Автореферат и диссертация по медицине (14.00.30) на тему:Бруцеллез в России: современная эпидемиология и лабораторная диагностика

Желудков Михаил Михайлович

БРУЦЕЛЛЕЗ В РОССИИ: СОВРЕМЕННАЯ ЭПИДЕМИОЛОГИЯ И ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА

14.00.30 - «эпидемиология» 03.00.07 - «микробиология»

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Москва 2009

003480393

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук НИИ эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика Н.Ф.Гамалеи РАМН

Научные консультанты: Член- корреспондент РАМН,

доктор медицинских наук, профессор Ананьина Юлия Васильевна

Доктор биологических наук Мещерякова Ирина Сергеевна

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор Семененко Татьяна Анатольевна

Академик РАМН, доктор медицинских наук,

профессор Сергиев Владимир Петрович

Член-корреспондент РАМН, доктор

медицинских наук, профессор Кутырев Владимир Викторович

Ведущая организация: ГОУ АЛО Российская медицинская академия последипломного образования Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию.

Защита диссертации состоится« 23 » октября 2009 г. в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 001.007.02 в НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи РАМН (123098, Москва, ул.Гамалеи 18).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН

Автореферат разослан « 22 » сентября 2009 г. Ученый Секретарь Диссертационного Совета

доктор медицинских наук, профессор Е.В.Русакова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Бруцеллез - особо опасная и социально значимая инфекция, приносящая значительный экономический ущерб и обусловливающая высокий уровень инвалидизации больных (П.А.Вершилова, 1961, Беклемишев Н.Д.1965).

Естественным резервуаром бруцелл в природе являются животные. Соответственно, эпидемиология бруцеллеза целиком определяется его эпизоотологией, а инфекция является типичным зоонозом.

Бруцеллез представляет собой мировую проблему для медицинского и ветеринарного здравоохранения (MJ.Corbel 1997, Boschiroli M.L. е.а., 2001).

По данным Объединенного комитета экспертов ВОЗ по бруцеллезу (1986), эта болезнь среди животных регистрируется в 155 странах мира. Наиболее широко бруцеллез распространен в странах Средиземноморья, Малой Азии, Юга и Юго-Восточной Азии, Африки, Центральной и Южной Америки ( Sauret I.M. е.а., 2002; Ergonul О. е.а., 2004; Karabay О. е.а., 2004; Getinkaua Z. е.а., 2005; Alim A., Tomul Z.D., 2005; Г.Г.Онищенко, 2005).

Вместе с тем ряд стран, особенно в Европе (Англия, Дания, Германия, Финляндия, Швеция, Норвегия, Швейцария, Чехия, Словакия, Румыния), а также Япония добились практически полной ликвидации этой болезни среди животных и людей (Bergstrom е.а., 2003; J. Ron е.а., 2003; Stukelj M., 2003; England T. е.а.,2004; Yumiko Imada, 2004; Al Dahouk S. е.а., 2005; Krkic-Dautovic S. е.а., 2006). Успешно проводится борьба с бруцеллезом в Болгарии, государствах бывшей Югославии, где регистрируются единичные случаи болезни в отдельных регионах (Jones RD е.а„ 2004; Cvetnic Z. е.а., 2003).

В 90-е годы истекшего столетия резко обострилась эпизоотическая и эпидемическая ситуация по бруцеллезу в странах СНГ и России в результате социально-экономических преобразований, в частности, интенсивного процесса приватизации в сельском хозяйстве. В немалой степени этому способствовали и экономические трудности, равно как и ослабление санитарно-ветеринарного надзора за животными индивидуальных хозяйств (Ts. Zakaria е.а., 2003; Л.Е.Цирельсон с соавт., 2004; Р.З.Нургазиев с соавт., 2005; А.И.Сатгаров, 2005; А.И.Калиновский, 2006). '

Возросшая в последние два десятилетия миграция населения, недостаточный ветеринарно-санитарный контроль за ввозом животных из стран неблагополучных по бруцеллезу, включая сопредельные государства СНГ, способны в настоящее время осложнить и без того напряженную эпизоотическую и эпидемическую ситуацию по этой инфекции.

Последнее диктует необходимость совершенствования эпиднадзора, долгосрочного прогнозирования динамики и интенсивности эпизоотического процесса и его эпидемических проявлений с целью своевременного осуществления адекватных профилактических мероприятий (В.И.Покровский, 2005; Г.Г.Онищенко, 2005).

Несмотря на невысокий уровень официально регистрируемой заболеваемости людей бруцеллезом на протяжении последних 10-15 лет в

Российской Федерации (0,3 - 0,4, не выше 0,5 на 100 тыс. населения), истинные показатели гораздо выше. При этом регистрируют только впервые диагностированные (свежие) случаи, в то время как учет хронических форм не ведется. Соответственно, отсутствуют данные об истинной распространенности бруцеллеза среди населения России. Неполная информация о заболеваемости связана не только со снижением обращаемости сельских жителей за медицинской помощью, уменьшением объемов плановых диспансерных обследований людей, работающих в животноводстве, в том числе владельцев скота, но и с несовершенством лабораторной диагностики бруцеллеза, особенно его хронических форм (Н.Д.Беклемишев, 1965; С.В.Дентовская с соавт., 1998; Т.Ю.Загоскина с соавт., 1999; Л.Е.Цирельсон с соавт., 2005).. Вместе с тем, быстро и правильно поставленный диагноз, а также своевременно начатое лечение, значительно сокращают частоту хронизации инфекционного процесса и инвалидизации больных.

До начала наших исследований лабораторная диагностика бруцеллеза осуществлялась с помощью, трудоемкого бактериологического и недостаточно чувствительных и специфичных серологических тестов, рекомендованных инструктивно-методическими материалами (МУ №28-1/6,1980). Это ставило важную научно-практическую задачу - разработать и внедрить в практическое здравоохранение комплекс современных методов и препаратов, направленных на эффективное выявление бруцеллезных антител и антигенов у людей на различных стадиях инфекционного процесса.

Решение этой задачи во многом определяется уровнем знаний об этиопатогенезе бруцеллезной инфекции. Особый интерес с практической точки зрения представляет изучение длительности персистенции возбудителя бруцеллеза, динамики синтеза специфических антител разных классов иммуноглобулинов (G,A,M) при инфекционном и вакцинальном процессах в эксперименте и при различных клинических формах бруцеллеза у людей. Расширение диагностического арсенала за счет новых методов иммуно- и генодиагностики позволит получить новые сведения об особенностях инфекционного и вакцинального процессов при бруцеллезе.

Цель работы: Оценка влияния социально-экономических преобразований в Российской Федерации на эпизоотолого-эпидемические проявления бруцеллеза и тенденции их развития в современный период. Разработка и внедрение в практику здравоохранения современных методов иммуно- и генодиагностики бруцеллеза.

Задачи исследования:

-анализ эпизоотолого-эпидемической ситуации по бруцеллезу и причин ее осложнения в современный период (1997-2006гг.);

-идентификация бруцелл, впервые выделенных на территории РФ от собак, оценка эпидемиологической значимости Brucella canis;

-разработка и сравнительная оценка диагностической значимости иммунологических методов индикации бруцелл, их растворимых антигенов, а также определения специфических бруцеллезных антител;

-создание чувствительных и специфичных диагностических тест-систем и их внедрение в практическое здравоохранение в виде коммерческих препаратов;

-оценка диагностической эффективности ПЦР при исследовании материала из различных очагов бруцеллезной инфекции;

-определение диагностической значимости антител различной физико-химической природы для оценки активности течения бруцеллеза;

-определение длительности персистенции возбудителя в динамике инфекционного и вакцинального процессов с помощью разработанных методов и тест-систем при экспериментальном бруцеллезе и различных формах заболевания у людей с помощью разработанных методов и тест-систем.

Научная новизна работы.

Впервые проведен анализ современной эпизоотолого-эпидемической ситуации по бруцеллезу в РФ, который позволил научно обосновать влияние социально-экономических факторов на эпидемические проявления бруцеллеза на конкретных территориях.

Установлено, что основное эпизоотолого-эпидемиологическое неблагополучие по бруцеллезу за период 1997-2006 гг. определяли Южный (Республики Дагестан, Калмыкия, Северная Осетия, Карачаево-Черкесская, Кабардино-Балкарская и Ставропольский край) и Сибирский (Р.Тыва) Федеральные Округа (ФО), на которые приходится 72,7% больных бруцеллезом людей (впервые установленным), и большая часть пунктов, неблагополучных по бруцеллезу животных: 96,7% по бруцеллезу крупного и 98,4% мелкого рогатого скота.

Выявлены особенности эпидемического проявления бруцеллеза в РФ, связанные с социально-экономическими преобразованиями в стране в 90-е годы, в том числе приватизацией в животноводстве, а также неадекватно проводимыми противобруцеллезными мероприятиями, которые выражаются в:

- росте числа больных людей с неустановленным источником инфекции на 25 территориях (28,4%) субъектов РФ. Последнее указывает на то, что больной бруцеллезом человек, по-прежнему, является «индикатором» эпизоотического неблагополучия территории;

- увеличении в 1,6 раза числа территорий, где регистрируется бруцеллез людей - с 33 (37,1%) в период 1991-1996гг до 52 (58,4%) в 1997-2006гг;

- изменении в социальной и возрастной структуре заболевших: увеличение доли городских жителей (до 24,9%), в том числе детей и подростков (до 27,1%), а также больных, профессионально не связанных с общественным животноводством (до 70,7%), включая безработных;

- росте числа больных с неблагоприятным трудовым прогнозом с 2003 по 2006гг в 1,5 раза, что составило 25,9% от общего числа больных хроническим бруцеллезом;

- расширении спектра эпидемически значимых резервуаров и источников бруцеллезной инфекции, вызываемой В.теШегшз (козье-овечий тип), вследствии интенсификации миграции возбудителя на неспецифических хозяев (крупный рогатый скот);

Впервые на территории РФ, совместно с ветеринарными специалистами, выявлена циркуляция двух биоваров бруцелл вида сзшб среди собак. Получены эпизоотические и микробиологические данные, свидетельствующие о завозе В.сашз из-за рубежа с собаками- компаньонами.

Впервые обоснована эффективность ИФА для лабораторной диагностики бруцеллеза в эпидемиологической и клинической практике, позволяющая выявлять бруцеллезный антиген и специфические антитела различных классов иммуноглобулинов. Применение только одного метода ИФА при обследовании людей в очаге бруцеллеза крупного рогатого скота повысило эффективность диагностики бруцеллеза в 11,9 раз по сравнению с реакцией агглютинации, в 6 раз - реакцией Хеддльсона, в 1,2 раза - антиглобулиновой пробой Кумбса. У больных хроническим бруцеллезом с большой давностью заболевания (более 5 лет) ИФА превосходила диагностические возможности реакции агглютинации в 2,33 раза, РПГА - в 7 раз, РК - в 1,4 раза.

Установлено, что при диагностике бруцеллезной инфекции у людей, ПЦР позволяет регистрировать активность инфекционного процесса при большой давности заболевания (60 мес. и более).

В эпидемиологической практике широкое использование ПЦР ограничено вероятностью выявления ДНК бруцелл у лиц без клинических проявлений, имеющих контакт не только с полевыми, но и с живыми вакцинными штаммами, применяемыми для иммунопрофилактики бруцеллеза животных.

С помощью современных методов детекции специфических антигенов и антител в эксперименте и клинике подтверждена длительная псрсистенция возбудителя бруцеллеза в макроорганизме и выявлены ранее неизвестные стороны патогенеза инфекционного и вакцинального процессов при бруцеллезе. Установлено, что в так называемую «стерильную» фазу инфекционного процесса, когда возбудитель бруцеллеза уже не выделяется (12 мес. от начала заражения вирулентной культурой бруцелл), наступает пик циркуляции специфического антигена и антител, тестируемых в ИФА, продолжительностью до 23 мес. (срок наблюдения). При бруцеллезе у людей специфические антиген и ДНК выявляли также в течение длительного срока заболевания (более 5 лет).

Практическая значимость работы:

- разработаны, апробированы и рекомендованы к практическому использованию современные методы микроанализа: иммуно-радиометрический (ИРМА), иммуноферментный (ИФА), реакция нейтрализации антител (РНАт), иммунофлуоресценции, флуоресцентный иммуноанализ с временным разрешением (ФИАВР), ПЦР. Определены основные параметры указанных тестов и их диагностическая значимость для идентификации, индикации и иммунологической диагностики бруцеллеза;

внедрены в производство и используются в практике здравоохранения:

-тест-система иммуноферментная для определения бруцеллезных антител (ЭПР №185-89 от 2.06.1989; ФСП 42-214ВС-89 от 2.06.1989),

-тест-система иммуноферментная для определения бруцеллезного антигена (ЭПР №25-86 от 13.11.1986; ВФС 42-51ВС-86 от 24.11.1986),

-иммуноглобулины диагностические бруцеллезные люминесцирующие, сухие (РП №247-82 и ТУ 42.14-290-82,- 1982г),

-иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие Я-бруцеллезные, сухие (ВФС 42/Д-018 ВС-95 от 10.05.1995; ЭПР №513-095 от 02.03.1995),

-диагностикум бруцеллезный жидкий для реакции агглютинации ( РП №1277-02 от 28.12.2002; ФСП 42-0180-4778-03 от 06.07.2004),

-вакцина бруцеллезная химическая жидкая (ФСП 42-0433376002.- 2002 РП № 1175-02),

изготовлены и переданы для практического использования в ГИСК им.Тарасевича:

-стандартный образец сыворотки бруцеллезной агглютинирующей сухой ОСО 42-28-6-88П,

-стандартный образец антигена бруцеллезного жидкого ОСО 42-28-5-88П,

а также разработаны следующие методические материалы:

- Бруцеллез (методические рекомендации по диагностике, лечению и реабилитации). М., 1987, С.28

- Бруцеллез. СП 3.1.085-96. Профилактика и борьба с заразными болезнями, общими для человека и животных. Сб. сан. и вет. правил. М. 1996, С.20-46.

- Профилактика и лабораторная диагностика бруцеллеза людей Методические указания (МУ 3.1.7.1189-03) МЗ РФ, М., 2003. С.58

- Бруцеллез в Российской Федерации в 2001-2005 годах. Информационный бюллетень ФС по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Москва 2007. С. 12

Материалы диссертации используются в лекциях по эпидемиологии и микробиологии бруцеллеза на кафедрах микробиологии РМАПО и инфектологии ММА им.И.М.Сеченова, составлено и опубликовано учебное пособие «Лабораторная диагностика бруцеллеза» М.1988, а также учебно-методическое пособие для врачей-бактериологов «Полимеразная цепная реакция (ПЦР) и ее применение в бактериологии» М.2006.

