pathog. 13:447.

30. Clarke, C. J. 1997. The pathology and pathogenesis of paratuberculosis in ruminants and other species. J. Сотр. Pathol. 116:217.

31. Cocito, C., P. Gilot, M. Coene, M. de Kesel, P. Poupart, and P. Vannuffel. 1994. Paratuberculosis. Clin. Microbiol. Rev. 7:328-345.

32. Collins, M. T. 1996. Diagnosis of paratuberculosis. Vet. Clin. N. Am. Food. Anim. Pract. 12:357-371.

33. Collins, M. Т., G. Lisby, C. Moser, D. Chicks, S. Christensen, M. Reichelderfer, N. Hoiby, B. A. Harms, О. O. Thomsen, U. Skibsted, and V.

34. Binder. 2000. Results of multiple diagnostic tests for Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in patients with inflammatory bowel disease and in controls. J. Clin. Microbiol. 38:4373-4381.

35. Collins, R. A., D. Wirling, S. E. Duggan, A. P. Bland, K. R. Parsons, C. J. Howard. 1999. itfT cells present antigen to CD4+ aPT cells. J. Leukocyte Biol. 63:707.

36. Collins, R. A., P. Sopp, I. Gelder, W. I. Morrison, C. J. Howard. 1996. Bovine t/S TcR+ T lymphocytes are stimulated to proliferate by autologous Theileria annulata-infected cells in the presence of interleukin-2. Scand. J. Immunol. 44:444.

37. Constant, P., F. Davodeau, M.-A. Peyrat, Y. Poquet, G. Puzo, M. Bonneville, J.-J. Fournie. 1994. Stimulation of human 7£T cells by nonpeptidic mycobacterial ligands. Science 264:267.

38. Corner L.A. Postmortem diagnosis of Mycobacterium bovis infection in cattle. Vet. Microbiol., 1994, 40, 53-63.

39. D'Sousa, C. D., A. M. Cooper, A. A. Frank, R. J. Mazzaccaro, B. R. Bloom, I. M. Orme. 1997. An anti-inflammatory role for 7<5T lymphocytes in acquired immunity to Mycobacterium tuberculosis. J. Immunol. 158:1217.

40. Davis, W. C., W. C. Brown, M. J. Hamilton, C. R. Wyatt, J. A. Orden, A. M. Khalid, J. Naessens. 1996. Analysis of monoclonal antibodies specific for the IS TcR. Vet. Immunol. Immunopathol. 52:275.

41. Emery, D. L., F. H. Duffy, and P. R. Wood. 1988. An analysis of cellular proliferation and synthesis of lymphokines and specific antibody in vitro by leucocytes from immunized cattle. Vet. Immunol. Immunopathol. 18:67-80.

42. Estes D. M. and Brown W. C. Type 1 and type 2 responses in regulation of Ig isotype expression in cattle. Vet. Immunol. Immunopathol., 2002, 90, 1-10.

43. European Economic Community. 1980. EEC directive 80/219 EEC, amending directive 64/432 annexe B. Off. J. L047:25-32.

44. Ferrick, D. A., M. D. Schrenzel, T. Mulvania, B. Hsieh, G. Ferlin, H. Lep-per. 1995. Differential production of interferon-7 and interleukin-4 in response to Thl- and Th2-stimulating pathogens by 7ЛТ cells in vivo. Nature 373:255.

45. Fifis, Т., L. A. Corner, J. S. Rothel, and P. R. Wood. 1994. Cellular and humoral immune responses of cattle to purified Mycobacterium bovis antigens. Scand. J. Immunol. 39:267-274.

46. Follows, G. A., M. E. Munk, A. J. Gatrill, P. Conradt, S. H. E. Kaufmann.1992. 7lnterferon and IL-2, but not IL-4, are detectable in l/S T cell cultures after activation with bacteria. Infect. Immun. 60:1229.

