Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Разработка и совершенствование средств, методов диагностики бруцеллеза животных и инфекционного эпидидимита баранов

На правах рукописи

ДЕГТЯРЕНКО ЛЮДМИЛА ВЛАДИМИРОВНА

РАЗРАБОТКА И СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ СРЕДСТВ, МЕТОДОВ ДИАГНОСТИКИ БРУЦЕЛЛЕЗА ЖИВОТНЫХ И ИНФЕКЦИОННОГО ЭПИДИДИМИТА БАРАНОВ

16.00.03 — ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора ветеринарных наук

Новосибирск— 2005

Работа выполнена в ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт бруцеллеза и туберкулеза животных СО РАСХН

Научный консультант: доктор ветеринарных наук,

профессор,

заслуженный деятель науки РФ Шумилов Константин Васильевич

Официэльныеоппоненты: доктор ветеринарных наук,

профессор

Самоловов Андрей Артемьевич,

доктор ветеринарных наук, профессор

Луницын Василий Герасимович,

доктор ветеринарных наук, старший научный сотрудник Альбертян Мкртич Погосович

Ведущая организация: ФГОУ ВПО «Нижегородская государственная

сельскохозяйственная академия»

Защита состоится «5» апреля 2005 года в 1000 часов на заседании диссертационного совета Д.006.045.01 в ГНУ Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока СО РАСХН по адресу: 630501, Новосибирская область, Новосибирский район, п. Краснообск, ГНУ ИЭВСиДВ.

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНСХБ СО РАСХН Автореферат разослан 2005 г.

Ученый секретар И . Логинов

диссертационного совета

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1. Актуальность проблемы Проблема ликвидации болезней, вызываемых у животных бактериями рода Brucella (бруцеллез разных видов животных, инфекционный эпидидимит баранов), в Российской Федерации, как и во многих других странах мира, несмотря на значительные успехи в этом направлении, окончательно еще не решена.

Диагностика инфекционных болезней животных - особое звено профилактических и противоэпизоотических мероприятий. При бруцеллезе животных и инфекционном эпидидимите баранов она должна обеспечивать оперативную и объективную постановку первичного диагноза, максимальное обнаружение явных и скрытых источников возбудителя болезни на всех стадиях ее проявления в целях быстрейшего оздоровления неблагополучных стад, а также дифференциацию у животных, привитых различными вакцинами, реакций вакцинного и инфекционного характера.

Что касается диагностики типичного бруцеллеза у разных видов животных, то РА и РСК с единым бруцеллезным диагностикумом, а также РИД с О-ПС антигеном при исследовании сыворотки крови являются в настоящее время основными официальными диагностическими тестами. Однако в процессе исследований установлено, что РА не обеспечивает выявление больных животных на всех стадиях развития инфекционного процесса, причем довольно часто ее показания могут носить неспецифический характер. РСК эту проблему, в основном, решает, но ее постановка в значительной степени сложна, требует больших затрат времени и средств. РИД с О-ПС антигеном ориентирована практически на дифференциальную диагностику бруцеллеза, выявляя из числа животных, реагирующих в РА и РСК, наиболее опасных в эпизоотическом отношении, тем самым подтверждая наличие в стаде бруцеллеза. Молоко является удобным объектом для массовых серологических исследований на бруцеллез, однако единственный официальный связанный с ним диагностический тест - КР, используется до сих пор недостаточно широко по ряду причин, в том числе в связи с проблемами неспецифических реакций, обусловленных маститами.

В этой связи возникает необходимость в разработке новых легко выполнимых, доступных для массового использования экспресс-методов диагностики бруцеллезных S-антител в сыворотке крови и молоке.

Из шести видов, официально признанных международным подкомитетом по таксономии бруцелл, четыре в исходном состоянии находятся в типичной S-форме (В.abortus, B.melitensis, B.suis, B.neotomae, остальные - в эволюционно измененной природной R-форме (B.canis, B.ovis). Диагностика при болезнях, вызываемых у животных бруцеллами, должна быть направлена на индикацию и дифференциацию типичных и измененных бруцелл.

Что касается типичных бруцелл, то в природе могут циркулировать их измененные варианты - R, RS, SR и L-формы (П.А. Вершилова с соавт., 1972; Н.П. Потапов, 1974; К.М.Салмаков с соавт., 1974; И.А. Косилов, 1975, 1992,

1999; ПА Триленко, 1976; Е.С. Мозесюк, ,1982; Н.П. Иванов, 1987; В.Г.Ощепкоь, 1990; Л.Н.Гордиенко, 1999 и др.).

Измененные в антигенном отношении бруцеллы способны к реверсии в исходные формы. Однако в диссоциированном состоянии их сложно идентифицировать, поскольку официальные диагностические средства сконструированы на основе типичных 8-форм бруцелл. Указанная проблема актуальна и в связи с широким использованием вакцин, изготовленных из бруцелл с различной антигенной структурой.

В этой связи исследования по изысканию новых эффективных диагностических препаратов с учетом изменчивости возбудителя бруцеллёза являются актуальными.

Отдельно следует рассматривать проблему диагностики болезней, вызываемых у животных специфическими для отдельных видов животных бруцеллами в природной Я-форме.

Бруцеллез, вызываемый у собак В.сатъ, впервые был установлен в США в.Е. Сагт1сЬае1 в 1966 году, в России в Волгоградской области в 1994 году (К.В. Шумиловым с соавт., 1996). Инфекция наносит значительный ущерб собаководству, относится к зооантропонозам. В России диагностические средства при данной болезни до настоящего времени официально не внедрены в ветеринарную практику.

Важной проблемой остается ликвидация инфекционного эпидидимита баранов (ИЭ), вызываемого В.о\1$, и наносящего ощутимый экономический ущерб овцеводству во многих странах мира, в том числе и в России. В широкой ветеринарной практике применяется, в основном, один серологический тест — РДСК, что является недостаточным как для профилактики, так и оздоровления хозяйств от ИЭ баранов.

Вышеизложенное свидетельствует о необходимости разработки новых и совершенствовании существующих средств и методов диагностики бруцеллеза животных и ИЭ баранов, поиска вариантов наиболее рационального использования их в системе мер борьбы с этими болезнями.

1.2. Цель исследований — разработать новые и усовершенствовать существующие средства, методы диагностики бруцеллеза животных и инфекционного эпидидимита баранов.

Основные задачи исследований:

- разработать способ изготовления Я-бруцеллезной агглютинирующей сыворотки и Я-бруцеллезных люминесцирующих иммуноглобулинов для индикации возбудителей инфекционного эпидидимита баранов и бруцеллеза (диссоциированные формы); испытать диагностическую эффективность полученных препаратов;

- разработать Я-бруцеллезные диагностикумы для РА, РСК и РИГА, изучить их диагностическую ценность в экспериментальных и производственных условиях;

- изучить диагностическую ценность РИГА с сывороткой крови, КР и

РЫТА с молоком у крупного рогатого скота, инфицированного типичными формами бруцелл, в том числе на фоне иммунизации вакциной из штамма 82;

- разработать оптимальную систему дифференциальной диагностики бруцеллеза крупного рогатого скота, иммунизированного вакциной из штамма 82, изучить её противоэпизоотическую эффективность;

- разработать методики изготовления овисных антигенов для РА, РСК, испытать их специфичность, чувствительность в экспериментальных и производственных условиях при ИЭ баранов;

- изучить диагностическую ценность метода провокации биосинтеза антител при ИЭ баранов;

- разработать средства и методы диагностики бруцеллеза собак, вызываемого В canis.

1.3. Научная новизна. Впервые разработана технология промышленного изготовления «Набора компонентов для серологической дифференциации культур бруцелл», включающего R-бруцеллезную агглютинирующую сыворотку и R-бруцеллезный цветной антиген для РА.

Способ изготовления R-бруцеллезного цветного антигена защищен авторским свидетельством № 955572 от 04.05.1982 г.

Впервые разработана технология промышленного изготовления R-бруцеллезных люминесцирующих иммуноглобулинов для бактериологической диагностики диссоциированных форм бруцелл в реакции иммунофлуоресценции (РИФ). Установлена более высокая чувствительность РИФ с новым диагностикумом в сравнении с бактериологическим методом. Показана целесообразность применения R-бруцеллезных люминесцирующих иммуноглобулинов для прижизненной диагностики возбудителя В ovis в сперме баранов.

Впервые сконструирован специфичный и чувствительный R-бруцеллезный диагностикум для РНГА на основе сенсибилизации эритроцитов барана фенольным экстрактом антигена из штамма B.abortus 16/4. Показана возможность использования его для выявления R-бруцеллезных антител у животных в экспериментальных и производственных условиях.

Доказана необходимость применения R-бруцеллезного антигена РСК для дифференциальной диагностики бруцеллеза у крупного рогатого, скота, привитого вакциной из штамма 82, в благополучных и неблагополучных по бруцеллезу хозяйствах в разные сроки после иммунизации.

Впервые показана возможность применения РНГА с сывороткой крови для диагностики бруцеллеза у крупного рогатого скота, реиммунизированного штаммом В abortus 82, в ранние и отдаленные сроки после иммунизации.

Разработана методика постановки РНГА с молоком для экспресс-диагностики бруцеллезных антител. В экспериментальных и производственных условиях доказана специфичность и чувствительность теста. Установлено, что его возможно использовать в целях дифференциальной диагностики бруцеллеза у коров, реиммунизированных вакциной из штамма 82.

Доказана целесообразность применения КР с молоком для диагностики

бруцеллеза у коров, иммунизированных вакциной из штамма 82.

Разработаны критерии эпизоотической оценки по бруцеллезу животных, иммунизированных вакциной из штамма 82, для благополучных и неблагополучных хозяйств по показателям РА и РСК с единым антигеном.

Разработана оптимальная система дифференциальной диагностики бруцеллеза у коров, реиммунизированных вакциной из штамма 82, доказана ее противоэпизоотическая эффективность при оздоровлении неблагополучных по бруцеллезу хозяйств.

Разработаны технологии изготовления овисных антигенов для РЛ и РСК, в экспериментальных и производственных условиях доказана специфичность и чувствительность новых диагностикумов.

Разработан новый метод диагностики ИЭ баранов на основе использования реакций иммунологической памяти (метод провокации антител). В экспериментальных и производственных условиях показана возможность применения в качестве провоцирующих средств бруцеллина ВИЭВ, бруцеллоовина в общепринятых дозах.

Впервые экспериментальным путем доказана возможность использования вакцины из штамма B.melitensis Rev-1 для регистрации вторичного иммунного ответа с целью диагностики животных, инфицированных возбудителем В ovis.

Сконструированы новые диагностикумы из бруцелл вида canis для РА, РСК, РНГА. Осуществлена их апробация наряду с антигенами из R-формы В abortus в экспериментальных и производственных условиях, показана целесообразность применения для диагностики бруцеллеза у собак.

Впервые на территории Западной Сибири с помощью испытанных диагностикумов выявлен бруцеллез собак, вызываемый B.canis.

При бруцеллезе собак впервые установлена высокая эффективность прижизненного способа диагностики — РИФ с R-бруцеллезными люминесцирующими иммуноглобулинами.

1.4. Теоретическая и практическая значимость. Результаты проведенных исследований вносят существенный вклад в решение проблемы диагностики бруцеллеза животных и инфекционного эпидидимита баранов.

Они могут быть использованы при изучении патогенеза и иммуногенеза бруцеллеза разных видов животных и усовершенствовании системы противобруцеллезных мероприятий.

Предложена концепция оптимизации диагностики болезней, вызываемых у животных бруцеллами.

На основе указанной концепции разработан комплекс диагностических средств и методов, внедрение которого в ветеринарную практику обеспечило повышение эффективности противоэпизоотических и профилактических мероприятий при бруцеллезе животных и инфекционном эпидидимите баранов.

1.5. Апробация полученных результатов. Материалы диссертации доложены и обсуждены на: Всесоюзной научной конференции по проблемам бруцеллеза и туберкулеза (Омск, 1980); 3-ей Всесоюзной конференции

«Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биопрепаратов» (Щелково, 1987); XII Всесоюзной конференции по природной очаговости болезней (Новосибирск, 1989); Всесоюзной конференции «Актуальные вопросы профилактики бруцеллеза и организации медицинской помощи» (Новосибирск, 1989); Всесоюзных и Всероссийских координационных совещаниях по проблеме бруцеллеза и туберкулеза с.-х. животных (Омск, 1987; Кустанай, 1988; Новочеркасск, 1989; Махачкала, 1990; Омск, 1991-1995; Новосибирск, 1999); Международной научно-практической конференции «Проблемы стабилизации и развития сельскохозяйственного производства Сибири, Монголии и Казахстана в XXI веке» (Новосибирск, 1999); 2-й региональной конференции «Актуальные проблемы ветеринарной медицины мелких домашних животных на Северном Кавказе (п.Персиановский, 1999); Всероссийской научной конференции по проблемам хронических инфекций (Омск, 2001); Международной научно-практической конференции «Состояние и перспективы аграрной науки Казахстана и Западной Сибири» (Петропавловск, 2003); 6-й Международной научно-практической конференции «Научное обеспечение АПК Казахстана, Сибири, Кыргыстана, Монголии, Беларуси и Башкортостана (Новосибирск, 2003); Международной научной конференции «Современные проблемы эпизоотологии» (п.Краснообск, 2004).

1.6. Публикации результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 53 научные работы в журналах «Ветеринария»; «Сибирский вестник с.-х. науки»; материалах всесоюзных, всероссийских и международных научных конференций; трудах Всероссийского научно-исследовательского института бруцеллеза и туберкулеза животных и других НИУ.

1.7. Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 455 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, выводов, практических предложений, списка литературы и приложений.

Диссертация иллюстрирована 67 таблицами, 3 рисунками. Список литературы включает 565 источников, из них 226 - зарубежных авторов.

1.8. Внедрение результатов исследований. Результаты научных исследований нашли отражение при разработке наставлений по диагностике бруцеллеза животных и инфекционного эпидидимита баранов, инструкции о мероприятиях по профилактике и ликвидации инфекционного эпидидимита баранов, ветеринарно-санитарных правил по профилактике и борьбе с бруцеллезом животных, методических указаний по дифференциальной эпизоотической оценке стад крупного рогатого скота, привитого вакциной из штамма 82.

Всего на основе научных разработок, проведенных в комплексе с сотрудниками других НИУ, подготовлено 30 новых нормативных документов, утвержденных и внедренных на союзном и российском уровнях.

1.9. Основные положения, выносимые на защиту;

материалы по усовершенствованию серологической и бактериологической диагностики бруцеллеза животных, сенсибилизированных диссоциированными формами бруцелл;

- результаты испытаний реакции непрямой гемагтлютинации, кольцевой реакции с молоком, диагностическое значение этих тестов при бруцеллезе крупного рогатого скота;

- система дифференциальной диагностики бруцеллеза крупного рогатого скота, иммунизированного вакциной из штамма 82, и ее противоэпизоотическая эффективность;

- материалы по разработке и испытанию диагностических средств, методов при инфекционном эпидидимите баранов и бруцеллезе собак, вызываемом В еат$.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и методы исследований

Работа выполнялась с 1977 по 2003 годы в СибНИВИ, ИЭВСиДВ, ВНИИБТЖ в соответствии с утвержденными планами научно-исследовательских работ, хозяйствах Приморского края, Иркутской, Читинской, Новосибирской, Кемеровской, Омской, Курганской областей, Красноярского края, Бурятии, Туве, Киргизии, Армении, Казахстане, а также Центральном научно-исследовательском ветеринарно-медицинском институте Болгарии (г. София).

В процессе разработки и совершенствования средств и методов диагностики бруцеллеза и инфекционного эпидидимита баранов поставлены эксперименты на 660 морских свинках, 170 кроликах, 373 головах крупного рогатого скота, 392 баранах, 8 собаках. Проведены в хозяйствах производственные опыты и наблюдения на 281 тыс. крупного рогатого скота и 46 тыс. овец различных половозрастных групп с разнообразной эпизоотической ситуацией по бруцеллезу и ИЭ баранов. В г. Омске исследовано на бруцеллез 430 собак.

Иммунизацию, заражение животных, отбор материала для бактериологических исследований, посевы на питательные среды, типизацию выделенных культур проводили по общепринятым методикам.

Подопытных животных заражали и иммунизировали разными способами (подкожный, внутривенный, конъюнктивальный) в различных дозах — от 10 м.к. до 600 млрд м.к. в зависимости от цели и задач опыта.