Апробация работы

Основные результаты диссертационной работы были доложены на научных конгрессах, съездах, конференциях: Всесоюзная научно-практическая конференция «Актуальные вопросы иммунодиагностики особо опасных инфекций» Ставрополь, 1986;У съезд гигиенистов, санитарных врачей, эпидемиологов. Микробиологов и инфекционистов Узбекистана, Ташкент, 1987;Международный конгресс по зоонозам, Брно, ЧССР, 1988; Всесоюзная конференция «Актуальные вопросы профилактики бруцеллеза и организации медицинской помощи больным», Новосибирск,1989; Всесоюзная конференция «Применение иммуноферментного анализа в медицине», Харьков, 1989;

Республиканская конференция «Новые методы диагностики СПИД, других вирусных и бактериальных инфекций в практике инфекционной и противоэпидемической службы», Алушта, 1990; Всесоюзная научная конференция «Новые методы прогноза патологического процесса.», Курск, 1991; Всесоюзная конференция «Актуальные проблемы химиотерапии бактериальных инфекций», Москва,1991; Научная конференция «Современные аспекты профилактики зоонозных инфекций», Ставрополь, 1991; Научно-практическая конференция «Здоровье человека и экологические проблемы», Киров,1991; Республиканская научно-практическая конференция по курортологии и физиотерапии, Махачкала, 1991; Съезд врачей инфекционистов в г.Суздале, 1992; Научно-практическая конференция «60 лет противочумной службы Кавказа».-«Актуальные вопрсы профилактики особо опасных и других инфекционных заболеваний», Ставрополь, 1995; XY международный симпозиум «Salmonellosis-Brucellosis», Кипр,1997; Совещание зам.главных врачей и заведующих отделами ООИ ЦГСЭН в субъектах РФ, начальников противочумных учреждений МЗ РФ.,Москва, 1999; YII, YIII, IX съезды Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, Москва,1997, 2002, 2007г.г.; III международная конференция «Актуальные проблемы ветеринарной медицины мелких домашних животных на Северном Кавказе», Персиановский, 2000; 53 бруцеллезная научная конференция "Brucellosis 2000", Франция,2000; Девятый Московский международный ветеринарный конгресс, Москва, 2001; Научная конференция «Молекуляно-биологоческие и генетические методы диагностики в инфекционной патологии», Москва,2002; Международная конференция «Развитие международного сотрудничества в области изучения инфекционных заболеваний», Новосибирск,2004; Международное рабочее совещание «Бруцеллез -пограничная инфекция животных и человека, требующая общих усилий разных стран», Серпухов, Мос.обл., 2008; Международная научная конференция «Brucellosis 2008», Лондон 2008.

Апробация диссертации состоялась на научной конференции отделов Медицинской микробиологии, Эпидемиологии и Природноочаговых инфекций ГУ НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН 12 февраля 2009 г.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 82 работы, в том числе 20 в журналах, рекомендованных ВАК для публикаций материалов диссертаций на соискание ученой степени доктора наук. Результаты исследований вошли в 7 научных отчетов по плановым темам НИР, выполненным при участии автора в качестве руководителя, ответственного исполнителя и исполнителя (№№ госрегистрации 79049008,01840011426, 01860012395, 01840016820, 01930004074, 01970005014, 01200110335). Полученные материалы нашли отражение в двух коллективных монографиях, двух рационализаторских предложениях и 3 патентах на изобретения.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена в монографическом стиле на 268 страницах машинописи и состоит из введения, 5 глав результатов собственных исследований, заключения, выводов и списка использованной литературы. Работа иллюстрирована 58 таблицами и 20

рисунками. Указатель литературы содержит 336 источников, из них 180 отечественных и 156 зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследований

Для анализа эпизоотолого-эпидемиологической ситуации по бруцеллезу на территории России использована государственная статистическая отчетность Роспотребнадзора МЗ РФ за 1997-2006 гг; отчетные данные территориальных Управлений Роспотребнадзора в 2003-2005 гг. по специально разработанному нами вопроснику, данные ФГУ Центра Ветеринарии МСХ РФ, а также результаты собственных эпидемиологических исследований в рамках деятельности лаборатории бруцеллеза НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН, являющейся Референс центром ВОЗ и Национальным Центром по бруцеллезу МЗ РФ, руководствуясь последним основополагающим документом (Приказ МЗ РФ и РАМН № 2/2 от 05.01.2000 г. «Положение о центре МЗ по бруцеллезу»).

Штаммы и условия культивирования. В работе использованы штаммы: В .abortus 19, 146, 544, 63/75, 104М, 82, 870, 99, А422, 340, 341, 343; B.melitensis 16М, 565, 753, 758/245, 51, 245; B.suis 1330, 214, 513, 6, 705; B.canis RM 6/66; В. neotomae 66/2; В. ovis 63/290 из коллекции лаборатории бруцеллеза НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи РАМН, а также B.ovis 424/2, B.abortus 16/4(МВБ) из коллекции ФГУ ВГНКИ.

Штаммы бруцелл выращивали на триптозном агаре ("Difco", США) с добавлением 1% глюкозы и глицерина при 37°С в течение 48 часов. Инактивацию выращенных культур проводили прогреванием на водяной бане при 80°С в течение 1,5 часа.

В качестве гетерологичных тест-штаммов использовали убитые нагреванием Y.enterocolitica 0-3 (134), 114,11738, 12202 хр Sh.dys.Newcastle 1251, Flexner 516, Sonne 1674, S.typhymurium5710, E.coli HB 101, F.tularensis 15 НИИЭГ, F. tularensis 503, E.Coli C-600, V. cholerae v 4, Y. pestis EV, Y. pestis pCad+, Y. pestis 995 p45, Mycoplasma fermentis, Mycobacterium tuberculosis, Micobacterium bovis, Legionella pneumophila. Гетерологичные тест-штаммы получены из соответствующих лабораторий института и Рос НЙПЧИ «Микроб».

Сравнительное изучение выделенных культур проводили по методикам, рекомендованным комитетом экспертов ФАО/ВОЗ (6 доклад, 1986г.) по бруцеллезу.

Для выполнения поставленных в ходе настоящей работы задач использовали клинический материал, исследования которого проводилось с помощью молекулярно-генетических и иммуно-серологических методов. Всего исследовано 2145 сывороток крови людей, из них: больные острой и подострой формой бруцеллеза - 431; больные хронической формой - 1009; по эпидемиологическим показаниям - 440; с целью определения специфичности разрабатываемых диагностикумов и тест-систем использованы сыворотки крови доноров, больных различными заболеваниями инфекционной и неинфекционной этиологии, вакцинированных живой туляремийной вакциной) - 265.

Иммуносерологические тесты: реакции агглютинации на стекле (Хеддльсона) и в пробирках (Райта), РПГА, антиглобулиновую пробу Кумбса, ИФА проводили по методикам, описанным в Методических указаниях по профилактике и лабораторной диагностике бруцеллеза людей (Москва,- 2003).

Выделение растворимого антигена (ЛПС) B.abortus 99, который использовался для сенсибилизации полистироловых планшет в ИФА, проводили из антигенного комплекса Буавена мягким щелочным гидролизом с последующим спиртовым осаждением и препаративной гель-хроматографией на колонках с сефадексом G-100, по методике, разработанной в лаборатории бруцеллеза НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи (Вершилова П.А., 1968).

Для выявления иммуноглобулинов разных классов с помощью ИФА использовали коньюгаты aiiTH-IgG,A,M мыши и aimi-IgG,A,M,E человека фирмы Sigma (США).

Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили в соответствии с разработанными лабораторией генной инженерии патогенных микроорганизмов НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи РАМН рекомендациями на приборе «Терцик» (Россия) с использованием праймеров, синтезированных АО «Синтол».

Моделирование инфекционного и вакцинального процессов проводили на беспородных белых мышах весом 18-20 г. и морских свинках массой 300-350 г. Животных заражали вирулентным штаммом В. melitensis 565 в дозе 1х102 м. кл/мл и B.abortus 19-ВА -1х109 м.кл/мл, подкожно в паховую область. Концентрацию микробных клеток определяли с помощью отраслевого стандартного образца мутности ГИСК им Л. А. Тарасевича.

Статистическая обработка результатов. Использованы методы математической статистики, принятые в биологии и медицине ( Ашмарин И.П., Воробьев А.А., 1962).

Эпизоотолого-эпидемическая ситуация по бруцеллезу в России в период социально-экономических преобразований (1997-2006 тт.)

Эпизоотическая ситуация по бруцеллезу в странах СНГ и Российской Федерации обострилась с начала 90-х годов прошлого столетия в результате социально-экономических преобразований в обществе и приватизации в сельском хозяйстве. В немалой степени это связано с экономическими трудностями, значительным ослаблением санитарно-ветеринарного надзора за животными индивидуальных хозяйств, куда переместилась большая часть сельскохозяйственных животных, особенно мелкого рогатого скота.

По официальным статистическим данным Департамента ветеринарии и животноводству произошло перераспределение числа животных в хозяйствах. Если в 1990 году в общественном секторе находилось 82,7% крупного- и 72,3% мелкого рогатого скота (КРС и MPC), то в 2006 году 48,5 и 23,0% соответственно. Увеличение в частном секторе неучтенного, не охваченного серологическими исследованиями на бруцеллез и профилактической вакцинацией скота, несоблюдение карантина при вводе новых животных в хозяйства, сказалось на ухудшении эпизоотической ситуации.

Официальные статистические данные ветеринарной службы свидетельствуют о преобладании в России пунктов неблагополучных по бруцеллезу КРС. Так, в 2006 году из 71 пункта 57 (80,3%) находились в Южном ФО, из 15 пунктов по мелкому рогатому скоту 11 (73,3%) - также в этом регионе. В среднем за 2002-2006 гг. эти цифры были примерно такими же - соответственно 79,6% и 75,4%.

Наибольшая сосредоточенность неблагополучных пунктов по бруцеллезу животных обоих видов в Южном регионе страны объясняется изменением технологии ведения животноводства. В индивидуальных хозяйствах с совместным содержанием крупного и мелкого рогатого скота создались благоприятные условия для миграции B.melitensis на крупный рогатый скот. Ветеринарная служба проводит противобруцеллезные мероприятия в большей мере относительно КРС (охват серологическими исследованиями в 2006г в целом по России составил 97,4%), тогда как MPC, особенно в индивидуальных хозяйствах, обследуется только по эпидемическим показаниям, когда заболевают люди.

Ежегодно на территории РФ регистрируется 300 - 500 случаев заболевания людей бруцеллезом, впервые выявленным. За 1997-2006 гг. диагноз бруцеллеза установлен у 4671 человека, в том числе детей до 14 лет - 329 (7,0%) (рис.1).

Федерации.

Интенсивный показатель заболеваемости на 100 тыс. населения находился в пределах 0,3-0,4, детей до 14 лет - 0,22-0,07, демонстрируя относительно спокойную и стабильную эпидемиологическую ситуацию по данной инфекции в России (рис.2).

0,45 0,4 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 О

1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006

Рисунок 2. Интенсивный показатель заболеваемости людей бруцеллезом, впервые выявленным в РФ. Сплошная линия - взрослые, пунктирная - дети до 14 лет.

Удельный вес сельских жителей в числе зарегистрированных больных бруцеллезом, впервые выявленным, составил 75,6%.

В течение 1997-2006 гг. бруцеллез у людей зарегистрирован на 58 территориях РФ (рис.3). Наибольшая заболеваемость людей регистрировалась в Южном ФО - 3138 человек (67,2% от учтенной в стране за указанный период), большая часть которой (91,1%) приходилась на 6 субъектов (Республики Дагестан, Калмыкия, Карачаево-Черкесская, Кабардино-Балкарская, Северная Осетия, а также Ставропольский край). В Сибирском ФО заболеваемость бруцеллезом зарегистрирована у 983 человек (21,1%), где наибольшее эпидемическое неблагополучие обеспечивали два субъекта - Р.Тыва и Хакасия, Приволжском - 5,7% (Саратовская, Оренбургская области); Уральском - 2,5% (Челябинская, Тюменская области); Центральном - 1,6% (г. Москва, Московская область); Дальневосточном - 1,4% (Р.Саха, а также Хабаровский край, Амурская область): Северо-Западном ФО - 0,5% (г. Санкт-Петербург). Всего за этот период зарегистрировано 329 больных детей, из них 170 детей - в Р. Тыва, 90 и 20 - в Р. Дагестан и Ставропольском крае соответственно. Более 70% детей, заболевших бруцеллезом, впервые выявленным, проживали в сельской местности.

В 1997-2006 годах наиболее сложная эпидемическая ситуация наблюдалась в Южном ФО, в котором средний показатель заболеваемости превышал в целом по России в 4,5 раза. На отдельных территориях превышение среднероссийского показателя было более чем в 20 раз (р.Калмыкия и Дагестан - 22,4 и 25,5 соответственно), в 4-8 раз - в республиках Карачаево-Черкессия, Северная Осетия, Кабардино-Балкария и Ставропольском крае. В Сибирском ФО наиболее

21,10%

□ Южный Ш Сибирский □ Приволжский В Прочие

Рисунок 3. Заболеваемость людей бруцеллезом в Федеральных Округах (1997-2006гг)

неблагополучная ситуация сложилась в Р.Тыва, показатель заболеваемости в которой превышал среднероссийский в 50,6 раз. Основным источником инфекции в Южном ФО и в Р. Тыва является мелкий рогатый скот.

Однако представленные показатели заболеваемости людей нельзя считать достоверными из-за неудовлетворительного состояния лабораторной диагностики.

250000

3 200000

х

х

§ 150000

ю 100000

о

о

| 50000

0

< Всего обследовано —-» - С диагностической целью

— И По эпидпоказаниям —■ — Плановые профилактические

Рисунок 4. Серологические исследования на бруцеллез людей в РФ (1995-2006гг). По оси абсцисс - годы, по оси ординат - число обследованных

За 1995-2006 годы объем серологических исследований на бруцеллез в РФ с диагностической целью сократился в 3 раза (рис.4). Лица с положительными серологическими реакциями на бруцеллез в ряде случаев не проходят полного клинического и повторного лабораторного обследования. Некоторые субъекты РФ серологические исследования на бруцеллез за указанный период практически не проводили.

Бактериологическая диагностика бруцеллеза проводится в единичных случаях (рис. 5). Так, если в 1995 году бактериологически было обследовано 58,9% больных впервые выявленным бруцеллезом, то в 2005 году - только 5%. За этот период объем бактериологической диагностики сократился в 12, 6 раз. Согласно данным бактериологических исследований, присланным с мест за 20032005 гг., из 506 посевов крови возбудитель бруцеллеза изолирован в 26 случаях (24 культуры относились к B.meiitensis, 2 - B.abortus). Большинство выделенных культур приходилось на р.Дагестан (61,6±10,1%) и р.Калмыкия (19,2±8,2%), 2 культуры бруцелл изолированы от больных Астраханской области, по одной -р.Тыва и Челябинской области. Даже этот небольшой материал свидетельствует о связи эпидемиологической ситуации с неблагополучием по бруцеллезу, прежде всего, MPC в Южном регионе страны. Вместе с тем, незначительный объем бактериологических исследований не только снижает диагностические возможности, но не позволяет осуществлять мониторинг за циркуляцией возбудителя и проводить адекватные противобруцеллезные мероприятия на конкретных территориях.

Рисунок 5. Бактериологические исследования на бруцеллез в РФ (1995-2006гг). По оси абсцисс - годы, по оси ординат - число обследованных.

Анализ заболеваемости людей с учетом профессионального и возрастного состава заболевших, путей передачи инфекции проведен на материале 2003-2005 гг., предоставленном территориальными Управлениями Федеральной службы. Большую часть больных бруцеллезом, впервые выявленным, составляли мужчины (63,9%). Больные чаще инфицировались контактным (68,1%) и алиментарным (23,9%) путем. У 8% больных путь передачи инфекции установить не удалось. Из 1462 больных, учтенных за указанные 3 года, у 429 (29,3%) инфицирование было связано с профессиональной деятельностью (контакт с общественным скотом), у 1033 больных (70,7%) этой связи не обнаружено. Среди профессиональных больных были чабаны (5,3%), их помощники (1,2%), ветеринарный, зоотехнический персонал (8,8%), скотники, доярки, телятницы (9,0%), рабочие убойных пунктов (0,8%), оленеводы (0,2%), рабочие предприятий по переработке животноводческого сырья (4,0%). В группе непрофессиональных больных большую часть (50,8%) составляли владельцы животных, остальные (19,9%) не имели отношения к животноводству (безработные; городские жители; пенсионеры; домохозяйки; студенты и др.). Таким образом, в современных условиях происходит опосредованное воздействие социально-экологических факторов на пути и факторы передачи инфекции, инфицирование категорий населения, ранее не столь часто вовлекающихся в процесс. Возросший процент заражения алиментарным путем свидетельствует об употреблении инфицированных продуктов питания.