47. Francis J., Seiler R.J., Wilkie I.W. et al. The sensitivity and specificity of various tuberculin tests using PPD and other tuberculins. — Vet. Rec., 1978, 103, 420-425.

48. Fu, Y.-X., R. Cranfill, M. Vollmer, R. van der Zee, R. L. O'Brien, W. Born.1993. In vivo response of murine 7$T cell to a heat shock protein-derived peptide. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:322.

49. Gershwin L.J., Krakowka S., Olsen R.G.- Immunology and Immunopathol-ogy of Domestic Animals.-Mosby, St.Louis/ Baltimore/ Boston/ Chicago/ London/ Madrid/Philadelphia/Sydney/Toronto, 1995, 195p.

50. Gilot, P., and C. Cocito. 1993. Comparative analysis of three sensitins used in cutaneous testing for tuberculosis and paratuberculosis in cattle. FEMS Microbiol. Lett. 110:307-311.

51. Gorman N.T.- Immunology. In: Textbook of Veterinary Internal Medicine. Eds. S.J.Ettinger and E.C.Feldman.- W.B. Saunders Co., Philadelphia/ London/ Toronto/Montreal/Sydney/Tokyo, 1995, vol.2, 1978.

52. Griffin, J. P., К. V. Harshan, W. K. Born, I. M. Orme. 1991. Kinetics of accumulation of Preceptor-bearing T lymphocytes in mice infected with live mycobacteria. Infect. Immun. 59:4263.

53. Haas, W., P. Pereira, S. Tonegawa. 1993. 1/5 cells. Ann. Rev. Immunol. 11:637.

54. Haregewoin, A., G. Soman, R. C. Horn, R. W. Finberg. 1989. Human Ш T cells respond to mycobacterial heat-shock protein. Nature 340:309.

55. Heegaard, P. M. H., and K. Muller. 1988. Lectins and the immune system. J. Immunol. Immunopharmacol. 8:239-247.

56. Hein, W. R., C. R. Mackay. 1991. Prominance of 7/6 T cells in the ruminant immune system. Immunol. Today 12:30.

57. Hewinson, R. G., S. L. Michell, W. P. Russell, R. A. McAdam, and W. R. Jacobs, Jr. 1996. Molecular characterization of MPT83: a seroreactive antigen of Mycobacterium tuberculosis with homology to MPT70. Scand. J. Immunol. 43:490-499.

58. Hirsch, С. S., Т. Yoneda, L. Averill, J. J. Ellner, Z. Toossi. 1994. Enhancement of intracellular growth of Mycobacterium tuberculosis in human monocytes by transforming growth factor-Pi. J. Infect. Dis. 170:1229.

59. Hoft, D. F., R. M. Brown, S. T. Roodman. 1998. Bacille Calmette-Guerin vaccination enhances human 75T cell responsiveness to mycobacteria suggestive of a memory-like phenotype. J. Immunol. 161:1045.

60. Janeway C.A., Travers P.- Immunobiology. The Immune System in Health -and Disease.- Current Biology Ltd/Churchill Livingstone/Garland Publishing Inc., 1999, 635p.

61. Jorgensen, J. B. 1982. An improved medium for culture of Mycobacterium paratuberculosis from bovine faeces. Acta Vet. Scand. 23:325-335.

62. Jungersen G., A.Huda, J.J.Hansen, and P. Lind. Interpretation of the Gamma Interferon Test for Diagnosis of Subclinical Paratuberculosis in Cattle. Clin. Diagn. Lab. Immunol., 2002, 9, 2, 453-460.

63. Kaufmann, S. H. E., C. Blum, S. Yamamoto. 1993. Crosstalk between <*/P T cells and lis T cells in vivo activation of a/P T cell responses after 7IS T cell modulation with the monoclonal antibody GL3. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:9620

64. Kennedy H.E., Welsh M.D., Bryson D.G. et al. Modulation of immune responses to Mycobacterium bovis in cattle depleted of WC1+ 7JT cells. Infect. Im-mun., 2002, 70 (3), 1488-1500.

