Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ РЕАКЦИИ НЕПРЯМОЙ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ И РЕАКЦИИ НЕЙТРАЛИЗАЦИИ АНТИТЕЛ ПРИ БРУЦЕЛЛЕЗЕ

сА- ъвггь

ВСЕСОЮЗНАЯ ОРДЕНА ЛЕНИНА АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК им. В. И. ЛЕНИНА ВСЕСОЮЗНЫЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ВЕТЕРИНАРИИ

На правах рукописи

Аспирант САДЫ КОВ Сеил Жангазинович

диагностическая эффективность реакции непрямой гемагглютинации и реакции нейтрализации антител при бруцеллезе

(16.00.03 — ветеринарная микробиология)

Автореферат диссертации па соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Москва — 1975

ВСЕСОЮЗНАЯ ОРДЕНА ЛЕПИМА АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК им. В, И, ЛЕНИНА ВСЕСОЮЗНЫЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ВЕТЕРИНАРИИ

На правах рукописи

Асшфакт САДЫ КОБ С сил Жаш'лзшгапич

ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ РЕАКЦИИ НЕПРЯМОЙ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ И РЕАКЦИИ НЕЙТРАЛИЗАЦИИ АНТИТЕЛ ПРИ БРУЦЕЛЛЕЗЕ

(1G.00.03 — ветеринарная микробиология)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

шгъ

Москва — 1975

Работа выполнена в лаборатории по изучению бруцеллеза Всесоюзного ордена Ленина института экспериментальной ветеринарии (директор — академик ВАСХНИЛ Я- Р- Коваленко).

Материалы диссертации изложены на 148 стр. машинописного текста, из них; 3 — введение, 36 — обзор литературы; 69 — собственные исследования, 5 — обсуждение результатов исследований, 2 — выводы и предложения; иллюстрированы 32 таблицами п 2 рисунками. Приложение — 3 стр. Список использованной литературы включает 319 источников, в том числе 71 иностранных авторов-

Научный руководитель — заслуженный деятель науки РСФСР, доктор ветеринарных наук, профессор Е. С. Орлов.

Официальные оппоненты:

1- Доктор ветеринарных наук М. А. Сидоров, зав. лабораторией микробиологии ВИЭВ,

2 Кандидат ветеринарных наук, доцент А. М. Романов.

Ведущее научное учреждение — Московская ордена Трудового Красного Знамени ветеринарная академия имени 1\. И. Скрябина,

Автореферат разослан « 4$ » 1975" г.

Зашита диссертации состоится » 1975" г.

на заседании Ученого совета Всесоюзного ордена Ленина института экспериментальной ветеринарии (Москва, 109472, Кузьминки, ВИЭВ).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИЭВ.

Ученый секретарь ВИЭВ кандидат биологических наук В- В. Калугин.

Бруцеллез сельскохозяйственных животных до настоящего »ременн представляет важную проблему для ветеринарной науки п практики.

Эта инфекция регистрируется на всех континентах н наносит большой экономический ущерб животноводческим .хотяйст-г.р м. Вместе с тем, существующие на территории СССР очаги бруцеллеза среди животных представляют постоянную угрозу здоровью людей. Весьма реальна также возможность завоза больных бруцеллезом животных из-за рубежа в условиях все расширяющихся торговых связен со странами, неблагополучными в отношении этого заболевания. Кроме того, бруцеллез числится в перечне инфекций, являющихся потенциальными средствами бактериологической войны, интенсивная подготовка к которой ведется в ряде капиталистических стран. Все изложенное диктует необходимость разработки эффективных н быстрых методов диагностики бруцеллеза, доступных для применения в практических условиях,

В настоящее время для диагностики бруцеллеза у сельскохозяйственных животных применяют серологически», аллергический и бактериологический методы исследования.

Для серологической диагностики бруцеллеза были предложены ,пластинчатая реакция агглютинации на стекле (реакция Хеддльеопа), пробирочная реакция агглютинации, реакция связывания комплемента, реакция длнтелыюго связывания комплемента на холоде, реакция преципитации, кольцевая реакция с молоком, реакция лизиса, оисонофагоннтарная реакция и др.

Однако известно, что каждый из названных выше тестов в отдельности не выявляет всех больных бруцеллезом животных-В связи с этим рекомендуется одновременное применение нескольких диагностических реакшш. Кроме того, некоторые из них (РСК п РДСК, бактериологическое исследование) сложны по технике постановки н занимают много времени.

Самым достоверным результатом диагностики бруцеллеза является выделение культуры возбудителя нз объектов исследования.

Однаю получение отрицательного результата бактериоло-пги-ч'кш'ч исследования не исключает наличия заболевания. Большим недочетом этого метода является сложность его проведения, длительность получения результатов. Кроме того, подлежащий проверке материал очень часто непригоден для бактериологического исследования, т. к. загрязнен посторонней микрофлорой.

Все указанное определяет актуальность разработки более чувствительных и доступных для ветеринарной практики методов диагностики бруцеллеза-

В последние годы многими исследователями большое внимание уделяется .изучению реакции непрямой (пассивной) гемагглютннацнн (РИГА) при различных бактериальных (туберкулез, чума, туляремия, бруцеллез н др.) и вирусных (паротит, болезнь Ньюкасла, ящур и др.) инфекциях.

Многие авторы отмечают специфичность и более высокую чувствительность этой реакции по сравнению с другими серологическими тестами (РА, РСК, РДСК).

При бруцеллезе РНГА испытывало.ряд авторов (Хнршберг п Ярбург, 1952; Фридман с соавт., 1955; К. А. Поздеев и О. А-Игнатьева, 1962; Н. И. Ишенко. 1964; Л. Христофоров, 1964— 1966; П. А. Вершллова, М. И. Чернышева и соавт., 1969; Е. И. Скаршеаская, 1971; М. Renoux, G. Renoux, <M, PJommet, A. Plii-Iippon, 1972; У. Хайдаров, 1972; В. Б. Бельченко, Н П. Иванов, 1973) н др.