Концентрацию микробных клеток устанавливали по оптическому стандарту ГИСК им. Л.А. Тарасевича. Для заражения животных применяли вирулентные штаммы В.аЬоНт 54, 544, эпизоотические штаммы В.аЬоНт 1671, 18-71, 110-71, 54-70, 12-71, 9-71, референтный штамм В.о™ 63/290, производственные штаммы Во™ 424/2, В.оук 6, а также эпизоотические

штаммы B.ovis 21-80, 83-79, 226-84, 215-84.

При бруцеллезе собак использовали референтный штамм В canis RM 6/66 и эпизоотические штаммы В.cams.

Для вакцинации животных использовали штаммы В abortus B-1, 519, 16/4, 82, 104 М, 19, В melitensis Rev-1. Для изучения антигенной структуры бруцелл в РА, РИФ, РНИФ были взяты 24 эпизоотических штамма В abortus, вирулентные штаммы В abortus 54, 544, 99, В melitensis 16 М, В suis 1330, В ovis 21-80, 6, 21584, В caws RM 6/66.

В качестве диагностических методов в экспериментах и производственных опытах при исследовании сыворотки крови применяли РА пробирочную и пластинчатую, РБП, РНГА, РСК-РДСК с S- и R-антигенами, РНИФ, РИД, а при исследовании молока - КР, РБПМ, РНГА.

В РСК-РДСК при ИЭ баранов использовали антигены из штаммов В ovis 6 и 64, изготовленные по разработанной нами методике на основе воздействия на микробную взвесь фенолом. Кроме того, применяли биофабричный овисный антиген, извлеченный методом криолиза (П.А. Триленко, 1970) Алма-Атинской биофабрики, овисный антиген, сконструированный на основе воздействия ультразвуком на микробные клетки штаммов В ovis 424/2 и 10/2 (авторы Н.П. Иванов, У.Э.Ниязов, К.В. Шумилов).

При проведении исследований на бруцеллез в РНГА использовали коммерческий медицинский эритроцитарный диагностикум производства Одесского бакпредприятия и эритроцитарный бруцеллезный антиген ДагНИВИ-ВГНКИ-ВНИИБТЖ Для диагностики диссоциированных форм бруцелл применяли R-бруцеллезный эритроцитарный диагностикум, изготовленный по разработанной нами совместно с А.П. Красиковым методике, для диагностики ИЭ баранов - овисный эритроцитарный диагностикум ВИЭВ-ВГНКИ (авторы ВА Ромахов, У.Э.Ниязов, К.В. Шумилов).

Иммунологический статус животных определяли в аллергической пробе с использованием бруцеллина ВИЭВ и бруцелоовина КазНИВИ-ВГНКИ-ИЭВСиДВ-ВНИИТиБП.

Для обнаружения S-бруцеллезных антигенов наряду с бактериологическим методом исследований применяли тест-систему ИФА, разработанную ИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи.

Методики отдельных экспериментов, научно-производственных опытов и наблюдений изложены в соответствующих разделах диссертации.

Результаты проведенных исследований подвергали анализу, отдельные экспериментальные данные — статистической обработке по таблицам Фишера и Стьюдента (Рокицкий, 1961).

Экономические расчеты результатов исследований проведены совместно с Ю.И. Смоляниновым.

Часть исследований выполнена совместно с сотрудниками ИЭВСДВ, ВНИИБТЖ (И.А Косиловым, Г.В. Разнициной, С.К. Димовым, А.Г. Хлыстуновым, А.П. Красиковым, П.К. Аракеляном, А.А. Новицким, Т.Г. Поповой, В.Г. Ощепковым, Л.Н. Гордиенко, Н.Г. Шпаком, С.А. Власовой), ВГНКИ (К.В.Шумиловым, У.Э.Ниязовым), ИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи

(М.М. Желудковым, И.П. Павловой), ВНИИТиБП (Н.И. Передереевым, Н.И. Галкиным)).

Основная часть работы, связанная с разработкой, испытанием средств диагностики бруцеллеза животных и ИЭ баранов, обобщение и анализ полученных результатов исследований проведены автором самостоятельно.

Автор выражает глубокую признательность и благодарность доктору ветеринарных наук, профессору, заслуженному деятелю науки РФ И.А. Косилову, научному консультанту доктору ветеринарных наук, профессору, заслуженному деятелю науки РФ К.В. Шумилову, а также всем упомянутым исполнителям и специалистам практической ветеринарной службы за поддержку избранного направления в науке, консультации, методическую и практическую помощь в проведении исследований.

2.2. Результаты исследований

2.2.1. Концепция оптимизации диагностики болезней, вызываемых у животных бруцеллами

Исходя из концепции управления эпизоотическими процессами бруцеллеза (С.К. Димов, 1993), основанной на современных теориях, в т.ч. саморегуляции паразитарных систем (В.Д. Беляков, Р.Х. Яфаев, 1989), диагностика в неблагополучных популяциях должна быть направлена на оперативное и максимальное выявление больных животных, скрытых носителей возбудителя в сочетании с созданием перманентного иммунитета на весь период оздоровления с помощью вакцины, не препятствующей поствакцинальным исследованиям и максимально обеспечивающей использование ее провоцирующих свойств.

В благополучных популяциях животных диагностика должна быть направлена на контроль за эпизоотическим состоянием популяции (в угрожаемых - в сочетании с перманентным иммунитетом, необходимым на весь период угрозы возможной эндо- или экзоинфекции).

Диагностика должна быть комплексной, обеспечивая выявление как явно больных, так и скрытых носителей, а также максимально простой.

Измененные бруцеллы, особенно Ь-формы, как в морфологическом, так и антигенном отношении весьма отличаются от типичных. Поэтому для их идентификации нужны специальные методы. Особенно актуальны диагностические сыворотки и иммуноглобулины, которые необходимо изготавливать из измененных бруцелл.

Для массовой диагностики болезней, вызываемых у животных бруцеллами, при проведении эпизоотологического контроля благополучия в свободных от данной инфекции зонах актуален комплекс средств и методов, ориентированных на выявление реакции макроорганизма на возбудитель: минимум простых для применения методов, отражающих гуморальный механизм. Диагностические тесты в данном случае должны быть простые,

экспрессные и недорогие, обеспечивающие основную цель - выявление эпизоотически опасных животных.

Для неблагополучных и угрожаемых по бруцеллезу животных территорий в диагностических целях необходим комплекс методов, отражающих не только гуморальный механизм, но и клеточный (аллергическая проба), а также метод, использующий возможность выявления с помощью феномена иммунологической памяти (вторичный иммунный ответ) скрытого носительства возбудителя.

В данной категории хозяйств, на непривитых противобруцеллезными вакцинами животных, целесообразно применение диагностикумов не только из типичных, но и измененных форм бруцелл с целью более объективной оценки степени неблагополучия стад.

Учитывая широкое использование противобруцеллезных вакцин с различной антигенной характеристикой, в стадах иммунизированных животных применение сверхчувствительных методов диагностики нецелесообразно.

При выявлении эпизоотически опасных животных с помощью различных средств и методов серологической диагностики на фоне применения вакцин важно использовать механизм повышения титров гуморальных реакций - по мере развития инфекционного процесса, и их понижения - по мере удаления сроков после иммунизации.

С помощью антигенов из измененных бруцелл возможно изучать и оценивать гуморальные механизмы вакцинного процесса в динамике.

Для оценки характера инфекционного процесса по гуморальным показателям у животных необходимы диагностикумы, изготовленные из гомологичных по антигенной структуре возбудителей.

Ниже приводятся результаты практической реализации предложенной концептуальной схемы оптимизации диагностики болезней, вызываемых у животных бруцеллами.

2.2.2. Результаты разработки и усовершенствования средств и методов индикации, идентификации измененных форм бруцелл

2.2.2.1. Биологический метод диагностики бруцеллеза у животных, сенсибилизированных измененными формами бруцелл С целью отбора штамма бруцелл для производства R-бруцеллезной агглютинирующей сыворотки использовали двадцать один штамм В. abortus из коллекции штаммов бруцелл лаборатории ИЭВСиДВ, из которых пять вакцинных, один - референтный, остальные выделены от непривитого крупного рогатого скота из бруцеллезных очагов Западной Сибири.

Из всех музейных штаммов бруцелл наиболее стабильными и агглютинабельными свойствами обладал штамм В.abortus 16/4, о чем свидетельствовали многолетние пассажи его на питательных средах в опытах по иммунизации лабораторных и сельскохозяйственных животных. У других же штаммов бруцелл менялись агглютинабельные свойства: появлялась и исчезала агглютинабельность с S-сывороткой (штаммы В abortus 16-71, 18-71,

12-71, 9-71 и др.).

Изучение агглютинабельных свойств культур бруцелл показало, что культуры штаммов B.abortus 16/4,45-71 не вступали в реакцию с S-сывороткой, а культуры штаммов B.abortus 79-72, 106-71, 63-72 содержали S-компонент в минимальном количестве (титр 1:10-1:20).

Среди SR-форм бруцелл имеются штаммы с высоким содержанием R-компонента (штаммы 110-71, 213-71). Наилучшую агглютинабельность и специфичность проявил антиген из штамма B.abortus 16/4, с которым получены четкие позитивные результаты с R-сывороткой и отрицательные с S-сывороткой.

Результаты проверки антигенных свойств четырех штаммов бруцелл (16/4, 110-71, 16-71, 18-71) показали, что, несмотря на отнесение их по агглютинабельным свойствам к R-штаммам бруцелл перед введением кроликам, штаммы B.abortus 110-71, 16-71, 18-71 не являлись стабильными глубокими диссоциантами.

Наилучшими антигенными свойствами обладал штамм B.abortus 16/4, сыворотка крови кроликов, полученная на его введение, была высоко специфична и содержала R-агтлютинины в титре 1:800-1:1200, R-комплементсвязывающие антитела — в титре 1:320.

В двух опытах на 13 бычках испытали шесть схем гипериммунизации живой или убитой культурой B.abortus 16/4, которую вводили подкожно, внутривенно в дозах от 100 до 600 млрд м.к.

При этом в сыворотке крови почти всех животных уровень R-агтлютининов в пробирочной и пластинчатой РА оставался низким.

Опыт № 3 был поставлен на четырех волах двухлетнего возраста: двум животным ввели живую культуру штамма B.abortus 16/4 трехкратно, с семидневным интервалом, внутривенным способом, в общей дозе 1300 млрд м.к. (схема 7). Остальных иммунизировали аналогично схеме 7, но общая доза антигена составляла 300 млрд м.к. (схема 8).

У волов, гипериммунизированных по схеме 7 высокой дозой антигена, синтезировались в организме S-комплементсвязывающие антитела.

R-сыворотка волов, иммунизированных по схеме 8, обладала специфичностью, не содержала S-антител. В пластинчатой РА титр R-аггяютининов составлял от 1:20 до 1:70.

Проведенные испытания различных схем иммунизации крупного рогатого скота бруцеллами в R-форме показали, что этот вид животных обладает инертностью к выработке R-агтлютининов. Использование в качестве доноров волов-продуцентов не всегда гарантирует стабильное получение R-агглютинирующей сыворотки.

В этой связи испытали пять схем гипериммунизации 32-х кроликов культурой штамма B.abortus 16/4. Животным вводили живую или убитую культуру бруцелл различными способами с интервалом 3-7 дней; общая доза составляла от 30 до 90 млрд м.к.

При отработке схемы гипериммунизации кроликов мы ставили задачу получения R-бруцеллезной сыворотки с титром в пробирочной РА не ниже

1:320, в пластинчатой - не ниже 1:30.

R-бруцеллезную агглютинирующую сыворотку, отвечающую критериям стандартизации, получили от всех кроликов, иммунизированных по схеме № 5, т.е. при четырехкратном внутривенном введении живой культуры в дозе 90 млрд м.к.

Для индикации и дифференциации культур бруцелл была отобрана R-бруцеллезная сыворотка, полученная по схеме 5, с которой определено 37 культур В abortus, B.suis, B.melitensis, B.ovis, Bcanis. Из общего количества культур 24 выделены от непривитых животных в очагах бруцеллеза, остальные - референтные и вакцинные штаммы. S- и R-бруцеллезными сыворотками агглютинировалось 14 культур (37,8%), только S-сывороткой — 7 (18,9%), только R-сывороткой - 16 (43,2%), что доказывает необходимость использования R-бруцеллезной сыворотки в бактериологической диагностике бруцеллеза.

Всего с использованием R-бруцеллезной сыворотки была изучена антигенная структура у 164-х культур, идентифицированных как бруцеллезные. Кроме того, исследовали 20 культур возбудителей сальмонелл, кишечной палочки, листерий.

В РА пластинчатой культуры сальмонелл, кишечной палочки и листерий не агглютинировались R-бруцеллезной сывороткой.

Из общего количества изученных культур 66 были дифференцированы как типичные полевые, три — полевые диссоцианты, 89 - вакцинный штамм В abortus 82, шесть - вакцинный штамм B.abortus 19.

После получения положительных результатов государственного комиссионного испытания специфичности, активности и чувствительности R-бруцеллезной агглютинирующей сыворотки она была принята к внедрению в ветеринарную практику.

2.2.2.2. Биологическийметоддиагностики бруцеллезау животных, инфицированныхдиссоциированными формамибруцелл

В соответствии с Наставлением по диагностике бруцеллеза животных, положительный диагноз на бруцеллез ставят при выявлении в сыворотке крови морских свинок, инфицированных подозрительным материалом, S-бруцеллезных антител в концентрации 10 МЕ.

Биопроба с использованием только S-бруцеллезного антигена при исследовании морских свинок, инфицированных материалом, содержащим диссоциированные штаммы бруцелл, может стать причиной постановки неверного диагноза на бруцеллез.

Провели испытание R-бруцеллезного цветного антигена в РА для решения вопроса о целесообразности применения его при постановке биопробы с целью диагностики бруцеллеза у животных, сенсибилизированных диссоциированными формами бруцелл.

В первом опыте использовали 234 морских свинок, которых иммунизировали вакциной из штамма 82 в дозах от 10 м.к. до 1 млрд м.к.

S-бруцеллезные антитела диагностировали, в основном, у 76,8%

животных, иммунизированных максимальной дозой вакцины - 1 млрд м.к.

Наиболее чувствительным при выявлении R-антител у иммунизированных животных оказался R-бруцеллезный цветной антиген для РА, особенно при исследовании морских свинок, инфицированных дозами 1 млрд, 10 тыс., 1000 м.к. бруцелл: реагировало соответственно 97,2, 92,5 и 100,0% животных.

Наиболее демонстративно проявлялась высокая чувствительность R-антигена для РА при исследовании морских свинок, сенсибилизированных минимальными дозами (50 м.к.), когда при отрицательных результатах с единым антигеном у 42,4% животных диагностировали R-агтлютинирующие антитела. Даже у 5,0% животных, вакцинированных дозой 10 м.к., получен положительный результат с R-бруцеллезным антигеном в РА.

Результаты бактериологических исследований наглядно показывают специфичность нового диагностикума. Из общего количества животных-бруцеллоносителей (162) у 96,2% регистрировали R-антитела. S-антитела установлены лишь в 20,3% случаев. Таким образом, диагностическая эффективность R-антигена для РА при обнаружении морских свинок, сенсибилизированных вакциной из штамма 82, была выше в сравнении с единым антигеном для РА и РДСК в 4,8 раза.

Во втором опыте изучали возможность миграции штамма В abortus 82 на 80 морских свинках, из которых 20 были иммунизированы вакциной в дозе 1 млрд м.к., остальных не иммунизировали.

При исследовании морских свинок через 30 дней в РА с единым S-антигеном реагировало позитивно 15,0% сенсибилизированных животных, с R-бруцеллезным цветным антигеном - 100,0%.

В группе неиммунизированных морских свинок через 30 дней R-агглютинины установлены лишь у двух животных в разведении 1:12,5, у остальных результаты исследований оставались отрицательными.

Следующие два опыта были поставлены с целью выяснения диагностической ценности R-антигена при заражении морских свинок полевыми диссоциантами бруцелл, выделенными от непривитого крупного рогатого скота.

В третьем опыте 14 морских свинок инфицировали культурами четырех диссоциированных штаммов B.abortus в дозе 1 млрд м.к.

К 30-му дню R-агглютинины обнаружены в сыворотке крови 100,0% зараженных морских свинок. У них же было установлено бруцеллоносительство при проведении бактериологических исследований

Четвертый опыт поставили на 90 морских свинках, которых инфицировали культурой штамма B.abortus 54-70 (R-форма) в дозах от 1 млрд до 10 м.к.

Через 15 дней S-антитела в сыворотке крови с единым S-антигеном не регистрировали, тогда как R-агтлютинины обнаруживали у 91,1% животных, а на 30 день — у 95,3%. Бруцеллоносительство у реагирующих морских свинок подтверждено в 71,1% случаев.