65. Koets, A. P., V. P. Rutten, A. Hoek, D. Bakker, F. van Zijderveld, К. E. Muller, and W. van Eden. 1999. Heat-shock protein-specific T-cell responses in various stages of bovine paratuberculosis. Vet. Immunol. Immunopathol. 70:105115.

66. Krebs, J. R., R. M. Anderson, T. Clutton-Brock, W. I. Morrison, D. Young, and C. Donnely. 1997. Bovine tuberculosis in cattle and badgers. Report to the Rt. Hon. Dr. Jack Cunningham M.P. MAFF Publications, London, United Kingdom.

67. Kronenberg, M. 1994. Antigens recognised by 75T cells. Curr. Opin. Immunol. 6:64.

68. Kuhnle, G., R. A. Collins, J. E. Scott, and G. M. Keil. 1996. Bovine inter-leukins 2 and 4 expressed in recombinant bovine herpesvirus 1 are biologically active secreted glycoproteins. J. Gen. Virol. 77:2231-2240.

69. Ladel, С. H., C. Blum, A. Dreher, K. Reifenberg, S. H. E. Kaufmann. 1995. Protective role of t/S T cells and a/P T cells in tuberculosis. Eur. J. Immunol. 25:2877.

70. Lanier, L. L., A. Weiss. 1986. Presence of Ti (WT31) negative T lymphocytes in normal blood and thymus. Nature 324:268.

71. Lathigra, R., Y. Zhang, M. Hill, M. J. Garcia, P. S. Jackett, and J. Ivanyi. 1996. Lack of production of the 19-kDa glycolipoprotein in certain strains of Mycobacterium tuberculosis. Res. Microbiol. 147:237-249.

72. Li, H., J. C. Ulstrup, Т. O. Jonassen, K. Melby, S. Nagai, and M. Harboe. 1993. Evidence for the absence of the MBP64 gene in some substrains of Mycobacterium bovis BCG. Infect. Immun. 61:1730-1734.

73. Lightbody, K. A., R. M. Girvin, D. A. Pollock, D. P. Mackie, S. D. Neill, and J. M. Pollock. 1998. Recognition of a common mycobacterial T cell epitope in MPB59 of Mycobacterium bovis. Immunology 93:314-322.

74. Lightbody, K. A., R. M. Girvin, D. P. Mackie, S. D. Neil, and J. M. Pollock. 1998. T-cell recognition of mycobacterial proteins MPB70 and MPB64 in cattle immunised with antigen and infected with Mycobacterium bovis. Scand. J. Immunol. 48:44-51.

75. Lilenbaum W., Schettini J.C., Souza G.N. et al. Comparison between a gamma-IFN assay and intradermal tuberculin test for the diagnosis of bovine tuberculosis in field trials in Brazil. Zentralbl. Veterinarmed, 1999, 46, 353-358.

76. Lyashchenko, K. P., J. M. Pollock, R. Colangeli, and M. L. Gennaro. 1998. Diversity of antigen recognition by serum antibodies in experimental bovine tuberculosis. Infect. Immun. 66:5344-5349.

77. MacHugh, N. D., A. Bensaid, C. J. Howard, W. C. Davis, W. I. Morrison. 1991. Analysis of the reactivity of anti-bovine CD8 monoclonal antibodies with cloned T cell lines and mouse L-cells transfected with bovine CD8. Vet. Immunol. Immunopathol. 27:169.

78. MacHugh, N. D., J. K. Mburu, M. J. Carol, C. R. Wyatt, J. A. Orden, W. C. Davis. 1997. Identification of two distinct subsets of bovine 7JT cells with unique cell surface phenotype and tissue distribution. Immunology 92:340.