Однако РНГА при бруцеллезе не вышла за рамки лабораторных испытаний, что связано с недостаточно» изученностью се при этой ¡шфекшш и с тем, что пе отработана методика приготовления эритроцитарного бруцеллезного дпагностикума, пригодного для широкого применения н доступного для массового изготовления.

Феномен гемагглютппации используется и в некоторых других реакциях, в частности в реакции нейтрализации антител (РНАт) для быстрой нидпкашш возбудителен болезни н их дериватов в патологическом материале, что имеет большое практическое значение.

Имеющееся сообщения М, И. Чернышевой н соавт- (1972, 1973) о применении РНАт свидетельствуют о перспективности при бруцеллезе этой реакции.

Однако, имеющихся литературных данных недостаточно для решения вопроса о применении этих реакции в практике. Учитывая недостаточную изученность РИГА н РНАт при бруцеллезе и отсутствие для указанных реакций эрнгроцигариого дпагностикума, отвечающего требованиям практики в отношении изготовления и применения, мы поставили перед собой 4

следующие задачи: разработать методику получения специфичного и высокочувствительного эритроинтариого диагностику ма, пригодного для кассового изготовления н широкого применения; изучить специфичность и чувствительность РНГЛ при диагностике бруцелеза у разных видов животных н в различных эпизоотических условиях п определить диагностическую эффективность РНАт при исследовании на бруцеллез патологического материала н объектов внешней среды.

материалы и методы исследования

Приступая к изучению реакции непрямой (пассивной) гем-агглютннацнн (РНТА) и реакции нейтрализации антител (РНАт) при бруцеллезе, мы шрежде всегосчигалн необхоаи-мым прпготовпть специфичный н высокочувствительный антиген, пригодный для массового изготовления п широкого применения,

В этих целях нами были испытаны различные методы получения бруцеллезного антигена для сенсибилизации эритроцитов, описанные в литературе при других инфекционных заболеваниях: метод Фуллера в модификации Е. П. Бернасовскон с соавт. (1971) применительно к лептоспирам> ннфузноппыи метод Сору (1957), метод Блинова п Запкпиа для получения гаи-теп-а три ка.ндндпозах при помощи р-нафтола (1959), по Хри-стофорову (1964) применительно к бруцеллам, а также пены-тывалпсь различные опытные варианты наших методик: длительное экстрагирование бруцелл в дистиллированной воде с замцр.ажтваН'Пем н оттачиванием, различный рН иа холоде, шут-it-лнрованне, авто к-лавпрованпе взпесп бруцелл при различных температурах, экспозиции ,н рН, озвучивание на низкочастотном ультразвуковом генераторе п др.

Однако дпагпостикумы с антигенами, полученными перечисленными выше методами, оказались недостаточно активными, а некоторые н песпецпфпчнымп,

В качестве адсорбентов пспытывалисы активированный уголь, гидроокись бария, гидроокись цннка, тальк, латекс, сн-лнкагель в сравнении с формалнпнзпрованнымн эритроцитами, а в качестве антигена применяли'иадосадочпую жидкость, автоклавнрованпую суспензию Br. abortus 19, полисахарид, суспензию бруцелл, разрушенных ультразвуком.

Все небпологнческпе адсорбенты, несмотря на отсутствие собственной апгнгенносги, которая иногда может повлиять на ход ¡н-акцчи, не дали каких-либо преимуществ перед формали-2 Зак. 1545 5

1М13Прованныыи эритроцитами- Поэтому мы придерживаемся мнения Б. Ф. Каральника (1970) и др, о преимуществах эритроцитов.

Нами были также проведены исследования по изысканию штамма бруцелл, наиболее пригодного для изготовления специфичного и актишюго антигена, изучено значение рН.ионре-делены время и оптимальная температура при сенсибилизации антигеном эритроцитов барана н влияние различных концентрации формалина па активность эрнгроцптарного бруцеллез-1ю;о диагностнкума.

Пршотовленныи нами дпагностикум предварительно изучали на специфичность в РИГА и с сыворотками крови здоровых по бруцеллезу, а также больных другими заболеваниями ;кииотпчх.

Специфичность и активность нашего днагностикума сравнивали едиа-гностикум-а ми,-приготовленными другими институтами ИЭЛ1 им- Н. Ф. Гамалеи, Ставропольским противочумным институтом (НИПЧИ). Казахским ПИВИ па сыворотках крови животных с различной эпизоотической характеристикой по бруцеллезу.

Убедившись в специфичности и высокой активности приготовленного памп днагностикума, мы испытали его активность в сравнении с пластинчатой РА, РА, РСК, РДСК и кольцевой реакцией с молоком.

Всего нами было исследовано 6593 сыворотки крови живот-пых, в том числе от здоровых по бруцеллезу и больных другими заболеваниями — 1733, экспериментально зараженных — 328, естественно больных — 1276, вакцинированных и зараженных -- Ьй9, вакцинированных и ревакцпиированных — 2444.

Специфичность и высокая активность эрптропнтарного днагностикума ВИЗВ в РНГА дали основание к испытанию его в реакции нейтрализации антител при бруцеллезе.

Предварительно специфичность РНАт с нашим дпагло-стикумом была проверена при исследовании органов и лимфатических узлов от здоровых животных и неинфицирован-¡¡ых бруцелламн .проб: 'водопроводной воды, сыворотки молока, чернозема, песка, а также 'бактериальной взвеси возбудителей других заболеваний (инфекционный зпидидимит бара.пов, вибриоз, пасте.реллез, листериоз, колибактериоз_, паратиф, а также культур стафилококка, -стрептококка и иротеуса).

Диагностическую эффективность РНАт проверяли исследованиями .патологического материала от крупного рогатого скота: экспериментально зараженного, естественно 'больного, ■вакцинированного и затем зараженного бруцеллезом в срав-6

нешш с бактериологическим методом и -предварительным исследованием серологи чески м и реакциями. Всего нсслсдов.иго 3047 объектов.

При серологическом (РА, РСК) н бактериологическом исследовании -попользовали животных, находящихся в опытах лаборатории по изучению бруцеллеза ВИЭВ и данные научных сотрудников А. Н. Касьянова, К- В. Шумилова, В."А. Ромахова.

