Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Диагностическая ценность РИД с полипептидным (p24) антигеном ВЛКРС в выявлении больного лейкозом крупного рогатого скота

I I и и *!

российская штт сельскохозшственных наук

СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ ШЮШУТ ЗЙСЯШЕЙЙШГДЛЫЮН ЕЭКИНАИИ СИБИРИ И ДАЛЬНЕГО ВОСТОКА

На правах рукописи УДК 619:616 - 006.446

испулоаев Агшн ИиаханоЕПЧ

ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РИД С ПОЛИПЕПЩДНШ (р24) АНГНШЮМ ВЛХРО в ЕШВЛ2Ш ВОЛЬНОГО ЛЕЙКОЗОМ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

16.00.03 > ветеринарная ижробиодэгия, вирусология етиэоотаюгия, иикаяопм я пммушлогся

Автореферат дисовртодия на соискание ученой степени кандидата ветериааряш наук

Новосибирск - 1993

Работа выполнена в отделе лейкозов сельскохозяйственных животных Института экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока СО РАСХН.

Научныэ руководители - доктор ветеринаршх наук,

профессор П.Н.СМИРНОВ

кандидат ветеринарии наук. ■ доцент В.Н.КИСЛВЖО

Официальные оппоненты - доктор ветеринарии наук,

профессор В.М.ЧВКШЕВ

: кандидат ветеринарка наук В.В.РАЗУМОЭСКАЯ

Ведущая организация - Омский Государственный ■ ветеринарный институт

Запита состоится ЛИЯ 1993 Г. в ж шхя на заоедании Специализированного совета Д.020.23.01 при Института вксшривн-тальной ветеринарии Сибири и Дальнею Востока 00 РАСХН.

Адрес института: 633128, Ноасмяйфская овя.,п.КрвсвххЗск.

ИЗВОДИВ.

С диссертацией моею озкакавггься в ЦНСХВ СО РАСХН. Автореферат разослан */т " Л/ЗХ^ 1869 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, доктор ветеринарных наук

¿.А. САМОЛОВОВ

СЕЦАЯ ХАРЛКТЕК'ХГГЖЛ РЛЕОТЫ

Актуальность проблаю. Соврешнньв достижения в диагностике лейкоза крупного рогатого скота m позволяют, к сскалюкпв, достаточно надэано и своевремэшю выявлять ашотныг, ин^.лкционньй процесс у которых трепел в стадию болезни, в силу чего проблема разработки Еысокочувствотелькых методов диагностики лейкоза крупного рогатого скота продолжает оставаться в числе ватаейпмх в практической Еотср:иарно;5 лзйкозологии.

В настоящее время основным лабораторным мзтодэм даагностизси этого заболевания является гематологический, прздусматривавдий регистрацию в пзр:*.ферической крови гивотшх прежде всего повышенного содержания л?.$оцитсв. Из недостатков данного метода ?к>яяо ввдэлить два основных:

- гйЕозмогкость выявления тавотных | у которых болезнь протекает ахейкемически, т.е бэз повышения абсолютного содержания лимфоцитов. Даш таких гивотных ерэда общего тлела- больного крупного рогатого скота составляет от £5 до 35S (D.A,.Abt et.al., 1976; Г.Л.Кудрявцева, 1880 и др.);

- достаточная трудоемкость метода, деланная, как правило, пэвозтяшм полный I! рзгу-пяршП охват данными ихйшдозанкяин маточного поголовья хкблагополучшх по лейкозу стад.

Серологические метода (в первую очередь реакция ге-мукодаффу-эии - ИЩ с антигенами вируса лейкоза) используются в лабораторной практика исключительно с целью выявления инфекции, ш es лейкоза как такового.

В то sä время исследования, проведенные П.Н.Смирновым и соаат. (1887); Л.И.Нагаевой (1S37); А.Ф.Вшшховым, Л.Г.Бурбой (1SSÜ); А.Т.Леважевш и соавт.(1931), показали, что имеется определенная зависимость мезд/ заболэваемосты> крупного, рогатохх» скота лейкозом и серологическим реагированием таких еивотных з РВД с ра4-аитнгеиам ВЛКРС. Однако глубоких исследований в атом направлении вэ проводилось.

В Инструкции "О марощгштиях по борьба с лейкозе»! крупного рогатого скота", утверндентай ГУВ ГАПК СССР 9 августа 1889 года, никакие ограничительные мэры в отношении гивотных, реагирующих в РИД о тлнпептцдньм антигеном, нэ предусмотрены, что объясняется недостаточной изученностью данного вопроса.

С учетом изложенного и бала определена оснозиза х?5ль рзбота: на основе комплексных исследований изучить, диагтстическую цен-

ность реакции иммудадиффузии с полипептидным антигеном ВЛКРС (РВДр24) для выявления животных, больных лейкозом, как метода, дополнительного или альтернативного гематологическому.

В соответствии с целью были сформулированы следующие эвдачи:

1. Оценить эпизоотическую ситуацию по инфекции вируса лейкоза крупного рогатого скота Новосибирской области.

2. Отработать тест-систему РИД с р24-антигеном ВЛКРС и в сравнительном аспекте изучить (количественно и качественно) характер антителоносительства к ер51- и р24-антигенам ВЛКРС у животных различных возрастных групп.

3. Изучить зависимость степени реагирования коров (с учетом породной принадлежности) в РИДр24 от клинико-гематологических показателей (в т.ч. в динамике) и патоморфологических изменений лейкозной природы.

4. Изучить возможную взаимосвязь между заболеваемостью крупного рогатого скота лейкозом (в различных стадиях) и биохимическими показателями крови животных.

5. Провести хронобиологические исследования коров с различным серологическим статусом и на их основе - сравнительный анализ динамики гематологических показателей с показателями уровня антител к щ>51- и р£4- антигенам ВЛКРС, уровня 11-оксикортикостероадов (11 —ОКС) и иммуноглобулинов основных классов.

6. Разработать метод групповой биопрс^.' на овцах для выявления инфицированиого ВЛКРС крупного рогатого скота.

7. Изучить влияние иммуностимуляции на характер серологического проявления ВЛКРС-кнфекции.