79. Magnusson, M. 1961. Specificity of mycobacterial sensitins. I. Studies on guinea pigs with purified "tuberculin" prepared from mammalian and avian tubercle bacilli, Mycobacterium balnei, and other acid-fast bacilli. Am. Rev. Respir. Dis. 83:57-68.

80. Magnusson, M., and M. W. Bentzon. 1958. Preparation of purified tuberculin RT-23. Bull. W. H. O. 19:829-843.

81. McCole, D. F., M. L. Doherty, A. W. Baird, W. C. Davies, K. McGill, P. R. Torgerson. 1999. T cell subset involvement in immune responses to Fasciola he-patica infection in cattle. Parasit. Immunol. 21:1.

82. McDonald, W. L., S. E. Ridge, A. F. Hope, and R. J. Condron. 1999. Evaluation of diagnostic tests for Johne's disease in young cattle. Aust. Vet. J. 77:113-119.

83. Modlin, R. L., C. Pirmez, F. M. Hofman, V. Torigan, K. Uyemura, Т. H. Rea, B. R. Bloom, M. B. Brenner. 1989. Lymphocytes bearing antigen-specific 18 T-cell receptors accumulate in human infectious disease lesions. Nature 339:544.

84. Monaghan M., Quinn P.J., Kelly A.P. et al. A pilot trial to evaluate the y-interferon assay for the detection of Mycobacterium bovis infected cattle under Irish conditions.- Irish Vet. J., 1997, 50,229-232.

85. Muira, K., S. Nagai, M. Kinomoto, S. Haga, and T. Tokunaga. 1983. Comparative studies with various substrains of Mycobacterium bovis BCG on the production of an antigenic protein. Infect. Immun. 39:540-545.

86. Nabeshima, S., K. Hiromatsu, G. Matsuzaki, A. Mukasa, H. Takada, S. Yo-shida. 1995. Infection of Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guerin in antibody-mediated 7JT-cell-depleted mice. Immunology 84:317.

87. Naessens, G., M. Selighem, N. MacHugh, Y. H. Park, W. C. Davis, and P. Toye. 1992. Selection of BoCD25 monoclonal antibodies by screening mouse L cells transfected with the bovine P55-interleukin 2 (IL-2) receptor gene. Immunology 76:305-309.

88. Neill S.D., Cassidy J., Hanna J. et al. Detection of Mycobacterium bovis infection in skin-test negative cattle with an assay for bovine gamma-interferon. -Vet. Record, 1994,135,134-135.

89. Neill S.D., Cassidy J., Hanna J. et al. Pathogenesis of Mycobacterium bovis in cattle. Vet. Microbiol., 1994, 40, 41-52.

90. Ng, К. H., F. E. Aldwell, N. Wedlock, J. D. Watson, and В. M. Buddie. 1997. Antigen-induced interferon-Y and interleukin-2 responses of cattle inoculated with Mycobacterium bovis. Vet. Immunol. Immunopathol. 57:59-68.

91. Nielsen, S. S., S. M. Thamsborg, H. Houe, and V. Bitsch. 2000. Bulk-tank milk ELISA antibodies for estimating the prevalence of paratuberculosis in Danish dairy herds. Prev. Vet. Med. 44:1-7.

92. Nielsen, S. S., S. M. Thamsborg, H. Houe, and V. Bitsch. 2000. Corrigendum to "Bulk-tank milk ELISA antibodies for estimating the prevalence of paratuberculosis in Danish dairy herds". Prev. Vet. Med., 46:297.

93. Olsen, I. and A.K.Storset. 2001. Innate IFN-gamma production in cattle in response to MPP14, a secreted protein from Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis. Scand. J. Immunol., 54:306-313.

94. Park H., Jang H., Kim C. et al. Detection and identification of Mycobacteria by amplification of the internal transcribed spacer regions with genus- and species-species PCR primers. J. Clin. Microbiol., 2000, 4080-4085.