2.2.2.3. Изучение антигенной структуры бруцелл с применением

S- и R-бруцеллезных диагностикумов

При изучении антигенной структуры бруцелл в практике используют качественное определение S- и R-компонентов в пластинчатой РА, но наиболее точное представление с ней дает количественное определение с помощью РА, РСК, РНИФ.

Изучение 20 серий вакцины из штамма 82 показало, что они содержали различное количественное соотношение S-, R-, RS-, SR-компонентов в антигенной структуре бруцелл.

В пробирочной РА регистрировали преимущественное содержание S-антител (титр 640 ME). R-агглютинины определяли в низкой концентрации.

Если у исходных культур бруцелл, выделенных от крупного рогатого скота, иммунизированного вакциной из штамма 82, в отдаленные сроки определяли в 84,6% случаев содержание SR-компонентов, то в результате 3-х пассажей на 122 морских свинках свойства культур изменялись в сторону накопления в антигенной структуре S-компонентов, которые удалось определить с помощью применения S- и R-диагностикумов.

В следующем опыте на 20 коровах, сенсибилизированных исходными культурами штамма В abortus 82, а также 3-х кратно пассажированными через морских свинок, установили, что R-комплементсвязывающие антитела обнаруживаются у всех животных, но показателем эпизоотической опасности положительно реагирующих коров в отдаленные сроки являются высокие титры S-антител в РА, РСК.

2.2.2.4. Диагностическая ценность непрямого и прямого методов

реакции иммунофлюоресценции (РНИФ и РИФ)

В нашей стране S-бруцеллезные люминесцирующие иммуноглобулины применяются в медицинской практике, но с их помощью невозможно провести индикацию диссоциированных форм бруцелл.

При изучении в РНИФ 35 штаммов бруцелл вида abortus (вакцинных и полевых) в сопоставлении с РА из исходных культур и другими методами индикации, убедились, что РНИФ с использованием S- и R-гипериммунных сывороток - чувствительный метод экспресс-диагностики при изучении антигенного состава культур и популяций отдельных колоний, более точно определяющей количественное соотношение S- и R-компонентов в структуре отдельных колоний. Тем не менее, его специфичность и чувствительность в значительной степени зависят от свойств бруцеллезных и антивидовых сывороток.

Учитывая эти недостатки РНИФ, разработали методику получения R-бруцеллезных люминесцирующих иммуноглобулинов для прямого метода РИФ.

Первоначально отработали на 50 кроликах и 16-и баранах схему получения высокоактивной R-бруцеллезной сыворотки (титр не ниже 1:2400)

Проверка специфичности R-бруцеллезных люминесцирующих иммуноглобулинов на 8-и культурах S-форм бруцелл разных видов и с

чужеродными антигенами показала полное отсутствие свечения.

В следующем опыте испытывали чувствительность R-бруцеллезных люминесцирующих иммуноглобулинов при изучении антигенных свойств культур бруцелл. Установлено, что все взятые в опыт культуры штаммов бруцелл в различной степени диссоциации при взаимодействии с R-бруцеллезными люминесцирующими иммуноглобулинами имели яркую люминесценцию с оценкой три или четыре креста.

При изучении антигенной структуры 53-х культур бруцелл разных видов 66,0% отнесены к R- или RS-формам бруцелл: микробные клетки светились при взаимодействии с S- и R-бруцеллезными люминесцирующими иммуноглобулинами.

С целью обнаружения бруцеллезных антигенов в тканях животных проведены опыты на 65 морских свинках, инфицированных S-формами бруцелл (В.abortus 54, 104М) и R-формами (B.abortus 54-70), а также на 12 коровах, зараженных полевыми диссоциантами (ВлЬсгШ 16-71,106-71).

При этом установлена специфичность и более высокая чувствительность R-бруцеллезных люминесцирующих иммуноглобулинов в сравнении с бактериологическим методом (в 3,1 раза выше в опыте на морских свинках и на 58,3-75,0% - в опыте на крупном рогатом скоте).

Таким образом, результаты проведенных исследований показали высокую чувствительность как прямого, так и непрямого методов РИФ при индикации диссоциированных форм бруцелл, изучении антигенной структуры. Более простым и удобным для исполнения является прямой метод РИФ. Разработанные R-бруцеллезные люминесцирующие иммуноглобулины обладают специфичностью, активностью и чувствительностью.

2.2.3. Результаты разработки R-бруцеллезных серологических диагностикумов

2.2.3.1. Диагностическая ценность R-бруцеллезного антигена для РСК

Нами разработан фенольный способ получения R-бруцеллезного антигена для РСК из штамма B.abortus 16/4.

При проверке специфичности диагностикума на непривитых 4 тыс. головах крупного рогатого скота ряда областей лишь в отдельных стадах регистрировали от 0,6 до 1,9% реагирующих животных.

При сенсибилизации 115 морских свинок диссоциированными культурами бруцелл, имеющими RS-антигенную структуру {B.abortus 82, 519, В-1, 110-71, 182а-71), в зависимости от ее трансформации in vivo отмечали различные сочетания в показателях с R-антигеном — от 65,0 до 100,0%. У животных, сенсибилизированных R-формами бруцелл (B.abortus 16/4, 16-71,

18-71, 106-71, 54-70), регистрировали, в основном, реакции только с R-антигеном в РСК.

Кроме того, было поставлено четыре опыта на 95-и телках, 25-и коровах и

19-и волах, которых иммунизировали вакцинами из штаммов B.abortus 19, 104М (S-форма - первая группа); 82, 519 (SR-форма - вторая группа) и 16/4 (R-

форма — третья группа).

Положительные результаты РА и РСК с единым антигеном регистрировали в 1, 2 группах у 12,0-100,0% животных, в третьей - 0%.

С помощью Я-антигена выявлено в первой группе 1,2-7,2% реагирующих, во второй - от 49,0 до 100,0%, в третьей - от 86,0 до 100,0%, т.е. установлена высокая чувствительность испытуемого препарата.

Испытание чувствительности Я-бруцеллезного антигена было продолжено при исследовании 12806 проб сыворотки крови непривитого крупного рогатого скота из неблагополучных по бруцеллезу хозяйств. При этом на стандартные диагностикумы реагировало от 6,0 до 39,0% животных. Дополнительно Я-антигеном выявлено от 12,0 до 23,0% реагирующих.

Диагностическая ценность Я-антигена подтверждена при убое пяти коров, реагировавших только на Я-антиген. Культуры В.аЬоИш в состоянии диссоциации выделили от трех животных, что показывает эпизоотическую опасность животных, реагирующих на Я-антиген, в естественных очагах бруцеллеза.

В дальнейших исследованиях изучали возможность использования Я-бруцеллезного антигена для РСК при исследовании крупного рогатого скота, иммунизированного вакциной из штамма 82.

При исследовании 5354 голов крупного рогатого скота из неблагополучных хозяйств Новосибирской, Омской, Иркутской областей в зависимости от эпизоотической обстановки с биофабричным антигеном в РА+РСК реагировало от 4,3 до 100,0%. С Я-антигеном процент реагирующих колебался от 0,7 до 78,6%. Процент совпадения позитивных показателей единого и Я-бруцеллезных антигенов составлял от 15,4 до 100,0%.

Испытание Я-бруцеллезного антигена проведено при исследовании 7876 проб сыворотки крови от привитого вакциной из штамма 82 крупного рогатого скота благополучных по бруцеллезу хозяйств. В этой категории хозяйств процент совпадений показателей единого 8- и Я-антигенов был значительно выше - от 82,5 до 100,0%. Из общего количества реагировавших в РА и РСК с единым антигеном, с Я-антигеном получен позитивный результат у 96,3% животных.

Таким образом, в неблагополучных по бруцеллезу хозяйствах животных, реагирующих в РА и РСК с единым 8-антигеном и не имеющих в сыворотках крови Я-антител, можно дифференцировать как больных бруцеллезом.

Заключая результаты испытания Я-бруцеллезного антигена для РСК следует отметить, что препарат имеет широкий спектр применения. С его помощью возможно выявлять животных, зараженных полевыми диссоциантами и толерантных при использовании вакцин из измененных штаммов бруцелл, контролировать реактогенность вакцин из измененных штаммов бруцелл (инагглютинабельных, инагглютиногенных, слабоагглютиногенных - как живых, так и инактивированных), определять реактивность животных, привитых вышеназванными вакцинами, оценивать стабильность биологических свойств производственных, референтных и вакцинных штаммов, изучать патогенез бруцеллеза.

2.2.3.2. R-бруцеллезные диагностиками для РА и РНГА

Разработан способ получения R-бруцеллезного цветного антигена, заключающийся в окрашивании бактериальной взвеси штамма B.abortus 16/4 красителем бенгальским розовым и ее суспендировании в фосфатном буферном растворе рН-8,7-9,0 (авторское свидетельство № 955572 от 04.05.1982 г.).

R-бруцеллезный диагностикум сконструировали путем сенсибилизации формализированных эритроцитов барана R-бруцеллезным антигеном, который представлял липополисахаридный комплекс, извлеченный из штамма B.adortus 16/4 фенольным способом по разработанной нами методике.

Чувствительность диагностикумов испытана в трех экспериментах на 49 головах крупного рогатого скота, сенсибилизированного полевыми диссоциантами (R-формы), вакцинными штаммами 82 и 16/4 (RS-, R-формы) и S-формами бруцелл (В abortus 544).

Перед введением культур бруцелл у опытных животных во всех тестах, в том числе и испытуемых, были получены отрицательные результаты исследований. В группах животных, инфицированных диссоциированными формами бруцелл, на 14-28 дни реагировало в РНГА от 50,0 до 90,0% животных, но наиболее высокие титры РНГА регистрировали к 90-120 дням исследований (83,3-100,0% реагирующих). R-агглютинины диагностировали у большинства животных этих групп в низком титре (1:50-1:100).

В сыворотках крови крупного рогатого скота, инфицированного S-формами бруцелл, у отдельных животных, наряду с содержанием S-антител, регистрировали R-агглютинины и гемагтлютинины, но в низком титре (1:50).

Обобщая результаты опытов, можно отметить следующее: при заражении крупного рогатого скота диссоциированными штаммами бруцелл в их организме синтезируются R-агтлютинирующие, R-гемагглютинирующие, R-комплементсвязывающие антитела, которые возможно установить часто только с помощью R-диагностикумов. В отдельных опытах только с их помощью удавалось диагностировать животных--бруцеллоносителей, о чем свидетельствовали данные бактериологического исследования.

Не установлено общих закономерностей в динамике биосинтеза R-антител. Чувствительность диагностикумов в значительной степени зависела, по нашему мнению, от степени антигенного раздражения (дозы инфекта, кратности) и в значительной степени от биологической характеристики штамма (антигенности, вирулентности).

При испытании РА и РНГА с R-диагностикумами в двух естественных очагах бруцеллеза при исследовании 392-х коров с единым антигеном в РА и РСК реагировало 3,5% животных. R-агглютинины выявлены в низкой концентрации у 0,6% коров, а R-гемагглютинины - у 6,5% животных.

2.2.4. Результаты разработки, совершенствования и изучения эффективности S-бруцеллезных диагностикумов

2.2.4.1. Реакция непрямой гемагглютинации с сывороткой крови для диагностики бруцеллеза у коров, инфицированных S-формами бруцелл

Учитывая многочисленные сообщения исследователей о высокой диагностической эффективности и специфичности РНГА при бруцеллезе различных видов животных, испытали первоначально специфичность и чувствительность РНГА с медицинским коммерческим эритроцитарным диагностикумом (Украина).

В 4-х экспериментах при искусственном заражении 23 коров вирулентной культурой бруцелл установили способность теста диагностировать инфицированных животных уже в ранние сроки после заражения. Дополнительно к официальным методам выявляли от 20,0 до 60,0% реагирующих в РНГА. Следует отметить и стабильность показателей РНГА, которые особенно наглядно проявились в опыте № 4 на протяжении 771 дня.

Данные бактериологического исследования патологического материала от зараженных животных дают основание . сделать заключение об эпизоотической опасности коров, в сыворотке крови которых обнаруживали гемагглютинины, т.к. все они оказались бруцеллоносителями.

Высокая диагностическая ценность РНГА установлена при исследовании 1626 коров из 10-и естественных очагов бруцеллеза в Армении. Определена высокая степень совпадения позитивных показателей РНГА и комплекса РА+РСК+РБП (от 87,9 до 100,0%), дополнительно выявлено значительное количество реагирующих (до 19,2%).

С целью выяснения вопроса о возможности дифференциации больных бруцеллезом от привитых вакциной из штамма 82 изучили количественное соотношение поствакцинальных гемагглютининов в сыворотке крови животных в благополучных и неблагополучных по бруцеллезу хозяйствах.

В благополучных хозяйствах гемагглютинины в титре 1:200 обнаруживали у незначительной части животных (0,4-2,5%).

Во всех неблагополучных по бруцеллезу пунктах диагностировали реагирующих в титре 1:400 и выше.

Установленное различие в количественном содержании гемагглютининов в сыворотке крови животных благополучных и неблагополучных по бруцеллезу хозяйств позволило определить критерии индивидуальной эпизоотической оценки животных на бруцеллез по показателям РНГА.

На основании результатов проверки специфичности, активности и чувствительности этого теста в ВГНКИ и производственных условиях, метод был принят к внедрению в ветеринарную практику.

В связи с распадом Советского Союза возникла необходимость создания отечественного эритроцитарного диагностикума для РНГА.

Нами совместно с ВГНКИ, ДагНИВИ разработана эффективная технология изготовления эритроцитарного бруцеллезного антигена на основе извлечения сенситина из вакцинного штамма В.abortus 19 химическим

способом с использованием додецилсульфата натрия.

На 48 тыс. проб сыворотки крови непривитого крупного рогатого скота доказана специфичность антигена. При обследовании свыше 60 тыс. голов крупного рогатого скота, иммунизированного вакциной из штамма 82, из благополучных по бруцеллезу хозяйств установили, что гемагглютинины в титре 1:200 регистрируются в сыворотке крови у низкого процента реагирующих (0,01%).

При исследовании 6390 животных, привитых вакциной из штамма 82, из неблагополучных по бруцеллезу хозяйств, высокие титры РИГА (1:400 и выше) регистрировали у 69,3% от общего количества реагирующих в РИГА.

Важно отметить, что в 91,0% случаев диагностировали позитивные показатели РЫТА в высоком титре у животных, имевших серопозитивные показатели РА и РСК, характерные для больных животных.

У животных, в сыворотке крови которых обнаружены гемагглютичины, в 71,4% случаев подтверждено бруцеллоносительство.

Таким образом, полученные нами материалы испытания РИГА убедительно доказывают целесообразность внедрения этого метода для исследования непривитых противобруцеллезными вакцинами животных, а также для дифференциации больных бруцеллезом от здоровых, иммунизированных слабоагглютиногенными противобруцеллезными вакцинами.

2.2.4.2. РА, РСК и РНГА в целях дифференциальной диагностики бруцеллеза у крупного рогатого скота, реиммунизированного вакциной из штамма 82

В результате изучения реактогенных свойств вакцины из штамма 82 на поголовье 21036 животных в благополучных хозяйствах установлено, что 8-комплементсвязывающие антитела обнаруживаются у привитых животных в большинстве случаев в невысоких титрах (1:5-1:10), а 8-агглютинины - в титре 50-100 МЕ.

В неблагополучных по бруцеллезу стадах при исследовании свыше 15 тыс. иммунизированных животных установили, что уже через два месяца после вакцинации возможно дифференцировать больных животных от здоровых по количественному соотношению 8-агглютинирующих и 8-комплемент связывающих антител в структуре серологических реакций.

При этом разработаны критерии эпизоотической оценки животных для неблагополучных хозяйств: реагирующих в титре РА 200МЕ и выше, РСК — в титре 1:20 и выше, РНГА в титре 1:200 и выше необходимо считать больными бруцеллезом.

2.2.4.3. Кольцеваяреакция с молоком для диагностики бруцеллеза у коров, привитых вакциной из штамма 82

Установили специфичность теста при исследовании 2554-х проб молока от непривитых коров из благополучных по бруцеллезу хозяйств. Вместе с тем, при обследовании 220 коров, имеющих маститы, и в этой связи нехарактерную КР с молоком, усовершенствовали методику постановки и учета реакции. В

результате появилась возможность не проводить диагностику скрытых форм мастита, что затрудняло ранее применение КР с молоком в ветеринарной практике.

При обследовании 13142-х животных, реиммунизированных вакциной из штамма 82, установили существенное различие в количественных показателях КР с молоком: в благополучных по бруцеллезу пунктах агглютинины в цельном молоке или титре 1:2 содержались у 0,5-1,4% животных, а в титре 1-4 - у 0,02% коров, в неблагополучных стадах реагировало до 51,1% коров.