Научная новизна в практическая ценность работы. Установлено, что активный синтез антител одновременно на оба антигена ВЛКРО £р51 и р24 в высоких титрах у больного лейкозом кррупного рогатого скота может служить интегральным показателем глубоких патогенетических изменений лейкозной природа, развивающихся в организме больного кивотного. Следовательно, для диагностики лейкоза крупного рогатого скота, в особенности в авейкемичес-кой стадии процесса, может быть использован тест РИД о р24-антигеном ВЛКРС.

В развернутой и терминальной стадиях лейкозного процесса у крупного рогатого скота происходят существенные изменения мэтабо-лизма, согровокдамциеся изменением «показателей синтеза аминокислот, в том числе усвоения незаменимых аминокислот, и ряда жизненно важных макро- и микроэлементов - К, На, Си, Со. Мб.

Хронобиологаческими исследованиями установлено, что бессимптомное вирусоносительство у крупного рогатого скота сопровоада-ется достаточно синхронным изменением показателей периферической крови и уровня антител к антигенам ВЛКРС (достоверная положительная корреляция).Изменения количественного составь лейкоцитов, в т.ч. лиьфоцитов перзфергееской крови и содержания 11-0KG находятся в прэтивофазе.

Разработаны методические рекомендации "Контроль благополучия стад по инфекции вируса лейкоза крупного рогатого скота иэтодои групповой биопрэбы".

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсухдеш иа Координационном научно-практическом совещании-семинаре по проблем лейкоза крупного рогатого скота в регионе Сибири и Дальнего Востока (Новосибирск, 1991); Научно-практической конференции, посвященной памяти профессора НГАУ Н.С.Щепилова (Новосибирск, 1993); на ¡заседаниях Ученого совета ИЭВСиДВ СО РАСХН (1891, 1992, 1993), Ученого совета ветеринарного факультета ЯГАУ (1S91, 1992).

Публикация. По тего диссертации опубликовано 3 научные работы и 1 методическая реко^ндация.

Структура и обьеи реботи. Диссертация изложена на 139 страницах машинописного текста, иллюстрирована 21 ркзунками и 20 таблицами и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение, ' выводы и практические предложения. Список цитируемой литературы содержит библиографические сведения о 108 отечественных и 69 иностранных публикациях.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Иотарзасд п истода. Для пыявления особенностей распространения онкорнавирусной инфекции крупного рогатого скота в Новосибирской области нами оьш проанализированы результаты серологических (в РИД с антигеном ВЛКРС) исследований крупного рогатого скота в хозяйстваз-учаспшкаж НПС "Сибснковат" (Головная организация ИЭВСиДВ СО РАСХН).

Для изучения характера реагирования крупного рогатого скота разных возрастных групп з РИД с глнюпротевдгьм ^51) и полипептидным (р24) антигеноми ВЛКРС, серологическое исследованию было

подвергнуто 15322 спонтанно инфицированных ВЛКРС хивотшх.Основную часть исследования проводили в крупных племенных совхозах "Пашинский","Бердский", ОПХ "Боровское" и в колхозе "Большевик" Новосибирской области.

Изучение феномена взаимосвязи гематологического диагноза на лейкоз и уровня специфических антител против основных антигенов ВЖРС проводили в неблагополучных по лейкозу хозяйствах. Для этого комплексные исследования проведены были в ряде хозяйств Западной Сибири и Республики Казахстан. За изучаемый период исследованиям было подвергнуто 12911 коров из 15 хозяйств.

Биохимические исследования биологических жидкостей от 65 коров с различной стспеньэ ксмяро.ч2тации к лзйкозу проводили ка базе отдела биохимии СибНИШГКЕа (заведулций - профессор,

B.А.Скуковский). Предметом исследования служили цельная кровь и сыворотка ¡сроен ливотных, сформированных в б подопытных групп в различных стадиях лейкозного процесса.

Сыворотку крови исследовали на содержание аминокислот (в % натуральной влажности), а цельную кровь исследовали на содервание макро- и микроэлементов К, На, tóg, Fe, Mn, Cu, Zn, Со.

Хронобкологическке исследования 6-ти коров с различным уровнем в сыворотке крови антител к, антигенам ВЛКРС (3 коровы с высокими и 3 низкими титрами антител к р24-антигену) проводили в условиях стационара! Физиологического СибНИИШЕа. Животных

оценивали по клеточному составу периферической крови, содержанию иммуноглобулинов основных классов (IgGI, IgG2 и IgM), титрам антител двух указанных специфичностей, содержании 11-оксикорти-костероидов, температуре тела.

Хронобиологическиё исследования б подопытных коров проводили по отработанной ранее методике (П.Н. Смирнов и А.Т.Левашев, 1986).

Для определения титра антител пробы сыворотки подвергали последовательным разведениям (от 1:2 до 1:512). За титр принимали последнее разведение сыворотки крови, при которым РИД еще читается как слабоположительная.

Определение иммуноглобулинов основных классов проводили с помощью йммунофермзнткого анализа (ИМ) по твердофазной методике

C.В. Avrameas et.al. (1872) в отделе биотехнологии ИЭВСиДВ совместно с сотрудником отдела Р.З.Файзудлкнш.

Для оценки функциональной активности коры надпочечников по уровню свободных коргизола и коргикостерона в плазме крови""круп-

ного рогатого скота был использован флюорямэтриеский тест, в оству которого пологена способность указанных горюнов флюоресцировать при возбугдэнЕЛ фиолетовым (<100- 470 icnc) скотом. í.a-тод описан ранга Ю.А.Панковкм и И.Я.Усватовой (1965} npi изучении глтокорткковдпой функции надпочечников у лабора^рак енвотных. Данная сэтодшса юдаф'.ндфовака сотрудников отдала лейкозов ИЗВСиДВ пряанэтельно к плазма крови крупного рогатого скота. Работу проводили cobí sctho со старлкм научным сотрудником Института цитологии и генетики СО РАН В.А.Шульгой.

Производственную проверку мэтода групповой СкопроСы проводили в ГПЗ "Тулшгсксе" Новосибирской области и в предприятиях по щэмзшочу делу Новосибирской и Кешровской областей. '

Совместно с сотрудниками лаборэтсрм ветпрепарзтсв ИЗВСиДВ (заведующий - профессор Ю.Я.Дольников) был проведен опыт по изучению влияния 1амуностнмулятора конзргина на уровень гуморального иммунитета у шфищтовшгных ВЛИТО аивотных. Испытания проведены па 20 коровах и 30 овцах, спонтанно и экспериментально инфицированных ВЖТО.