Почти половина больных, учтенных в 2003-2005 гг., была в возрасте до 40 лет (дети и подростки - 12,2%; 20-39 лет - 37,4%; 40-59 лет - 42,3%; 60 лет и старше - 8,1%.

Изучение сезонности заболеваемости людей бруцеллезом, впервые выявленным, в наиболее неблагополучных субъектах Южного и Сибирского ФО показало, что с марта по сентябрь-октябрь регистрировалось от 76 до 92% больных, в то время как в 70 - 80 -е годы XX века основная часть больных регистрировалась в весенне-летний период (март-июнь). В какой-то мере это может объясняться особенностями ведения животноводства в индивидуальных хозяйствах смешанного типа (изменение сроков осеменения животных, разное время окота и отела, доения коз, овец и коров, сезон стрижки овец), однако по нашему мнению, «удлинение» сезонности до 7 - 8 месяцев в значительной степени связано со слишком длительными сроками установления диагноза бруцеллеза у людей.

Сравнительный анализ эпидемиологических и эпизоотологических данных за 2002-2006 гг. (рис.6) показал, что только 30 (34,1%) территорий субъектов РФ были свободны от бруцеллеза среди животных и людей, на 9 (10,2%) территориях регистрировались больной бруцеллезом КРС, MPC и заболеваемость людей, на 15 (17,0%) - пораженность бруцеллезом КРС и заболеваемость людей, на 3 (3,4%) -пораженность MPC и заболеваемость людей, на 6 (6,8%) - только пораженность КРС и MPC при отсутствии регистрации больных людей, на 25 (28,4%) территориях - заболеваемость людей при отсутствии установленного источника инфекции. Из этого следует, что в России, по-прежнему, больной бруцеллезом

человек является «индикатором» эпизоотического неблагополучия по бруцеллезу территории.

ПВ 1 02 аз 534 О 5 ■ 6 В7

Рисунок 6 Эпизоотолого-эпидемиологическая характеристика территорий РФ по бруцеллезу в 2002-2006 гг.

Примечание: территории, на которых регистрируется бруцеллез:1-только у людей (28,4%); 2-людей, КРС и MPC (10,2%); 3-людей и КРС (17,0%); 4-людей и MPC (3,5%); 5-тодько КРС (4,5%); 6-только MPC (2,3%); 7-бруцеллез не регистрировался (34,1%).

Анализ заболеваемости людей бруцеллезом на указанных территориях показал, что максимальная заболеваемость людей бруцеллезом - 1809 человек (73,4% от общего количества, учтенного в стране), сосредоточена на 9 (10,2%) территориях субъектов РФ, преимущественно в пунктах, неблагополучных по бруцеллезу обоих видов животных, тогда как на 15 (17,1%) территориях, неблагополучных только по крупному рогатому скоту, бруцеллезом заболели лишь 454 (18,4%) человека, на 3 (3,4%) территориях с наличием пунктов, неблагополучных по мелкому рогатому скоту - 81 (3,3%). На 25 (28.4%) территориях бруцеллез установлен у 122 больных (4,95%), однако источник инфекции установлен не был - Сибирский, Приволжский и Уральский ФО. Учитывая преимущественно хронические варианты бруцеллеза у данных больных, источником инфекции мог быть крупный рогатый скот, диагностика бруцеллеза у которого не всегда представляется возможной (так называемые «скрытые» очаги бруцеллеза). На 30 (34,1%) территориях бруцеллез среди животных и людей не регистрировался (Центральный, Северо-Восточный и Дальневосточный ФО), что, возможно, связано с незначительным объемом диагностических серологических исследований.

Следовательно, наиболее опасными для инфицирования людей были очаги смешанного типа, в которых созданы благоприятные условия для миграции высоковирулентного возбудителя B.melitensis на нетипового хозяина с

последующей реализацией алиментарного пути передачи инфекции через молоко коров и возникновением эпидемических вспышек бруцеллезной инфекции, нередко далеко за пределами очага. Изменение технологии ведения животноводства (совместное содержания различных видов животных) владельцами скота в современный период значительно осложняет не только эпидемиологическую ситуацию, но и проведение противобруцеллезных мероприятий.

Косвенным признаком, свидетельствующим о ведущей роли мелкого рогатого скота как источника инфекции для людей, а также активности эпизоотических очагов бруцеллеза среди MPC, является преобладание острых клинических форм бруцеллеза у людей. По данным материалов за 2003-2005 гг., представленных Управлениями Роспотребнадзора субъектов РФ, преобладание у людей острых форм бруцеллеза отмечается преимущественно в Южном ФО (республики Дагестан, Кабардино-Балкарская, Калмыкия, Северная Осетия и Ставропольский край), а также в Сибирском (Р. Тыва). Соотношение острых и хронических клинических форм бруцеллеза на данных территориях колебалось от 2:1, до 7,66:1. Эпидемиологическая роль MPC на территориях Южного и Сибирского ФО подтверждается преимущественным выделением культур B.melitensis от больных людей в 2003 - 2005 гг. в республиках Дагестан, Калмыкия, а также в Челябинской области, в которой за этот период не было выявлено ни одного случая бруцеллеза среди сельскохозяйственных животных. Только от 2-х больных бруцеллезом были изолированы культуры В. abortus (Р. Дагестан).

Диспансерное наблюдение за животноводами с целью активного выявления больных в настоящее время значительно сокращено в объеме. С другой стороны, выявленные положительно реагирующие на бруцеллезный антиген лица чаще всего в дальнейшем не обследуются более углубленно и не берутся на диспансерный учет. В результате упускается возможность ранней диагностики, своевременного и эффективного лечения, предупреждения неблагоприятных исходов болезни.

За последние годы возросла частота случаев с неблагоприятным трудовым прогнозом. В 2003-2005 годы число лиц, состоящих на диспансерном учете, как переболевших бруцеллезом, так-и больных хронической формой заболевания, составляло: 2003 г.- 2570,2004 г. -2653,2005 г. -3148 человек. За этот период инвалидность по бруцеллезу зарегистрирована, соответственно у 279, 219 и 200 больных (всего - 698 человек). Наиболее частая инвалидизация больных регистрировалась в Южном (57,25% от учтенной в РФ) и Сибирском (21,0%) ФО. До 2003 года на учете состояло 1475 инвалидов по бруцеллезу, в основном лиц трудоспособного возраста. На 2006 год в России числилось 2173 больных, имеющих инвалидность по бруцеллезу, что составило 25,9%.

Высокий процент инвалидизации при бруцеллезе за последние годы связан с одной стороны, с вступлением в силу Положения РФ о материальной компенсации больным профессиональными заболеваниями (2003г.) и повышением обращаемости контингента, ранее переболевшего бруцеллезом. С другой - поздней диагностикой, некачественным проведением лечения и

диспансеризации переболевших, отсутствием реабилитации в санаторных условиях.

До настоящего времени специфическая иммунопрофилактика людей осуществлялась с помощью живой бруцеллезной вакцины из штамма B.abortus 19 ВА. После распада СССР, реформирования хозяйственной деятельности в животноводстве и сложившихся экономических трудностей объем вакцинопрофилактики бруцеллеза у людей снизился в 6-7 раз. В 2003-2005 гг. иммунопрофилактика среди угрожаемых групп населения проводилась лишь в 8 субъектах РФ (республики Калмыкия, Алтай, Бурятия, Ростовская, Оренбургская и Иркутская области), в которых вакцинированы 2170 и ревакцинированы 1495 человек. В таких субъектах РФ, как Ставропольский край, Р.Хакасия, Карачаево-Черкесская Р., где регистрируется высокий процент больных профессиональным бруцеллезом, вакцинопрофилактика не проводится. Малый объем планируемой вакцинопрофилактики в России в последние годы, в определенной мере, связан еще и с тем, что в эпидемиологической структуре заболеваемости преобладает контингент (70,7%), профессионально не связанный с животноводством, а специфическая профилактика бруцеллеза у этого контингента не предусматривается директивными документами.

В настоящее время вопрос о специфической профилактике бруцеллеза среди угрожаемых контингентов в России остается особенно актуальным. Возросшая заболеваемость непрофессиональных групп населения, ранее не имевших навыков в обслуживании большого числа различных видов животных и не подлежавших плановым обследованиям на бруцеллез (диспансеризации) и специфической вакцинации, требует незамедлительной разработки и утверждения Методических указаний об обязательном диспансерном наблюдении за выше указанным контингентом, аналогичным профессиональной группе.

B.canis - новый возбудитель бруцеллеза на территории России и его эпидемиологическая значимость

Согласно литературным данным, бруцеллез собак представляет серьезную опасность для людей, в основном для их хозяев, а также обслуживающего персонала - работников питомников и ветеринарных специалистов.

Первое сообщение об этом заболевании появились в США в 60 -е годы. В питомниках для собак были широко распространены аборты, пропустовки, эпидидимиты, вызванные грамотрицательными коккобактериями. Культуру микроорганизмов в чистом виде (B.canis) впервые выделил Carmichael L. в 1966 г. После многолетних исследований, проведенных в различных лабораториях по изучению бруцеллеза, в 1974 г. по решению Подкомитета по таксономии бруцелл Международного комитета по номенклатуре бактерий B.canis утверждена в качестве самостоятельного вида рода Brucella.

С момента первой публикации о выявлении нового вида бруцелл бруцеллез собак, вызванный B.canis, зарегистрирован во многих странах мира: США, Канада, Мексика, Китай, Австралия, Великобритания, Франция, Германия, Италия и др.

В 1994г. в Волгоградской области в ветлаборатории из абортированного

плода американского стаффордширского терьера, принадлежащего частному лицу, была выделена культура микроорганизмов по фенотипическим характеристикам сходная с R-формой бруцелл. Согласно результатам эпизоотологического расследования стало известно, что заражение собаки произошло от стаффорширдского терьера, ранее привезенного из США для племенных целей.

Нами, совместно с сотрудниками отдела препаратов против хронических болезней животных ВГНКИ, проведено изучение тинкториальных, культуральных, молекулярно-биологических и генетических свойств выделенной культуры. Использование классических методов дифференциации видов бруцелл позволило отнести выделенный от собаки штамм к виду B.canis, который нами был обозначен как К-01.

Устойчивость культуры к натриевой соли бензилпенициллина, установленная нами, и сообщение зарубежных исследователей о существовании второго биовара B.canis, отличающегося от референтного штамма B.canis RM 6/66 (Forbes L.B. Panteckoen J.F., ¡988), позволили отнести изучаемый нами штамм B.canis К-01 ко второму биовару вида canis идентичному B.canis МЕХ 51.

Для дальнейшей характеристики штамма B.canis К-01 и подтверждения его таксономического статуса нами был проведен иммуноблотинг клеточных лизатов со специфической сывороткой, который позволяет получить информацию об антигенном составе анализируемых штаммов (рис.8).

Рисунок.8 Иммуноблотинг клеточных лизатов после разделения белков в 12,5% полиакриламидном геле. 1- В.бшэ 1330,2- В.сашБ 6/66,3 - В.сашв К-01

При использовании антибруцеллезной Я - сыворотки отмечается идентичность профилей антигенов лизатов штаммов В.саше ЯМ 6/66 и В.саги.? К-01, взаимодействующих с антителами этой антисыворотки. Высокая степень сходства отмечена также с лизатом штамма В^шв 1330, что позволяет сделать заключение об идентичности поверхностных антигенов у сравниваемых штаммов.

Таким образом, эти исследования наглядно демонстрируют сходство вновь выделенного штамма В.сашэ К-01 с референтным штаммом В.сашэ 11М 6/66 (рис.8).

Сыворотку крови абортировавшей собаки исследовали в РА и ИФА с Я- и Б-бруцеллезными антигенами. Корпускулярный Я- диагностикум был приготовлен из референтного штамма В.сашэ 6/66 по методу, предложенному ФАО/ВОЗ по бруцеллезу, в-антиген - коммерческий диагностикум. При постановке ИФА в качестве Я-антигена использовали ультразвуковой дезинтеграт В.сашв 6/66, а Б- антиген - ЛПС, выделенный из В.аЬоПив 99. Использовали коньюгат анти-^О собаки, изготовленный филиалом «Медгамал» ГУ НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи РАМН. Забор крови проводили через 50 дней после аборта, одновременно обследовали собаку, находившуюся в одном помещении с больным животным. У обеих собак были выявлены специфические антитела как в РА, так и ИФА с Я-бруцеллезным антигеном в диагностических титрах. Результаты ИФА были также положительными с 8-антигсном в низких титрах, что может быть обусловлено наличием ЯБ-антител в организме зараженных животных.

Для уточнения эпизоотической опасности через 2,5 месяца после выделения культуры (подозрительной на бруцеллы) были обследованы собаки, контактировавшие с больным животным на общих выгульных площадках. Из трех собак у одной были положительными РА с Я- бруцеллезным антигеном в титре 1:20, а ИФА - 1:1600 и одно животное реагировало в РА -1:10. Эти данные свидетельствует о достаточно быстром распространении инфекции среди животных.

В 1999 году из государственной академии ветеринарной медицины Санкт-Петербурга поступило для идентификации 10 культур бактерий, выделенных из крови и внутренних органов собак, принадлежащих частным лицам или содержащихся в питомнике. Культуры обладали свойством термопреципитации, в РА на стекле не реагировали с Б-бруцеллезной сывороткой и агглютинировали с Я-сывороткой.

Первоначально идентификацию выделенных штаммов мы проводили с помощью ПЦР с использованием родоспецифических праймеров (рис.9). Результаты показали, что специфический продукт амплификации 260 н.п. образуется как у контрольных штаммов бруцелл (дорожки 11-18), так и у всех свежевыделенных штаммов (дорожки 1-10), и соответствует полосе амплификации положительных контролей ДНК бруцелл (дорожки 19-20).

Ш* пиши: m.l ЩИ mni' щ «рр> «в» ¡ш^^ЦМ^и'и ММ 'МШ МММИМ и*

Рисунок 10. Анализ продуктов ПЦР в 1,5% агаразном гель-электрофорезе. 1-10 - штаммы, выделенные от больных собак; 11- B.melitensis 16М; 12- В.abortus 544; 13-B.abortus 16/4; 14- B.suis 1330; 15-B.abortus 19; 16-B.canis RM6/66; 17- B.ovis 424/2; 18- B.canis K-01; 19- ДНК B.abortus 99; 20- ДНК B.melitensis 565.

Таким образом, с помощью ПЦР было установлено, что выделенные штаммы относятся к роду Brucella. Однако установить вид бруцелл с помощью ПЦР было невозможно, так как нами были использованы родоспецифические праймеры.

Для видовой идентификации изучались фенотипические характеристики этих культур по методам, рекомендованным ФАО ВОЗ по бруцеллезу, которые позволили отнести их к виду В. canis. Из 10 изученных штаммов 7 показали сходство с В. canis RM6/66, однако 3 штамма имели отличия, в частности, ростом на плотных питательных средах с добавлением фуксина и сафранина и повышенной концентрацией пенициллина. Сравнение полученных нами результатов подтвердило ранее высказанное предположение о существовании 2 биоваров В. canis (Forbes et al 1984), один из которых соответствовал по фенотипическим характеристикам референтному штамму В. canis RM6/66, а другой - штамму В. canis Мех51.