Вместе с тем, при исследовании непривитых коров бруцеллезных изоляторов, а также животных неблагополучных хозяйств отмечали более низкую диагностическую значимость КР с молоком в сравнении с серологическими методами: РА и РСК.

Проведенные исследования позволили рекомендовать КР с молоком в следующих случаях:

- для контроля благополучия стад крупного рогатого скота, привитого вакциной из штамма 82;

- для эпизоотической оценки стад, в которых у отдельных коров в отдаленные сроки после прививки появляются положительные РА и РСК;

- для диагностики бруцеллеза в оздоравливаемых стадах;

для исследования коров, иммунизированных вакциной из штамма 82, на заключительном этапе оздоровления.

При изучении КР с молоком особый интерес представляли данные бактериологического исследования материала от убитых коров с различным сочетанием иммунологических реакций. Из восьми коров-бруцеллоносителей у пяти (62,5%) отсутствовали РА и РСК, что свидетельствует о высокой диагностической ценности КР с молоком.

Таким образом, КР с молоком является специфичной и чувствительной реакцией, способной выявлять больных бруцеллезом среди коров, иммунизированных вакциной из штамма 82, в ранние и отдаленные сроки после прививки.

2.2.4.4. Реакция непрямой гемагглютинации с молоком для диагностики бруцеллеза у коров

В трех экспериментах на 19-ти коровах, искусственно инфицированных возбудителем В abortus, установили высокую чувствительность РНГА с молоком. Гемагглютинины появлялись, как и агглютинины в молоке, в острой стадии развития инфекции и стабильно диагностировались в хронической стадии заболевания на протяжении 760 дней.

Ценные данные получены при изучении чувствительности РНГА при исследовании 756 коров из естественных очагов бруцеллеза в Армении, где была установлена более высокая чувствительность РНГА с молоком в сравнении с КР (от 1,6 до 11,1 раза). В отдельных хозяйствах чувствительность РНГА с молоком была выше по отношению к показателям единого антигена РА, РСК.

В производственных условиях нами доказана эпизоотическая опасность

животных, реагирующих в РИГА: РЫТА с молоком была положительной у 100,0% коров-бруцеллоносителей; из них у 20,0% определяли только гемагглютинины в молоке.

Впервые нами установлена возможность использования РНГА с молоком для диагностики бруцеллеза у коров, привитых вакциной из штамма 82, причем этот тест возможно применять через месяц и последующие сроки после ревакцинации. При исследовании 21118-и коров этой категории хозяйств лишь у единичных животных определяли гемагглютинины в титре 1:50 -1:100.

Отличительной особенностью проявления РНГА у коров в неблагополучных хозяйствах были высокие титры гемагглютининов молока (1:200-1:400). Общее количество таких животных составляло 8,0% от числа обследованных животных (10518).

Чувствительность РНГА с молоком была выше, чем КР с молоком (соответственно 13,3 и 9,4% реагирующих).

Полученные результаты позволили рекомендовать её применение в следующих случаях:

- для контроля благополучия стад крупного рогатого скота по бруцеллезу через месяц и последующие сроки после иммунизации коров вакциной из штамма 82 (диагностический титр 1:100 и выше);

- при оздоровлении неблагополучных стад крупного рогатого скота на бруцеллез через месяц и последующие сроки после ревакцинации (диагностический титр 1:50 и выше).

2.2.5. Противоэпизоотическая эффективность системы дифференциальной диагностики бруцеллеза крупного рогатого скота, привитого вакциной из штамма 82

Полученные данные по апробации различных средств и методов диагностики бруцеллеза, вызванного типичными 8-формами бруцелл на непривитых, а также иммунизированных вакциной из штамма 82 животных, позволили разработать схему дифференциальной диагностики бруцеллеза у крупного рогатого скота.

В неблагополучных по бруцеллезу хозяйствах необходимо проводить исследования привитых животных в РА и РСК с единым антигеном через два месяца после ревакцинации слабоагглютиногенными вакцинами, при этом реагирующих позитивно в титре РА 200 МЕ и выше, РСК - в титре 1:20 и выше, РНГА - титре 1:200 и выше, а также животных, не имеющих в сыворотке крови Я-антител к Я-бруцеллезному антигену для РСК, следует изолировать и сдавать на убой.

Внедрение системы дифференциальной диагностики проводили в Республике Казахстан, где в четырех неблагополучных по бруцеллезу хозяйствах с различной эпизоотической обстановкой (4,0-14,4% больных животных), заболеваемость бруцеллезом снижена до 0,1-0,7%.

Дальнейшее внедрение системы дифференциальной диагностики продолжили в семи хозяйствах, на 18-ти неблагополучных по бруцеллезу

фермах в Омской области.

Необходимо особо отметить, что на отдельных фермах хозяйств сложилась тяжелая эпизоотическая обстановка: заболеваемость коров бруцеллезом составляла 18,6-32,6%.

Примененные средства и методы дифференциальной диагностики бруцеллеза через 1-2 месяца и в последующие сроки после ревакцинации позволили купировать бруцеллезную инфекцию в относительно короткие сроки (5-12 месяцев), оздоровить 15 неблагополучных ферм и значительно снизить заболеваемость крупного рогатого скота на трех фермах.

Важно отметить, что в результате дифференциации больного скота от здорового, реагировавшего на вакцину из штамма 82, в стадах сохранено за период оздоровления для дальнейшего использования 755 здоровых коров с поствакцинальными реакциями.

Таким образом, представленные материалы убедительно показывают целесообразность широкого внедрения разработанной системы дифференциальной диагностики бруцеллеза крупного рогатого скота в неблагополучных и благополучных по бруцеллезу хозяйствах.

2.2.6. Результаты разработки и изучения эффективности средств и методов диагностики ИЭ баранов

2.2.6.1. Овисный антиген для реакции агглютинации

Сконструировали цветной овисный антиген из штамма B.ovis 6, специфичность которого установлена в РА при исследовании 1483-х проб сывороток крови баранов и овцематок из благополучных по ИЭ баранов хозяйств.

В шести экспериментах на 130-и баранах-производителях, инфицированных культурами разных штаммов B.ovis, установили, что агглютинины появляются рано: на 3-й день реагируют 30,7-38,4% животных, на 7, 14 и 28 дни — до 100,0%. Уровень агглютининов в сыворотке крови зараженных баранов оставался высоким до 90 дней (92,3-100,0% реагирующих).

При изучении динамики иммунного ответа у инфицированных B.ovis баранов на протяжении 1396 дней (опыт №6) наблюдали подъемы уровня агглютининов и их снижение в течение всего срока исследований, вплоть до выпадения реакций в отдельные сроки.

Сравнение чувствительности овисного антигена РА и РСК с диагностикумом ВНИИБТЖ в этом эксперименте показало способность РА дополнительно выявлять к показаниям РСК до 11,1% реагирующих животных.

Достоверность показаний нового диагностикума для РА подтверждена при убое 97 баранов. Из числа бруцеллоносителей в сыворотке крови 29,3% животных обнаруживали только агглютинирующие антитела с помощью нового диагностикума.

Производственные испытания овисного антигена для РА показали его высокую диагностическую ценность, так как применение препарата позволило

выявить дополнительно по отношению к РСК с овисным антигеном до 5,3% реагирующих.

Эпизоотическая опасность животных, реагировавших в РА с овисным антигеном, доказана при убое 11 баранов-производителей с клиническими признаками заболевания. Из них 50,0% баранов-бруцеллоносителей имели позитивные результаты только в РА с овисным антигеном.

Таким образом, РА с цветным овисным антигеном является специфичным и чувствительным методом диагностики ИЭ баранов, который необходимо использовать при проведении мониторинга при данном заболевании, а также оздоровлении неблагополучных хозяйств.

2.2.6.2. Овисный антиген дляреакции связывания комплемента

К началу наших исследований применялась РДСК с овисным антигеном, разработанным П.А. Триленко на основе криолиза. Диагностикум, по мнению многих исследователей, обладал недостаточной чувствительностью.

Нами сконструирован антиген на основе фенольной экстракции активных биополимеров из стабильного штамма B.ovis 6, адаптированного к росту в аэробных условиях.

При апробации антигена для РСК в производственных условиях установлена его специфичность при исследовании свыше 11 тыс. мелкого рогатого скота различных половозрастных групп.

В шести опытах на 156-и инфицированных B.ovis баранах и овцематках, несмотря на различные заражающие штаммы, дозы, пол животных, антиген из штамма B.ovis 6 имел значительно более высокую чувствительность не только в сравнении с биофабричным диагностикумом, но и более активным антигеном КазНИВИ-ВГНКИ, изготовленным на основе дезинтеграции микробных клеток ультразвуком.

В отдельных опытах чувствительность фенольного антигена была выше в сравнении с биофабричным в 3,1 раза, с антигеном КазНИВИ-ВГНКИ - в 2 раза.

При испытании диагностикума в производственных условиях в неблагополучных хозяйствах по ИЭ баранов установили, что антиген из штамма B.ovis 6 позволял выявить в 4,6 раза больше реагирующих, чем биофабричный овисный антиген.

Сравнительное испытание диагностической эффективности овисных антигенов ВНИИБТЖ и КазНИВИ-ВГНКИ при исследовании 3790 животных из неблагополучных хозяйств показало, что при полном совпадении позитивных показателей диагностикумов с помощью овисного антигена ВНИИБТЖ выявлено дополнительно 4,8% реагирующих.

Высокая диагностическая ценность овисного антигена из штамма B.ovis 6 подтверждена в совместных исследованиях с болгарскими учеными.

При исследовании 935 баранов 12-и неблагополучных пунктов установлена почти равнозначная чувствительность антигенов ВНИИБТЖ и болгарского, изготовленных различными химическими способами.

Эпизоотическая опасность баранов, реагировавших с овисным антигеном

ВНИИБТЖ, подтверждена при диагностических убоях 71 баранг-производителя. Бруцеллоносительство установлено в 34 случаях (47,0%).

2.2.6.3. Сравнительное испытание чувствительностиразличных диагностических тестов при ИЭ баранов

Возможность использования других серологических тестов для выявления антител к В ovis: РНГА с антигеном ВИЭВ-ВГНКИ, РНИФ, РП изучали в двух экспериментах на 32-х баранах, инфицированных В ovis, и производственных условиях.

В опытах на баранах наиболее высокой чувствительностью обладала РНИФ. с 7-го по 120 дни после заражения выявлено 90,0-100,0% реагирующих Диагностическая ценность РНГА в ранние сроки после инфицирования была ниже в сравнении с РА, РСК с овисными антигенами ВНИИБТЖ и РНИФ. В отдаленные сроки исследований (60-120 дни) преобладали позитивные показатели РСК и РНИФ, Тем не менее, РНГА позволяла диагностировать больных животных на протяжении опытов.

В РП позитивные результаты регистрировали у инфицированных баранов в ранние сроки исследований (3-7 дни). В отдаленные сроки (60-90 дни) результаты теста были негативными.

При сравнительном испытании чувствительности РА, РСК-РДСК, РНГА в производственных условиях при исследовании сыворотки крови от 1180 баранов-производителей установили, что наиболее высокую диагностическую ценность имеет РСК с овискым антигеном ВНИИБТЖ из штамма В ovis 6, на втором месте по чувствительности - РА с овисным антигеном, далее - РНГА. Как и в экспериментальных условиях, низкую диагностическую ценность имела РП: ее показания отставали от клинического метода диагностики. Сравнительные испытания диагностической ценности разных тестов при ИЭ баранов показали, что наиболее оптимальным набором при оздоровлении неблагополучных хозяйств являются РСК, РА и РНГА.

В благополучных по ИЭ баранов хозяйствах с целью оптимизации диагностики достаточно применять наиболее простой тест - РА.

2.2.6.4. РИФ с R-бруцеллезнымилюминесцирующими иммуноглобулинами для прижизненной диагностики ИЭ баранов

В двух опытах на 36 баранах, искусственно инфицированных В ovis, установлена более высокая чувствительность РИФ с использованием Я-бруцеллезных люминесцирующих иммуноглобулинов в сравнении с бактериологическим методом диагностики: через 30 дней после заражения возбудитель с помощью РИФ обнаружен в сперме 88,8% баранов, бруцеллоносительство бактериологическим методом установлено в 37,5% случаев. Корреляция между положительными находками в РИФ при исследовании спермы и позитивными серологическими результатами отмечена в 100,0% случаев.

Особую ценность имеет РИФ при исследовании спермы в отдаленные сроки после инфицирования животных (1421 день), когда у 81,8% баранов

обнаруживали возбудителя B.ovis в сперме при угасании серологических реакций у 56,0%.

В производственных условиях при исследовании спермы от баранов из неблагополучного хозяйства в целях прижизненной диагностики подтверждена высокая чувствительность метода.

2.2.6.5. Разработкаметода диагностики ИЭ баранов с использованием реакции иммунитета - иммунологической памяти

В экспериментальных условиях на 24-х баранах, инфицированных B.ovis, установлена способность бруцеллоовина КазНИВИ-ВГНКИ-ИЭВСиДВ-ВНИИТиБП вызывать вторичный иммунный ответ у больных с угасшими иммунологическими реакциями в отдаленные сроки после заражения (600-1085 дни).

Чувствительность метода зависала от времени, прошедшего с момента первичного антигенного воздействия: через 600 дней после заражения и введения бруцеллоовина с применением РСК диагностировано на 21-28 дни 100,0-95,8% больных, через 1085 дней -только 36,8 и 10,5%.

В условиях другого эксперимента на 25-и баранах, инфицированных B.ovis, установлена способность бруцеллина ВИЭВ и вакцины из штамма Rev-1 вызывать провокацию комплементсвязывающих антител. Средний титр по группе зараженных животных после провокации бруцеллином ВИЭВ повышался в 4,8-6,3 раза, у отдельных животных — до 16 раз. Эффект провокации комплементсвязывающих антител у зараженных баранов достигался при подкожном и пальпебральном введении вакцины Rev-1 в общепринятой дозе. Так, пальпебральное введение вакцины из штамма Rev-1 «спровоцировало» выявление комплементсвязывающих антител с 14-го по 28 дни исследований у 80,0-100,0% инфицированных баранов.

В экспериментальных и производственных условиях бруцеллоносительство подтверждено у баранов, выявленных с помощью аллергенов и вакцины из штамма Rev-1, в 33,3-60,0% случаев, что доказывает их эпизоотическую опасность.

2.2.7. Разработка диагностики бруцеллеза собак, вызываемого B.canis

2.2.7.1. Биологические свойства культур B.canis, выделенных на территории Западной Сибири

С помощью разработанных во ВНИИБТЖ диагностикумов для РА и РСК, изготовленных из бруцелл вида canis и R-формы В.abortus, у восьми собак разных пород г. Омска, имевших характерные клинические признаки, был поставлен диагноз на бруцеллез и выделены гемокультуры бактерий. Все культуры по культурально-морфологическим, метаболическим и агглютинабельным свойствам отнесены к B.canis, по отношению роста на средах с анилиновыми красителями и антибиотиками - ко второму подвиду B.canis МЕХ-51.

Основные биологические свойства изолированных культур B.canis не

отличались от референтного штамма B.canis RM 6/66. В этой связи для изготовления диагностикумов использовали штамм B.canis RM 6/66, обладающий стабильными биологическими свойствами.

2.2.7.2. Испытание диагностической эффективности РА и РСКпри бруцеллезе собак

Для диагностики бруцеллеза в РА пластинчатой, пробирочной были изготовлены антигены, окрашенные красителем бенгальской розовой из штаммов B.canis RM 6/66 и В abortus 16/4 (R-форма).

Комплементсвязывающие антитела в сыворотке крови животных определяли с помощью антигенов, извлеченных фенольным методом из тех же штаммов бруцелл.

Проверка специфичности опытных диагностикумов при обследовании 380 условно здоровых собак показала, что во всех случаях в пробирочной РА в разведении сыворотки крови 1:100, а в РСК - 1:5 получены отрицательные результаты исследований.

В результате исследования 112 здоровых морских свинок с испытуемыми антигенами установили, что диагностическим титром РА у этого вида животных можно считать позитивный результат в разведении сыворотки крови 1:10 и выше, в РСК — 1:5 и выше.

При изучении чувствительности антигенов в опыте на 42-х морских свинках, инфицированных B.canis, определили, что даже при введении минимальной дозы бруцелл (100 м.к.) с помощью опытных антигенов в РА и РСК можно диагностировать 66,6-33,3% реагирующих животных, а при инъекции более высоких доз (от 1 тыс. м.к. до 1 млрд м.к.) — от 80,0 до 100,0%.