95. Pechhold, К., D. Wesch, S. Schonelmaier, D. Kabelitz. 1994. Primary activation of Vr9-expressing 7<TT cells by Mycobacterium tuberculosis. J. Immunol. 152:4984.

96. Pollock J. M. and Welsh M. D. The WC1+ 76T-cell population in cattle: a possible role in resistance to intracellular infection-Vet. Immunol. Immunopathol., 2002, 89, 105-114.

97. Pollock JM, Girvin RM, Lightbody KA, Clements RA, Neill SD, Buddie BM, Andersen P. Assessment of defined antigens for the diagnosis of bovine tuberculosis in skin test-reactor cattle. Vet. Rec., 2000, 146(23): 659-65.

98. Pollock, J. M., and P. Andersen. 1997. Predominant recognition of the ESAT-6 protein in the first phase of infection with Mycobacterium bovis in cattle. Infect. Immun. 65:2587-2592.

99. Pollock, J. M., and P. Andersen. 1997. The potential of the ESAT-6 antigen secreted by virulent mycobacteria for specific diagnosis of tuberculosis. J. Infect. Dis. 175:1251-1254.

100. Pollock, J. M., D. A. Pollock, D. G. Campbell, R. M. Girvin, and A. D. Crockard. 1996. Dynamic changes in circulating and antigen-responsive T-cell sub-populations post-Mycobacterium bovis infection in cattle. Immunology 87:236-241.

101. Porro M, Viti S., Antoni G.- Ultrasensitive silver-stain method for the detection of proteins in polyacrylamide gels and immunoprecipitates on agarose gels.-Anal. Biochem., 1982, 127,316-321.

102. Pottumarthy, S., A. J. Morris, A. C. Harrison, and V. C. Wells. 1999. Evaluation of the tuberculin gamma interferon assay: potential to replace the Mantoux skin test. J. Clin. Microbiol. 37:3229-3232.

103. Pritchard, D. G. 1988. A century of bovine tuberculosis 1888-1988: conquest and controversy. J. Сотр. Pathol. 15:651-663.

104. Radford, A. J., P. R. Wood, H. Billman-Jacobe, H. M. Geysen, T. J. Mason, and G. Tribbick. 1990. Epitope mapping of the Mycobacterium bovis secretory protein MPB70 using overlapping peptide analysis. J. Gen. Microbiol. 136:265.

105. Rhodes, S. G., В. M. Buddie, R. G. Hewinson, H. M. Vordermeier. 2000. Bovine tuberculosis: immune responses in the peripheral blood and at the site of active disease. Immunology 99:195.

106. Rhodes, S. G., D. Gavier-Widen, В. M. Buddie, A. O. Whelan, M. Singh, R. G. Hewinson, H. M. Vordermeier. 2000. Antigenic specificity in experimental bovine tuberculosis. Infect. Immun. 68:2573.

107. Rhodes, S. G., Hewinson, R. G., Vordermeier, H. M. (2001). Antigen Recognition and Immunomodulation by {{gamma}}{{delta}} T Cells in Bovine Tuberculosis. J.Immunology, 166: 5604-5610.

108. Rhodes, S. G., Palmer, N., Graham, S. P., Bianco, A. E., Hewinson, R. G., Vordermeier, H. M. (2000). Distinct Response Kinetics of Gamma Interferon and Interleukin-4 in Bovine Tuberculosis. Infect. Immun. 68: 5393-5400.

109. Roche, P. W., C. G. Feng, and W. J. Britton. 1996. Human T cell epitopes on the Mycobacterium tuberculosis secreted protein MPT64. Scand. J. Immunol. 43:662-670.

110. Roche, P. W., P. W. Peake, H. Billman-Jocobe, T. Doran, and W. J. Britton.1994. T-cell determinants and antibody binding sites on the major mycobacterial secretory protein MPB59 of Mycobacterium bovis. Infect. Immun. 62:5319-5326.