Гистологический анализ €т проведен старшим научном сотрудником отдела лейкозоз ИЗЕСиДВ, кандидатом ветершарак наук В.В.Смирновой.

Весь цифровой матерка! по результатам исследований обрабатывал! по Г.Ф.Лаккну (1S80) на перс-спальных компьютерах "CD-28S" и "íiazcvia СМ 1914".

FE37Jb?m 5ХСЛЕДСЕЛГПП1

1. Разработка п псетаисвка рзакцпп шгцунодЕфйузпп с полппептвдакы (р24) актагеисы ВЯКРС

Для серолопгсесксго исследования сыворотки и плазмы крови зизоткых нами была разработана тест-система РИД с р24-антигеном ВЛНРС в агаровом гелз (ГД2р34).

Диагностику?») дня данной тест-системы готоенхи хво следующей методика:

Культуральнуи жидкость 8-10-сугочной ^культура клеток почки амСркона овцы (FIX) конценгрфсвзли путем лспарекгл чарэз целлофан в - направленном поттесо воздуха а 20-25' раз. Полученный кон-

¡¡ектрат обрабатывали полизтиленгликолем мол.м.6000 (15-2035 к массе концентрата), вьщэряивали 12 часов при +4°С и центрифугировали при 5 тыс об/мин в течей® 30 мин. Супернатант сливали, а осадок растворяли в трис-буфере в объема, составляющем 1/80-1/100 часть первоначального объема культуральной кидкости. К этому раствору белков добавляли неионный детергент тритон Х-100 в конечной концентрации 0,01 Ж..

В качестве специфической преципитирупцей сыворотки (СПС) использовали сыворотку крови коров-доноров, реагирующих на р24 антиген.

Антигенный препарат вирусных белков титровали со СПС в РИД. Для этого делали последовательные разведения небольших проб антигена и СПС трис-буфером (например, соответственно 1:0,25; 1:0,5; 1:0,75 и т.д) ив различных сочетаниях разведений антигена и СПС ставили РИД, включая в тест-систему в качестве испытуешг заведомо слабополояительную и отрицательную сыворотки. Итоговые разведения всего объема антигена и СПС производили в таких пропорциях, которые удовлетворяли требуемым дня РИД условиям.

Антиген и СПС консервировали тиомэросалом в конечном разведении 1:10000 и лиофилизировали. Все серии диагностикума стандарн тизировали по активности единого его эталонного образца (по одной из серий диагностикума).

РИД ставили на стеклянных пластш х. Реакцию оценивали в крестах (в системе четырех крестов).

. При серологическом исследовании плазмы и сыворотки крови в ЩЦgp51 нами также был применен дифференцированный учет реакции в зависимости от уровня антител к нр51 ВЛКРС в исследуемых пробах. Реакцию ставили аналогично РИД с р24-антигеном и учет вели в система пяти крестов.

£. Распространение шгфекции ВЛКРС среди крупного рогатого скота в Новосибирской области

Следует отметить, что широкомасштабные диагностические исследования крупного рогатого скота в Новосибирской области на

лейкоз оыли развернуты только в 1991 г.

Для выявления особенностей распространения инфекции ВЛКРС среди животных различных половозрастных групп мы провели исследо-

вания в хозяйствах, входящих в Научно-производственную систему "Сибонковет" (56 ферО-

Б 1892 году уровень инфицированное™ скота вирусом лейкоза составил в среднем среди керов 34,7%, нетелзй - 25,3$, среда телок случного возраста - 18,9%, телок в возрасте 12 i-йс - 12,6% и ерзда телок в 6 мес - 8»4й.

IIa основе объективных данных о распространении лейкоза крупного рогатого скота в Новосибирской области, полученных нами предварительно по хозяйствам в 1S90 г., совместно с ветеринарным отделом облагропрома была разработана комплексная программа оздо-. роахания хозяйств области от лейкоза. Она предусматривала презда всего обучение специалистов ветеринарных лабораторий качественной постановке диагноза и квалифицированной интерпретации результатов исследования. Одновременно с этим бала проявлена серш практических семинаров и совещаний с ветеринарньми врачам] всех уровней- от ветврача хозяйства (фер.и) до руководителей ветеринарной слугбы районоз области. Это позволило перевести организацию всей оздоровительной работы на качественно новый методический и организационный уровень. Уге за 2,5 года работы реализация этой программы в рамках НПО "Сибонковет" позволила достичь положительны* результатов. Оздоровлено 12 фер1 в 8 хозяйствах.

3. Характер реагирования тсруппого рогатого скота различных возрест5!ЫХ груш в РЯД с антигенам зр51 п р24 ВПКРС

При проведении массовых серологических исследования крупного рогатого скота в хозяйствах'Новосибирской и ряда других областей Сибири в РИДзр51 да выявляли аивотных, реагкрущих одновременно на ®51 и на р24-антигены ВЛКРО. К прэиеру, из 3389 исследуемых коров в РИД с др51-антигеном реагировало 57,4%, из шя у 1,0Ж одновременно выявили антитела к полшэптидному антигену ВЛКРС (в тест-системз ИЩгрб! ¡жно выявить антителояосительство к р24 лкзь в высоких титрах).

На сладуггцэм этапе работ при проведении серологических исследовании крупного рогатого скота различных возрастов иы использовали тест-систему Н?Др24 как дополнительную к ГИД,,р51, пезводякауа выявить о'ггитела как в высоких,. так и б низких титрах (табл.1).

Таблица 1

Сравнительная количественная характерютика реагирования крупного рогатого скота разных возрастных групп в РИД с антигенами ВЛКРС

Возрастные группы ■ кивотаых Всего исследов. (голов) Реагировало в РИД с антигенами ВЛКРС:

8Р51 р24

• . всего (голов) % (от числа исследов.) всего (голов) Ж(от числа реаг.РИДзрб!)