Бактериологическое подтверждение бруцеллоносительства при инфицировании морских свинок высокими дозами возбудителя B.canis (100 тыс. м.к. и выше) получено в 60,0-100,0% случаев.

В опыте на восьми беспородных собаках, зараженных эпизоотическим штаммом B.canis 2/99 в дозе 500 тыс. м.к., установлена высокая чувствительность изготовленных диагностикумов, т.к. с их помощью агглютинирующие и комплементсвязывающие антитела к B.canis обнаруживали в сыворотке крови с 7-го по 154-й дни исследований у всех животных (срок наблюдения).

Эпизоотическая опасность животных, реагировавших с испытуемыми антигенами, подтверждена прижизненным выделением гемокультуры заражающего штамма от 100,0% инфицированных собак во все сроки исследований.

Результаты серологических исследований морских свинок и собак, экспериментально зараженных B.canis показывают, что возбудитель B.canis имеет выраженное антигенное родство к возбудителю B.abortus в R-форме, т.к. с помощью R-антигенов для РА и РСК, изготовленных из стабильного штамма B.abortus, удается выявить всех инфицированных B.canis морских свинок и собак.

2.2.7.3. Диагностическая ценность диагностикумов для РА, РСК при бруцеллезе собак в полевыхусловиях

Испытание изготовленных нами диагностикумов в полевых условиях показало их диагностическую эффективность, причем чувствительность не зависела от вида бруцелл, из которых были приготовлены антигены.

При этом больными бруцеллезом были признаны 19 собак, которые реагировали с испытуемыми антигенами в РА, РСК и имели клинические признаки, характерные для бруцеллезной инфекции: артриты, орхиты, аборты, рождение нежизненоспособного потомства и др.

Из числа больных бруцеллезом собак у 68,4% титр агглютинирующих антител к антигенам B.abortus (Я-форма) и B.canis был одинаковым.

Девять собак считали сомнительно реагирующими, т.к. у них отсутствовали клинические признаки или реагировали в одном тесте и низком титре. Результаты исследования городских собак с единым антигеном в РА, РСК были отрицательными.

Необходимо отметить, что из общего количества больных собак прижизненно бруцеллоносительство с выделением гемокультур установлено у 42,1% животных.

Положительные результаты биопробы на морских свинках были получены от восьми собак, от которых выделяли гемокультуры B.canis.

Таким образом, испытания изготовленных нами диагностикумов для РА и РСК показали, что они специфичны и обладают достаточной чувствительностью при бруцеллезе собак, вызываемом В.сатх.

2.2.7.4. Разработкаэритроцитарного канисного антиген

На следующем этапе провели изыскания в направлении создания эритроцитарного канисного диагностикума.

Применяя химический (2% р-р додецилсульфата натрия) и сочетанный (2% р-р додецилсульфата натрия + воздействия ультразвуком) способы дезинтеграции бактериальной взвеси В.сатх, получили эритроцитарные канисные диагностикумы, которые при проверке на здоровых 86-и морских свинках и 369-и собаках показали специфичность.

В экспериментах на 24-х морских свинках и восьми собаках, инфицированных эпизоотическим штаммом B.canis, установили высокую чувствительность обоих испытуемых эритроцитарных канисных антигенов, с помощью которых во все сроки исследований у 100,0% животных наряду с агглютининами и комплементсвязывающими антителами выявили гемагглютинины.

Вместе с тем, опытные эритроцитарные канисные диагностикумы имели разную активность, т.к. уровень гемагглютинирующих антител в среднем титре по группе инфицированных B.canis морских свинок и собак в отдельные сроки исследований был выше с антигеном, полученным с помощью 2% раствора додецилсульфата натрия,

Эпизоотическая опасность собак, реагировавших с эритроцитарными канисными диагностикумами, доказана путем выделения гемокультуры

заражающего штамма от 100,0% животных во все сроки исследований.

Таким образом, способ дезинтеграции бруцелл вида саше с применением 2% раствора додецилсульфата натрия является эффективным, позволяет получить специфичный, высокоактивный и чувствительный эритроцитарный канисный диагностикум.

2.2.7.5. Диагностическая ценностьреакции иммунофлуоресценции при бруцеллезе собак

Испытание диагностической эффективности РИФ с Я-бруцеллезным люминесцирующими иммуноглобулинами проводили в сравнении с бактериологическим методом при исследовании крови, внутренних органов, лимфатических узлов морских свинок и собак, инфицированных эпизоотическими штаммами В. canis.

В опыте на морских свинках, инфицированных разными дозами В.canis (100, 1000, 100 тыс., 1 млн., 1 млрд м.к.) чувствительность РИФ, как и бактериологического метода, зависила от величины инфицирующей дозы и сроков исследований животных.

При заражении 42-х морских свинок В.canis в дозе 1000 м.к. удалось обнаружить антиген обоими методами у 20,0% животных.

Возбудителя бруцеллеза в крови с помощью РИФ регистрировали только через 30 дней после инфицирования дозами 100 тыс. и 1 млн. м.к. у 60,0% морских свинок, 1 млрд м.к. - у 100,0 % животных.

При заражении животных высокими дозами B.canis (1 млн., 1 млрд м.к.) диагностическая эффективность РИФ и бактериологического метода была одинаковой, возбудителя обнаруживали у 60,0-100,0% морских свинок.

В опыте на собаках, инфицированных эпизоотическим штаммом B.canis 2/99, установили, что с 7-го по 70-й дни после заражения чувствительность РИФ и бактериологического метода (выделение гемокультуры) была высокой и составляла 100,0%.

Диагностическая эффективность РИФ при исследовании крови с 84-го по 154-й дни снизилась, т.к. бруцеллоносительство устанавливали у 75,0% зараженных животных, тогда как гемокулътуры выделяли от 100,0% собак.

При сопоставлении чувствительности бактериологического метода и РИФ при обнаружении возбудителя в тканях животных после убоя регистрировали более высокую диагностическую значимость последнего метода (соответственно 15,2-21,2%), тем не менее обоими методами удалось обнаружить B.canis у всех инфицированных собак.

Таким образом, реакция иммунофлюоресценции позволяет прижизненно диагностировать возбудителя B.canis в кровяном русле инфицированных животных.

Высокую диагностическую ценность при бруцеллезе собак, вызываемом B.canis, имеет бактериологический метод выделения гемокультур, с помощью которого доказана эпизоотическая опасность животных, имеющих положительные результаты РИФ.

3. Выводы

1. Основой предложенной концепции оптимизации диагностики болезней, вызываемых у животных бруцеллами, является необходимость использования комплекса простых, специфичных, чувствительных средств и методов, позволяющих максимально выявлять явных и скрытых бруцеллоносителей и объективно оценивать характер инфекционных и вакцинных процессов на всех стадиях, с учетом изменчивости бруцелл.

Практическая реализация этой концепции позволила обеспечить повышение уровня эффективности проводимых противобруцеллезных и противоэпидидимитных мероприятий, а также открыла перспективы для их дальнейшего совершенствования.

2. Разработанная R-бруцеллезная агглютинирующая сыворотка обладает специфичностью и чувствительностью, позволяет проводить индикацию диссоциированных форм бруцелл, идентифицировать виды Вovis, Beams, определять стабильность вакцинных, референтных, производственных S-штаммов бруцелл.

3. Разработанный R-бруцеллезный цветной антиген для реакции агглютинации специфичен и высокочувствителен: выявляет от 42,4 до 100% морских свинок, сенсибилизированных диссоциированными формами бруцелл, при этом в 71,1-100% случаев у реагирующих животных подтверждено бруцеллоносительство.

Диагностикум позволяет при постановке биологической пробы обнаруживать возбудителя бруцеллеза в различной стадии диссоциации, а также В ovis, изучать антигенную структуру бруцелл, пато- и иммуногенез при взаимодействии микроба с макроорганизмом.

4. R-бруцеллезные люминесцирующие иммуноглобулины позволяют проводить индикацию диссоциированных форм бруцелл в бактериальных культурах, биологических объектах, идентифицировать виды E.ovis, В canis.

В опытах на морских свинках и крупном рогатом скоте, инфицированных полевыми диссоциантами бруцелл, установлена более высокая чувствительность реакции иммунофлуоресценции в сравнении с бактериологическим методом диагностики.

При бруцеллезе собак РИФ с R-бруцеллезными люминесцирующими иммуноглобулинами позволяет прижизненно регистрировать возбудителя заболевания в крови у 75-100% зараженных животных. Позитивные результаты РИФ с кровью подтверждены в 100% случаев выделением гемокультур.

5. R-бруцеллезный эритроцитарный диагностикум для реакции непрямой гемагтлютинации, сконструированный на основе сенсибилизации эритроцитов антигеном из штамма В. abortus 16/4, извлеченным химическим способом, обладает специфичностью, чувствительностью и позволяет в экспериментальных условиях диагностировать от 66 до 100% голов крупного рогатого скота, сенсибилизированного диссоциированными формами возбудителя бруцеллеза.

В естественных очагах бруцеллеза с помощью нового антигена выявлено дополнительно к показаниям официальных методов диагностики 5,1% реагирующих животных.

6. Разработана технология изготовления R-бруцеллезного антигена для реакции связывания комплемента. Установлена специфичность и высокая диагностическая ценность диагностикума в экспериментальных и производственных условиях, способность выявлять животных, вакцинированных или зараженных диссоциированными формами бруцелл. R-бруцеллезный антиген позволяет дифференцировать больных бруцеллезом животных от здоровых, иммунизированных штаммом B. abortus 82, в благополучных и неблагополучных по бруцеллезу хозяйствах в комплексе с другими средствами дифференциальной диагностики.

7. Реакция непрямой гемагглютинации с сывороткой крови при использовании коммерческого медицинского эритроцитарного диагностикума и сконструированного нами антигена обладает специфичностью и высокой чувствительностью. В естественных очагах бруцеллеза крупного рогатого скота РНГА выявляет дополнительно к комплексу официальных диагностических тестов до 19,2% реагирующих животных. Животные, диагностированные с помощью РНГА, представляют эпизоотическую опасность, что подтверждено результатами бактериологических исследований.

В стадах крупного рогатого скота, реиммунизированного слабоагтлютиногенными противобруцеллезными вакцинами, с помощью РНГА возможно осуществлять эпизоотический контроль благополучия животных по бруцеллезу и оздоровление неблагополучных пунктов, но не ранее, чем через два месяца после вакцинации.

8. Разработана методика постановки реакции непрямой гемагглютинации с молоком для диагностики бруцеллеза у крупного рогатого скота. Реакция непрямой гемагглютинации с молоком обладает более высокой специфичностью в сравнении с КР, позволяет выявлять дополнительно к показаниям КР от 4,5 до 34,4% реагирующих коров. Установлена возможность применения РНГА с молоком для диагностики бруцеллеза у коров, реиммунизированных вакциной из штамма 82, через 30 дней после ревакцинации и в последующие сроки.

9. Кольцевая реакция с молоком позволяет проводить диагностику бруцеллеза у коров, иммунизированных слабоагглютиногенными противобруцеллезными вакцинами, с целью контроля благополучия хозяйств и дополнительной диагностики бруцеллеза в оздоравливаемых стадах крупного рогатого скота. Усовершенствованная методика постановки и учета реакции дает возможность исключить дополнительные исследования молока на наличие субклинических форм мастита у коров.

10. Количественное соотношение S-антител, выявляемых единым антигеном в РА и РСК, возможно использовать для дифференциальной оценки животных, привитых вакциной из штамма 82, на бруцеллез. Дифференциацию больных бруцеллезом животных от здоровых целесообразно осуществлять через два месяца и в последующие сроки после иммунизации. Больными

следует считать животных с оценкой титра РА - 200 ME и выше, РСК - 1:20 и выше. В благополучных по бруцеллезу хозяйствах к больным следует относить животных, имеющих показатели РА в титре 200 ME и выше, РСК - в титре 1:40 и выше.

11. Система дифференциальной диагностики бруцеллеза крупного рогатого скота, реиммунизированного вакциной из штамма 82, предусматривающая определение количественного соотношения S-бруцеллезных антител в сыворотке крови животных при постановке РА, РСК, РИГА, в молоке - с помощью КР или РНГА и наличия R-бруцеллезных комплементсвязывающих антител в сыворотке крови, имеет высокую противоэпизоотическую и экономическую эффективность, позволяет оздоравливать неблагополучные по бруцеллезу пункты за 10-12 месяцев, при этом предотвращает необоснованный убой здоровых животных, реагирующих на вакцину из штамма 82.

12. Разработан овисный цветной диагностикум для РА пробирочной, обладающий специфичностью, чувствительностью и выявляющий дополнительно к показаниям РСК с антигеном ВНИИБТЖ от 0,4 до 13,6% реагирующих животных в отарах, неблагополучных по инфекционному эпидидимиту баранов.

13. Разработанный овисный антиген из штамма B.ovis 6 для РСК специфичен и имеет высокую диагностическую эффективность. Животные, реагирующие на овисный антиген, представляют эпизоотическую опасность.

14. Разработан метод провокации антител к B.ovis при инфекционном эпидидимите баранов, основанный на введении животным бруцеллина или бруцеллоовина общепринятыми способами- Оптимальный срок исследования сыворотки крови животных - 21-28 дни после введения препаратов. Чувствительность метода зависит от сроков первичной антигенной стимуляции.

Экспериментально доказана возможность применения

противобруцеллезной вакцины Rev-1 в дозе 2 млрд м.к. в качестве средства, провоцирующего антитела к B.ovis. Доказана эпизоотическая опасность животных, диагностированных с помощью этого теста.

15. Антигены, изготовленные из штаммов B.canis RM 6/66 и В.abortus 16/4 (R-форма) для пластинчатой, пробирочной РА и РСК, обладают специфичностью, позволяют диагностировать в экспериментальных и производственных условиях до 100% собак, инфицированных возбудителем В canis.

16. Эритроцитарный канисный диагностикам, сконструированный при воздействии на микробные клетки 2%-ого раствора додецилсульфата натрия, специфичен и имеет высокую диагностическую эффективность. При экспериментальном инфицировании морских свинок и собак возбудителем В canif с помощью антигена в РНГА возможно выявить до 100% зараженных животных.

4. Практические предложения

Научные разработки, положения и выводы диссертационной работы нашли отражение в нормативных документах и рекомендациях, внедренных и принятых для внедрения в ветеринарную практику:

«Наставление по диагностике бруцеллеза животных» (Утв. ГУВ МСХ СССР 30 12.82 г.).

«Инструкция по изготовлению и контролю набора компонентов для серологической дифференциации культур бруцелл» (Утв. ГУВ Госагропрома СССР 30.01.87 г.).

Технические условия (ТУ 10-07-587-87) «Набор компонентов для серологической дифференциации культур бруцелл" (Утв. ГУВ Госагропрома СССР 25.12.87 г.).

«Наставление по определению количественного содержания 8- и Я-компонентов в антигеннной структуре бруцелл» (Утв. ГУВ ГКПЗ СМ СССР 05.10.89 г.).

«Наставление по применению антигена овисного цветного для РА при диагностике инфекционного эпидидимита баранов» (Утв. ГУВ ГКПЗ СМ СССР 11.11.89 г.).

«Инструкция по изготовлению и контролю антигена овисного цветного для реакции агглютинации при диагностике инфекционного эпидидимита баранов» (Утв. ГУВ ГКПЗ СМ СССР 11.11.89 г.).

«Наставление по постановке и учету кольцевой реакции с молоком (КР) для диагностики бруцеллеза у коров, привитых вакциной из штамма 82» (Утв. ГУВ ГКПЗ СМ СССР 05.09.90 г.).

«Наставление по постановке и учету результатов реакции непрямой гемагглютинации с молоком при диагностике бруцеллеза у коров» (Утв. ГУВ ГКПЗ СМ СССР 30.08.90 г.).

Технические условия (ТУ 10-07-55-90) «Антиген овисный цветной для реакции агглютинации при диагностике инфекционного эпидидимита баранов» (Утв. ГУВ ГКПЗ СМ СССР 30.08.90 г.).

«Наставление по постановке и учету результатов реакции непрямой гемагглютинации с сывороткой крови при бруцеллезе крупного рогатого скота» (Утв. ГУВ ГКПЗ СМ СССР 07.09.90 г.).

«Наставление по постановке и учету реакции связывания комплемента с Я-бруцеллезным антигеном» (Утв. ГУВ ГКПЗ СМ СССР 30.08.90 г. и ГУВ МСХ РФ 15.04.93 г.).

Технические условия «Я-антиген бруцеллезный для реакции связывания комплемента» (Утв. ГУВ ГКПЗ СМ СССР ЗОЛ 1.90 г.).