Изучение диагностического значения РНГЛ при бруцеллезе мы начали с использования полпеахарндного антигена, любезно предоставленного мам М. II. Чернышевой (Институт им. Н. Ф. Гамалеи). Этот антиген оказался специфичным и высокочувствительным, но широкое его использование в опытах ограничивалось тем, что натнвпые эритроциты, сенсибилизированные полисахаридом, .пригодны к употреблению только в течение 24—72 часов. ,К тому же днагностикум готовят (сенсибилизация эритроцитов -полисахаридом) перед применением, что довольно сложно и не всегда может быть поручено ветла бор а тория м. Поэтому мы 'поставили своей задачей получить эрнтроцитарнып днагпостикум, более пригодный для массового изготовления н широкого применения, так как до настоящего времени такого дпагностикума практика не имеет.

В результате испытания многочисленных методик мы остановились на методике inpизготовления антигена, -где для сенсибилизации формалниизированных эритроцитов используется экстракт Brucella abortus 19, .полученный путем а-вто-клавироеания. Предварительная обработка эритроцитов танином по лашей методике не требуется, что намного ускорит процесс 'приготовления эрнтроцдтаршэго антигенного днагностикума.

Первым эта-пом нашей работы было определение оптимальных условии для .приготовления антигена. В этих целях мы исследовали способность экстракта -бруцелл штамма 19, полученного по .нашей методике, адсорбироваться па эритроцитах барана, влияние температуры, концентрации водород--ных ионов, времени адсорбции на активность антигена.

При определении оптимальной концентрации сенсибилизирующего антигена ламп установлено, что наиболее высокие титры РИГА .получены с эрптроцнтарными диагностнку-■мамтг три сенсибилизации эритроцитов экстрактом бруцелл, .полученным при концентрации суспензии 50—100 млрд. микробных тел. Поэтому в дальнейшем прл сенсибилизации эритроцитов мы использовали такой антиген.

С целью определения значения вида и штамма бруцелл, 2* 7

используемого при изготовлении антигена аля сенсибилизации эритроцитов, были взяты пять штаммов бруцелл из музея лаборатории по изучению бруцеллеза ВИЗВ: Вг. aborius 19. 54, 104-М; Br. melitensis 498;" Br. suis 61. Все 1птаммы обладали типичными кулвту-ралыю-бпохимическими свойствами и не имели признаков диссоциации. Из указанных штаммов .готовили антигены по следующей методике.

Трехсуточную культуру отобранных штаммов бруцелл, выращенную на мясо-леченочно-пептонном агаре (МППА) в пробирках, смывали 3—5 мл физиологического раствора (pH 7,2) и смывом засевали матрасы с МППА (-с 2—3% глицерина и 1% тлюкозы), которые помещали ib термостат (37°С).

На третьи сутки агаровую культуру смывали 0,5%-ным формалннизированным физиологическим раствором. Смыв агаровой культуры подвергали трехкратному центрифугированию. Осадок доводили ацетатным буфером до концентрации 50—100 млрд. м. т. (по бруцеллезному стандарту ГКИ им. Тарасовича) и автоклавн.ровали в течение 30 минут при НО—115°. После автоклаьнровання суспензию бруцелл центрифугировали в течение 30 минут при 6000—8000 об/мин.

Иадосадочпую жидкость сливали и попользовали в качестве антигена для сенсибилизации эритроцитов.

Изучение -специфичности и активности эритроцитарных лиатностикумов для РИГА, приготовленных с использованием разных видов и штаммов бруцелл, проводили в сравнении па одних и тех же сывсротклх крови животных. В процессе .проведенных работ было устаповл&но, 'что при изготовлении антигена для РИГА из разных штаммов бруцелл, наиболее активными антигенными свойствами обладал штамм 19, который и был использован нами в дальнейшем при изготовлении эритроцитарного диапюстнкума.

При этом было отмечено, что для постановки РНГЛ оптимальной -средой ятляетея нейтраль-пая (рИ=7,0). В кислой среде (<рН = 4,0) титр антигенов из всех штаммов снижается в 16—64 раза, в то ¡время как при рН=9,0 и 11,0, наблюдается снижение гитра в 2—8 раз по сравнению с нейтральной средой-

По вопросу -о тем.пературном режиме, при котором лучите происходит адсорбция антигена, в литературе имеются >раз-погл а-сня.

Для определения оптимального температурного режима при сенсибилизации эритроцитов бруцеллезным антигеном мы поставили опыты по сенсибилизации бараньих эритроцитов нашим антигеном ib течение часа на холоде (4°), при комнатной температуре (18^22°), -при 37° и 48— 50°. В 45 опы-

тах было установлено, что сенсибилизация бараньих эритроцитов антигеном .происходит наиболее интенсивно три 48— 50° (в течение четырех часов.

Отрабатывая методику изготовления эритроцитарного диагностикума, очень важным являлось определение оптимальной концентрации формалина при изготовлении и сохранении срока его активности. При других инфекциях в отношении оптимальной концентрации формалина с эрнтроцнта,р-.пом аиагностикуме имеются разноречивые данные. При 'бруцеллезе этот вопрос также изучен недостаточно.

Учитывая очень важное значение данного вопроса, нами были поставлены опыты по изучению влияния различных концентраций формалина (0,5; 1; 3 и 5%) на активность эритроцитар'Ного диагностикума. Исследованиями установлено, что диапностикум, консервированный 0,5—1,0% формалином, лучше сохранял активность. Поэтому данная концентрация формалина 'применялась нами .гири дальнейшем 'приготовлении эритроцитарного бруцеллезного диагностикума.

Очень важным моментом для РНГА явилось также определение оптимальной концентрации эритроцитов при изготовлении бруцеллезного эрнтроцнтарного диагностикума.