телки 6-12 мес. 1863 187 10.0 95 50.8

телки 12-18 мес. 1092 111 10.1 44 39.6

телки 18-24 мес. 1069 75 7.0 33 44.0

Нетели 849 83 9.7 51 61.4

Коровы 7060 5137 72.7 1548 30.1

Из приведенных данных видно, что наиболее высокий показатель инфицированности (регистрируемой по наличию положительной РИД с £р51-антигеном) наблюдался среди взрос, ^го маточного поголовья (72,756), тогда среди молодняка этот показатель составлял 7,010,1%.

В тест-системе с полипептидным антигеном реагировало в средне;.] 50% тавотных, от серопозитивных к вр51, причем среди коров число реагирующих было значительно нкяе (30,1%).

На этом же поголовье мы провели, сравнительный качественный анализ уровня иммунного отвата на ВЛКРС в РИД, выраженного в (табл.2).

Определяя степень реагирования (по количественному признаку) как качественную характеристику, мы имели в виду возможное качественное различие мэзду яивотными разных возрастов по характеру протекания инфекционного процесса, что долзво было находить отра-кение в уровне специфических противовирусных антител. С этой целью реакции нами показаны диффэрзнцированно: слзбополохительнш (+ и ++) и сильноположительныэ (+++ и -н-н-).

Для объективной интерпретации полученных результатов необходимо сделать следукцее замечание. Исследованиям в РИД мы подвергали крупный рогатый скот из хозяйств, ведущих планомерную оздоровительную работу от лейкоза. Положительно реагирующий молодняк

Таблица 2

Сравнительная качественная характеристика реагирования в ИЩ крупного рогатого скота различных возрастных груш (в %)

Возрастные группы ЗШЗОТНЫХ Реагировало в РИД с антигенами ВЛКРС

яр51(в® от числа исследованных) р24(в% от числа реагируют« в РИД с рр51

| *•++ , ++++ + , ++ +++ , +++•+

телки 6-12 мэс. 2.0 телки 12-18 мэс. 3.1 телки 18-24 гас. 1.8

Нзтеди 4.8

Коровы 4.5

а. о у. а 5.2 4.9 68.2

48.9 36.9 44.0 60.2 28.2

1.9 2.7 0 1.2 1.9

сразу ге отбивался в отдельные гурты дня откорма на мясо и болзе в РИД на исследовался. В противоположность этому, тестирует* короны выходили из серопозитивных гуртов т.е. это были, как правило, анвотные. уже длительнее время инфицированньв ВЛКРС и регулярно исследуемые на лейкоз гематологически. Этим и объясняется выраженная стабильность (отсутствие нарастания) показателя инфи-цкрованности нивотных среда молодняка с возрастом - с одной стороны, и столь высокий процент ккфицирзвашюсти срада коров -о щ/гой.

4. Взгпносвязь швду уровнен зюттад к яр51 0 р24 антягензи ВЛКРС и клззагческЕШ, патсцсрфологячсскти п гсшзтололггогаашц прсяплвшпш яэйкеза у торов

За период работы комплексному (гематологическому и серологическому) исследованию было шдвергнуто 12911 короз та 14 хозяйств. Яра этом было выявлено 5,Ь5£ гематологически больных лейкозом ишоткых; 72,18 серопозитивных к глисопрэтевдиому; 28, - к юлжегггадазму антигенам ВЛКРС.

По результатам исследований керев в РИДр24 в совхозе пБзрдский" и ГПЗ "Пэрвомзйскяй" НовссибкрсгаП области было прове-

депо клиническое обследование положительно реагирующих коров на предмет выявления у них признаков, характерных для лейкоза. Так, в 10056 случаях у сильно реагирующие в ЩДр24 животных имели место признаки лейкоза: увеличение поверхностных шейных и глубоких паховых лкм|>атических узлов, рзже - зкзефтальмия. Животные, реагирующие на р24-антиген в тест-системе РИДзр51, были выборочно уЗиты на мясокомбинате. У всех зарегистрирован^ патомэрфологи-ческие вменения, характерные для лейкоза.

Следушцим этапом работы было сопоставление у исследуемых животных Iзматологического диагноза на лейкоз с уровнем реагирования их в РЯД с ер51- и р24-анткгенами, оцениваемом в крестах (табл.3).

Таблица 3

Уровень реагирования в РИД сывороток крови коров с различнш гематологическим диагнозом

Гематологический диагноз Всего, гол. Реагировало в РИД с антигенами ВЛКРС

8р51 р24(вй от числа реагируют: в РИД с £р51

- + .-н- •н-н-ь - + , ++ +++, -н-н-

ВолсНш лейкозом 758 12 36 710 340 374 32

1.-6 4,8 93,6 44,8 49,4 4,2

Подозрительные 315

в заболевании 14 23 278 14Ь 137 19

лейкозом 4,4 7,3 88,3 46,0 43,6 6,0

Здорозьв 11038 3515 2585 5738 6069 2180 74

(гематологически ■ 29.8 21,8 48,4 51,2 18,4 0,6

отрицательные)

Примечание: в числителе - рсолетчество голов, в знаменателе - % от от числа животных с данным гематологическим диагнозом.

• Сравнительный анализ гематологического диагноза по "лейкоз-ному кзючу" с уровнем реагирования коров в РИД (концентрацией в крови вирусстоцифических антител) показал наличие общ»й тенденции гюзышения - их' ' -титров с переходом от здоровых к больным. Единственное исклвченке составил более высокий процент рззкопози-тшнл-к р24-антигену зхквотных (+++ и -н-н-) в груше подозрительных ъ згбол-звании, по сравнению с больными. Среда кивотных нахо-

дящихся только в стадии бессимптомного кэширования, случал ан-тителоноснтельства к р24-аитнгену в шсоин титрах пвлязстся еда -ничньки (0,6- 0,72). В то гэ вреет 1,6% коров из группы гематологически больных т проявили рзакци» на глксопротеид зр51.

Итак, М0Я5Ю считать, что, с одной сторо;и - гематологически больные, а о другой - рэагиррцке в РИД на два антигена ЕЛКРО -это довольно однородные то количествешой характеристике антиге-лоносительства категории гзтвотиых, причем вяз зависимости от их серологического (для первых) или гематологического (для вторых) статуса.