«Наставление по постановке и учету реакции связывания комплемента с овисным антигеном» (Утв. ГУВ ГКПЗ СМ СССР 21.06.91 г.).

«Инструкция по изготовлению и контролю овисного антигена для реакции связывания комплемента» (Утв. ГУВ ГКПЗ СМ СССР 21.06.91 г.).

Технические условия (ТУ 10-07-142-91) «Антиген овисный для реакции связывания комплемента» (Утв. ГУВ ГКПЗ СМ СССР 21.06.91 г.).

«Наставление по диагностике инфекционной болезни овец, вызываемой Brucella ovis (инфекционный эпидидимит баранов)» (Утв. ГУВ ГКПЗ СМ СССР 13.11.91г.).

«Наставление по постановке реакции непрямой гемагглютинации при диагностике бруцеллеза с молоком коров, привитых вакциной из штамма 82» (Утв. ГУВ ГКПЗ СМ СССР 30.08.91 г.).

«Наставление по применению набора для серологической диагностики инфекционного эпидидимита баранов в реакции связывания комплемента» (Утв. ГУВ МСХ РФ 27.02.92 г.).

«Инструкция о мероприятиях по профилактике и ликвидации инфекционной болезни, вызываемой Brucella ovis (инфекционный эпидидимит бара нов)» (Утв. ГУВ МСХ РФ 03 .07.92 г.).

«Наставление по применению набора для диагностики инфекционного эпидидимита баранов в реакции агглютинации» (Утв. ГУВ МСХ РФ 27.02.92г.).

«Методические указания по дифференциальной эпизоотической оценке стад крупного рогатого скота, привитого вакциной из штамма 82» (Утв. ГУВ МСХ РФ 01.07.92 г.).

«Рекомендации по применению метода диагностики инфекционного эпидидимита баранов с использованием реакции иммунологической памяти (метод провокации антител)». Одобрены ДВ МСХиП РФ, 1995 г. и рекомендованы для включения в новое наставление по диагностике инфекционного эпидидимита баранов.

Экспериментально-производственный регламент на иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие R-бруцеллезные сухие № 513-95 (Утв. директором НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН 02.03.1995).

Временная фармакопейная статья ВФС 42/Д-018ВС-95 «Иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие R-бруцеллезные сухие (Утв. Госкомсанэпиднадзором РФ 10.05.1995)

Инструкция по применению иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих R-бруцеллезных сухих (Утв. Госкомсанэпиднадзором РФ 10.05.1995).

Сборник санитарных и ветеринарных правил «Профилактика и борьба с заразными болезнями, общими для человека и животных» (Утв. Госкомсаннадзора России и Минсельхозпрод России, 1996 г.).

«Наставление по применению антигена бруцеллезного эритроцитарного для реакции непрямой гемагглютинации (РИГА) в порядке широкого производственного испытания» (Утв. Департаментом ветеринарии МСХиП РФ 02.09.98).

Технические условия (ТУ 9388-152-00494185-98) «Антиген бруцеллезный эритроцитарный для реакции непрямой гемагглютинации (РИГА)» (Утв. Департаментом ветеринарии МСХиП РФ 15.09.98 г.).

Методические рекомендации «Диагностика, лечение и профилактика бруцеллеза собак, вызываемого B.canis» (Утв. подсекцией «Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии 13.12.2001, протокол № 12).

Концепция оптимизации противобруцеллезных мероприятий у крупного рогатого скота и собак в Сибири, рассмотрена и одобрена научно-техническим советом секции «Ветеринария» Межрегиональной Ассоциации «Сибирское соглашение». Омск, 22.08.2003.

«Наставление по диагностике бруцеллеза животных» (Утв. Департаментом ветеринарии МСХ 29.09.2003 г.).

Методические рекомендации «Система дифференциальной диагностики бруцеллеза крупного рогатого скота, привитого вакциной из штамма 82» (Утв. подсекцией «Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии 15.01.2004, протокол № 3).

5. Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Экспериментальные и производственные испытания новых диагностикумов из И-форм бруцелл // Сб. науч. тр. ИЭВСиДВ.-Новосибирск, 1976.-Вып.1-С.72-75.

2. Производственные испытания овисного антигена СибНИВИ / Соавт. И.А. Косилов // Бюллетень НТИ СибНИВИ.- Новосибирск, 1976.- Вып.4.-С.13-17.

3. Материалы по изучению физико-химических свойств антигенов РСК-РДСК, полученных разными методами из диссоциированных бруцелл / Соавт.: Н.И. Передереев, Н.И. Галкин // Меры борьбы с заболеваниями с.-х. животных в промышленных комплексах: Сб. науч. работ СибНИВИ.-Омск, 1977.-Вып.30.-С31-35.

4. Испытание Я-антигенов в РСК при бруцеллезе крупного рогатого скота / Соавт.: Н.М, Потапов, И.А. Косилов // Науч.-техн. бюл. ИЭВСиДВ.-Новосибирск, 1977.-Вып.7.-С.23-27.

5. Изучение в РСК антигенной активности бруцелл с различными биологическими свойствами // Меры борьбы с заболеваниями с.-х. животных в промышленных комплексах: Сб. науч. работ СибНИВИ.-Омск, 1977.-Вып.30.-С.27-30.

6. Испытание реактивности организма крупного рогатого скота, привитого вакциной из штамма 82 // Науч.-техн. бюл. ИЭВСиДВ.- Новосибирск,

1977.-Вып.7.-С.27-31.

7. Испытание Я и ИЗ-антигенов РСК-РДСК на животных после применения вакцины из штамма В.abortus 82 / Соавт. И.А. Косилов // Профилактика заболеваний с.-х. животных в Сибири и на Дальнем Востоке.-Новосибирск, 1978.-С.58-62.

8. Изучение диагностической ценности Я-антигенов при бруцеллезе в условиях эксперимента / Соавт.: А.А. Новицкий, М.А. Бажин // Инфекционные, болезни животных: Сб. науч. работ СибНИВИ.- Омск,

1978.-Вып.32.-С.23-27.

9. Материалы по сравнительному изучению разных овисных антигенов в эксперименте на баранах // Инфекционные болезни животных: Сб. науч.

работ СибНИВИ.- Омск, 1978.-Вып.32.-С.ЗЗ-39.

10. Патоморфологическая характеристика хронических форм инфекции, вызываемой В ovis IСоавт. А.Н. Кононов // Диагностика и профилактика инфекционных болезней животных: Сб. науч. работ СибНИВИ - Омск, 1980.-Вып.37.-С.24-30.

11. Изучение серологических реакций в диагностике инфекционного эпидидимита баранов // Профилактика болезней с.-х. животных / ВАСХНИЛ, Сиб. отд-ние, ИЭВСиДВ.- Новосибирск, 1980.-С.39-42.

12. Непрямой метод иммунофлуоресценции при изучении антигеной структуры бруцелл / Соавт. А.П. Красиков // Науч.-техн. бюл. ИЭВСиДВ.- Новосибирск, 198О.-Вып.19.-С.12-15.

13.Использование РА и РИГА с R-антигенами для диагностики животных, сенсибилизированных диссоциированными формами бруцелл / Соавт. А.П. Красиков // Инфекционные и инвазионные болезни с.-х. животных / Науч.-техн. бюл. СО ВАСХНИЛ, ИЭВСиДВ.- Новосибирск, 1980.-Вып.19.-С.8-12.

14.Изучение эпизоотического значения коров, привитых вакциной из штамма 82 / Соавт.: И.А. Косилов, В.Г. Ощепков, З.С. Калинина и др. // Профилактика болезней с.-х. животных / Сб. науч. тр. СО ВАСХНИЛ, ИЭВСиДВ.- Новосибирск, 1980.-С.39-42.

15. Эпизоотическая оценка стад крупного рогатого скота по бруцеллезу после применения вакцины из штамма 82 / Соавт.: И.П. Никифоров, И.А. Косилов, С.К. Димов и др. // Инфекционные и инвазионные болезни с.-х. животных / Науч.-техн. бюл. СО ВАСХНИЛ, ИЭВСиДВ.-Новосибирск, 198О.-Вып.19.-С.48-53.

16. Биологические свойства культур бруцелл вакцинного штамма В.abortus 82, выделенных от животных из благополучных хозяйств / Соавт.: Е.А. Тягунина, А.А. Новицкий // Инфекционные и паразитарные болезни с.-х. животных: Науч.-техн. бюл. / ВАСХНИЛ, Сиб. отд-ние, ИЭВСиДВ.-Новосибирск, 1981.-Вып.50.-С.8-11.

17. Биосинтез антител у баранов, экспериментально зараженных В ovis II Хронические инфекции животных / ВАСХНИЛ, Сиб. отд-ние, ИЭВСиДВ.- Новосибирск, 1981.-С.38-42.

18. Диагностическая ценность R-антигенов для РА и РНГА при бруцеллезе крупного рогатого скота / Соавт. А.П. Красиков // Науч.-техн. бюл. / СО ВАСХНИЛ, ИЭВСиДВ.- Новосибирск, 1981.-Вып.33.-С.9-13.

19. Изучение антигеного состава вакцинного штамма В.abortus 82 / Соавт. Ё.А. Тягунина // Хронические инфекции животных / ВАСХНИЛ, Сиб. отд-ние, ИЭВСиДВ.- Новосибирск, 1981.-С.21-24.

20. Оценка диагностической ценности R-антигенов ИЭВСиДВ при бруцеллезе / Соавт. А.П. Красиков // Науч.-техн. бюл. СО ВАСХНИЛ.-Новосибирск, 1981 .-Вып. 50.-С. 12-15.

21. Изучение агглютинабельных и антигенных свойств диссоциированных штаммов бруцелл для получения R-сыворотки / Соавт.: И.А. Косилов, У.Э. Ниязов, К.В. Шумилов // Науч.-техн. бюл. СО ВАСХНИЛ.-

Новосибирск, 1983.-Вып.31.-С.З-7.

22. Получение Я-бруцеллезной сыворотки на кроликах / Соавт.: У.Э. Ниязов, К.В. Шумилов, И.А. Косилов // Профилактика и диагностика болезней животных: Сб. науч. тр. СО ВАСХНИЛ.- Новосибирск, 1983.-С. 103-107.

23. Иммунологические показатели сыворотки крови крупного рогатого скота при экспериментальном заражении Я-формами бруцелл / Соавт. Г.В. Разницина // Науч.-техн. бюл. / СО ВАСХНИЛ, ИЭВСиДВ.-Новосибирск, 1985.-Вып.30.-С.19-24.

24. Диагностическая эффективность РА с овисным антигеном ИЭВСиДВ / Соавт.: В.Я. Гончаренко, А.Г. Хлыстунов, И.А. Косилов // Науч.-техн. бюл. / СО ВАСХНИЛ, ИЭВСиДВ.- Новосибирск, 1985.-Вып.30.-С.24-З0.

25. Иммунный ответ организма баранов при экспериментальном заражении В ovis I Соавт. Г.В. Разницина // Эпизоотология, диагностика и меры борьбы с инфекционными болезнями: Сб. науч. тр. СО ВАСХНИЛ, ИЭВСиДВ.- Новосибирск, 1986.-С.80-85.

26. Диагностическая эффективность кольцевой реакции с молоком при бруцеллезе у коров, привитых вакциной из штамма 82 / Соавт.: И.А. Косилов, С.К. Димов, Г.В. Разницина и др. // Вопросы эпизоотологиии, диагностики и мероприятия по ликвидации туберкулеза и бруцеллеза животных: Сб. науч. тр. СО ВАСХНИЛ.- Новосибирск, 1987.-С.91-95.

27. Изменчивость бруцелл и ее значение в проблеме бруцеллеза с.-х. животных / Соавт. И.А. Косилов // Совершенствование систем и методов в борьбе с бруцеллезом и туберкулезом животных: Сб. науч. тр. СО ВАСХНИЛ.- Новосибирск, 1987.-C.i71.

28. Изыскание диагностических реакций с молоком при бруцеллезе крупного рогатого скота / Соавт. Г.В. Разницина // Диагностика и специфическая профилактика бруцеллеза и туберкулеза животных: Сб. науч. тр. СО ВАСХНИЛ.- Новосибирск, 1988.-С. 19-23.

29. Результаты изучения реакции иммунофлуоресценции при диагностике диссоциированных форм бруцелл / Соавт.: И.В. Павлова, Г.В. Разницина // Бруцеллез сельскохозяйственных животных: Сб. науч. тр. ВАСХНИЛ, Сиб. отд-ние, ВНИИБТЖ.- Омск, 1989.-С.52-55.

30. Диагностическое значение реакции непрямой гемагтлютинации при обнаружении бруцеллезных антител в молоке крупного рогатого скота / Соавт.: Г.В. Разницина, П.К. Аракелян // Бруцеллез сельскохозяйственных животных: Сб. науч. тр. ВАСХНИЛ, Сиб. отд-ние, ВНИИБТЖ.- Омск, 1989.-С.45-52.

31. Использование реакции непрямой гемагтлютинации с молоком для диагностики бруцеллеза у коров / Соавт.: Г.В. Разницина, П.К. Аракелян // Пути совершенствования профилактики и диагностики бруцеллеза с.-х. животных: Сб. науч. тр. ВАСХНИЛ, Сиб. отд-ние, ВНИИБТЖ.- Омск, 1990.-С.42-49.

32. Диагностическая эффективность реакции непрямой гемагглютинации при бруцеллезе крупного рогатого скота / Соавт.: Г.В. Разницина,

П.К. Аракелян, Г.Е. Саркисян // Пути совершенствования профилактики и диагностики бруцеллеза с.-х. животных: Сб. науч. тр. ВАСХПИЛ, Сиб. отд-ние, ВНИИБТЖ.- Омск, 1990.-С.49-52.

33. Применение РИГА с сывороткой крови для дифференциальной диагностики бруцеллеза у крупного рогатого скота, реиммунизированого вакциной из штамма В.abortus 82 / Соавт.: Г.В. Разницина, П.К. Аракелян // Сб. науч. тр. ВАСХНИЛ, Сиб. отд-ние, ВНИИБТЖ.- Омск, 1991. -С. 10-15.

34. Результаты изучения метода провокации антител при инфекционном эпидидимите баранов в экспериментальных условиях / Соавт. Г.В. Разницина // Туберкулез и бруцеллез с.-х. животных: методы и средства диагностики, профилактики / Сб. науч. тр. РАСХН, Сиб. отд-ние, - Новосибирск, 1994.-С.75-81.

35. Прижизненная диагностика возбудителя инфекционного эпидидимита баранов в реакции иммунофлуоресценции / Соавт. Г.В. Разницина // Туберкулез и бруцеллез с.-х. животных: методы и средства диагностики, профилактики / Сб. науч. тр. РАСХН, Сиб. отд-ние, - Новосибирск, 1994.-С.81-85.

36. К вопросу о диагностики бруцеллеза собак / Соавт.: В.Г. Ощепков, Л.Н. Гордиенко, Г.В. Разницина // Проблемы адаптации с.-х. животных: Материалы науч.-произв.конф. / РАСХН, Сиб. отд-ние, ИЭВСиДВ.-Новосибирск, 1997.-С.188-190.

37. Результаты изучения биологических свойств культур бруцелл, выделенных от собак / Соавт.: Л.Н. Гордиенко, Г.В. Разницина, С.А. Власова // Материалы научно-практической конференции, 20 октября 1998. Краснообск. -Новосибирск, 1999.-С.30-31.

38. Критерии эпизоотической оценки по бруцеллезу крупного рогатого скота, реиммунизированного вакциной из штамма B.abortus 82 / Соавт.: Г.В. Разницина, С.А. Власова // Актуальные проблемы бруцеллеза и туберкулеза животных/ Сб. науч. тр. / РАСХН, Сиб. отд-ние. ВНИИБТЖ.-Омск,2000.-С.210-212.

39. Диагностика латентных форм бруцеллеза у животных с применением метода провокации антител / Соавт. П.К. Аракелян // Актуальные проблемы бруцеллеза и туберкулеза животных / Сб. науч. тр./ РАСХН, Сиб. отд-ние. ВНИИБТЖ.- 0мск,2000.-С.157-160.

40. Оптимальная система дифференциальной диагностики бруцеллеза крупного рогатого скота и ее противоэпизоотическая эффективность / Материалы Всероссийской науч. конф. по проблеме хронических инфекций / Сб. науч. тр. / РАСХН, Сиб. отд-ние. ВНИИБТЖ. - Омск, 2001.-С.26-28.