Изучая этот вопрос, мы испытали диагностику« .при концентрации 1,5; 2,5 и 5% эритроцитов три разном температурном режиме — +4, 18—22° и 37°, физиологического раствора ■рН 7,0 и забуфе-ре иного физиологического раствора рН 7,2,

Результаты проведенных исследований показали, что более высокие титры РНГА получаются при температуре 18 — 22°. С повышением температуры до 37° тнтры снижались. Скорость оседа'ння эритроцитов -зависела от температуры: она .проходила быст-рее всего 'при 37°, далее при 22° и медленно .гари 4°. Скорость оседания эритроцитов повышалась также н с увеличением концентрации эритроцитов, быстрее всего она наблюдалась при использовании 5%-ной и медленнее 1,5%-ной концентрации. -При постановке РНГА в физиологическом .растворе рН 7,0—7,2 разницы не отмечалось.

Следует отметить, что гемапглкшширугощая активность антигена с .1,5%-иымн эритроцитами 'барана выше по сравнению с 2,-5%-ными при температуре +4, +37". Но, как показали опыты, три постановке РНГА с негативными сыворотками животных с 1,5%-иыми сенсибилизированными эритроцитами барана трудно учитывать результаты реакции и ■появляются неспецифпческне реакции, что, видимо, связано с малой концентрацией эритроцитов.

Таким образом, *по нашим исследованиям, наиболее оптимальными условиями для приготовления эрнтроцнтарного дн-агностн'кума ¡при бруцеллезе являются: использование экст-

■рак та 50—100 млрд. взвеси брулелл штамма Бр. а бор туе 19, автоклавнрованной при 110—115° 30 минут, -сенсибилизация им 2,'5%-ных формалипизиро^анных эритроцитов барана при 48—50е в течение четырех часов н консервирование его 0,5—-1,0% формалином.

Приготовленный таким образом диагностикум применялся в дальнейших -наших исследованиях.

Испытание специфичности и активности эритроцитарного диагностикума в РИГА

Специфичность приготовленного нами -бруцеллезного эритроцита рного дпаписстикума предварительно изучалась в РНГА в сравнении с днагиостнкумамн Института им- Н. Ф, Гамалеи, Ставропольского противочумного института (НИПЧИ) и Казахского H ИВИ на 1580 сы-воротках крав и от здоровых .по бруцеллезу животных, в том числе: крупного рогатого скота 1353, овец 152, северных оленей — 23, кроликов — 15, морских свинок — 37.

При исследовании в РНГА перечисленных выше сывороток со (всеми антигенами были -получены отрицательные результаты.

Следует отметить, что к этому времени институт им. Н. Ф. Гамалеи .приготовил сухой лиофилизнроваиный эрнтроцитар-ный диагностику:«, который, 1как и нативные эритроциты, сенсибилизированные -полисахаридом, оказался специфичным и -высокочувствительным.

Специфичность в РНГА указанных антигенов подтвердилась также в реакции торможения -непрямой тема ггл юти нации (РТНГА), предложенной М. И. Леви (1969). При этом антигены ВИЭВ, ИЭМ им. Н. Ф- Гамалеи и Казахского НИВИ оказались специфичными, за исключением антигена Ставропольского НИПЧИ от 15 ноября 1972 .г., обладающего :в РНГА большой чувствительностью, но пои .проверке специфичности в РТНГА н в реакции нейтрализации антител на нормальной сыворотке кролика в разведении 1 : 100 и физиологическом растворе, он давал неспецифические реакции.

Дополнительно специфичность приготовленного нами антигена .проверили в РНГА на 153 сьиворотках крови животных, в том числе 16 от больных бруцеллезом и 137 от больных другими инфекционными заболеваниями бактериального и вирусного происхождения (туберкулез, вибриоз, оа-стерел-лез, лейкоз — крупного рогатого скота, вирусный аборт, инфекционный апидидимит баранов (Br. ovis), токсоплаз-моз— овен; чума сомлей, туляремия), полученных в лабораториях ВИЭВ. 10

■Полученные данные свидетельствуют о нзысокон специфичности 'бруцеллезного эритроцитарного днагностнкума ВИЭВ. С сьивороткамн больных бруцеллезом животных реакция была четко положительной в титрах 1:200—1:400, тогда как с сыворотками больных другими ннфекшюшшми заболеваниями РНГА была отрицательно Л, за исключением части туляремийных агглютинирующих -сывороток, которые иногда давали реакцию, но только в разведении 1:25++.

Убедившись в специфичности при готовленного ламп эрнт-:])оцитарпого антигенного диагностику-ма для РИГА, мы изучили его активность -в сравнении с днагпостнкумами ИЭЛ\ им. Н. Ф. Гамалеи, Ставропольского научно-исследовательского противочумного института (НИЬЧИ), Казахского НИВИ ,на 321 сыворотке крови животных с (различной эпизоотической характеристикой.

Результаты сравнительного исследования активности эрн-троцнтарных днагностикумов различных институтов на сыворотках крови животных ■представлены -в таблице 1.

Таблица 1

Эпизоотическая характеристика групп £ о С "1 Реагировало с ми днагностнкума-(в %)

й 5 3 М г и а «1 Е= н =е о г? л о ~ М £ ВИЭВ ИЭМ им. И.Ф. Гамалеи Казахский НИВИ Ставропольский нипчи

Экспериментально КРС 52 100,0 96,1 96,1 100,0

зараженные Овцы 22 95,4 95,4 95,4 100,0

2. Свежий очаг КРС 105 84,8 70,1 76,1 87,6

3, Вакцинированные КРС 142 81,7 76,7 72,5 78,9

н затем зараженные

Всего 321 86,6 80,9 79,1 86,0

В стадах с острой инфекцией, где в течение года регистрировались аборты бруцеллезного происхождения и выделялось значительное количество реагирующих, тремя диагно-стикумами 'были исследованы сыворотки от ¿77 животных. Положительные результаты получены: с диатн ости кумом ВИЭВ—467 (80,9%), ИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи—431 (74,6), Казахского НИВИ — 430 ( 74,5%).

Дополнительно на 162 сыворотках северных оленей*, из свежего очага бруцеллеза напитывались два антигена — ВИЭВ и Института им. Н. Ф* Гамален. При этом положн-

* Совместно с научным сотрудником Ямальской сельскохозяйственной станции И. А, Касьяновым.