111. Romero R.E., Garzon D.L., Mejia G.A. et al. Identification of Mycobacterium bovis in bovine clinical samples by PCR species-species primers. -Can.J.Vet.Res., 1999, 63, 101-106.

112. Rook, G. A., J. W. Carswell, and J. L. Stanford. 1976. Preliminary evidence for the trapping of antigen-specific lymphocytes in the lymphoid tissue of "anergic" tuberculosis patients. Clin. Exp. Immunol. 26:129-132.

113. Rothel J.S., Jones S.L., Corner L.A. et al. A sandwich enzyme immunoassay for bovine interferon-y and its use for the detection of tuberculosis in cattle.- Aust. Vet. J., 1990, 67, 134-137.

114. Rothel, J. S., S. L. Jones, L. A. Corner, J. C. Cox, and P. R. Wood. 1992. The gamma-interferon assay for diagnosis of bovine tuberculosis in cattle: conditions affecting the production of gamma-interferon in whole blood culture. Aust. Vet. J. 69:1-4.

115. Ryan TJ, Buddie BM, De Lisle GW. An evaluation of the gamma interferon test for detecting bovine tuberculosis in cattle 8 to 28 days after tuberculin skin testing. Res. Vet. Sci., 2000, 69 (1): 57-61.

116. Sechi L.A., Dupre I., Sanguinetti et al. Simple and rapid identification of different species of Mycobacteria by PCR.- Mol. Cell. Probes, 1999, 13, 141-146.

117. Smyth, A. J., M. D. Welsh, R. M. Girvin, and J. M. Pollock. 2001. In vitro responsiveness of 7<TT cells from Mycobacterium bovis-infected cattle to mycobacterial antigens: predominant involvement of WC1+ cells. Infect. Immun. 69:89-96.

118. Sorensen, A. L., S. Nagai, G. Houen, P. Andersen, and A. B. Andersen.1995. Purification and characterization of a low-molecular-mass T-cell antigen secreted by Mycobacterium tuberculosis. Infect. Immun. 63:1710-1717.

119. Stabel, J. R. 1996. Production of gamma-interferon by peripheral blood mononuclear cells: an important diagnostic tool for detection of subclinical paratuberculosis. J. Vet. Diagn. Investig. 8:345-350.

120. Stabel, J. R. 2000. Cytokine secretion by peripheral blood mononuclear cells from cows infected with Mycobacterium paratuberculosis. Am.J.Vet.Res. 61: 754.

121. Stabel, J. R. 2000. Transitions in immune responses to Mycobacterium paratuberculosis. Vet. Microbiol. 77:465-473.

122. Sweeney, R. W., R. H. Whitlock, C. L. Buckley, and P. A. Spencer. 1995. Evaluation of a commercial enzyme-linked immunosorbent assay for the diagnosis of paratuberculosis in dairy cattle. J. Yet. Diagn. Investig. 7:488-493.

123. Thorns C.J. and Morris J.A. The immune spectrum of Mycobacterium bovis infection in some mammalian species: a review. Vet. Bull., Weybridge, 1983, 53, 543-550.

124. Tizard I.R.- Veterinary Immunology. An Introduction.- W.B.Saunders Co., Philadelphia/London/Toronto/Montreal/Sydney Tokyo, 1996, 890 p.

125. Toossi, Z., P. Gogate, H. Shiratsuchi, T. Young, J. J. Ellner. 1995. Enhanced production of TGF-P by blood monocytes from patients with active tuberculosis and presence of TGF-P in tuberculous granulomatous lung lesions. J. Immunol. 154:465.

126. Tsukaguchi, К., B. de Lange, W. H. Boom. 1999. Differential regulation of IFN-7, TNF-a and IL-10 production by CD4+ aPTCR+ T cells and У82+ 7<5T cells in response to monocytes infected with Mycobacterium tuberculosis-H37Ra. Cell. Immunol. 194:12.