41. Прижизненные методы диагностики бруцеллеза собак, вызываемого В canis I Соавт. Н.Г. Шпак // Материалы Всероссийской науч. конф. по проблеме хронических инфекций / Сб. науч. тр. / РАСХН, Сиб. отд-ние. ВНИИБТЖ.- Омск,2001.-С.67-69.

42. Изучение значимости методов серологической диагностики бруцеллеза крупного рогатого скота, привитого вакциной из штамма 82 / Соавт.: А.А. Новицкий, Т.Г. Попова, Г.В. Разницина и др. // Инфекционная патология животных / Сб. науч. тр. / РАСХН, Сиб. отд-ние. ВНИИБТЖ. -Омск, 2001.-С.44-51.

43. Сравнительная оценка методов получения антигена для реакции непрямой гемагглютинации при бруцеллезе собак, вызываемой B.canis / Соавт.: Н.Г. Шпак, Г.В. Разницина // Инфекционная патология животных / Сб. науч. тр. / РАСХН, Сиб. отд-ние. ВНИИБТЖ. - Омск, 2001. - С. 149-153.

44. Диагностическая ценность серологических тестов при экспериментальном бруцеллезе собак, вызываемом Brucella canis / Соавт.: Г.В. Разницина, Н.Г. Шпак // Инфекционная патология животных / Сб. науч. тр./ РАСХН, Сиб. отд-ние. ВНИИБТЖ. - Омск, 2001.- С. 145-148.

45. Дифференциальная диагностика бруцеллеза крупного рогатого скота, привитого вакциной из штамма 82 / Соавт.: А.А. Новицкий, Г.В. Разницина, С.А. Власова//Ветеринария.-2002.-№ 1.-С.17-21.

46. Анализ эпизоотических, клинических и лабораторных исследований при бруцеллезе собак в мегаполисе Сибири (г. Омск) / Соавт. Л.Н. Гордиенко // Эпизоотология, диагностика и профилактика хронических инфекционных болезней животных / Материалы Международн. науч. конф., посвященной 175-летию аграрной науки Сибири.- Омск.-24-26 июня 2003 г. Сб. науч. тр., РАСХН.- Сиб. отд-ние ВНИИБТЖ. - Омск, 2003 .-С.216-221.

47. Результаты производственного испытания диагностикумов при бруцеллезе собак, вызываемом B.canis I Соавт.: Н.Г. Шпак, С.А. Власова // Эпизоотология, диагностика и профилактика хронических инфекционных болезней животных / Материалы Международн. науч. конф., посвященной 175-летию аграрной науки Сибири.- Омск.-24-26 июня 2003 г. Сб. науч. тр., РАСХН.- Сиб. отд-ние ВНИИБТЖ. - Омск, 2003.-С.225-228.

48. Новый контрольный тест молока крупного рогатого скота на бруцеллез / Соавт.: Г.В. Разницина, С.А. Власова // Эпизоотология, диагностика и профилактика хронических инфекционных болезней животных / Материалы Международн. науч. конф., посвященной 175-летию аграрной науки Сибири.- Омск.-24-26 июня 2003 г. Сб. науч. тр., РАСХН.- Сиб. отд-ние ВНИИБТЖ. - Омск, 2003.-С.229-235.

49. Биосинтез специфических иммуноглобулинов у животных, экспериментально зараженных бруцеллами вида канис / Соавт.: Н.Г. Шпак, В.Г. Ощепков // Эпизоотология, диагностика и профилактика хронических инфекционных болезней животных / Материалы Международн. науч. конф., посвященной 175-летию аграрной науки Сибири.- Омск.-24-26 июня 2003 г. Сб. науч. тр., РАСХН.- Сиб. отд-ние ВНИИБТЖ. - Омск, 2003 .-С.318-324.

50. Антигенные и превентивные свойства противобруцеллезной вакцины из штамма Brucella abortus 82 / Соавт.: В.Г. Ощепков, Л.Н. Гордиенко,

О.В. Львова // Состояние и перспективы аграрной науки Казахстана и Западной Сибири / Материалы Международн. науч -практ. конф, посвященной 40-детию Северного НИИ жив-ва и ветеринарии. -Петропавловск.-2003.-Т. II -С.363-366.

51. Производственное испытание реакции агглютинации пластинчатой с молоком при бруцеллезе крупного рогатого скота // Научное обеспечение АПК Казахстана, Сибири, Кыргызстана, Монголии, Беларуси и Башкортостана / Материалы 6-й Международн. науч.-практ. конф. Сиб вестник с.-х. науки. -2003.- № З.-С .25-27.

52. Практическая реализация концепции оптимизации противобруцеллезных мероприятий крупного рогатого скота Сибири / Соавт.: С.К. Димов, В Г. Ощепков и др. // Современные проблемы эпизоотологии / Материалы Международн. науч. конф. - РАСХН. Сиб. отд-ние, Краснообск, 30 июня 2004.-С.66-69.

53. Концептуальная схема оптимизации диагностики болезней, вызываемых у животных бруцеллами / Соавт.: В.Г. Ощепков, С.К. Димов, А.С. Димова // Сиб вестник с.-х. науки. -2005.- № 1.-С .71-79.

Подписано в печать 14.02.2005 г. Формат 60x84 1/16 Объем 2 п. л. Заказ № 109 Тираж 100 Типография ОмГУПСа, 2005 г. 644046, г. Омск, пр. Маркса, 35.

u

{'' ; 1819

Il MAP 2005■■

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Одной из важнейших задач сельскохозяйственного производства во всем мире является обеспечение населения высококачественной экологически чистой животноводческой продукцией, что предполагает изыскание новых и совершенствование существующих методов профилактики, диагностики и ликвидации таких антропозоонозов как бруцеллез животных, вызываемый видами abortus, melitensis, suis.

Несмотря на значительные успехи, достигнутые в ликвидации бруцеллеза в Российской Федерации совместными усилиями научного потенциала и практической ветеринарной службы, проблема ликвидации бруцеллеза крупного рогатого скота окончательно не решена.

Современная система профилактики и борьбы с бруцеллезом основывается на проведении общих ветеринарно-санитарных мероприятий, выявлении источников инфекции - больных животных и их удалении, применении средств специфической профилактики.

Наиболее важным элементом этой системы является диагностика бруцеллеза, от эффективности которой зависят размеры экономического ущерба при ликвидации заболевания.

Значительные трудности в диагностике бруцеллеза создают циркулирующие в природе измененные варианты возбудителя бруцеллеза: R, RS, SR и L-формы, о существовании которых сообщали многие исследователи (П.А.Вершилова с соавт., 1972; Н.П. Потапов, 1974; K.M. Салмаков с соавт., 1974; И.А. Косилов, 1975, 1992; П.А. Триленко, 1976; Е.С. Мозесюк, 1982; В.Г.Ощепков, 1990; Л.Н. Гордиенко, 1999 и др.).

Измененные формы бруцелл, несмотря на их пониженную вирулентность, способны к реверсии в исходные формы и могут вызвать вспышки бруцеллеза.

Изменения в антигенной структуре возбудителя создают трудности в бак* териологической диагностике при индикации возбудителя бруцеллеза и в серологической, поскольку официальные диагностические средства сконструированы на основе типичных S-форм бруцелл. ч'

В этой связи исследования по изысканию новых эффективных диагностических препаратов с учетом изменчивости возбудителя бруцеллёза являются актуальными.

Широко применяющаяся в системе противобруцеллёзных мероприятий слабоагглютиногенная вакцина из штамма B.abortus 82, имеющая RS-антигенную структуру, осложняет диагностику из-за проблемы дифференциации поствакцинальных реакций от реакций у больного скота.

Эта проблема также требовала проведения исследований, направленных на разработку надежных диагностических средств и методов дифференциальной диагностики, которые возможно было бы использовать не только в отдаленные, но и ранние сроки после иммунизации животных.

Основными методами серологической диагностики бруцеллеза у непривитого и иммунизированного противобруцеллёзными вакцинами крупного рогатого скота в нашей стране являются РА, РСК, РИД. Однако, для эффективного выявления больных животных на всех стадиях развития инфекционного процесса этих реакций недостаточно. Возникает необходимость в разработке новых легко выполнимых, доступных для массового исследования экспресс методов диагностики бруцеллезных антител в сыворотке крови и молоке.

Такие диагностические средства и методы необходимы не только для выявления больных животных в неблагополучных по бруцеллезу хозяйствах, но и для зон свободных от инфекции, где взамен РА, дающей в ряде случаев неспецифические реакции на бруцеллез, и трудоемких дорогостоящих РСК, РИД целесообразно внедрять более простые, эффективные способы диагностики бруцеллеза.

Важной проблемой до настоящего времени остается ликвидация инфекционного эпидидимита баранов, вызываемого B.ovis, и наносящего ощутимый экономический ущерб овцеводству.

Наряду с широким распространением этого заболевания почти во всех странах мира, он имеет место и в Российской Федерации. Несмотря на разработанные в ВГНКИ - ВИЭВ такие эффективные диагностические методы, как ИФА, РНГА, РНАТ, РНИФ, на практике применяется, в основном, один серологический тест - РДСК, что является недостаточным как для профилактики, так и для оздоровления хозяйств от ИЭ баранов.

Бруцеллез собак, вызываемый В.сашБ, впервые установленный в США О.Е. Сапгпс11ае1 в 1966 году, впоследствии в результате разработки средств диагностики зарегистрирован во многих странах мира: Франции, Англии, ФРГ, Японии, Мексике, Румынии, Аргентине, Германии, Китае, Бразилии и др.

В России первый случай бруцеллеза собак, обусловленный В.сагш, был зарегистрирован в Волгоградской области в 1994 году (К.В. Шумилов с соавт., 1996).

Инфекция наносит значительный ущерб собаководству, который складывается из потери воспроизводительной способности кобелей, выбраковки ценных в племенном отношении животных, абортов и рождении слабых, нежизнеспособных щенков (О.Е. Саггшс11ае1, 1988).

Бруцеллез собак относится к зооантропонозам - болезням, регистрируемым у животных и представляющих угрозу для здоровья людей (6-ой доклад ФАО/ВОЗ, 1986).

В России (ВГНКИ) проводится разработка диагностических средств при данном заболевании, но до настоящего времени они не внедрены в ветеринарную практику.

Вышеизложенное обусловило необходимость проведения исследований, направленных на разработку новых и совершенствование существующих средств и методов диагностики бруцеллеза животных и ИЭ баранов, поиск вариантов наиболее рационального использования их в системе мер борьбы с этими инфекциями.

В настоящей диссертационной работе обобщены результаты многолетних и исследований по созданию новых и совершенствованию существующих средств и методов диагностики бруцеллеза животных и ИЭ баранов. В частности, показана особенность диагностики бруцеллеза в связи с изменчивостью возбудителя и представлены материалы по разработке R-бруцеллезных антигенов для РСК, РА, РНГА, R-бруцеллезных люминесцирующих иммуноглобулинов, R-бруцеллезной агглютинирующей сыворотки. Изложены результаты испытаний РНГА с сывороткой крови и молоком, KP с молоком, РИД для диагностики бруцеллеза у непривитых животных, а также апробация этих методов с целью дифференциальной диагностике бруцеллеза у крупного рогатого скота, иммунизированного вакциной из штамма B.abortus 82.

При ИЭ баранов представлены материалы по разработке и испытанию новых средств диагностики: РА и РСК с овисными антигенами, R-бруцеллезных люминесцирующих иммуноглобулинов для прижизненной диагностики заболевания, метода провокации биосинтеза антител для диагностики латентно больных животных.

При бруцеллезе собак, вызываемом B.canis, представлены материалы по разработке и апробации средств серологической диагностики для РА пластинчатой, пробирочной, РСК, РНГА. Показана возможность совершенствования прижизненной бактериологической диагностики заболевания с помощью РИФ.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЙ. Исходя из вышеизложенного, мы поставили цель: разработать новые и усовершенствовать существующие средства, методы диагностики бруцеллеза животных и инфекционного эпидидимита баранов.

Основные задачи исследований:

- разработать способ изготовления R-бруцеллезной агглютинирующей сыворотки и R-бруцеллезных люминесцирующих иммуноглобулинов для ин-^ t 1 дикации возбудителей инфекционного эпидидимита баранов и бруцеллеза (диссоциированные формы); испытать диагностическую эффективность полученных препаратов;

- разработать R-бруцеллезные диагностикумы для РА, РСК и РНГА, изучить их диагностическую ценность в экспериментальных и производственных условиях;

- изучить диагностическую ценность РНГА с сывороткой крови, KP и РНГА с молоком у крупного рогатого скота, инфицированного типичными формами бруцелл, в том числе на фоне иммунизации вакциной из штамма 82;

- разработать оптимальную систему дифференциальной диагностики бруцеллеза крупного рогатого скота, иммунизированного вакциной из штамма 82, изучить её противоэпизоотическую эффективность;

- разработать методики изготовления овисных антигенов для РА, РСК, испытать их специфичность, чувствительность в экспериментальных и производственных условиях при ИЭ баранов;

- изучить диагностическую ценность метода провокации биосинтеза антител при ИЭ баранов;

- разработать средства и методы диагностики бруцеллеза собак, вызываемого B.canis.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Впервые разработана технология промышленного изготовления «Набора компонентов для серологической дифференциации культур бруцелл», включающего R-бруцеллезную агглютинирующую сыворотку и R-бруцеллезный цветной антиген для РА.

Способ изготовления R-бруцеллезного цветного антигена защищен авторским свидетельством № 955572 от 04.05.1982 г.

Впервые разработана технология промышленного изготовления R-бруцеллезных люминесцирующих иммуноглобулинов для бактериологической диагностики диссоциированных форм бруцелл в реакции иммунофлуоресцен-ции. Установлена более высокая чувствительность РИФ с новым диагностику-мом в сравнении с бактериологическим методом диагностики. Показана целесообразность применения R-бруцеллезных люминесцирующих иммуноглобулинов для прижизненной диагностики возбудителя B.ovis в сперме баранов.

Впервые сконструирован специфичный и чувствительный Я-бруцеллезный диагностикум для РНГА на основе сенсибилизации эритроцитов барана фенольным экстрактом антигена из штамма В.аЬогШБ 16/4, показана возможность использования его для выявления Я-бруцеллезных антител у животных в экспериментальных и производственных условиях.

Доказана необходимость применения Я-бруцеллезного антигена РСК для дифференциальной диагностики бруцеллеза у крупного рогатого скота, привитого вакциной из штамма 82, в благополучных и неблагополучных по бруцеллезу хозяйствах в разные сроки после иммунизации.

Впервые показана возможность применения РНГА с сывороткой крови для диагностики бруцеллеза у крупного рогатого скота, реиммунизированного штаммом В.аЬоЛиз 82, в ранние и отдаленные сроки после иммунизации.

Разработана методика постановки РНГА с молоком для экспресс-диагностики бруцеллезных антител. В экспериментальных и производственных условиях доказана специфичность и чувствительность теста. Установлено, что РНГА с молоком возможно использовать в целях дифференциальной диагностики бруцеллеза у коров, реиммунизированных вакциной из штамма 82.

Доказана целесообразность применения КР с молоком для диагностики бруцеллеза у коров, ревакцинированных вакциной из штамма 82.

Разработаны критерии эпизоотической оценки по бруцеллезу животных, иммунизированных вакциной из штамма 82, для благополучных и неблагополучных хозяйств по показателям РА и РСК с единым антигеном.

Впервые разработана оптимальная система дифференциальной диагностики бруцеллеза у коров, реиммунизированных вакциной из штамма 82, доказана ее противоэпизоотическая эффективность при оздоровлении неблагополучных по бруцеллезу хозяйств.

Разработаны технологии изготовления овисных антигенов для РА и РСК, в экспериментальных и производственных условиях доказана специфичность и чувствительность новых диагностикумов.

Разработан новый метод диагностики ИЭ баранов на основе использования реакций иммунологической памяти (метод провокации биосинтеза антител), в экспериментальных и производственных условиях показана возможность применения в качестве провоцирующих средств бруцеллина ВИЭВ, бру-целлоовина в общепринятых дозах.

Впервые экспериментальным путем доказана возможность использования вакцины из штамма В.теШепз18 Яеу-1 для регистрации вторичного иммунного ответа с целью диагностики животных, инфицированных возбудителем В.оу1з.

Сконструированы новые диагностикумы из бруцелл вида сагиБ для РА, РСК, РНГА и апробированы наряду с антигенами из Л-формы В.аЬогШБ в экспериментальных и производственных условиях, показана целесообразность их применения для диагностики бруцеллеза у собак.

Впервые на территории Западной Сибири с помощью испытанных диаг-ностикумов выявлен бруцеллез собак, вызываемый В.сатБ.

При бруцеллезе собак впервые установлена высокая эффективность прижизненного способа диагностики - РИФ с Я-бруцеллезными люминесцирую-щими иммуноглобулинами.