тельно .реагировало с длапностнкч'мамп: 'ВИЭВ — 113 оленей (69,7%), ИЭМ им. М. Ф. Гамалеи — 101 (62,3^о).

Такие же,в ©славном, результаты (получены и гтри исследовании в РИГА сыворотки крови 200 экспериментально зараженных и вакцинированных морских свинок, где с диагно-стпкумом ВИЭВ реагировало 132 (06,0%), ИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи — 114 (57,0%), Казахского НИВИ — 106 (53,0"/»).

При сравнении антигенов института им, Н. Ф. Гамалеи и ВИЭВ более высокая чувствительность последнего выражалась в том, что с имм реакция получалась на 1—2 разведения больше. Например, при исследовании 33 позитивных сывороток животных с эритроцитариым антигеном ВИЭВ титр 'был выше, чем с диатностикумом ИЭМ им. Н, Ф. Гамалеи с 14 сыворотками и только в двух случаях антиген ВИЭВ оказался несколько менее чувствительным. То же самое получено при сравнительном испытании указанных антигена© на сыворотках с высоким титром. Так, с поливалентной кроличьей сывороткой с антигеном института им, Н. Ф. Тамалеи титр был 12800, а с антигеном ВИЭВ — 51200. С сывороткой гипериммунной коровы «Милка» с алтнгеиом института им. н. Ф. Гамалеи титр был 51200, а с антигеном 'ВИЭВ—102400 и с национальной позитивной сывороткой — соответственно титры РИГА были 800 и 3200.

Как видно из приведенных данных и таблицы 1, эритро-цптарпымп диагностику мамп различных институтов для РИГА 1в сравнении было исследовано 3029 сывороток крови четырех видов животных с различной эпизоотической характеристикой. .При этом у экспериментально зараженных, естественно больных, вакцинированных и затем зараженных животных с дпагпостикумом ВИЭВ положительные результаты получены с большим количеством сыворогок крови, чем с диагностику мам и Института им. Н. Ф. Гамалеи и Казахского ПИВИ-

С диагностикумом Ставропольского НИПЧИ в некоторых группах животных 'получено несколько больше -положительных результатов РНГА. чем с антигеном ВИЭВ. Но, как уже упоминалось выше, проверка специфичности этого диагностн-кума при помощи РТНГЛ показала, что в части случаев с этим антигеном .получаются нес.пецифические реакции.

Таким образом, по результатам проведенных исследований приготовленный нами эритроцитарный диа-гностикум является специфичным и высокочувствительным. Методика его приготовления проста и требует двух—трех дней, если не учитывать трое суток для выращивания культуры >бруцелл. Срок годности диагностикума 18 месяцев (срок наблюдения), 12

Дальнейшее испытание активности и изучение диагностического значения реакции непрямой гем агглютинации (РНГА) в сравнении с другими серологическими тестами (РА, РСК, РДСК и др.) мы провели на сыворотках крови здоровых, экспериментально зараженных и .больных -бруцеллезом животных 'в хозяйствах.

Реакцию непрямой гемагглютинации ставили в полнстеро-ловых прозрачных пластинках в -соответствии с Временным наставлением по .применению 'бруцеллезного полисахарида, составленного ИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи и утвержденного комитетом вакцин и сывороток Министерства здравоохранения СССР от 23 ноября 1970 г.

По литературным данным, при исследовании на бруцеллез сывороток крови крупного рогатого скота в РНГА -сомнительным результатом считают наличие гемагглютининов в раэаедении 1 :50, положительным 1 : 100 и выше, у северных оленей н овец титр 1 :25 считается сомнительной реакцией, а 1:50 и выше — положительной.

По анализу результатов исследования значительного количества сывороток крови от здоровых по бруцеллезу животных >мы определили, что с нашим аиагностикумом за положительный 'результат РНГА следует считать титр с 1:100, не менее чем на три креста, сомнительной .реакцией 1:50 и 1:100 два креста.

При изучении диагностического значения РНГА при бруцеллезе одновременно с другими серологическими реакциями (РА, РСК, РДСК) исследовали 3564 сыворотки крови животных с различной эпизоотической характеристикой. В РА, РСК и РДСК сыворотки исследовали по общепринятым методикам с использованием антигена Харьковской 'биофабрики. В (Карагандинской НИВС совместно с кандидатом <вет. наук В. Б. Бельченко исследовали 787 сывороток животных.

Результаты исследования активности эритроцитарнаго диагностнкума ВИЭВ в РНГА в сравнении с пластинчатой РА и пробирочной РА и РОК на сыворотках крови животных с различной характеристикой приведены в таблице 2-

Дополнительно в колхозе им. Дзержинского нами были проведены серологические исследования 52 коров 'бруцеллезного изолятора. При этом положительная РНГА получена V 52 >гол о в (100»/*), -РА 35 (67,3%), РДСК у 35 (67,3%) и кольцевая реакция с молоком у 38 голов (73,1%).

В этих же целях мы провели исследование 97 сывороток крови «оров одно- н трехкратно иммунизированных вакциной из штамма 19. При этом РНГА была 'положительной у 71 (73,0->/о); РА у 35 (36,0%); РДСК у 36 (37,0%) и кольцевая реакция (КР) с молоком — 36 (37,0%) животных.

Таблица 2

| % реагирующих

Эпизоотическая характеристика групп животных Вид животных «2 2 £ Т о ь™ й 1 РНГА пл. РА пр. РА РСК

Экспериментально зараженные КРС Морские сиинки 119 89 99,0 ЮО.О 81,0 01.0 74.0 8Л.0 69,0 79,7

СиеишП очя г * К1>С О лепи 765 162 51,0 75.8 43,0 66,4 19.0 51.6 27.0 47.С

Вакцинирование н затем зараженные КРС Морскнс свинки 43» 144 85,2 41,6 72.3 34.2 38,4 22.2 47.4 15.9

Вакцинирование КРС Морские свники М40 497 70.0 61.1 66.0 51.5 38,0 49,8 25,0 35.4

Ревакцинкроватшй КРС 65 75,4 70,7 43.1 52,3

Всего 1 3415 I 67.0 1 56,8 38,0 34,0

Такн-м образом, при исследовании экспериментально зараженного,естествен но больного бруцедезом крупного рогатого скота как в свежих, так и в хронических очагах инфекции (изолятор), вакцинированных и затем зараженных, вакцинированных и |р ев а «дин и р о>в ан н ы , положительная РИГА с нашим дпагпсстнкумом .получена у большего количества животных, нежели пластинчатая РА, РА, РСК, РДСК-

Значительно больше .положительных результатов получено у экспериментально зараженных, чем у вакцпннровашшх п ■затем зараженных животных, что, видимо,связапос наличием у последних иммунитета.