Один 13 основных выводов из добытых нами данных состоит в тем, что у гематологически больных корез средние показатели давня шггитед обеих сггащйичкостей (причем, особенно анти-р24) значительно превшетг таковьй гематологически отрицательных, по се-рошзиттпых. В то га время регистрация антителонос,лте..ш>ства к антигенам ВЛКРС (£р51 и р24) одновременно у генатологичасну. отрицательных • короз мояет указывать на развита у них той или июй стадии лейкозного процесса в алзйкекической фор-а. Надо подчеркнуть, что доля таких аиэотных в проксследсваншх стадах довольно ощутима 19л, а среди бальных и подозрительных в зеболевгяяи -53,6 и 49,6% соответственно (см.табл.3).

Из находишься шд стационарным клиническим наблюдением 7 ¡сороа, павяих затем в тот или иной срок от лейкоза, у всех в терминальной стадии отмзчайась пзрсистекция антител к р24-антигену ВЛКРС б высоких титрах, солровоздавзаяся прогрессией клинического проявления лейсоза. Пата^рфологически у всех подтвержден лейкоз.

5. Срйвкзтелыюа изучение уровня антятея к антагекац ВЛКГС и показателя^ крова у короз свнкеитвльской порода п годатинофрззеках помесей

Основная касса негдадегакий по кзучасьыя нами вопросам была проведана ча местном скб<фском черт-пэстром -скоте (чеке всего был гшытшжзированкый скот) - Шэтсму ми 1фавани сспоставлэнке показателей хгсрзв черво-изстрой и ск*г«н?&т2.ской юрод. .Результаты приведены в таблице 4.

Как видно из таблицы, по уровню рэагарсвак-ш еквотеых обеих пород в КЩ с антрггеном р24 В;ЖРС ра?личкй не наблхдалосъ, нас?4отря на то, что ив^ицированность, шямённая по ер51 -антиге-

ну, отличалась в сравниваемом поголовье почти на 20%.

Таблица 4

Показатели заболеваемости лейкозом и инфицированкости BJ1KPC коров черно-пестрой и сишэнтальской пород ."

Породная принадаекность Всего исследовано голов Выявлено гематоло- Реагировало в РИД _ с антигенами'ВЛКРС

гически больных gp51 - от числа реагир.в BUigpSI >

гол. % голов % голов V /О

%рно-пестрая 12911 753 5,9 9315 72,1 2691 28,8

Симмэнтальская 2098 , 24 1,1 1111 52,9 303 27,2

Несмотря на достаточно высокий уровень инфицированное™ ВЛКРС, корова симментальской породы в значительно меньшей степени подвержены заболеванию лейкозом, чем черно-пестрой.

Таким образом, комплексные исследования, проведенные на животных двух пород, выявили различия в заболеваемости лейкозом и не выявили разницы в реагировании кивотны,- в РЩ с р24-антигеном ВЛКРС.

6. Изучение взаимосвязи серологических и гематологических показателей с результатами биохимических исследований биологических жидкостей крупного рогатого скота с различной степэкью кошроыатацпи к лейкозу

Для изучения микроэлемзнтного и аминокислотного состава биологических жидкостей мы качественно расширили категории объектов исследований в зависимости от степени компрометации к лейкозу.

Подопытных животных распределили на б групп:

I. Коровы с клиническим проявлением лейкоза, реагирующие в РИД с gp51 и р24 антигенами ВЛКРС; .

II. Коровы с перс-истентным лимфоцитозом (ко без клинических -признаков лейкоза), одновременно реагирующие в РИД в высоких титрах (+++ или ++++) с яр51 и р24- антигенами ЕЛКРС; . •

III. Коровы с персистентнкм лимфоцитозом, одновременно рза-

гирущиэ з высоком титре (-н-t- или ++++) в РИД с gp51- ентигексм ВЛКРС, но отрицательно реагирующие в РЭДр24;

IV. Коровы без гамэнений крови, характерных для лейкоза, но рэагирукщие в высоких титрах (+++ или +-н+) в К1Д на оба антигена ВЛКРС (gp51 и р24);

У. Коровы без гематологических изменений, характерен для лейкоза, но реагирущие в высоких титрах (+++ или ++++) в РИД с gp51 и отрщатзльно или в очень низком титре (+) реагирующие с р24-антигеном ВЛКРС.

VI. Контрольная груша коров - совершенно не скомпрометированные в отношении лейкоза и лейкозной инфекции.

В каждую группу было подобрано по 10-15 коров-аналогов (по возрасту, продуктивности и показателям лабераторно-диагшети-ческих и клинических исследований).

В группу определяемых в крови макро- и микроэлементов входили - К, Na, Mg, Fe, Mn, Cu, Zn, Со.

Из группы алифатических аишбкислот определяли: глицин, ала-шя, валян, изолейвдн, лейцин, серм, треонин, мэтиогап!, аспара-тювую и глутаминовую кислоты, аргинин, лизин.

Из группы циклических аминокислот определяли: фенилаланин, тирозин, гистидин, пролин.

Статистическая обработка данных выявила у животных в клинической стадии лейкоза (I гр.) достоверное снижение в крови таких незаментих аминокислот, как метиошш, изолейцин, гистидш и аргинин. Кроме того, было 'снижено содаряание кобальта и марганца, а таияе нарушен баланс калия и натрия. В то se время значительно повышено содержание меди, увеличена концентрация цинка.

Пря сравнении архитектоники количественных изменений исследуемых показателей животных 1,11 и IV групп мезду собой ш установили, что у коров второй и четвертой груш шэла место общая тенденция снижения биосинтеза всех показателей, чего нельзя сказать о первой группе. В ней эти изменения носили хаотический характер, что являлось, по—видимому, следствием серьезных метаболических нарушений, происходящих в организма коров в стадии генерализованного лейкозного процесса. . В стадии га перхшетептного лим-фоцитоза и выраженного синтеза антител на gp51 и р24-антигены ВЛКРС изменения в содержании исследуемых веществ носили более од-но?ипный характер - в сторону снижения (в сравнении с контролем). Это указывало на связь с относительным родством патогенетических проявлений лейкозного процесса у животных II и IV групп.

Нз большое своеобразие измэвзний изучаемых показателей имело шсто и у животных III опытюй группы, характеризовавшейся развитием шрсистентшго люфщитоза и активной продукцией антител только на gp51-антиген ВЛКРС. Оно состояло лишь в снижении (относительно контроля) содержания аргинина и увеличения уровня мзда и натрия. В V группа коров выявили тенденцию снихения содержания иетионина. гистидина и марганца.