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. Результаты проведенных исследований вносят существенный вклад в решение проблемы диагностики бруцеллеза животных и инфекционного эпидидимита баранов.

Они могут быть использованы при изучении патогенеза и иммуногенеза бруцеллеза разных видов животных и усовершенствовании системы противо-бруцеллезных мероприятий.

Предложена концепция оптимизации диагностики болезней, вызываемых у животных бруцеллами.

На основе указанной концепции разработан комплекс диагностических средств и методов, внедрение которого в ветеринарную практику обеспечило повышение эффективности противоэпизоотических и профилактических мероприятий при бруцеллезе животных и инфекционном эпидидимите баранов.

АПРОБАЦИЯ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ. Материалы диссертации доложены и обсуждены на: Всесоюзной научной конференции по проблемам бруцеллеза и туберкулеза (Омск, 1980); 3-ей Всесоюзной конференции «Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биопрепаратов» (Щелково, 1987); XII Всесоюзной конференции по природной очаговости болезней (Новосибирск, 1989); Всесоюзной конференции «Актуальные вопросы профилактики бруцеллеза и организации медицинской помощи» (Новосибирск, 1989); Всесоюзных и Всероссийских координационных совещаниях по проблеме бруцеллеза и туберкулеза с.-х. животных (Омск, 1987; Кустанай, 1988; Новочеркасск, 1989; Махачкала, 1990; Омск, 1991-1995; Новосибирск, 1999); Международной научно-практической конференции «Проблемы стабилизации и развития сельскохозяйственного производства Сибири, Монголии и Казахстана в XXI веке» (Новосибирск, 1999); 2-й региональной конференции «Актуальные проблемы ветеринарной медицины мелких домашних животных на Северном Кавказе (п.Персиановский, 1999); Всероссийской научной конференции по проблемам хронических инфекций (Омск, 2001); Международной научно-практической конференции «Состояние и перспективы аграрной науки Казахстана и Западной Сибири» (Петропавловск, 2003); 6-й Международной научно-практической конференции «Научное обеспечение АПК Казахстана, Сибири, Кыргыстана, Монголии, Беларуси и Башкортостана (Новосибирск, 2003); Международной научной конференции «Современные проблемы эпизоотологии» (п. Краснообск, 2004).

ПУБЛИКАЦИИ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ. По теме диссертации опубликовано 52 научные работы в журналах «Ветеринария»; «Сибирский вестник с.-х. науки»; материалах всесоюзных, всероссийских и международных научных конференций; трудах Всероссийского научно-исследовательского института бруцеллеза и туберкулеза животных и других НИУ.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация изложена на 455 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы,

4. ВЫВОДЫ

1. Основой предложенной концепции оптимизации диагностики болезней, вызываемых у животных бруцеллами, является необходимость использования комплекса простых, специфичных, чувствительных средств и методов, позволяющих максимально выявлять явных и скрытых бруцеллоносителей и объективно оценивать характер инфекционных и вакцинных процессов на всех стадиях, с учетом изменчивости бруцелл.

Практическая реализация этой концепции позволила обеспечить повышение уровня эффективности проводимых противобруцеллезных и противоэпи-дидимитных мероприятий, а также открыла перспективы для их дальнейшего совершенствования.

2. Разработанная Я-бруцеллезная агглютинирующая сыворотка обладает специфичностью и чувствительностью, позволяет проводить индикацию диссоциированных форм бруцелл, идентифицировать виды Яоуи, В.сатБ, определять стабильность вакцинных, референтных, производственных 8-штаммов бруцелл.

3. Разработанный Ы-бруцеллезный цветной антиген для реакции агглютинации специфичен и высокочувствителен: выявляет от 42,4 до 100% морских свинок, сенсибилизированных диссоциированными формами бруцелл, при этом в 71,1-100% случаев у реагирующих животных подтверждено бруцелло-носительство.

Диагностикум позволяет при постановке биологической пробы обнаруживать возбудителя бруцеллеза в различной стадии диссоциации, а также В.оугя, изучать антигенную структуру бруцелл, пато- и иммуногенез при взаимодействии микроба с макроорганизмом.

4. Ы-бруцеллезные люминесцирующие иммуноглобулины позволяют проводить индикацию диссоциированных форм бруцелл в бактериальных культурах, биологических объектах, идентифицировать виды В. ovis, В.сатя.

В опытах на морских свинках и крупном рогатом скоте, инфицированных полевыми диссоциантами бруцелл, установлена более высокая чувствительность реакции иммунофлуоресценции в сравнении с бактериологическим методом диагностики.

При бруцеллезе собак РИФ с R-бруцеллезными люминесцирующими иммуноглобулинами позволяет прижизненно регистрировать возбудителя заболевания в крови у 75-100% зараженных животных. Позитивные результаты РИФ с кровью подтверждены в 100% случаев выделением гемокультур.

5. R-бруцеллезный эритроцитарный диагностикум для реакции непрямой гемагглютинации, сконструированный на основе сенсибилизации эритроцитов антигеном из штамма В.abortus 16/4, извлеченным химическим способом, обладает специфичностью, чувствительностью и позволяет в экспериментальных условиях диагностировать от 66 до 100% голов крупного рогатого скота, сенсибилизированного диссоциированными формами возбудителя бруцеллеза.

В естественных очагах бруцеллеза с помощью нового антигена выявлено дополнительно к показаниям официальных методов диагностики 5,1% реагирующих животных.

6. Разработана технология изготовления R-бруцеллезного антигена для реакции связывания комплемента. Установлена специфичность и высокая диагностическая ценность диагностикума в экспериментальных и производственных условиях, способность выявлять животных, вакцинированных или зараженных диссоциированными формами бруцелл. R-бруцеллезный антиген позволяет дифференцировать больных бруцеллезом животных от здоровых, иммунизированных штаммом В.abortus 82, в благополучных и неблагополучных по бруцеллезу хозяйствах в комплексе с другими средствами дифференциальной диагностики.

7. Реакция непрямой гемагглютинации с сывороткой крови при использовании коммерческого медицинского эритроцитарного диагностикума и сконструированного нами антигена обладает специфичностью и высокой чувствительностью. В естественных очагах бруцеллеза крупного рогатого скота РНГА выявляет дополнительно к комплексу официальных диагностических тестов до 19,2% реагирующих животных. Животные, диагностированные с помощью РНГА, представляют эпизоотическую опасность, что подтверждено результатами бактериологических исследований.

В стадах крупного рогатого скота, реиммунизированного слабоагглюти-ногенными противобруцеллезными вакцинами, с помощью РНГА возможно осуществлять эпизоотический контроль благополучия животных по бруцеллезу и оздоровление неблагополучных пунктов, но не ранее, чем через два месяца после вакцинации.

8. Разработана методика постановки реакции непрямой гемагглютинации с молоком для диагностики бруцеллеза у крупного рогатого скота. Реакция непрямой гемагглютинации с молоком обладает более высокой специфичностью в сравнении с КР, позволяет выявлять дополнительно к показаниям КР от 4,5 до 34,4% реагирующих коров. Установлена возможность применения РНГА с молоком для диагностики бруцеллеза у коров, реиммунизированных вакциной из штамма 82, через 30 дней после ревакцинации и в последующие сроки.

9. Кольцевая реакция с молоком позволяет проводить диагностику бруцеллеза у коров, иммунизированных слабоагглютиногенными противобруцеллезными вакцинами, с целью контроля благополучия хозяйств и дополнительной диагностики бруцеллеза в оздоравливаемых стадах крупного рогатого скота. Усовершенствованная методика постановки и учета реакции дает возможность исключить дополнительные исследования молока на наличие субклинических форм мастита у коров.

10. Количественное соотношение Б-антител, выявляемых единым антигеном в РА и РСК, возможно использовать для дифференциальной оценки животных, привитых вакциной из штамма 82, на бруцеллез. Дифференциацию больных бруцеллезом животных от здоровых целесообразно осуществлять через два месяца и в последующие сроки после иммунизации. Больными следует считать животных с оценкой титра РА — 200 МЕ и выше, РСК - 1:20 и выше. В благополучных по бруцеллезу хозяйствах к больным следует относить животных, имеющих показатели РА в титре 200 МЕ и выше, РСК — в титре 1:40 и выше.

11. Система дифференциальной диагностики бруцеллеза крупного рогатого скота, реиммунизированного вакциной из штамма 82, предусматривающая определение количественного соотношения 8-бруцеллезных антител в сыворотке крови животных при постановке РА, РСК, РНГА, в молоке — с помощью КР или РНГА и наличия Я-бруцеллезных комплементсвязывающих антител в сыворотке крови, имеет высокую противоэпизоотическую и экономическую эффективность, позволяет оздоравливать неблагополучные по бруцеллезу пункты за 10-12 месяцев, при этом предотвращает необоснованный убой здоровых животных, реагирующих на вакцину из штамма 82.

12. Разработан овисный цветной диагностикум для РА пробирочной, обладающий специфичностью, чувствительностью и выявляющий дополнительно к показаниям РСК с антигеном ВНИИБТЖ от 0,4 до 13,6% реагирующих животных в отарах, неблагополучных по инфекционному эпидидимиту баранов.

13. Разработанный овисный антиген из штамма B.ovis 6 для РСК специфичен и имеет высокую диагностическую эффективность. Животные, реагирующие на овисный антиген, представляют эпизоотическую опасность.

14. Разработан метод провокации антител к Яоу/.у при инфекционном эпидидимите баранов, основанный на введении животным бруцеллина или бруцеллоовина общепринятыми способами. Оптимальный срок исследования сыворотки крови животных — 21-28 дни после введения препаратов. Чувствительность метода зависит от сроков первичной антигенной стимуляции.

Экспериментально доказана возможность применения противобруцел-лезной вакцины Яеу-1 в дозе 2 млрд м.к. в качестве средства, провоцирующего антитела к В.оугз. Доказана эпизоотическая опасность животных, диагностированных с помощью этого теста.

15. Антигены, изготовленные из штаммов В.сатБ ЯМ 6/66 и В.аЬогШБ 16/4 (Я-форма) для пластинчатой, пробирочной РА и РСК, обладают специфичностью, позволяют диагностировать в экспериментальных и производственных условиях до 100% собак, инфицированных возбудителем В.сатБ.

16. Эритроцитарный канисный диагностикум, сконструированный при воздействии на микробные клетки 2%-ого раствора додецилсульфата натрия, специфичен и имеет высокую диагностическую эффективность. При экспериментальном инфицировании морских свинок и собак возбудителем В.сатя с помощью антигена в РИГА возможно выявить до 100% зараженных животных.

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Наставление по диагностике бруцеллеза животных» (Утв. ГУВ МСХ СССР 30.12.82 г.).

Инструкция по изготовлению и контролю набора компонентов для серологической дифференциации культур бруцелл» (Утв. ГУВ Госагропрома СССР 30.01.87 г.).

Технические условия (ТУ 10-07-587-87) «Набор компонентов для серологической дифференциации культур бруцелл" (Утв. ГУВ Госагропрома СССР 25.12.87 г.).

Наставление по определению количественного содержания Б- и Я-компонентов в антигеннной структуре бруцелл» (Утв. ГУВ ГКПЗ СМ СССР 05.10.89 г.).

Наставление по применению антигена овисного цветного для РА при диагностике инфекционного эпидидимита баранов» (Утв. ГУВ ГКПЗ СМ СССР 11.11.89 г.).

Инструкция по изготовлению и контролю антигена овисного цветного для реакции агглютинации при диагностике инфекционного эпидидимита баранов» (Утв. ГУВ ГКПЗ СМ СССР 11.11.89 г.).

Наставление по постановке и учету кольцевой реакции с молоком (КР) для диагностики бруцеллеза у коров, привитых вакциной из штамма 82» (Утв. ГУВ ГКПЗ СМ СССР 05.09.90 г.).

Наставление по постановке и учету результатов реакции непрямой гемагглютинации с молоком при диагностике бруцеллеза у коров» (Утв. ГУВ ГКПЗ СМ СССР 30.08.90 г.).

Технические условия (ТУ 10-07-55-90) «Антиген овисный цветной для реакции агглютинации при диагностике инфекционного эпидидимита баранов» (Утв. ГУВ ГКПЗ СМ СССР 30.08.90 г.).

Наставление по постановке и учету результатов реакции непрямой гемагглютинации с сывороткой крови при бруцеллезе крупного рогатого скота» (Утв. ГУВ ГКПЗ СМ СССР 07.09.90 г.).

Наставление по постановке и учету реакции связывания комплемента с R-бруцеллезным антигеном» (Утв. ГУВ ГКПЗ СМ СССР 30.08.90 г. и ГУВ МСХ РФ 15.04.93 г.).

Технические условия «R-антиген бруцеллезный для реакции связывания комплемента» (Утв. ГУВ ГКПЗ СМ СССР ЗОЛ 1.90 г.).

Наставление по постановке и учету реакции связывания комплемента с овисным антигеном» (Утв. ГУВ ГКПЗ СМ СССР 21.06.91 г.).

Инструкция по изготовлению и контролю овисного антигена для реакции связывания комплемента» (Утв. ГУВ ГКПЗ СМ СССР 21.06.91 г.).

Технические условия (ТУ 10-07-142-91) «Антиген овисный для реакции связывания комплемента» (Утв. ГУВ ГКПЗ СМ СССР 21.06.91 г.).

Наставление по диагностике инфекционной болезни овец, вызываемой Brucella ovis (инфекционный эпидидимит баранов)» (Утв. ГУВ ГКПЗ СМ СССР 13.11.91 г.).

Наставление по постановке реакции непрямой гемагглютинации при диагностике бруцеллеза с молоком коров, привитых вакциной из штамма 82» (Утв. ГУВ ГКПЗ СМ СССР 30.08.91 г.).

Наставление по применению набора для серологической диагностики инфекционного эпидидимита баранов в реакции связывания комплемента» (Утв. ГУВ МСХ РФ 27.02.92 г.).

Инструкция о мероприятиях по профилактике и ликвидации инфекционной болезни, вызываемой Brucella ovis (инфекционный эпидидимит бара нов)» (Утв. ГУВ МСХ РФ 03 .07.92 г.).

Наставление по применению набора для диагностики инфекционного эпидидимита баранов в реакции агглютинации» (Утв. ГУВ МСХ РФ 27.02.92г.).

Методические указания по дифференциальной эпизоотической оценке стад крупного рогатого скота, привитого вакциной из штамма 82» (Утв. ГУВ

МСХ РФ 01.07.92 г.).

Рекомендации по применению метода диагностики инфекционного эпидидимита баранов с использованием реакции иммунологической памяти (метод провокации антител)». Одобрены ДВ МСХиП РФ, 1995 г. и рекомендованы для включения в новое наставление по диагностике инфекционного эпидидимита баранов.

Экспериментально-производственный регламент на иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие Я-бруцеллезные сухие № 513-95 (Утв. директором НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН 02.03.1995).

Временная фармакопейная статья ВФС 42/Д-018ВС-95 «Иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие Я-бруцеллезные сухие (Утв. Госком-санэпиднадзором РФ 10.05.1995)

Инструкция по применению иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих Я-бруцеллезных сухих (Утв. Госкомсанэпиднадзором РФ 10.05.1995).

Сборник санитарных и ветеринарных правил «Профилактика и борьба с заразными болезнями, общими для человека и животных» (Утв. Госкомсаннадзора России и Минсельхозпрод России, 1996 г.).

Наставление по применению антигена бруцеллезного эритроцитарного для реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) в порядке широкого производственного испытания» (Утв. Департаментом ветеринарии МСХиП РФ 02.09.98).

Технические условия (ТУ 9388-152-00494185-98) «Антиген бруцеллезный эритроцитарный для реакции непрямой гемагглютинации (РНГА)» (Утв. Департаментом ветеринарии МСХиП РФ 15.09.98 г.).

Методические рекомендации «Диагностика, лечение и профилактика бруцеллеза собак, вызываемого В.сашБ» (Утв. подсекцией «Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии 13.12.2001, протокол № 12).

Концепция оптимизации противобруцеллезных мероприятий у крупного рогатого скота и собак в Сибири, рассмотрена и одобрена научно-техническим советом секции «Ветеринария» Межрегиональной Ассоциации «Сибирское соглашение». г. Омск, 22.08.2003.

Наставление по диагностике бруцеллеза животных» (Утв. Департаментом ветеринарии МСХ 29.09.2003 г.).

Методические рекомендации «Система дифференциальной диагностики бруцеллеза крупного рогатого скота, привитого вакциной из штамма 82» (Утв. подсекцией «Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии 15.01.2004, протокол № 3).