■В ■связи с высокой чувствительностью РНГА, результаты которой поглощают показания пластинчатой РА, РА, РСК и дополнительно выявляют реагирующих, 'возникла необходимость выяснить эпизоотическое значение животных, с сыворотками которых получается только РНГА.

Изучая этот вопрос, -мы правели убой и бактериологическое исследование семи коров из свежего очага бруцеллеза, давших положительную РНГА .при отрицательных результа-N

тах других серологических реакций {РА, РСК). При этом от всех -семи животных с положительной РНГА в титре 1 : 100 (+ + + +), 1:200, 1:400 при отрицательных результатах других реакций, получены культуры йруцелл. Эти данные указывают, что исследование в РНГА крупного рогатого скота может иметь 'большое практическое значение, особенно в свежих очагах бруцеллеза, так как эта *реакция дополнительно к РА и РСК выявляет больных бруцеллезом животных.

Испытание эритроцитарного диагностикума в реакции нейтрализации антител (РНАт)

При 'бруцеллезе очень часто требуются бактериологические исследования абортированного плода, ¡последа, молока и другого материала. Однако этот метоа требует длительного времени и специальных питательных сред.

Большим недостатком его является и то, что доставляемый в ветеринарную лабораторию .патологический материал иногда не пригоден для бактериологического исследования, так как загрязнен .посторонней микрофлорой. Особенно часто это бывает в летнее время, когда патологический материал .при дальности расстояния до лаборатории доставляется с запозданием, и в других случаях. Поэтому разработка метода, более пригодного для быстрой индикации 'бруцелл ка>к ¡в патологическом материале, так и в объектах внешней среды ('вода, навоз, почва и др.) может иметь большое .практическое значение.

Для этих 'Целей по ¡предварительным данным наиболее пригодной может быть РНАт, которая оказалась специфичным и высокочувствительным методом при бруцеллезе-

Дополнительному изучению ¡этой реакции мы уделили большое внимание.

Используя одновременно бактериологический метод и РНАт, мы исследовали следующие внутренние органы животных: селезенку, почки, печень, <п од челюстные, заглоточные, околоушные, щредлоп а точные, паховые, надколенные, надвыменные, гппогастральпые, пара аортальные, средостен-■ные лимфоузлы.

На ш:нове проведенных опыт«® мы применяли -следующую методику подготовки материала для исследования в РЙАт. Патологический материал (кусочки внутренних органов, лимфатических узлов) растирали ® ступке, заливали 1 ; 10 физиологическим раствором хлористого натрия рН 9,0— 10,0, затем экстрагировали -при 100°С в течение 30 минут, (центрифугировали и фильтровали через бумажный фильтр.

Полученный фильтрат, рН которого обычно равнялся 7,0—7,2, испытывали в РНАт,

Специфичность РНАт с приготовленным нами днагностикумом [предварительно была проверена 'при исследовании органов и лимфатических узлов от 8 здоровых животных .(120 .проб) и 113 проб — водопроводной ■воды, сыворотки .молока, чернозема, песка не инфицированных бруцелламн. Во всех случаях получали отрицательный результат РНАт. Дополнительно специфичность РНАт испытывали с экстрактом и бактериальной взвесью возбудителен других заболеваний (инфекционного эпид1$инта баранов, вибриоза, .пастереллеза, листериоза, гкол и бактериоз а, паратифа, а также культур-стфилококка, стрелтококка и ■протеуса).

При исследовании в РНАт 232 микробных суспензий возбудителей различных заболеваний (30 штаммов), в том числе не культурами Вг, оу1э (6 штаммов), в концент.рациях 10 млрд. — 625 млн. аг. т. в I мл -получен отрицательный, а с контрольной взвесью бруцелл (7 штаммов) — положительный результат. Особо' нас интересовала специфичность РИАт с бруцеллезным эритроцнтарпым днагностикумом при заболевании овец Вг, охмэ. Получив отрицательный результат с суспензиями шести штаммов этого вида, .полученных от баранов в различных зонах Советского Союза, мы дополнительно испытали патологический материал от семи овец, зараженных Вг, Всего было исследовано 83 объекта и также результаты РНАт были отрицательными.

Таким образом, лри исследовании патологического материала от здоровых по ¡бруцеллезу животных, суспензии возбудителей других различных заболеваний и латматериала от овец, зараженных Вг. оу^й, всего 548 объектов, «ами во всех случаях .получены 'Отрицательные результаты, что свиде-юльствует о высокой специфичности РНАт с бруцеллезным эритроцитарным днагностикумом.

При отработке методики постановки РНАт мы выясняли также онтнмэльные температуру и экспозицию в первой фазе .реакции, т. е. при связывании антигена с антителом. В этих целях после смешивания иммунной сыворотки с исследуемым материалом пластинки с указанными компонентами выдерживали лри разных температурах и различное время.

Опытом установлено, что лучшие .результаты .получаются .при добавлении бруцелезного эрнтроцнтарного диагностнку-ма через два часа шосле инкубации смеси антигена н сыворотки при 37°, н учете результатов че-рез три часа .после выдерживания реакцни'шрн комнатной темлературе-

■Изучая влияние концентрации формалина на срок прн-

годности патологического материала для исследования в РНАт, от 17 телок, экспериментально за-раженных. Br abortus 54, мы .провели четырехкратное исследование натматериала: в день убоя животных, через 5 суток, 3 и 7 месяцев хранения opi aiiOB при 18—22° в 10%-ном растворе формалина-При этом результаты исследования РМАт данного патологического материала в указанные сроки со клали с теми же данными, что и в день убоя.