Анализируя в целой те количественный изменения биологически активных веществ, которые были зарегистрированы нами в крови у животных, находящихся в разной стадии лейкозного процесса, мокло сказать, что развитие лейкоза крупного рогатого скота ассоциируется с кзмзнзккям« метаболических процессов,опосредующими кзйзнз--ния уровня таких ватных для организма биологически активных веществ, как макроэлементы К и Na, микроэлементы 2n, Со, Си, Mg, Нп, аминокислоты - мзтионин, изолейцин, гистидан, аргинин.

Учитывая функциональные! характеристики каждого из перечисленных веоеств, можно со всей определенностью сказать, что в зависимости от степени компрометации животных к лейкозу в больном организма косвенно можно говорить и об изменении алектролитности крови, осмотического давления; можно предполагать и более высокую степень выщелачивания кальция при увеличении уровня цинка.

Значительное превыаениэ уровня меда у клинически больных лейкозе»! коров указывает на относительно высокую ферментативную активность, пошпенный синтез гормонов и витаминов.

В то же время показатель снижения (относительно контроля) уровня таких незаменимых аминокислот, как изтионин, изолейцин, гистидин, аргинин указывает на серьезныз отклонения в биосинтезе белка в больном лейкозом организме.

Если рассматривать все выявленные количественные изменения в синтезе Сиолотмчески активных веществ в крови больных лейкозом животных (в разных стадиях процесса) в контексте белково-минеральной питательности молока (от таких животных), то можно ¡шагать, что оно на будет соответствовать качествам ГОСТа. Однако а тот вопрос требует особого целенаправленного исследования, которое будет продолжено нами в последующем в рамках кокгшжешй программы отдела лейкозов ИЭВСиДВ 00 РАСКН.

'Л гсзал&глгы гронобиологсческого ассдвдаваиия инйпрфошнных J с рваигашм серологическим статусом

С помощью хронобиологического подхода предполагалось проследить топкую динамику антителоносительства обеих спещ*фичностей (к gp51 и р24 антигенам ВЖРС), взаимосвязь титров антител с количественным клеточный составом периферической крови, уровнем иммуноглобулинов основных классоз, а такте концентрацией в плазмэ крови 11 -оксикортикостероидов (тазе казываешх, гормонов стресса).

В результате стационарных 4-месячных наблюдений нами были получены и проанализированы хронограммы указанных показателей ¡лести коров с бессимптомной инфекцией в число которых входили как рзагирукцие толысо на вр51~антиген (I группа, 3 гол.), так и се-ропозитивныэ в тест-систеш РИДр24 (ц группа, 3 гол.).

У аивотных, реагирущих в высоких титрах на р24 антиген, гематологические показатели! (общее содершше лейкоцитов и дифференцированно лимфоцитов) в их временных рядах были в среднем относительно вше, чем в группе реагирующих только на gp51.

" Исследования показали, что на протяжении 125 суток (срок наблюдения) у коров, изначально •'подобранных в I группу, как па реагирущих в ИЩр24, яашжативно (в определенные временные отрезки до 1-2 недель) могет регистрироваться антителоносительство данной специфичности в очень низких титрах (как правило, на ныла 1:2). Выпаданий реакции на gp51 нз отмечали. У коров II группы антитела как к gp51, так и к р24 выявлялись в течение всего срока наблюдений.

"У коров обеих групп выявлен значительный динамизм титров антител, оцениваемый по величине и скорости их нарастания или сни-кения. Пр1 этом у всех тавотных, находившихся под наблюдением, прэобладала тенденция к однонаправленности изменений серологических и гематологически! показателей. Отмечена и достаточно Еысокая степень положительной корреляции содержания . gp51 - и р24-антитед (до r=0,58 npi п=125), хотя в отдзльныэ кратковременные пергады повышение концентрации антител одной специфичности ?югло происходить на фоне снижения уровня антител другой специфичности.

Выявлено, что на хроноиммуногргммах всех коров II 1рупш титр! антител тс р24 были стабильно шеге, чем'к gp51» хотя степень их различия могла со времэкем значительно изменяться.

Для выявления возможной связи динамики титров антител против BJIKPO с особенностями физиологического состояния организма нами был пряден сравнительный анализ хроногемограмм и хроноиммуног-рамм с временными рядами концентрации 11 -оксикортикостероидов в

(

гаазма крози.

Расчеты показдли, что при наложении временных рядов 11-ОКС и содержания лейкоцитов имела место средняя степень отрицательной корреляции, причем это отмечалось у коров обеих груш (до г--0,3б; Р<0,01).

¡¿анее однозначная картина предстает при сопоставлении динамик 11-ОКС с одной стороны и содержания - с другой. Исходя из подученных нами в этом плане результатов, мэяно констатировать, что имеется тенденция к разнонаправленное™ динамики 11-ОКС с динамикой содержания ^противовирусных антител (слабая и средняя степень корреляции, до г=-0,40), но не о общим содержанием иммуноглобулинов СиИ.

8. Рсзработка иатодшш постановки групповой баопробы на овцах для диагностика инфекции ВЛКРС у крушшго рогатого скота

Ызтод биопробы до настоящего времени использовался, как правило, лишь в условиях эксперимента. Так, он был использован в опытах по выявлению вируса в лейкоцитах крови, молока и молозива, а также слюна, фекалиях и спер-й инфицированных ВЛКРС животных. Во всех случаях подчеркивается высокая чувствительность и специфичность метода. Тем не шнае и, прездв всего, из экономических соображений, возможность повсеместного и широкомасштабного использования этого мзтода остается весьма проблематичной.

Иодифицированный нами метод биопробы назван групповые, поскольку предполагает получение и использование для инокуляции овце суммарного объема лейкоконцентрата, полученного от группы (до 500 голов) крупного рогатого скота, • на предмет выявления среди них скрытого вирусокоситедьства.

Предлагаемая модификация классического метода биопробы на овцах открывает возможность широкого применения его в ветеринара ;юй практике о целью кош роля инфекции ВЛКРС непосрадстваюю на ' база областных (районных) ветеринарных лабораторий, делая метод доступньм и экономически целесообразны*.

Постановку бшпробы проводили в условиях экспериментальной базы ИЭВСиДВ.