Эти данные свидетельствуют о том, что на территории РФ циркулируют два биовара B.canis, а на территории Санкт-Петербурга имеется очаг эпизоотии, вызванный B.canis.

Первый случай заболевания собак бруцеллезом, вызванный B.canis в Москве, зарегистрирован в 1998 году. Это дало нам возможность обследовать хозяев больных бруцеллезом собак и членов их семей. У всех собак (3 немецкие овчарки) в сыворотке крови были выявлены специфические антитела в диагностических титрах как в РА, так и ИФА с R-антигенами.

В сыворотке крови хозяйки, которая непосредственно занимается уходом за животными, были выявлены специфические R-бруцеллезные антитела в РА и ИФА в титрах 1:200 и 1:1600 соответственно. При этом хозяйка предъявляла жалобы характерные для бруцеллеза (длительный субфебрилитет, слабость, повышенная утомляемость, боли в мышцах и суставах), при консультировании инфекционистом, был верифицирован диагноз бруцеллеза и проведена патогенетическая терапия.У хозяина только ИФА дала положительный результат с R-бруцеллезным антигеном в низком титре- 1:200. В сыворотках крови детей (сын и дочь) не были выявлены антитела ни в одном из использованных тестов.

Исследование сывороток крови членов семьи в ПЦР показало наличие ДНК бруцелл во всех образцах.

Полученные результаты свидетельствуют об инфицировании всех членов семьи, однако клинические проявления отмечались только у хозяйки, которая больше всех уделяла времени по уходу за животными и, именно она, принимала непосредственное участие в родовспоможений.

Приведенный случай свидетельствуют об эпидемиологической значимости B.canis и необходимости проведения широкомасштабных исследований для определения степени пораженности животных и инфицированное™ людей этим возбудителем.

Кроме того, полученные данные свидетельствуют о высокой чувствительности и информативности ПЦР при диагностике бруцеллеза, вызванного B.canis.

Таким образом впервые в России был зарегистрирован случай заболевания

собаки бруцеллезом, вызванным В .сап ¡б. Выделенная из абортированного плода стаффордширского терьера культура бруцелл относится ко второму биовару, отличающемуся от первого выраженной устойчивостью к пенициллину и сафранину. Показана эффективность использования ПЦР и иммуноблотинга для идентификации бруцелл, выделенных от собак, а также высокая значимость ПЦР для оценки инфицированное™ животных и людей этим видом бруцелл.

Установлено широкое распространение бруцеллеза собак, вызванного Вхашв на территории России, и показана эпидемиологическая значимость этого вида, способного вызывать заболевание людей бруцеллезом

Ветеринарным специалистам при обследовании собак с клиническими признаками, характерными для бруцеллеза (аборты, бесплодие, орхиты, эпидидимиты и т.д.), необходимо исключать данное заболевание. Учитывая широкое распространение бруцеллеза собак (В.сахш) за рубежом, целесообразно обследование на бруцеллез всех завозимых в страну собак.

Необходимо проведение более широких клинико-эпидемиологических исследований, на основании которых можно было бы сделать рекомендации владельцам собак и ветеринарным специалистам.

Поскольку В.сашз существует только в Я-форме, а имеющиеся диагностические препараты рассчитаны на диагностику бруцеллеза, вызванного Э-формами бруцелл, то требуется разработка и внедрение диагностикумов, позволяющих выявлять специфические антитела к И-формам возбудителя В.сашэ.

Иммунологические методы детекции бруцелл и их растворимых антигенов

Лабораторная диагностика бруцеллеза дает возможность не только подтверждать диагноз, но и выявлять источник заражения, пути и факторы передачи возбудителя.

В настоящее время для специфической индикации бруцелл используют бактериологический, иммунологические, физико-химические и молекулярно-биологические методы исследования. Наиболее чувствительным и достоверным является бактериологический метод, позволяющий выявлять в различных объектах единичные живые бактерии. При незначительной концентрации бруцелл, загрязнении проб посторонней микрофлорой, когда прямые высевы не дают положительных результатов, используют биологическую пробу. Однако эти методы не удовлетворяют требованиям, предъявляемым к методам индикации, из-за длительного срока получения ответа (1-2) мес. В связи с этим ведущее значение приобретают иммунологические и молекулярно-биологические тесты, в том числе, основанные на использовании иммуноглобулинов, меченых флуорохромами, ферментами, радиоактивными изотопами и т.д.

Применительно к бруцеллезу разработаны, апробированы и находят практическое применение реакции иммунофлуоресценции (РИФ), иммунофлуоресцентный анализ с временным разрешением (ФИАВР), пассивной гемагглютинации (РПГА, РНАт), модификации иммуноферментного анализа (ИФА), иммунорадиометрический анализ (ИРМА), реакция коагглютинации

(PICA). В РФ большинство из перечисленных тестов были разработаны нами или с нашим участием.

Наши исследования были направлены на усовершенствование существующих (РИФ,РНАт), разработку методов (ФИАВР, ИРМА, РКА) и тест-систем (ИФА) нового поколения и сравнительную оценку их диагностической эффективности.

Были отработаны оптимальные условия проведения иммунологических реакций, проведены исследования по изучению их чувствительности и специфичности при выявлении корпускулярных и растворимых бруцеллезных антигенов, влияния посторонней микрофлоры, органических и неорганических примесей на чувствительность тестов, а также по обнаружению антигена в биологических объектах, что позволило оценить их эффективность и практическую значимость.

Сравнительный анализ иммунологических тестов для индикации бруцелл и их растворимых антигенов выявил различные диагностические возможности их использования (табл.1):

- РИФ, является экспрессным, позволяющим визуально наблюдать цельную клетку, чувствительность которого составляет 1x10 м.кл/мл. РИФ может быть использован для установления чувствительности бруцелл к антибиотикам непосредственно в первичном посеве исследуемого материала. При этом концентрация бруцелл в исследуемой пробе должна быть не менее 1х106 мкл/мл, а длительность инкубации посевов - 24 ч при 37°С.

- ФИАВР обладает более высокой чувствительностью для выявления растворимых и корпускулярных специфических антигенов. Анализ имеет высокую специфичность и позволяет выявлять бруцеллезные антигены в смеси с гетерологичными микроорганизмами без снижения чувствительности. ФИАВР может быть использован как в эпидемиологической, так и клинической практике. Однако ФИАВР имеет ряд недостатков, основными из которых являются необходимость высокой чистоты проведения анализа и специального импортного оборудования для учета реакции.

- реакции, основанные на феномене гемагглютинации (РПГА, РНАт, РАГА)- обладают высокой чувствительностью, специфичностью, достоверностью, простотой исполнения, возможностью получения быстрого ответа (2-4 часа), однако, существенным недостатком является нестабильность и нестандартность эритроцитарных диагностических препаратов;

- реакция РКА показала низкую диагностическую эффективность, на 2-3 порядка уступающую результатам РНАт, РИФ и ИФА, что не позволяет рекомендовать её в целях ранней диагностики и индикации возбудителя и его растворимых антигенов;

- чувствительность ИРМА при выявлении бруцелл в присутствии посторонней микрофлоры, а также составляющих частиц почвы, материала кирпича, была на 2 порядка выше, чем РНАт и ИФА; у больных бруцеллезом - в 2 раза чаще, чем при использовании ИФА; выявление специфического антигена у биопробных животных удавалось в ранние сроки (1 сутки вместо 3 - при бактериологическом методе), в том числе с отрицательным результатом посева.

Однако следует отметить, что ИРМА обладает рядом существенных недостатков, затрудняющих применение его в широкой практике, в первую очередь, из-за использования радиоактивной метки, специальных приборов для учета метода, специальной лаборатории, где возможно проведение этого анализа, необходимости большого числа повторов анализа (10-12) и сложной статистической обработки. Учитывая вышеизложенное, эффективное использование ИРМА возможно в крупных лабораториях, либо в условиях институтов. Особое место этот анализ занимает в проведении научно-исследовательских работ по изучению патогенеза инфекционных заболеваний, вызванных как бактериальными, так и вирусными агентами.

- преимущество ИФА перед традиционными иммунологическими тестами, главными из которых являются высокая чувствительность, специфичность, возможность получения количественных данных, воспроизводимость, стандартизация основных ингредиентов анализа, возможность исследования сильно загрязненных образцов, биологических жидкостей и экстрактов, возможность автоматизации всех этапов постановки и чета реакции. Результаты проведенных исследований позволили рекомендовать ИФА для определения чувствительности бруцелл к антибиотикам непосредственно в первичном посеве исследуемого материала и получить быстрый ответ (длительность термостатной инкубации посевов - 24 часа при 37°С).

Сравнительный анализ разработанных иммунологических тестов показал, что методом выбора для выявления бруцелл и их растворимых антигенов в объектах внешней среды и биологическом материале являются РИФ и ИФА.

Значение ПЦР в системе эпидемиологического надзора за бруцеллезной инфекцией.

В настоящее время для индикации, идентификации бруцелл и лабораторного подтверждения диагаоза используют молекулярио-биологические методы исследования, в частности метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), позволяющий в короткие сроки (в течение рабочего дня) определить наличие специфической последовательности ДНК бруцелл в пробах как клинического, так и полевого материала.

Для постановки ПЦР сотрудниками лаборатории генной инженерии патогенных микроорганизмов НИИЭМ им .Н.Ф.Гамалеи РАМН совместно с нашей лабораторией была разработана тест-система, в которой использовали праймеры, синтезированные на основе последовательности гена BCSP31, кодирующего синтез поверхностного белка наружной мембраны В.abortus размером 31 кД. Родоспецифические праймеры: прямой праймер Brl 5'- AGT CAG ACG TTG ССТ ATT G-3' и обратный праймер Вг2 5'- GTG TTC AGC СТТ GAT АТС G-3' фланкировали фрагмент ДНК размером 260 п.н. и обеспечивали высокую специфичность ПЦР.

Чувствительность и специфичность тест-системы ПЦР при идентификации и индикации бруцелл

Первоначально была изучена эффективность тест-системы ПЦР в экспериментах на чистых культурах. При изучении специфичности было

Таблица 1

Сравнительные данные о разрешающей способности методов выявления бруцелл и их растворимых антигенов

Показатели эффективности Метод

РИФ ФИАВР РПГА РНАт РКА ИРМА ИФА РАГА

Минимальное определяемое кол-во бактерий в чистой ультуре мкл/мл 1х104-1x106 7,5x103-1,5х104 9,7x10" -5,2х105 7,5x10" 2,5x105 1х107-1х108 1x10-1x103 2х104-1х105 не определяли

Минимальное определяемое кол-во бруцелл в смеси с другими бактериями мкл/мл 1х105-1х107 7,5x10'-1,5х104 1x105-1x10е 1х105-1х106 1x10® неспецифическая агглютинация 1х102-1x10" 2x10"-1х105 не определяли

Минимальное определяемое кол-во антигена ЛПС не определяли 0,1 нг/мл 10-20 нг/мл 1 -5 нг/мл 100 нг/мл 0,01-0,1 пкг/мл 1-5 нг/мл 0,9-3,5 нг/мл

Время проведения анализа в час. 1,5-2 2-3 2-3 3-4 0,5-1 2-3 2-3 2-3

РИФ — реакция иммунофлуоресценции; ФИАВР - иммунофлуоресцентный анализ с временным разрешением; РПГА- реакция пассивной гемагглютинации; РНАт- реакция нейтрализации антателРКА- реакция Ко-агглютинации; ИРМА-иммунорадиометрический анализ; ИФА-иммуноферментный анализ; РАГА- реакция агрегат гемагглютинации;

показано, что использование синтезированных праймеров обеспечивает синтез амплификационного фрагмента ДНК размером 260 н.п. с ДНК бруцелл всех видов. Использованные праймеры Brl и Вг2 оказались родоспецифическими. ДНК бактерий, перекрестно-реагирующих с бруцеллами в серологических реакциях (V. cholera, Y. enterocolitica, F. tularensis, E. coli, Y. pestis и др.), не служила матрицей для синтеза выбранного фрагмента ДНК и результат ПЦР был отрицательный.

Таблица 2.

Индикация бруцелл в тест-пробах из объектов внешней среды и биологических объектов с помощью ПЦР

Инфицированные пробы Число микробных клеток в 1 мл Количес тво проб Положительный результат %

Тест- штаммы

B.abortus 99 В.suis 1330

Кровь человека 1х105 30 100 100

1x10" 30 100 100

lxl0j 30 90.0±5,6 90,0±5,6

lxlO2 30 70,0±8,5 70,0±8,5

1x10' 30 20,0±7,4 20,0±7,4

Органы животных (селезенка) lxlO5 30 100 100

lxlO4 30 100 100

lxlO3 30 90,0±5,6 90,0±5,6

lxlO2 30 70,0±8,5 70,0±8,5

lxlO1 30 23,0±7,8 23,0±7,8

Речная вода lxlO5 45 100 100

lxlO4 40 100 100

lxl0J 30 100 100

1x10" 30 83,0±7,0 83,0±7,0

1x10' 30 60,0±9,1 60,0±9,1

Почва lxlO3 30 100 100

lxlO4 30 100 100

lxl0J 30 50,0±9,3 50,0±9,3

После подтверждения специфичности реакции данные праймеры были использованы для определения чувствительности метода. С этой целью мы осуществили постановку ПЦР с лизатами клеток бруцелл убывающей концентрации от 105 до 101 м.кл/мл. Количество вносимых клеток определяли титрованием суспензий на твердой питательной среде. Специфический фрагмент 260 п.н. определялся во всех образцах лизатов, в том числе и полученных из концентрации 10 м.кл/мл, что определяло порог чувствительности метода ПЦР.

Изучение чувствительности ПЦР при индикации бруцелл в объектах внешней среды и биологических объектах было проведено на тест-пробых,

искусственно контаминированных В. abortus 99 и В. suis 1330 в различных концентрациях (табл 2).

При исследовании проб, контаминированных обоими видами бруцелл в концентрации 1х104 м.кл/мл, ПЦР была положительной в 100% случаев. По мере уменьшения количества бруцелл в пробах снижался процент положительных результатов и оставался значительным при исследовании проб речной воды 60,0±9,1% и почвы 50,0±9,3%, содержащих десять клеток. При этой концентрации клеток в 2-3 раза был ниже процент положительных результатов в пробах крови (20,0±7,4%) и в органах животных (23,0±7,8%).

Диагностическая ценность ПЦР в клинической практике

Оценку эффективности ПЦР в лабораторной диагностике бруцеллеза в клинической практике осуществляли при исследовании 231 образца сывороток крови людей больных различными формами бруцеллеза. Все обследованные были разделены на 3 группы (табл. 3).

Образцы сывороток тестировали с помощью ПЦР, традиционных серологических реакций (PA, PK, РПГА, РХ) и ИФА.

При исследовании сывороток крови людей, больных острой (I группа), подострой (II группа) и хронической формой (III группа) бруцеллеза с помощью ПЦР были получены положительные результаты практически у всех обследованных больных (96,3±3,7%, 100% и 95,9±1,6% соответственно). Следует отметить, что все больные находились на стационарном лечении и были обследованы в период активного течения инфекционного процесса с выраженными клиническими проявлениями. Частота положительных ответов в серологических реакциях при этих формах заболевания подтверждали активность инфекционного процесса. Наиболее эффективными серологическими тестами при диагностике всех форм заболевания явились PK и ИФА, с помощью которых бруцеллезные антитела были выявлены в 100% - 97,1±2,9% случаев при острой и подострой и в 79,3±3,1-82,2±2,9% при хронической формах бруцеллеза (соответственно).