Диагностическую эффективность РНАт изучали на патологическом материале от 213 голов крупного .рогатого скота с различной эпизоотической характеристикой: из .них 60 го-лоь с положительной РЛ и РСК, в свежих очагах бруцеллеза, 50 голов крупного рогатого скота, экспериментально зараженного Br. abortus 54 и от 103 телок, привитых вакциной из штамма 19 и затем зараженных Br. abortus 54.

Во ¡всех опытах патологический материал исследовали в РНАт параллельно с бактериологическим методом.

В .первом опыте был исследован 261 объект от 48 коров из свежих очагов бруцеллеза. Данные этих исследований приведены в таблице 3.

Таблица 3

Результаты бактериологического и в РНАт исследования патматериала от коров с положительной РА и РСК в свежих очагах бруцеллеза

К-во исследованных В|>1 делено культур Положительная РМАг

ХозяЯстпа 1С 3 Н о ей К ей О О л , Ч — " к g % О. о 5 и л % £ й * О А 2 -J. ж 5 и S о £_

* а О ^ се е к >1 а в Л

Кол.\оз им. Дзержинского IS ПО 8 <14,4 10 16.3 12 65,6 28 24,1

Колхоз .Путь Ленина* 30 145 12 40.0 20 13,7 21 80,0 33 22.7

Всего 48 261 20 41,7 39 11,9 36 75,0 61 23,3

Из таблицы 3 'видно, что положительные результаты .в РМАт получены у большего количества естественно больных бруцеллезом животных, чем бактериологическим методом. Во втором опыте бактериологически и РНАт от 12 коров

из свежего очага бруцеллеза было исследовано но шесть ибьсктои (органы, лимфоузлы), всего 72 пробы. При этом бактериологическим исследованием выделено 19 культур (26,3%), а положительная РНАт получена в 31 (43,5%) случае ib титре 1:16—il:128.

В третьем опыте исследовали патологический материал от девяти телок 8—'12-месячного возраста, зараженных копъ-юпктнвально Brucella abortus 54 различными дозами (по 3 головы). Телок убивали и исследовали через 30—35 дней после заражения. При этом из 126 объектов, исследованных бактериологическим .методом, выделено 46 культур (36,5%), а РНАт была положительной © 62 случаях -(41,0%).

Интересно отметить, что с экстрактами ночек этих телок РНАт была положительной в пяти случаях в титрах 1:2—1:8 при отрицательных результатах 'бактериологического исследования. Не обнаружено также 'бруцелл у трех телок, зараженных Br. abortus 54 в дозах 25 тыс. м. т., тогда как РНАт была положи тел ун ой с 7 объектами в титрах 1:2—1:8.

Положительный результат РИАт в небольших титрах получали лри заражении животных малыми дозами, т. е. .каг-„ да в патологическом материале было мало антигена и, .наоборот, чем больше была заражающая доза бруцелл, тем выше были титры РНАт. Следовательно, титр РНАт указывает на степень инфицировашюсти исследуемого материала.

Учитывая возможность малого количества специфического антигена в исследуемом натматернале, мы (Применяли ®ы-париванне экстракта органов и лимфатических узлов .боль-пых бруцеллезом животных до 1/10 объема. При этом во всех случаях получали положительную РНАт в более высоком титре.

Разница положительных результатов РНАт и бактериологического метода, по-видимому, может быть обусловлена тем, что для постановки РНАт берется больше патологического материала, чем для бактериологического исследования и с выявлением этой реакцией продуктов распада бруцелл.

В четвертом опыте сорок телок, экспериментально зараженных Br. abortus 54 подкожно или конъюнктива ль но в дозах 2,5—25 млн. м. т., через 30 дней после заражения животных подвергали убою и исследованию .бактериологически и в РНАт. При этом от 40 телок (685 объектов) было выделено 300 культур (43,7%), а положительная РНАт получена в 401 -случае (58,Wo).

В пятом опыте 103 телки через 3—5 месяцев после иммунизации вакциной пз штамма 19 были заражены Br. abortus 54 подкожно, в дозах 2,5 млн. м- т. Через .месяц (После их 18

заражения бактериологическим исследованием 1872 объектов выделено 93 культуры (4,09%), а РНЛт с темп же объектами была положительной в 203 случаях ('10,8%).

В шестом опыте от телки, абортировавшей после экспериментального заражнеия Brucella abortus 54 коиъюнктиваль-но, в дозе 2,5 млн. м. т., плод исследовали бактериологически л РНАт. Исследованием i 4 объектов абортированного плода культура бруцелл .получена в п-яти случаях, а РНЛт была положительной с 9 объектами.

Считаем необходимым отметить, что при исследовании гтатологпческого материала от экспериментально зараженных бруцеллезом животных, плода и др., как .правило, 'Положительные результаты бактериологического исследования н РНАт совпадают и дополнительно положительная РНАт получается в 14,8—28,5% и более случаев.

Как с научной, так и с ^практической точки зрения, нас интересовал вопрос о возможности исследования РНАт разложившегося патологического материала. В этих целях пат-материал от экспериментально зараженных телок Br. abortus 54, хранившийся при комнатной температуре, через семь месяцев исследовали повторно. Всего исследовали 47 -проб патматериала (органы и лимфоузлы). При этом не было обнаружено разницы в результатах исследования щ .первый и второй раз.

Установив специфичность iii высокую активность РНЛт при исследовании патологического материала от здоровых и больных бруцеллезом животных, мы использовали эту реакцию iB целях индикации бруцелл и их антигенов © молоке и в 150 объектах внешней среды: воде, черноземе, песке инфицированных разными дозами бруцелл, а также навоз от больных бруцеллезом животных.

При этом 'в водопроводной воде бруцеллы 1были обнаружены при концентрации 125—500 тыс. м. к. в I мл, в пробах земли 1—3,5 гмлн. м- ¡к. в 1 гр., в пробах песка—-'500 тыс.— 1 млн. м. к. в 1 :гр„ в сыворотке молока—500 тыс.—1,5 млн. м. к, в 1 мл (средние показатели 23 объектов). Со всеми пробами навоза от больных бруцеллезом животных получена положительная РНАт в титрах 1 : 16—>1 :64.