В условиях акспеЕименгальной и производственной проверки показана возможность и экономическая целесообразность использования групповой (до 500 животных) биопробы дня контроля благополучия

стад по инфекция ВЛКРС.

Итак, выявленный нами относительный предел чувствительности теста составил одно.инфицированное зизотное на 500 исследуемых.

9. Изученпэ влияния профилактической эффективности противовирусного (ВЛКРС) препарата иа крупной рогатои скоте и овцах, спонтанно (г экспериментально пнфзщировашшх вирусом лейкоза

Проведено изучение профилактической эффективности препарата конэргина, разработанного профессором Дольниковым Ю.Я. Для этого были использованы .ягнята (в возрасте 4 мес), экспериментально инфицируемые ВЛКРС.

Сформировано 3 группы животных (по 10 голов в группе):

I - препарат вводили за 3 суток до введения заражавдего материала:

II - препарат вводили одновременно с введением ВЛКРС-содарта щего материала;

III - вводили только зарахаиций материал (контроль).

В качестве заракавдего материала слуаияа стабилизированная гепарином кровь (10-15 ЕЦ на 1 мл крови) инфицированной ЕШКРС коровы черно-пестрой породы (инв.И 3502). Показатели кропи коровы находились в пределах физиологической нормы. Кровь вводили ягнятам внутрибршинно в дозе 2 мл. Конэргш вводили подкояно в цоге 5 мл на голову 7 раз, с интервалом мезду введениями 48 Чазов.

Спустя 14, 21 , 28, 60 дней после введения заразгавдэго материала проводили гематологические исследования животных, а также определяли наличие антител в сыворотке крови в РВД с gp51-антигеном ВЛКРС.

Показатели периферической крови у аивотных опытных и контрольной груш находились в пределах норм.

IIa 14-й день после введения заражавшего материала антитела к гр51 антигену ВЛКРС выявили у одного животного первой группы, у шух второй группы, а в контрольной груше животных антител не $арегистрирс-?ено.

Спустя 21 день от начала опыта антитела обнаружили еше у )-ти особей первой группы, у 7-ми - вторэй группы и у 6-ти - п юнтроле.

Чергэ 28 дней после начала эксперимента антитела появились у животных всех групп.

Показатели гуморального иммунного ответа на ВЛКРС у животных опытных и контрольной групп оценивали в РЩ количественно (в крестах). Результаты тестирования в РЙДйр51 приведены в тайд.5.

Таблица б

Средние значения уровня специфических антител , у подопытных ягнят в различные периоды наблюдений

N хрупп Хар-ка групп Средние значения (М + и) антител через

21 день 28 дней 60 дней

I Введение конзргина 2,00 + 0,45 за 3 сут до заражения 3,20 1 0.49 4,50 + 0,17*

II Введение конзргина одаовр-но с заражением 1,40 + 0,45 2,60 ± 0,52 4,20 + 0,29

III ВЛКРС ■ (кош-роль) 1,00 + 0,37 2,30 ± 0,37 3,90 + 0,18

* - различия с контролем достоверны.

Как видаю из таблицы, во всех группах в течение 28 дне] эксперимента различий в развитии иммунного ответа у тавотных л выявлено. Спустя 60 дней при сравнении животных I и III груш установлена разница в уровне специфических антител к нр51 (р 0,05)',, в то время как во II и III группах в уровш антител различий не выявлено. Таким образом, у животных I группы введена; конзргина до инфицирования ВЖРС стимулировало выработку специфи часких к вирусу лейкоза антител в более ранте сроки и в бола; высоких титрах, чем у животных II и III групп.

Далее мл провели испытание конзргина на спонтанно инфициро ванных ВЛКРС коровах (2 гр(уппы ю 10 животных в каждой). I групп (опытная) - получала конэргш, II груша служила контролем. Ей вотным 1-ой группы препарат вводили подкожно в дозе 20 ни на ни

вотное 7 раз о интервалом 48 часов. Всех коров исследовали через 14, 45 дней посла завершения инъекций конэргина.

При анализе характера иммунного ответа у аивотшх опытней группы каких-либо изменений в уровне вирусспецифических антител из выявлено. Средние значения титра антител кивотных опытной группы составили (2,89 + 0,35 и 2,76 + 0,41), а в контроле (3,11 + 0,45 и 2,71 +0,47) соответственно через 14,45 дней пос.пе начала опыта.

Полученные данные свидетельствуют о том, что препарат, введенный на фоне спонтанной хронической инфекции, - не изменял титр специфических антител. Клеточный состав тр5ферггсской крови у тавотных в течение опыта оставался без изменений.

В разрезе данного опыта с целью изучения профилактической эффективности конэргина, нам удалось установить видовые особенности реагирования гетерологичных вивотных при экспериментальной инфекции ВЛКРС. Для этого в опыте использовали 10 ягнят (III груша из предыдущего опыта) и 10 телят 4-5-месячного возраста. Заразаюций материал телятам вводили внутряброшнно в дозе 5 га однократно.

Результаты исследований показали, что титры специфических антител у ягнят и телят заметно возрастали, начиная с 21-го дня после введения зараяащего материла. При этом разница в уровне антител у аивотных подопытных груш характеризовалась высокой достоверностью. Через 2 месяца (к концу опыта) уровни специфических антител у телят и ягнят в обеих грушах уравнялись. "

ВЫВОДЫ

1. Лейкозная инфекция у крупного рогатого скота диагностирована во всех крупных племенных хозяйствах Новосибирской области.

Вирусом лейкоза инфицирован крупный рогатый скот различных половозрастных груш - коровы в среднем 34,7й; нетели - 25,3%; телки случного возраста - 18,92; телки в 12 мес -12,6%; телки в 6 мзс - 8,4%. -

2. В стационарно неблагополучных по лейкозу стадах Западной Сибирх выявляется от 0,3 до 1,9% коров, положительно рэагирупцих в РИД в агаровом геле (тест-система РИДщз51) одновременно на оба антигена ВЛКРС - £р51 и р24. Количество реагирующих в РИД с

рйД-антигеном (в тест-системе РИДр24) составляет в среднем 30,1% от всех серопозктивных к gp51-антигену.