Полученные результаты свидетельствуют о высокой диагностической эффективности ПЦР в клинической практике.

Значение ПНР в эпидемиологической практике

Важным разделом нашей работы было определение возможности использования ПЦР для проведения эпидемиологического надзора за бруцеллезной инфекцией и оценка информативности различных методов лабораторной диагностики при обследовании лиц, относящихся к группам риска заражения бруцеллезом. Всего было обследовано 440 человек (табл.4) из них:1 группа - сотрудники специализированной лаборатории (9 человек), П группа -работники биокомбината (79 человек), Ш группа - мясокомбината (200 человек), IV - молочно-товарной фермы (20 человек), а также V группа - контактные лица в очаге бруцеллеза мелкого рогатого скота (104 человека) и VI - крупного рогатого скота (20 человек).

При обследовании сотрудников лаборатории, постоянно контактирующих с живыми культурами бруцслл (I группа), выявили наличие ДНК бруцелл во всех образцах. Все сотрудники лаборатории были ранее вакцинированы живой бруцеллезной вакциной из штамма B.abortus 19ВА, а один сотрудник болен хронической формой бруцеллеза.

Группа II - сотрудники биокомбината, на котором изготавливают живые бруцеллезные вакцины из штаМмов В. abortus 19 и 82, используемые в ветеринарной практике. Сотрудники биокомбината не были вакцинированы против бруцеллеза и в плановом порядке никогда ранее не обследовались на бруцеллез. Несмотря на непрерывный закрытый процесс выращивания бактериальной массы в ферментерах, не исключалась возможность прямого контакта персонала с живыми культурами бруцелл вакцинных штаммов, в том числе с штаммом B.abortus 82, имеющим высокую остаточную вирулентность. Этим можно объяснить столь частые находки ДНК бруцелл в ПЦР( 91,1 ±3,2%), а также положительные результаты серологических реакций (77,2±4,8% - РПГА, 74,7±4,9% - РК и 89,9±3,6%ИФА.

В системе эпидемиологического надзора за бруцеллезной инфекцией важное место занимает плановое серологическое обследование профессиональных групп, являющихся группами риска заболевания бруцеллезом. В этой связи нами были обследованы сотрудники мясокомбината, который является современным высоко технологичным предприятием, работающим на привозном, замороженном сырье и где забой скота не производится (группа III). Из таблицы 4 видно, что у четырех обследованных (2,0±1,0%) в сыворотке крови была выявлена ДНК бруцелл, а также специфические антитела. При последующем тщательном клиническом обследовании у этих сотрудников был диагностирован бруцеллез в хронической форме.

Обследование сотрудников молочно-товарной фермы (группа IV), на которой животные были вакцинированы живой бруцеллезной вакциной B.abortus 82 (Оренбургская область), позволило выявить ДНК бруцелл в образцах сывороток крови с помощью ПЦР в 89,3±5,9% случаев. Специфические антитела были выявлены в сыворотках крови только у 42,9±9,5% обследованных. При этом клинические проявления бруцеллеза у сотрудников фермы не были выявлены. По видимому присутствие ДНК бруцелл в крови обследованных сотрудников МТФ при отсутствии клинических проявлений бруцеллеза свидетельствуют о «проэпидемичивании» их в результате попадания во внешнюю среду вакцинного штамма 82, В этих случаях ПЦР не имеет диагностической ценности, а лишь демонстрирует наличие ДНК вакцинного штамма в организме персонала МТФ.

Следует отметить, что в большинстве случаев обострение эпидемиологической ситуации по бруцеллезу на благополучных территориях связано с бесконтрольным завозом больных животных из регионов неблагополучных по бруцеллезу сельскохозяйственных животных. Так, в 2003 г были зарегистрированы случаи заболевания людей бруцеллезом в Зоопитомнике Московского зоопарка. При обследовании очага инфекции и изучении эпизоотологической обстановки было выявлено, что источником заражения

людей бруцеллезом оказались овцы гиссарской породы (6 голов), привезенные в 2002 году из Таджикистана. Лабораторное обследование с помощью серологических тестов и ПЦР всех сотрудников Зоопитомника и подсобного хозяйства позволило выявить 36 лиц (34,6±4,7%), инфицированных возбудителем бруцеллеза, в 6 (16,7±6,3%) из них верифицирован диагноз бруцеллеза. ПЦР была положительной у 32,7±4,6% обследованных, в двух случаях при положительном результате РХ, ПЦР была отрицательной (rpynnaV). Следовательно, в очаге бруцеллеза MPC, возникшем на ранее благополучной территории, наиболее информативным лабораторным методом была ПЦР.

В группе лиц (группа VI), обследованных в очаге бруцеллеза крупного рогатого скота (частный сектор), у всех контактировавших с больным животным ПЦР была положительной. Ни в одном случае не были выявлены специфические антитела и клинические проявления бруцеллезной инфекции, что можно объяснить слабой вирулентностью коровьего вида бруцелл. Следует отметить, что частный скот не был вакцинирован против бруцеллеза.

Таким образом, проведенные исследования показали высокую эффективность ПЦР как в клинической, так и эпидемиологической практике. ПЦР обладает высокой чувствительностью и специфичностью, она давала положительный ответ у больных хроническим бруцеллезом с большой давностью инфекционного процесса. Изучение эффективности ПЦР в эпидемиологической практике позволило установить инфицирование людей не только полевыми штаммами бруцелл, но и вакцинными, применяемыми для иммунопрофилактики животных. Показано, что контакт людей с вакцинными препаратами с высокой остаточной вирулентностью не является безразличным для организма. У ряда работников биокомбината, где производится вакцина из штамма 82, развивались клинические проявления болезни. Сравнительный анализ диагностических возможностей общепринятых серологических реакций и ПЦР в этих случаях показал преимущество ПЦР, а также ИФА, которые способствовали уточнению диагноза бруцеллеза. Однако очень высокая чувствительность ПЦР требует иных подходов к клинической интерпретации результатов. Необходимо учитывать тот факт, что попадание возбудителя бруцеллеза в организм человека не всегда вызывает развитие инфекционного процесса , особенно при контакте с малыми дозами или слабо патогенными видами бруцелл. Кроме того, в России значительное число сельскохозяйственных животных ежегодно прививают против бруцеллеза. При этом используют живые бруцеллезные вакцины, которые создают не стерильный иммунитет и длительное время вакцинный штамм выделяется в окружающую среду. Лица, обслуживающие этих животных, также контактируют с вакцинными штаммами и могут иметь положительный результат в ПЦР. Аналогичная ситуация может создаваться на предприятиях, перерабатывающих продукты животноводства, где производится забой вакцинированных животных или употребление непастеризованных молочных продуктов. Все это необходимо учитывать при получении положительных результатов ПЦР у людей без клинических проявлений, как и положительных результатов серологических тестов при отсутствии клиники. В этих случаях

важным является тщательно собранный эпидемиологический анамнез и комплексное клинико-лабораторное обследование пациента.

Высокая специфичность ПЦР может помочь при проведении дифференциальной диагностики бруцеллеза с другими инфекционными заболеваниями, возбудители которых имеют общие антигенные детерминанты с бруцеллами.

Лабораторные методы для оценки иммунного ответа при бруцеллезной

инфекции

Для объективной оценки активности инфекционного процесса и характера иммунологической перестройки организма при бруцеллезной инфекции необходимо знание физико-химической природы синтезирующихся специфических антител, что имеет важное значение для диагностики бруцеллеза - инфекции с хроническим течением, частыми рецидивами и повторным инфицированием лиц, профессионально связанных с животноводством.

В последние годы большое внимание уделялось ИФА, возможности его использования для диагностики бруцеллеза у животных и людей, а также выявления с его помощью специфических иммуноглобулинов разных классов

(G, А, М).

Нами были отработаны оптимальные условия проведения ИФА для выявления специфических антител при бруцеллезе у людей и изучена его специфичность и чувствительность.

В качестве твердофазного носителя применяли отечественные планшеты для иммунологических реакций. Для сенсибилизации полистирола использовали ЛПС из штамма В. abortus 99.Для получения пероксидазного конъюгата применяли кроличьи сыворотки против IgG (Н + L) человека. Оптимальной концентрацией ЛПС бруцелл для сенсибилизации планшетов является 1мкг/мл, иммобилизацию планшетов проводили 2 ч при 37°С или 16 ч при 4°С. Реакцию взаимодействия антиген-антитело проводили 1 ч при 37°С. Рабочее разведение конъюгата 1:400.Результаты учитывали на фотометре фирмы «Flow Laboratories» при длине волны 492 нм, положительным считали результат, более чем в 2 раза превышающий ОП в лунках с отрицательными контролями. Последующую постановку реакции осуществляли с соблюдением этих условий.

Специфичность ИФА была изучена при исследовании 143 сывороток людей, из них 63 от доноров, 42 - лиц с различными заболеваниями (сальмонеллез, паратиф, гастроэнтероколит, полиартрит и ОРВИ). Учитывая возможность перекрестных серологических реакций между бруцеллами и другими микроорганизмами, в том числе и возбудителем туляремии, было исследовано 38 сывороток крови людей, вакцинированных живой туляремийной вакциной. Эти сыворотки давали положительные результаты в РА и РПГА с туляремийными антигенами (микро- и макрометоды) в титре от 1:20 до 1:160.

Сравнительное изучение эффективности ПЦР в клинической практике бруцеллезной инфекции.

Таблица 3.

Форма Результаты лабораторных методов исследования

заболевания РА PK РПГА ИФА ПЦР

% пол. титр* % пол. титр* % пол. титр* % пол. титр* Пол %

острая п=27 92,6±5,3 1:1000 100 1:2000 88,9±6,2 1:640 100 1:25600 26 96,3±3,7

подострая п=35 88,6±5,3 1:400 97,) ±2,9 1:5000 85,7±6,0 1:200 97,42,9 1:10000 35 100

хроническая п=169 44,4±Э,8 1:100 79,3±3,1 1:800 32,0±3,6 1:200 82,2±2,9 1:5120 162 95,9±1,6

Примечание: *- средняя величина геометрического титра

Таблица 4

Сравнительное изучение эффективности ПЦР в эпидемиологической практике бруцеллезной инфекции.

№ группы обследованных Результаты лабораторных методов исследования

РА PK РПГА ИФА РХ ПЦР

% пол. Ср. титр* % пол. ср. титр* % пол. Ср. титр* % пол. Ср. титр* % сом. % пол. Пол %

1 п=9 - - 100 1 128 - - 100 1 1000 55,6±17,6 1I.1±II,I 9 100

II п=79 32,2±8,9 1:80 74,7±4,9 1 256 77,2±4,8 1:128 89,9±3,6 1 4000 48,1*5,7 20,3±4,6 72 91,1±3,2

III п=200 1,0±0,7 1:50 1,0±0,7 1 64 - - 2,0±1,0 1 800 1,0±0,7 0,5±0,49 4 2,0±1,0

IV п=28 3,6±3,6 1:50 35,7±9,2 1 80 - - 42,9±9,5 1 800 25,0±8,3 7,1 ±4,9 25 89,3±5,9

V п=104 3,8±1,9 1:200 2,8±1,6 1 320 2,8±1,6 1:320 4,8±2,1 1 1600 12,5±3,2 4,8±2,1 34 32,7±4,6

VI п=20 - - - - - - - - - - 20 100

Примечания: *- средняя величина геометрического титра, « -» - результат отрицательный. I — сотрудники лаборатории, постоянно контактирующие с живыми культурами бруцелл; II- сотрудники биокомбината; III- сотрудники мясокомбината; IV- сотрудники молочнотоварной фермы; V - лица, обследованные по эпидпоказаниям в очаге бруцеллеза мелкого рогатого скота (профессиональная группа); VI — лица, обследованные по эпидпоказаниям в очаге бруцеллеза крупного рогатого скота (частный сектор)

31

При исследовании гетерологичных сывороток в ИФА ни в одном случае не были выявлены антитела с бруцеллезным антигеном, что свидетельствует о высокой специфичности этого теста.

Чувствительность ИФА изучена при исследовании сывороток крови больных с острой и хронической формой бруцеллеза (табл. 5). Следует отметить, что больные хронической формой бруцеллеза были обследованы в период обострения заболевания в условиях стационара. Параллельно эти сыворотки исследовали в РА, РПГА, и РК.

Таблица 5.

Результаты сравнительного изучения эффективности серологических реакций при различных клинических формах бруцеллеза

Реакции Клиническая форма бруцеллеза

Острая (п = 23) Хроническая (п=111)

Число положительных результатов Средний титр* Число положительных результатов Средний титр*

абс % абс %

РА 19 82,6±8,08 1:316 46 41,6±44,68 1:125

РПГА 19 82,6±8,08 1:200 37 33,3±4,47 1:200

РК 23 100 1:630 92 82,9±3,57 1:256

ИФА 23 100 1:3200 96 85,6±ЗД4 1:1600

*- средняя величина геометрического титра.

При острой форме бруцеллеза совпадение положительных результатов ИФА с РА и РПГА было установлено в 82,6%, а ИФА и РК-в 100%.

При обследовании больных хроническим бруцеллезом у 11 (9,9±2,8%) специфические антитела не были выявлены ни в одной серологической реакции. Совпадение положительных результатов в этой группе больных установлено для ИФА и РА в 45,0±4,7%, для ИФА и РПГА в 37,0±4,6%, а для ИФА и РК -91,0±2,7% случаев.

Титр антител в ИФА колебался от 1:400 до 1:51200. В разведении сывороток 1:100 абсолютные значения оптической плотности отрицательных контролей не превышали 0,1, а положительных сывороток составляла 1,4±0,6. Проведенные исследования позволили рекомендовать титр 1:400 как

диагностический, так как все сыворотки больных бруцеллезом имели титр выше 1:200, а сыворотки контрольной группы не давали положительных неспецифических реакций в разведении 1:100.

Проведенные исследования позволили отработать оптимальные условия постановки ИФА для выявления бруцеллезных антител в сыворотке крови людей, установить высокую специфичность и чувствительность ИФА для определения бруцеллезных антител, которая превышала в 5-16 раз чувствительность используемых в практике методов РК, РПГА, и РА. Нами, совместно с сотрудниками лаборатории люминесцирующщих сывороток НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи была разработана тест-система диагностическая для выяления специфических антител иммуноферментным методом при бруцеллезе у людей.

Аналогичные условия проведения ИФА применялись при выявлении специфических IgG, A, M, Е - антител. В качестве конъюгатов были использованы анти IgG, A, M, Е - человека и MbiuiH(Sigma, США).

Динамика синтеза специфических иммуноглобулинов при экспериментальном бруцеллезе

Развитие методов иммунодиагностики, в частности, ИФА, имеющего ряд преимуществ перед рутинными методами, позволило провести исследования по изучению динамики синтеза специфических IgG, А, М-антител в эксперименте на мышах.

. Нами была изучена динамика синтеза специфических иммуноглобулинов в различные фазы инфекционного процесса, вызванного инфицированием высоковирулентной культурой бруцелл ( рис.9).

Опыт проводили на 80 белых мышах, которых заражали вирулентной культурой бруцелл В. melitensis 575 в дозе 1х103 микробных тел, подкожно в паховую область. Зараженных животных вскрывали в различные фазы инфекционного процесса и проводили бактериологические и серологические (РА, РК и РПГА) исследования. Уровень IgG, А и M определяли в ИФА с использованием коньюгатов anTH-IgG,A,M мыши (Sigma).