127. Tsukaguchi, К., K. N. Balaji, W. H. Boom. 1995. CD4+ aPand 7*T cell responses to Mycobacterium tuberculosis. J. Immunol. 154:1786.

128. Wahl, S. H. 1992. Transforming growth factor P(TGF-P) in inflammation: a cause and a cure. J. Clin. Immunol. 12:61.

129. Walravens К., V. Wellemans, V. Weynants et al. Analysis of the antigen-specific IFN-7 producing T-cell subsets in cattle experimentally infected with Mycobacterium bovis. —Vet. Immunol. Immunopathol., 2002, 84, 29-41.

130. Waters, W. R., J. R. Stabel, R. E. Sacco, J. A. Harp, B. A. Pesch, and M. J. Wannemuehler. 1999. Antigen-specific B-cell unresponsiveness induced by chronic Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis infection of cattle. Infect. Immun. 67:1593-1598.

131. Wedlock D.N, Vesosky В., Skinner M.A. et al. (2000). Vaccination of cattle with Mycobacterium bovis culture filtrate proteins and interleukin-2 for protection against bovine tuberculosis. Infect. Immun. 68:5809-5815.

132. Werz, О., M. Brungs, D. Steinhilber. 1996. Purification of transforming growth factor PI from human platelets. Pharmazie 51:893.

133. Whipple D.L., Bolin C.A., Davis A.J. et al. Comparison of the sensitivity of the caudal fold skin test and a commercial y-interferon assay for diagnosis of bovine tuberculosis.- Am. J. Vet. Res., 1995, 56 (4), 415-419.

134. Whitlock, R. H., and C. Buergelt. 1996. Preclinical and clinical manifestations of paratuberculosis (including pathology). Vet. Clin. N. Am. Food. Anim. Pract. 12:345-356.

135. Wiker, H. G., K. Sletten, S. Nagai, and M. Harboe. 1990. Evidence for three separate genes encoding the proteins of the mycobacterial antigen 85 complex. Infect. Immun. 58:272-274.

136. Wood P.R, Rothel J.S. In vitro immunodiagnostic assays for bovine tuberculosis. Vet. Microbiol., 1994,40, 125-135.

137. Wyatt, C. R., C. Madruga, C. Cluff, S. Parish, M. J. Hamilton, W. Goff, W. C. Davis. 1994. Differential distribution of 7<TT-cell receptor lymphocyte subpopulations in blood and spleen of young and adult cattle. Vet. Immunol. Immunopathol. 40:187.

138. Young, D., L. Kent, A. Rees, J. Lamb, and J. Ivanyi. 1986. Immunological activity of a 38-kilodalton protein purified from Mycobacterium tuberculosis. Infect. Immun. 54:177-183.

139. Young, D., R. Lathigra, R. Hendrix, D. Sweetser, and R. A. Young. 1988. Stress proteins are immune targets in leprosy and tuberculosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4267-4270.

140. Young, R. A., B. R. Bloom, С. M. Grossinsky, J. Ivanyi, D. Thomas, and R. W. Davis. 1985. Dissection of Mycobacterium tuberculosis antigens using recombinant DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:2583-2587.

Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Диагностическое значение реакций клеточного иммунитета при туберкулезе крупного рогатого скота

Автореферат диссертации по ветеринарии на тему Диагностическое значение реакций клеточного иммунитета при туберкулезе крупного рогатого скота

Оглавление диссертации Савицкая, Оксана Александровна :: 2004 :: Москва

Введение диссертации по теме "Ветеринарная эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология", Савицкая, Оксана Александровна, автореферат

Заключение диссертационного исследования на тему "Диагностическое значение реакций клеточного иммунитета при туберкулезе крупного рогатого скота"

Список использованной литературы по ветеринарии, диссертация 2004 года, Савицкая, Оксана Александровна

Похожие научные работы

Каталог диссертаций