3. Выявлена разница в показателях рэагирования серэпозитявного к gp51 -антигену ВЛКРС крупного рогатого скота различных половозрастных групп в тест-системе РИДр24 (по уровню прэципитирую-щих антител) - среди телят до 18-месячного Еозраста в. среднем в 2 раза вше, чем у животных старших возрастов.

4. Вззультаты комплексных (клинико-гематологических, серологических и патоморфологических) исследований крупного рогатого скота, спонтанно инфицированного ВЖРС, на представительном поголовье позволили установить взаимосвязь показателей реагирования кквотиых б тест-системе РИДр24 б кисоккх титрах о развитием лей-козного процесса.

5. Сравнительна«! изучением зависимости степени компрометации крупного рогатого скота к лейкозу от показателя реагирования животных в РИД с gp51 и р24-антигекамк ВЖРС выявлена следувдая закономерность: из числа гематологически больных 1,6% животных были серокегативны к gp51-антигену ВЛКРС; 88,4« больных лейкозом были саропозитивны к gpS1 и среди них 63,635 - к р24-антигену (в тест-системе РИДр2''>), в том числе 4,2% аивотных в еысоких титрах; иреди подозрительных в заболевании лейкозом - 4,4% были серонега-тивны, а 88,335 животных этой категории реагировали в высоких титрах в РИДнр51 и 49,6й из них были серопозитивны в РИДр24 в высоких и низких титрах (соответственно - 6,0 и 43,3%).

Бессимптомная инфекция ВЛКРС регистрировалась в 70,2% случаев - в PHflgpSI и в 19Х случаев (из серопозитивных к gp51 -шп'кге-ну) - в РИДрй4.

6. Не выявлено зависимости показателей инфицированнюсти стад крупного рогатого скота вирусом лейкоза от породной принадлежности животных. В то же время частота заболеваемости животных лейкозом, то есть реализация лейкозогенных потенций ВЛКРС. срада гсштшизированного скота, достоверно превышала аналогичный показатель животных симментальской порода.

7. Сравнительное изучение содзрвания макро- и микроэлементов и аминокислотного состава крови внтактных аивотных и животных с различной степенью компрометации к лейкозу, выявило у последних изменение относительного содераания изучаемых показателей в сторону увеличения иди уменьшения, а по содеркани» незаменимых аминокислот - только уменьшения, что в целом служит показателем факта нарушешя общего штаболизма биологически ак-

тивньзх веществ в организма больного лейкозом и инфицировашюго ВЛКРС крупного рогатого скота.

8. Хронобшлогаческ'ики исследованиями в стационаре установлено. что в группе коров, рэагируших на рй4-антиген, более высокий средний уровень содэрзания лейкоцитов, в т.ч. лимфоцитов, а такте 11 -оксикоргтсоотеродцов в периферической крови, по сравнению с япвотньми, реагирующими только на йр51 .В динамике серологи-ческгсз показатели (тптра антител обеих спещфтчностей и концентрация иммуноглобулинов) положительно коррелировали с содержанием лейкоцитов в периферической крови.

9. !йтод групповой биопробы на овцах обладает пределом чувствительности - 1 инфицированное ВЛКРС зшвотное на 500 исследуемых.

10. Стимуляция иммунной систет®! конзргином у овец, экспериментально инфицированных ВЛКРС,приводит к более быстрому развитию серологического реагирования животных в РЯД. В то ге время икму-кссткмуляцип коров с длительно протекающей спонтанной инфекцией нэ отражается на характере серологического проязлэния инфекции.

ПРД!СТочЕС1СПг ПРНДЯОЗЗШ

-1. Разработаны и предложены дая щзактического использования католические рекомендации по контролю благополучия стад по инфекции вируса лейкоза крупного рогатого скота мэтодом групповой биопробы.

Данное предложение рекомендуется использовать для контроля благополучия быков-производителей племпредпрштиЯ , а такта на завериаицем зтапэ оздоровления стад, с целью сокращения сроков полного их оздоровления от лейкоза.

2. Рекомендуется использовать тест-систему "ИЩ з агаровом геле с антигеном р£4 ВЛКРС** для выявления 1срупного рогатого слота в алэйкгмяческой стадии лейкозного процесса.

3. Все случаи одновременного реагирования кругаюго рогатого скота в РИД с антигенами ер51 и р24 ВЛКРС (в тест-системе Р]ЩВр51) следует квалифицировать (независимо от результатов гематологического исследования) как положительный диагноз на лейкоз.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕЩ ДИССЕРТАЦИИ

1, Контроль благополучия стад по инфекции вируса лейкоза крупного рогатого скота методом групповой биопроОы: Рекомендации / РАСХН. Сиб.отд-ние. ЮВСиДВ, НПЦ "Сибонковет"; Сост.; В.В.Храмцов, А.Т.Левашв, П.Н.Смирнов, А.И.Испул-лаев, Л.Ы.Брэва.- Новосибирск, 1891.- 8 с.

2, Левашев А.Т., Смирнов П.Н., Опанасюк А.С., Смирнова В.В., Испуллаев А.И. ВДЦ с полипептидньм антигеном ВЛКРС для выявления коров, больных лейкозом // Диагностика и профилактика заразных болезней животных: Сб.науч.тр./ РАСХН. Сиб.отд-ше, ИЭВСиДВНовосибирск. 1992.- 0.27-37.

3. Испуллаев А.И., Смирнов П.Н. Левашов А.Т., Возрастные особенности серологического реагирования крупного рогатого скота, ифщировашюго ВЛКРС // Диагностика инфекционных болезней животных: Сб.науч.тр. / РАСХН. Сиб.отд-ние. ИЭВСиДВ.- Новосибирск, 1993.- 0.33-37.

4. Испуллаев А.И., Левашев А.Т., Смирнов П.Н. Взаимосвязь гематологического диагноза на лейкоз и уровня антител против основных антигенов ВЛКРС // Диагностике инфекционных болезней животных: Сб.науч.тр. / РАСХН. Сиб.отд-нюз. ИЭВСиДВ,- Новосибирск, 1893.- С.69-76.

У

Подписано к почата 11.05.93 г. Эорггат 60x84/16 Объем Гл.л. Заказ Я 770. йфаз 100 экз. Рвдакционво-полиграфичосяоэ объединение СО РАСХП, ротапринт 635128,Новосибирская область, п.Краснообск