Бруцеллезная инфекция у белых мышей последовательно проходит 3 фазы: адаптации, регионарной и генерализованной инфекции. Продолжительность этих фаз обусловлена вирулентностью и дозой вводимой культуры.

Проведенные исследования выявили определенные закономерности синтеза специфических иммуноглобулинов. Развитие инфекционного процесса у белых мышей, зараженных вирулентной культурой бруцелл, характеризуется поэтапным синтезом специфических иммуноглобулинов IgM (9 сутки), IgG (21сутки), IgA (30 сутки). Период выраженной диссеминации возбудителя в макроорганизме (генерализованная фаза) характеризуется наличием специфических IgM и IgG антител. Определение IgM после завершения генерализации инфекционного процесса свидетельствует о сохранении возбудителя в макроорганизме. Длительный синтез IgG-антител обеспечивается наличием в макроорганизме растворимого антигена.

1 3 9 16 21 30 45 60 90 120 210 ДНИ

ЕЯИИ —*—1дМ —О— |дй - - -1дА

Рисунок.9. Синтез специфических ^А в динамике инфекционного процесса у мышей

Результаты наших исследований согласуются с данными других авторов полученными с различными бактериальными агентами, и свидетельствуют о том, что этапность синтеза иммуноглобулинов разных классов при введении антигенов является общебиологической закономерностью.

Знание закономерности синтеза специфических иммуноглобулинов разных классов имеет практическое значение, так как эти данные позволяют оценить давность инфицирования организма животных и людей, что важно в эпидемиологической практике при обследовании очага инфекции и в клинической диагностике.

Оценка уровня специфических ^О. 1аА, 1еМ антител при различных формах бруцеллеза у людей с помощью ИФА.

Нами обследовано 514 больных бруцеллезом, у которых клинический диагноз был подтвержден исследованием сывороток крови общепринятыми методами - РА, РК, РПГА.

Острая и подострая формы бруцеллеза характеризуются наличием в сыворотках крови специфических антител всех классов иммуноглобулинов в высоких титрах (табл.6 и 7).

У большинства больных хроническими формами заболевания остается высоким уровень и ^А, специфические антитела класса 1§М регистрируются у половины обследованных и в более низком титре.

Далее был проведен анализ результатов совместного выявления различных классов иммуноглобулинов (табл.7).

Таблица 6.

Уровень специфических иммуноглобулинов разных классов у больных __бруцеллезом_

Форма бруцеллеза У ровень иммуноглобулинов

ДО 1ВА 1еМ

% пол. титр* % пол. титр* % пол. титр*

Острая п=96 96,9±1,8 1:25600 96,Ш,8 1:4000 96,6±1,8 1:1280

Подострая п=46 100 1:16000 100 1:2500 100 1:1000

Первично-хроническая п=60 91,7±3,6 1:5200 70,0±5,9 1:1000 53,4±6,5 1:256

Вторично-хроническая п=312 91,7±1,б 1:5000 75,6±2,4 1:1280 55,0±2,8 1:320

♦-средняя величина геометрического титра

Таблица 7

Совместное выявление специфических иммуноглобулинов С,А,М при ___различных формах бруцеллеза_

Форма бруцеллеза Частота выявления (в %)

^СН^А ^(З+^М ДО 1БА 1ёМ

Острая п=96 97,8±2, 8 1,04±1,04 1,04±1,04 - - -

Подострая п=46 97,8±2, 2 2,2±2,1 - - - -

Первично- хроническая п=60 35,0±6, 2 35,0±6Д 16,7±4,8 5,0±2,8 1,7±1,7

Вторично- хроническая п=312 47,1±2, 8 26,3±2,3 8,7±1,6 9,9±1,69 2,2±0,8

В хронической стадии бруцеллеза все 3 класса иммуноглобулинов - 1§С, IgA, чаще определялись при вторично-хронической форме (47,1±2,8%), что подтверждало более выраженный инфекционный процесс у данных лиц, перенесших острую форму заболевания. Одновременное выявление антител и 1цА, наоборот, чаще регистрировалось при первично-хроническом бруцеллезе. Отличительным для хронических форм являлась совместная циркуляция и 1цМ антител, а также отдельно - IgA и 1§М. Такое разнообразие сочетаний иммуноглобулинов различных классов у больных хроническим бруцеллезом связано с возможностью реинфицирования людей, находящихся в очагах инфекции. Важно отметить, что выявление отражающих свежее

инфицирование, чаще регистрировалось в сочетании как с ^О, так и отдельно у больных первично-хроническим бруцеллезом, что наводит на мысль о большей вероятности повторного заражения у этой категории лиц.

Ведущее место в клинике бруцеллеза занимает поражение опорно-двигательного аппарата. Сравнительное изучение содержания ^С, 1§М, ^А у 119 больных хроническим бруцеллезом с поражениями костно-суставной системы, показало, что у больных с выраженными очаговыми поражениями островоспалительного характера (артриты, остеоартриты, спондилиты), уровень специфических иммуноглобулинов всех трех классов был значительно выше по сравнению с другими группами больных (с артралгиями или дегенеративными изменениями).

Проведенные исследования показали, что определение специфических иммуноглобулинов 1§0,1§А, 1§М с использованием ИФА позволяет судить об активности инфекционного процесса, вероятности повторного заражения, характере местных воспалительных изменений со стороны костно-суставной системы, что, в конечном итоге, способствует улучшению диагностики и качества лечения.

Особенности персистенции бруцелл при инфекционном и вакцинальном процессах.

Развитие инфекционного процесса при бруцеллезе характеризуется диссеминацией бруцелл и их размножением в макрофагах хозяина. Хроническое течение инфекционного процесса у людей и животных связано со способностью бруцелл противостоять защитным антимикробным механизмам хозяина.

При персистенции возбудителя бруцеллеза в макроорганизме непрерывно происходят процессы адаптации, размножения, гибели, разрушения с последующей циркуляцией освободившихся растворимых антигенов. В этой связи особое значение имеет выбор методов, позволяющих следить за течением инфекционного процесса путем регистрации маркеров возбудителя (растворимый антиген, ДНК) бруцеллеза в крови больных людей и животных.

Нами была оценена возможность изучения персистенции бруцелл в организме экспериментально зараженных животных и людей с помощью бактериологического метода, а также ИФА и ПЦР. Изучение антигенемии в динамике инфекционного и вакцинального процессов при бруцеллезе в эксперименте.

В работе использованы 83 морские свинки массой 300-350 г. Животных заражали подкожно вирулентным штаммом В.те1кепз18 565 в дозе 1х102 м.кл/мл и вакцинным В.аЬогШБ 19-ВА -1х109 м.кл/мл. Количество колоний бруцелл, выделенных из внутренних органов животных (лимфатические узлы, печень, селезенка, легкие) выражали в процентах индекса инфицированности (ИИ). Сыворотки крови исследовали до заражения и в динамике инфекционного (в течение 23 месяцев) и вакцинного (18 месяцев) процессов. Бруцеллезный антиген выявляли с помощью прямого ИФА. Полистироловые планшеты сенсибилизировали ^й-фракцией бруцеллезной кроличьей сыворотки в концентрации 10 мкг/мл. В качестве коньюгата использовали ту же иммуноглобулиновую фракцию меченную пероксидазой хрена в разведении 1:400. Оптимальные концентрации ^в-фракции и коньюгата подбирали путем «шахматного» титрования. Количественное содержание антигена выражали в

нг/мл, определяя его по калибровочной кривой, построенной по растворимому антигену (ЛПС), выделенному из В. abortus 99.

Использование ИФА позволило проследить динамику антигенемии у зараженных животных (рис.10). В фазе «адаптации» (начальные 15 суток), когда бактериологическим методом возбудитель бруцеллеза удается выделить в единичных случаях из внутренних органов (ИИ=10,2±5,4), тогда как специфический антиген выявлялся в сыворотке крови в количестве 4,57 нг/мл. В период от 15 до 60 суток возбудитель выделялся из внутренних органов животных ИИ= 86,7±10,0%. В тот же период («регионарная и генерализованная» фазы) специфический антиген выявлялся у 60,0±15,0 - 70,0±15,3% зараженных животных соответственно, а количество антигена колебалось от 4,5± 1,8 до 5,9± 1,98 нг/мл. Спустя 3 месяца после заражения ИИ постепенно уменьшался и к 12 месяцу возбудитель не выделялся. По мере снижения ИИ с 3-го месяца начинал возрастать уровень специфического антигена, достигая максимума к 12-14 месяцам в концентрации 18,3±3,2 и 18,5±3,8 нг/мл у 71,4±15,6 и 80,0±15,1 % инфицированных животных соответственно. В более отдаленные сроки (23 месяц предельный срок наблюдения) уровень антигена снизился в 3-4 раза и составил 4,7±3,5 нг/мл у всех обследованных животных.

шшади шешившАя УГАСШН

отгонная

ФАЗЫ ИНФЕКЦИОННОГО ПРОЦЕССА.

РисунокЮ. Уровень антигенемии в динамике инфекционного процесса.

По оси абсцисс - сроки исследования, фазы инфекционного процесса. По оси ординат -количество антигена (нг/мл); индекс инфицированности (%).Штриховка-развитие инфекционного процесса по индексу инфицированности.

Таким образом, периоду повышения уровня антигена в крови предшествует интенсивное внутриклеточное размножение бруцелл, сопровождающееся выраженной пролиферацией клеток ретикулоэндотелия. Первичный очаг

воспаления в ответ на введение бруцелл характеризуется выраженной макрофагальной реакцией и частичной деструкцией бруцелл в макро- и микрофагах (П.А.Вершилова,1974). Возможно, этот первичный воспалительный очаг и является ранним источником поступления специфического антигена в кровяное русло.

Параллельно нами был изучен антительный ответ в РА, РПГА, РК как при наличии возбудителя в организме животных, так и в период, когда выявлялся только растворимый антиген (рис. 11).

РисунокП. Результаты сравнительного изучения антигенемии и антителообразования в динамике инфекционного процесса. По оси абсцисс - сроки исследования, по оси ординат -столбики - количество антигена (нг/мл); - титра специфических антител ( 1- реакция агглютинации, 2- реакция Кумбса, 3- РПГА).

В начальной фазе инфекционного процесса выявляются агглютинины, гемаглютинины и неполные антитела, синтез которых мог быть обусловлен как наличием возбудителя, так и растворимого бруцеллезного антигена. В период выраженной антигенемии (7-16 месяцев после заражения) титры антител в РА и РПГА были такими же, как и в ранние сроки, в то время как уровень неполных антител (РК) повышался и сохранялся высоким в течение всего периода наблюдения. Эти данные позволяют предположить, что синтез неполных антител обусловлен наличием в организме животных растворимого бруцеллезного антигена.

При изучении вакцинального процесса, созданного с использованием живой вакцины В.аЬоПиэ 19ВА, выявлены те же закономерности, что и при инфекционном., а именно - увеличению количества циркулирующего антигена предшествует диссеминация вакцинного штамма бруцелл в организме животных. Так, в нестерильной фазе количество антигена в сыворотках крови колебалось от 8,5±2,8 до 4,3±1,6 нг/мл. В стерильной фазе, когда вакцинный штамм не выделяется, уровень специфического антигена возрастал до 11,7±7,6 - 10,1±3,0

нг/мл у 87,6% животных с последующим снижением к 18 месяцам (предельный срок наблюдения) до 6,3±4,9 нг/мл у 56.2% вакцинированных животных.

Учитывая тот факт, что длительная антигенемия, по-видимому, обусловлена персистенцией вакцинного штамма в организме животных, можно сделать заключение об отсутствии стерильной фазы иммунитета при вакцинальном процессе. Однако для окончательного решения этого вопроса необходимо проведение дополнительных исследований.

С помощью прямого ИФА уровень циркулирующего антигена был изучен у 21 больного острой и подострой и 43 больных хронической формами бруцеллеза (табл. 8). Специфический антиген выявлялся у большинства больных острой, подострой и хронической формами заболевания, при этом концентрация антигена у больных острой, подострой формами бруцеллеза составила 2,3±0,7, а при хронической 2,98±0,5 нг/мл .

Таблица 8

Выявление специфического антигена в сыворотках крови людей больных

бруцеллезом с помощью ИФА

Форма бруцеллеза Числ о больных Выявлен бруцеллезный антиген

% положительных М±ш (нг/мл)

Острая, подострая 21 87,5±7,8 2,3±0,7

Хроническая 43 65,1±9,2 2,98±0,5

Таким образом, проведенные исследования показали длительную циркуляцию бруцеллезного антигена у инфицированных и вакцинированных животных и людей больных бруцеллезом, что может свидетельствовать о персистенции живого возбудителя в макроорганизме.

Использование ПЦР для выявления персистенции возбудителя бруцеллеза у людей

Высокая специфичность, чувствительность и диагностическая эффективность ПЦР имеет большие преимущества перед существующими методами выявления бруцелл. ПЦР применяется с целью видовой и родовой идентификации штаммов бруцелл и для анализа клинических образцов в диагностике бруцеллеза людей и животных

Нами с помощью ПЦР были исследованы сыворотки крови людей больных хронической формой бруцеллеза. Параллельно с ПЦР в сыворотках крови определяли специфические антитела с использованием серологических реакций (РА, РК, РПГА и ИФА), а также проводили посевы крови на питательные среды для выделения кулыуры бруцелл.

Хроническая форма заболевания у обследованных больных характеризовалась выраженным клиническим течением инфекционного процесса. В 14,8±4,6 % случаях была выделена культура бруцелл (6 культур В.теШепз^з

биовара 3, 2 культуры В.аЬогШв биовара 1 и 1 культура В^шэ биовара 4), а ПЦР была положительной у 93,4±3,2% больных. Выраженные серологические реакции у этих больных также подтверждали активность инфекционного процесса.

Нами были проанализированы результаты лабораторных исследований у больных хронической формой бруцеллеза в зависимости от давности заболевания (табл.9). Таблица демонстрирует, что с увеличением давности заболевания происходило снижение титров специфических антител в серологических реакциях, включая ИФА, уменьшение случаев выделения культур бруцелл. При этом ДНК бруцелл выявляли с помощью ПЦР во все сроки от начала заболевания (от 6 до 60 месяцев и более) практически у всех больных, независимо от проводимой терапии. ПЦР фиксирует минимальные количества ДНК возбудителя, что дает возможность косвенно судить о персистенции инфекционного агента в макроорганизме.

Таким образом, использование комплексного подхода, включающего бактериологический и серологические методы, включая ИФА, а также ПЦР, позволяет оценивать персистенцию возбудителя, судьбу его антигенов в организме и их влияние на динамику и исход инфекционного процесса.

Циркулирующий антиген в сыворотках зараженных животных выявлялся в фазе «адаптации», а периоду повышения количества антигена в крови предшествовало интенсивное внутриклеточное размножение бруцелл с повышением индекса инфицированности, сопровождающееся выраженной пролиферацией клеток ретикулоэндотелия. Первичный очаг воспаления на введение бруцелл характеризуется выраженной макрофагальной реакцией и в дальнейшем частичной деструкцией бруцелл в макрофагах (Вершилова П.А. с соавт., 1974). Интенсивное антигенное раздражение вызывало выраженный синтез специфических антител, выявляемых в положительных серологических тестах. С 3-х месяцев наблюдения на фоне снижения индекса инфицированности начинал возрастать уровень специфического антигена, достигая максимума в поздние сроки после заражения, и общая динамика инфекционного процесса приобретала вид характерных "ножниц".

Следовательно, использование ИФА позволило установить длительный характер антагенемии при инфекционном и вакцинном процессах. Полученные результаты позволяют высказать предположение, что длительный синтез неполных антител (РК) при хроническом течении инфекции (глава 4) обусловлен наличием растворимого бруцеллезного антигена в макроорганизме.