Рядом исследователей предпринимались попытки к обнаружению бруцеллезного антигена в исследуемом материале с применением антительного днагностикума. Имеющиеся в литературе сообщения ко применению РНАт с аптнтельным дпагностикумом заслуживают большого тинмачшя в связи с простотой ее постановки. При бруцеллезе эту .реакцию -применяли Ю. Г. Сучков, Ю. В. Канатов (1965), Т- Харитонова

(1960), М. Ф. Шмутер (19696) и др. Однако данная реакция не ¡получила 'применения в практике, т. к, не отработана еще методика приготовления антителыюго эрнтроцитарного днаг-постнкума. Поэтому нами была сделана 'попытка .получить антительный днагаостнкум. Гамма-глобулин получали с помощью метанола .по методу Дюбера с соавторами (1953). Источником у глобулина служили протпвобруцеллезные сыворотки крупного рогатого скота н овец. Было изготовлено 11 серий антителыюго диатностнкума, из них пять серий оказались наиболее активными -в РИГА. Указанные днагн-ост и кумы 'была использованы в РИГА 'параллельно с РНАт с антигенным диагност и кумом для выявления антигенов бруцелл в патологическом материале экспериментально зараженных телок.

Но, как показали результаты опытов, антительный диаг-постикум в РИГА был менее активным и иногда давал нечеткие реакции с завецомо известными суспензиями бруцелл, т. е. значительно слабее по сравнению с антигенным дизгио-стнкумом.

Результаты наших исследований совпадают с работами других авторов. Так, Ю. А. Черняев (1969) <при использовании четырех серий ящурного гамма-глобулина только в одном случае получил сенсибилизированные эритроциты (методика -постановки РИГА |ПО Рицаю), а из 46 гипернммунных сывороток морской свинки только семь оказались способными сенсибилизировать эритроциты. Автору не удалось юыяспнть ■причины, обусловливающие непригодность большей части типернммунных сывороток и серий .гамма-глобулина для сенсибилизации эритроцитов.

Б. П. Доброхотов, И. С. Мещерякова (1974) подчеркивают, что .при использовании аитительного эрнтроцитарного днаг-постикума для выявления антигена туляремнниого н чумного микробов в погадках хищных птиц с помощью РНГА, часто получаются песпшпфические или отрицательные результаты с материалом, содержащим специфический антиген.

Таким образом, то данным ряда авторов и ;по шредварн-тельным нашим исследованиям, применение антителыюго эрнтроцитарного аиагностнкума для обнаружения антигена п исследуемом материале не дало желаемых результатов. Методика сенсибилизации эритроцитов специфическими антителами требует 'дополнительного изучения. Учитывая -простоту ^остановки РИГА с ант ¡¡тельным днагноетлкумом. этот ■вопрос заслуживает большого внимания. 20

Выводы и предложения

1. Реакция непрямой гем агглютинации (РНГА) — специфический и более -чувствительный метод диагностики бруцеллеза по сравнен ню с применяемыми в ^практике 'пластинчатой РА, пробирочной РА, РСК и РДСК. Применение РНГА особенно может быть полезным в свежих очагах 'бруцеллеза, при вводе в благополучное <по бруцеллезу хозяйство новых животных и в других ответственных случаях.

Эта реакция пригодна для исследования на бруцеллез сывороток крови крупного рогатого скота, овец, северных оленей, морских синок и, видимо, других видов животных.

,2. Реакция нейтрализации антител (РНАт) специфична и 'высокочувствительна, она обнаруживает бруцеллы и их антигены в большем количестве патологического материала, чем бактериологический метод. РНАт может быть использована при исследовании абортированных (плодов и другого патологического материала, в том числе и непригодного для бактериологического исследования, а также .молока и объектов внешней среды (почва, навоз, вода).

3. Простая/по (выполнению РНАт является ценным диагностическим методом. Применение РНАт при исследовании абортированных плодов н другого материала может значительно .повысить 'эффективность исследования и облегчить работу ветеринарных лабораторий.

4. Разработанная нами методика приготовления эритро-цитарлого диагност и кум й для РНГА и РНАт .при бруцеллезе путем сенсибилизации эритроцитов экстрактом .бруцелл, проста то 'выполнению, днагностикум является специфичным и высокочувствительным .препаратом. Срок годности его не менее 18 месяцев.

5. Для более полного определения .практического значения РВГА с приготовленным нами антигеном при исследовании на бруцеллез сывороток крови животных и РНАт при исследовании патологического материала, молока и объектов внешней среды (вода, почва) необходимо провести широкое испытание этих .реакций [в (Производственных условиях и быстрее решить вопрос о .внедрении их в ¡практику.

Список опубликованных работ по материалам диссертации

1. Реакция нейтрализации антител ят-ри диагностике бруцеллеза, «Ветеринария», 1974, № 3, 94—95,

2- Диагностическая эффективность непрямой гемагглгати-нацни (РНГА) и реакцн Нейтрализации антител (РНАт) при бруцеллезе. «-Ветеринария», 1975, № 9, 110—112.

Материалы диссертации доложены;

1. На Всесоюзном совещании научных работников 'по бруцеллезу 18 апреля 1974 г., ВИЭВ."

2. На заседании Межведомственной научно-методической комиссии Минздрава СССР и Минсельхоза СССР по борьбе с бруцеллезом. 6 июля 1974 г., ИЭМ им. Н- Ф. Гамалея.

3. На заседании Ученого совета ВИЭВ 23 декабря 1974 г.

4. На заседании сотрудников лаборатории по изучению бруцеллеза ВИЭВ 23 июня 1975 >г.

Ответственный за выпуск автореферата заслуженный деятель науки РСФСР, профессор Е. С.( Орлов,

Подпек псч. 6/Х—75 г, Зак, 1545—150____

Типография Московской ордена Трудового Красного Знамени ветеринарной академии имени К. И. Скрябина