Метод ПЦР открывает новые возможности в изучении патогенеза бруцеллеза, прежде всего, с учетом внутриклеточного паразитизма бруцелл. В случаях, когда низкая чувствительность методов не позволяет выявлять антигены бруцелл, ПЦР фиксирует минимальные количества ДНК возбудителя, что дает возможность косвенно судить о персистенции инфекционного агента в макроорганизме и вносит свои особенности в интерпретацию положительных результатов этого анализа.

Проведенные исследования позволили получить дополнительные сведения о патогенезе и иммуногенезе заболевания, что имеет важное значение для клинической практики и лабораторной диагностики бруцеллеза.

Таблица 9.

Результаты обследования больных хронической формой бруцеллеза с различной давностью заболевания

Давность заболевания (месяцы Серологические методы Бактериологи ческий ПЦР

РА РК РПГА ИФА

% пол. титр* % пол. титр* % пол. титр* % пол. титр* % пол. % пол.

6-12 (п=25) 96,0±4,0± 1:256 96,0±4,0 1:640 88,0±6,6 1:200 100 1:6400 24± 92,0±5,5

12-24 (п=18) 94,4±5,6 1:200 100 1:320 77,8±10,1 1:200 100 1:4000 16,7± 100

24-36 (п=6) 100 1:80 100 1:160 33,3±21,0 1:100 83,3±16,7 1:2000 - 100

36-60 (п=5) 100 1:64 100 1:256 20,ОНО,0 1:100 100 1:500 - 100

Более 60 (п=7) 42,9±20,2 1:50 71,4±18,4 1:128 14,3±14,3 1:200 100 1:1000 - 85,7±14,3

средняя величина геометрического титра

Выводы

1.Впервые проведен анализ эпизоотолого-эпидемиологической ситуации по бруцеллезу в РФ за период 1997-2006 годы, который позволил выявить и научно обосновать влияние социально-экономических факторов на эпидемические проявления бруцеллеза на конкретных территориях.

2.Установлен рост числа территорий субъектов РФ с регистрацией бруцеллеза животных и людей с 39(43,8%) в 1991-1996 гг. до 58(65,9%) в анализируемый период. Основное эпизоотолого-эпидемиологическое неблагополучие по бруцеллезу за период 1997-2006 гг. определяли Южный (Республики Дагестан, Калмыкия, Северная Осетия, Карачаево-Черкесская, Кабардино-Балкарская и Ставропольский край) и Сибирский (Р.Тыва) Федеральные Округа, на которые приходится 72,7% больных людей бруцеллезом (впервые установленным), и большая часть пунктов, неблагополучных по бруцеллезу животных: 96,7% по бруцеллезу крупного и 98,4% мелкого рогатого скота.

3. Современные особенности эпидемического проявления бруцеллезной инфекции состоят в:

- преобладании острых клинических форм бруцеллеза у людей, в том числе детей до 14 лет с выделением гемокультур B.melitensis на территориях Южного и Сибирского ФО, неблагополучных по бруцеллезу КРС и MPC, и первично-хронических форм - на территориях Сибирского, Уральского, Приволжского, Дальневосточного ФО, неблагополучных или условно «благополучных» по бруцеллезу КРС;

- частой регистрации больных с неустановленным источником инфекции -25 территорий (28,4%) субъектов РФ. Последнее указывает на то, что больной бруцеллезом человек, по-прежнему, является «индикатором» эпизоотического неблагополучия территории;

- изменении профессибнальной структуры заболеваемости в сторону значительного увеличения доли больных, не связанных с общественным животноводством -70,7% (50,8% - владельцы животных индивидуального сектора, 19,9±1 Д% - не работающие лица, пенсионеры, домохозяйки и др.);

- значительной доле алиментарного пути заражения инфекцией (23,9%);

- удлинении сроков сезонности заболеваемости до 7-8 мес. в очагах смешанного типа;

- сохранении высокого уровня Заболеваемости городских жителей (до 24,9%), в том числе детей до 14 лет (до 27,1 %);

- росте числа больных с неблагоприятным трудовым прогнозом с 2003 по 2006гг в 1,5 раза, что составило 25,9% от общего числа больных хроническим бруцеллезом

4.Выявлено расширение спектра эпидемически значимых резервуаров и источников бруцеллезной инфекции, вызываемой B.melitensis (козье-овечий тип), за счет интенсификации миграции возбудителя на неспецифических хозяев (крупный рогатый скот).

5.Показано, что причинами непрогнозируемого осложнения эпидемиологической обстановки по бруцеллезу на благополучных территориях в современный период могут быть трансграничные перемещения животных.

6. Впервые на территории РФ выявлена циркуляция бруцелл вида саш (два биовара) среди собак. Получены данные, позволяющие предположить о завозе В.сатБ из-за рубежа с собаками-компаньонами.

7. Сравнительный анализ разработанных иммунологических тестов для обнаружения бруцелл и их растворимых антигенов (РИФ, ФИАВР, РПГА, РНАт, РАГА, РК, ИРМА), а также ПЦР, выявил различные диагностические возможности их использования в эпидемиологической и клинической практике. Показано, что методом выбора для выявления бруцелл и их растворимых антигенов в объектах внешней среды и биологическом материале являются РИФ, ИФА и ПЦР-

8.0боснована универсальность использования ИФА для лабораторной диагностики бруцеллеза в эпидемиологической и клинической практике, позволяющего выявлять бруцеллезный антиген и специфические антитела разных классов иммуноглобулинов. Определение уровня специфических ^0,А,М позволяет судить об активности инфекционного процесса, вероятности повторного заражения, характере местных воспалительных изменений со стороны костно-суставной системы, что способствует улучшению диагностики и качества лечения.

9.Установлена высокая диагностическая эффективность ПЦР при бруцеллезной инфекции:

- высокая чувствительность и специфичность ПЦР обеспечивала возможность верификации диагноза на всем протяжении инфекционного процесса (в острой, подострой и хронической стадиях болезни) и выявления активности инфекционного процесса у больных хроническим бруцеллезом при больших сроках давности (до 60 мес и более);

- использование ПЦР в эпидемиологической практике позволило установить инфицирование людей в различных очагах инфекции гораздо чаще, чем традиционные методы серологической диагностики. При этом положительный результат в ПЦР имеет практическое значение только при наличии клинических признаков болезни из-за возможности определения ДНК бруцелл у лиц, имеющих контакт с живыми вакцинными штаммами, которые выделяются привитыми животными во внешнюю среду. Последнее необходимо учитывать при интерпретации положительных результатов данной реакции;

- применение ПЦР для регистрации ДНК бруцелл во внешней среде, искусственно контаминированной возбудителями бруцеллеза (В.аЬогШэ 99 и В.бшб 1330), показало высокую чувствительность теста даже при минимальном содержании микробных клеток (10 - 102), что указывает на перспективность использования этого теста в целях контроля пищевых продуктов.

Ю.Подтверждена длительная персистенция возбудителя бруцеллеза в макроорганизме с помощью современных методов детекции специфических антигенов и антител в эксперименте и клинике. Установлено, что в так называемую «стерильную» фазу инфекционного процесса, когда возбудитель

бруцеллеза уже не выделяется (12 мес. от начала заражения вирулентной культурой бруцелл), наступает пик циркуляции специфического антигена и антител продолжительностью до 23 мес. (срок наблюдения), определяемый в ИФА. Специфический антиген и ДНК бруцелл выявлялись также в течение длительного срока (более 5 лет) заболевания у людей.

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации

1. Желудков М.М., Павлова И.П., Шаханина KJL, и др. Определение специфических антител иммуноферментным методом при бруцеллезе у людей./ В.сб. Современные аспекты профилактики зоонозных инфекций. Иркутск.-1984,- ч.2.- С. 102-103.

2. Чернышева М.И.,Желудков М.М., Перекопский И.С. Сравнительная оценка метов определения IgG антител при бруцеллезе у людей.// ЖМЭИ. -1986.-№2.- С.114-116.

3. Чернышева М.И., Желудков М.М., Перекопский И.С. Определение специфических гемолизинов у больных бруцеллезом в непрямой реакции гемолиза. // ЖМЭИ.- 1986.-№4,- С.75-78.

4. Желудков М.М., Павлова И.П. Умнова Н.С.Эффектавность иммуноферментного анализа при диагностики бруцеллеза у людей. /В сб.Актуальные вопросы иммунодиагностики особо опасных инфекций. Тез.докл., всесоюз.н.-практ. конф. Ставрополь,- 1986.-Ч. I.- С. 96-98.

5. Желудков ММ.,Павлова И.П., Умнова Н.С., Перекопский И.С.Иммуноферментный метод в диагностике бруцеллеза у людей.// ЖМЭИ.- 1986,-№8.- С.59-63.

6. Умнова Н.С., Желудков М.М., Павлова И.П., Шаханина КЛ.Выявление антигенов возбудителя бруцеллеза иммуноферментным методом. // ЖМЭИ.-1986, №9., С.103-107.

7. Желудков М.М., Чернышева М.И. Использование дитиотреитола для выявления специфических IgG антител при бруцеллезе.// Лаб. дело.- 1987,-№ 11.-С.870-871.

8. Губина ЕА., Желудков М.М.Дъяков С.И., Лебедева И.К. Иммунофлуоресцентный экспресс метод определения антибиотикочувствительности бруцелл.// Антибиотики.- 1989.-T.XXXXIY.-№2,-С.109-112.

9. Zheludkov М.М., Pavlova I.P. Immunoenzymatic assey in diagnosis of Brucellosis. /Zoonoses Congress with International Paticipation Brno,Czechoslovakia.-1988.-8.-l 1B.-P.11.

Ю.Токарева Л.Е. Горелов B.H., Желудков M.M. Подбор тестов для выявления клонированных в клетках E.coli антигенов В.abortus 99./ В сб. Актуальные вопросы профилактики бруцеллеза и организации медицинской помощи больным. Тезисы докл.Всесоюз. конференция.- Москва,- 1989.-С.82-84.

П.Чернышева М.И., Желудков М.М.,Власова И.В.Лабораторная диагностика бруцеллеза (Учебное пособие). Москва.-1988.-С.42.

12.Желудков М.М. Перспективы совершенствования лабораторной диагностики бруцеллеза./ В сб. Актуальные вопросы профилактики бруцеллеза и организации медицинской помощи больным. Тезисы докл. Всесоюз. конференция. Москва.-1989.- С.91-92.

13.Желудков М.М., Павлова И.П., Умнова Н.С., и др. Использование иммуноферментного анализа для выявления бруцеллезных антител разных классов./ В сб. Актуальные вопросы профилактики бруцеллеза и организации медицинской помощи больным. Тезисы докл. Всесоюз. конференция. Москва,-1989,- С.107-108.

М.Пономарева И.В., Шаханина КЛ., Желудков М.М. Использование лантанидного флуоресцентного иммуноанализа для выяления специфических антител при бруцеллезе у людей. / В сб. Актуальные вопросы профилактики бруцеллеза и организации медицинской помощи больным. Тезисы докл. Всесоюз. конференция. Москва,- 1989.- С.111-112.

15.Желудков М.М., Павлова И.П. Иммуноферментный метод - универсальный метод диагностики бруцеллеза./ В сб.Применение иммуноферментного анализа в медицине (тезисы докл.).-Харьков.-1989.- С.87-88.

16.Польщикова H.H., Желудков М.М., Никифоров В.Н., и др. Трудности оценки активности хронического бруцеллеза и выборов методов терапии. // Сов.медицина.- 1989.-№11.-С 109-110.

17.Пономарева И.В. Шаханина КЛ. Желудков М.М. Использование флуоресцентного иммуноанализа с временным разрешением для диагностки бактериальных и вирусных инфекций./ В сб.Новые методы диагностики СПИД, других вирусных и бактериальных инфекций в практике инфекционной и противоэпидемической службы.Тезисы докл.- Алушта.-1990,- С.98-99.

18.Zheludkov М.М, ELISA - а universal method for Brucellosis diagnosis. /In Advances in Brucellosis research Texas A and V Univ., Press Colostation Egit by L.C.Adams.-1990.- P.494-495.

19.Желудков M.M.,Чернышева М.И.,Павлова И.П., и др. Специфические иммуноглобулины разных классов при бруцеллезе у людей.// Тер.архив.-1990.-№11.- С.42-46.

20.Желудков М.М., Бартова JI.M., Сулейманов А.К., Магамедова ДА. Определение уровня Р-бслков в сыворотке крови при бруцеллезной инфекции. // В сб.Новые методы прогноза патологического процесса. Под ред. Кульберга АЛ. -М.-1991.- С.11-12.

21.0палейчук И.С., Желудков М. М., Умнова Н.С., Павлова И.П. Использование реакции агглютинации латекса для диагностики бруцеллезной инфекции. //ЖМЭИ.-1991.--№7.- С.61-63.

22.Желудков М.М., Сулейманов А.К., Магамедова Д.А.Актуальные вопросы лабораторной диагностики бруцеллеза. / В сб.Современные аспекты профилактики зоонозных инфекций. Тезиса докл. науч.конфер.-991В сб. Актуальные проблемы химиотерапии бактериальных инфекций. Тезисы докл.Всес. конф.-1991.- С.29-30.

23.Желудков М.М., Губина ЕЛ., Лебедева И.К., Дьяков С.И. Разработка экспрессного метода антибиотикочувствительности бруцелл. //Антибиотики и химиотерапия.-1992.-Т.37.-№5.- С.12-14.

24.Желудков М.М.,Чернышева М.И., Павлова И.П. и др. Антигенемйя в динамике инфекционного и вакцинного процессов при бруцеллезе. //ЖМЭИ.-1992- № 7-8.- С.71-75.

25.Сулейманов А.К., Желудков М.М. Сравнительная клинико-иммунологическая характеристика бруцеллеза у людей, проживающих в эндемичных очагах. /В сб. Съезд врачей инфекционостов в г.Суздале (сентябрь 1992 г.). Москва-Киров.-1992,- Т.Н.- С.222-223.

26.Желудков М.М., Павлова И.П., Сулейманов А.К., и др. Специфические иммуноглобулины G, А, М, Е при бруцеллезе у людей. /В сб. Съезд врачей инфекционостов в г. Суздале (сентябрь 1992 г.). Москва-Киров.-1992.- Т.И.-С.224-226.

27.Желудков М. М., Чернышева М.И., Павлова И.П., и.др. Специфические IgE антитела при бруцеллезеУ/ Рос. мед. журнал.-1992.-№ 5-12,- С.17-19.

. 28.Покровский В.И., Сулейманов А.К.Д1ебедев В.В., Желудков М.М., и др. Иммунореабилитирукнцее действие тимогексина при лечении больных хроническим бруцеллезом.//Тер. архив.- 1992.-№ П.- С.22-26.

29.Сулейманов А.К., Желудков М.М., Черньпнева М.И., и др. Динамика уровней специфических иммуноглобулинов классов G,A,M и Е в процессе лечения больных хроническим бруцеллезом.// Тер. архив,- 1992.-№ 11.- С. 26-28.

30.Suleimanov А.К., Zheludkov М.М., Chernisheva M.I., et al. Changes in levels of specific IgG, IgA, IgM and IgE during treatment of patients with chronic Brucellosis.// Sov. Arch. Internal Med.-1992.-V.64.- N 6.- P.644-646.

31.Pocrovskii V.l., Suleimanov A..K., Lebedev V.V., Zheludkov M.M. et al. Immunorehabilitative effect of Thymohexin in treatment of chronic Bructllosis patients.// Sov. Arch. Internal Med.-1992.-V.64.-N 6.-P. 647-651.

32.Сулейманов A.K., Ющук Н.Д., Никулин B.H., Кузнецов В.Ф., Желудков М.М. Функциональная активность нейтрофилов периферической крови у больных хроническим бруцеллезом. // ЖМЭИ.-1993.-№4,- С.99-103.

33.Желудков М.М., Маликов В.Е., Таран И.Ф.Бруцеллез. //Информационный бюллетень об инфекционных и паразитарных заболеваниях Российской Федерации.-Москва,- 1993.-С.145-151.

34.Гандара Б., Желудков М.М., Чернышева М.И. Оценка эффективности методов лабораторной диагностики бруцеллеза.// ЖМЭИ.- 1994.- №4,- С.55-58.

35.Желудков М.М., Магамедова Д.М., Кулагина H.H., Кульберг А.Я.Изучение уровня Р-белков в динамике инфекционного процесса при экспериментальном бруцеллезе.// Иммунология,-1994,- №1,- С.55-58.

36.Драновская Е.А., Желудков М.М., Толмачева ТА., и др. Иммунобиологическая активность и физико-химические свойства компонентов клеточной стенки бруцелл и Y.enterocolitica 0:9 Л Ветеринария.-1995.- №11.- С.34-37.

37.Шумилов К.В., Калмыков В.В., Михайлов Н.А., Желудков М.М. и др. Свойства штамма бруцелл, выделенного из абортированного плода собаки. // В сб.научных трудов ВГНКИ. - 1995,- Т. 57.- С.179-187.

38.Шумилов К.В., Калмыков В.В., Михайлова Ю.П., Желудков М.М. Случай выявления бруцеллеза собак в России. //Ветеринария.-1996,- №5.- С.55-59.

39.Драновская Е.А., Желудков М.М., Толмачева Т.А. и др. К вопросу о внутриклеточном паразитизме и персистенции бруцелл. / В.сб. Актуальные вопросы профилактики особо опасных и других инфекционных заболеваний. Мат.науч.-практи. Конф. "60 лет противочумной службы Кавказа". Ставрополь.- 1995.-С.269-271.

40.Желудков М.М., Маликов В.Е., Драновская ЕЛ.Совершенствование иммуноферментного анализа для диагностики бруцеллеза. / В.сб. Актуальные вопросы профилактики особо опасных и других инфекционных заболеваний. Мат.науч.-практи. Конф. "60 лет противочумной службы Кавказа". Ставрополь.- 1995.- С.149-151.

41.Желудков М.М. Бруцеллез. Анализ деятельности центров Госсанэпиднадзора по лабораторной диагностике особо-опасных и природно-очаговых инфекций по итогам 1994 года7/ Информационный сборник статистических и аналитических материалов.- М.-1995.- Вып.18.- Раз. 12.- С.11-12.

42.Malikov V.E., Zheludkov М.М., Dranovskaya Е.А. Appliance of Poly-B antigen in laboratory diagnostic of Brucellosis. / Suppl. biochimica clinical.-1995.- V.19.-N.10.- P.25.

43.Zheludkov M.M., Dranovskaya E.A., Magomedova D.A. Specific ELISA for detection of human antibody to Brucella./ XY International Symposium W.A.V.M.I. Salmonellosis-Brucellosis.-Cypras.-1997.- P.58.

44.Dranovskaya E.A. Zheludkov M.M. Toxonomy and molecular biology of Brucellae. / XY International Symposium W.A.V.M.I. Salmonellosis -Brucellosis.- Cyprus.- 1997,- P.64.

45.Kulakov Y.K., Zheludkov M.M., Dranovskaya E.A. et al. Comparative characteristics of molecular-biological and immunochemical properties of B.canis strains. / XY International Symposium WA.V.M.I. Salmonellosis - Brucellosis.-Cyprus.- 1997.- P.65.

46.Кулаков Ю.В., Желудков M.M., Селютина Д.Ф., и др. Разработка современных средств диагностики и профилактики бруцеллеза с использованием методов генной инженерии. Мол. генетика, микробиол. и вирусол.-1994.-№5.- С.32-34

47.Желудков М.М.,Яшина Н.В., ,Прокопов Н.И., Ишков А.И. .Применение объемной реакции агглютинации латекса в диагностике бруцеллеза.// Биомедицинские технологии.- 1996.- Вып.З.- С.63-67.

48.Кулаков Ю.К., Желудков М.М., Драновская Е.А., Сковронская А.Г Сравнительное изучение антигенного состава штаммов Brucella canis методом иммуноблотингаУ/ Мол.генетика, микробиол. вирусол.-1997.-ЖЗ.-С.15-17.

49.Магомедова Д.А.,Сулейманов А.К, Желудков М.М. Лабораторные показатели в динамике иммунотерапии больных хроническим бруцеллезом. / Int.J. on Immunorehabilitation. -1997.- N 4.-Р.49.

50.Желудков М.М.Шумилов К.В., Толмачева Т.А., и др. Первое выделение

B.canis на территории Российской Федерации. / В сб.Мат. YII съезда Всеросийского общества эпидем.,микробиол. и паразитол. М.-1997.-Т. I.-

C.72-73.

51.Желудков М.М., Маликов В.Е., Таран Ю.Ф. Бруцеллез в Российской Федерации. / В сб.Мат. YII съезда Всеросийского общества эпидем.,микробиол. и паразитол. М.-1997.-Т. I,- С.73-74.

52.Кулаков Ю.К., Желудков М.М., Лаврова В.А., и др. Сравнительный анализ антигенов различных видов Brucella методом иммуноблота с антисыворотками иммунизированных кроликов.// Мол.геиетика, микробиол. вирусол,- 1998.-№2,- С.7-13.

53.Желудков М.М., Кулаков Ю.К.Использование в иммуноферментном анализе белковых .антигенов бруцелл, синтезированных в клетках Escherichia Coli. //ЖМЭИ.-. 1998.- №5.- С.74-77.

54.Кулаков Ю.К. Желудков М.М.,Селютина Д.Ф.,Скавронская А.Г.Чувствительность и адаптация различных видов бруцелл к кислотному шоку Л Мол.генетика, микробиол. и вирусол.-1999.- №3.- С.8-12.

55.Кулаков Ю.К., Желудков М.М.,Селютина Д.Ф.,Скавронская А.Г.Повышенная продукция белкового антигена Brucella melitensis в клетках Eshericchia со117/Мол.генетика, микробиол. и вирусол.- 1999.-№4.- С.15-19.

56.Smits H.L., Basahi MA., DiazR........Zheludkov М.М. et al. Development and

evaluation of a rapid Dipstic Assay for serodiagnosis of acute human Brucellosis. // J.Clin. Microbiol.-1999.-V.37.- N3,- P.4179-4182.

57.Кулаков Ю.К., Желудков M.M., T.A. Толмачева и др. Использование молекулярно-биологических методов идентификации бруцелл в сравнительном анализе штаммов, выделенных от больных собак. // Мол. генетика, микробиол. и вирусол,- 2000.- № 4.- С.7-12.

58.Шумилов К.В., Калмыков В.В., Михайлова Ю.П.Диагностика бруцеллеза собак, вызываемого Brucella canis. /Девятый Московский международный ветеринарный конгресс. 2001,- Москва.- С.16-17.

59.Кулаков Ю.К., Желудков ММ. Молекулярные основы вирулентности бруцелл.// Мол. генетика, микробиол. и вирусол.-2001.- №4.- С.8-12.

60.Kulakov Y.K. Zheludkov М.М. Acid sensitivity and the capacity to adaptive acid tolerance response of various Brucella species. / In mat. 53 Brucellosis research conference "Brucellosis 2000" Nimes, France.- 2000.- P.72-73.

61.Михайлова Ю.П., Калмыков В .В., Шумилов К.В., Желудков М.М.. Средства серологической диагностики бруцеллеза собак, вызванного Brucella canis. /Материалы III Межд. Конф. "Актуальные проблемы ветеринарной медицины мелких домашних животных на Северном Кавказе" Персиановский,-2000,-С. 132-133.

62.Кулаков Ю.К., Желудков М.М., ТЛ.Толмачева. Дополнительные методы идентификации и дифференциации бруцелл. / Материалы VIII съезда

Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов.-Москва.- 2002,- Т.1.-С.75.

63.Желудков М.М., Горшенко В.В. Эпидемиологический надзор за бруцеллезной инфекцией в РФ7 Материалы VIII съезда Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов.- Москва.-2002. -Т.1.-С.25.

64.Желудков М.М.Бруцеллез. В кн. Частная эпидемиология, под ред. Черкасского Б Л.- Москва. Интерфэн,- 2002.- С. 326-338.

65. Желудков М.М., Кулаков Ю.К., Алексеева Н.В., и др. Использование имму но ферментного анализа и полимеразной цепной реакции для оценки персистенции возбудителя бруцеллеза.// ЖМЭИ.- 2003,- №4,- С.67-71.

66.Желудков М.М., Белый Ю.Ф., Кулаков Ю.К. Использование рекомбинантных белков в тест-системе ИФА для диагностики бруцеллеза. / Мат. Междунар. Конф. Развитие международного сотрудничества в области изучения инфекционных заболеваний. Новосибирск.- 2004.- С.146.

67.Желудков М.М., Кулаков Ю.К.,Алексеева Н.В., .Толмачева ТА. ПЦР в диагностике бруцеллеза. // Клин, лабор. диагностика.- 2005.- №9,- С.58-59.

68.Желудков ММ., Алексеева Н.В.,.Кулаков Ю.К. ПЦР в диагностике бруцеллеза. / В уч.методическом пособии для врачей бактериологов « ПЦР и ее применение в бактериологии». Москва.-2006.- С.46-53.

69.Кулаков Ю.К., Желудков М.М. Молекулярные основы персистенции бруцелл. / ЖМЭИ.- 2006.- №4 - С.72-77.

70.Суслов А.П., Лунин В. Г., Народицкий Б.С.,Мещерякова И.С., Желудков М.М., и др. Системы иммунодетекции особо опасных инфекций, в том числе с использованием технологии фагового дисплея. // В сб.докладов Научно-практ. конфер. «Живые системы» в рамках ФЦНТП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники 2002-2006гг». М.2006.- С.126-131.

71.Фельдшерова Л Л., Эльгорд Д.А., Коноплева М.В.,Хац Ю.С., Третьяков О.Ю., Кулаков ЮЛС., Толмачева ТА.,Желудков М.М.,Суслов А.П. Высокочувствительная иммуноферментная тест-система на основе моноклональных антител для выявления антигенов бруцелл. //ЖМЭИ.-2007.-Xsl.-C.52-57.

72.Желудков М.М.,Горшенко В.В., О.С.Хддарцев и др. Бруцеллез: современная эпидемиология и эпидемиологический надзор.// В сб. Материалы IX съезда Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов.-2007.-М.-том 1.-С.148-149.

73.Желудков М.М., Кулаков Ю.К.,Толмачева Т.А. Метод ПЦР для идентификации и дифференциации бруцелл. / В сб. Материалы IX съезда Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов.-2007.-М.-ЧЗ.-С.54.

74.Желудков М.М.Дирельсон Л.Е., Хадарцев О.С., и др. Состояние заболеваемости бруцеллезом на территории РФ. / В сб. Современные аспекты эпидемиологического надзора за особо-опасными инфекционными заболеваниями на юге России (мат.н.-практ.конф.).-2007.-Ч.1.-С.142-145.

75.Кулаков Ю.К., Желудков М.М., Толмачева Т.А. Генетическое типирование штаммов бруцелл, выделенных от больных собак в разных регионах России.// В сб. Современные аспекты эпидемиологического надзора за особо-опасными инфекционными заболеваниями на юге России (мат.н,-практ.конф.).-2007.-Ч.2.-С.10-12.

76.Климанов А.И., .Зинова А.А., Скляров О.Д., УльяноваМ.В., Шумилов К.В., Желудков М.М., и др. Выделение и идентификация Brucella canis В сб. н. трудов ВГНКИ,- М.-2007.-Т. 68.-С.125-130.

77.Желудков М.М., Цирельсон Л.Е., Кулаков Ю.К. Эпидемиология бруцеллеза в России. // В Сб.материалов н.-практической конференции «Актуальные вопросы зоонозных инфекций». Улаанбаатар.-2008.- С.53-60.

78.Желудков М. М., Цирельсон JI.E., Кулаков Ю.К. Бруцеллез в России. / Мат. Междунар. рабочего совещания «Бруцеллез-пограничная инфекция животных и человека, требующая общих усилий разных стран». Серпухов, Мос.обл., 2008.-С.21-22.

79.Кулаков Ю. К., Желудков М.М., Толмачева Т.А. и др. Генетические маркеры вакцинных штаммов BRUCELLA ABORTUS 82 и 75/79-АБ. 7 Мат. Междунар. рабочего совещания «Бруцеллез-пограничная инфекция животных и человека, требующая общих усилий разных стран». Серпухов, Мос.обл.- 2008.-С.23-24.

80.Zheludkov M.M.,Tsirelson I.E., Kulakov Y.K. Human brucellosis in Russia. / Mat. Intern. Confer. Brucellosis 2008, UK.- London.- 2008,- P.125.

81.Kulakov Y.K., Zheludkov M. M., Sklyarov O.D. Identification of genetic markers in Brucella strains circulating in Russia for use in molecular epidemiology. / Mat. Intern. Confer. Brucellosis 2008, UK.- London.- 2008,- P.67.

82.Желудков M.M., Цирельсон JI.E., Хадарцев O.C., Горшенко B.B., Кулаков Ю.К. Состояние заболеваемости бруцеллезом в Российской Федерации. // Дезинфекционное дело.- 2009.-№2.-С.38-40.

Список сокращений

ВФС - временная фармакопейная статья

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ИИ - индекс инфицированноста

ИРМА - иммунорадиометрический анализ

ИФА - иммуноферментный анализ

КРС - крупный рогатый скот

ЛПС - липополисахарид

MPC — мелкий рогатый скот

НТД - научно-техническая документация

ОП - оптическая плотность

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РА - реакция агглютинации Райта

PATA - реакция агрегат-гемагглютинации

РИФ - реакция иммунофлуоресценции

РК - антиглобулиновая проба (реакция) Кумбса

PICA - реакция ко-агглютинации

РНАт - реакция нейтрализации антител

РП - регламент производства

РПГА - реакция пассивной гемагглютинации

РСК - реакция связывания комплемента

РХ - реакция Хеддльсона

ФИАВР - иммунофлуоресцентный анализ с временным разрешением

ФСП - фармакопейная статья производства

IgA, gM, IgG,IgE -иммуноглобулины класса A,M,G и Е

S-формы - гладкие формы бруцелл

R-формы - шероховатые формы бруцелл

S-R-формы - переходные формы бруцелл

Подписано в печать:

21.09.2009

Заказ № 2542 Тираж -110 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Актуальность проблемы. Бруцеллез — особо опасная и социально значимая инфекция, приносящая значительный экономический ущерб и обусловливающая высокий уровень инвалидизации больных (18,29).

Естественным резервуаром бруцелл в природе являются животные. Соответственно, эпидемиология бруцеллеза целиком определяется его эпизоотологией, а инфекция является типичным зоонозом.

Бруцеллез представляет собой мировую проблему для медицинского и ветеринарного здравоохранения (196, 215).

По данным Объединенного комитета экспертов ВОЗ по бруцеллезу (1986), эта болезнь среди животных регистрируется в 155 странах мира. Наиболее широко бруцеллез распространен в странах Средиземноморья, Малой Азии, Юга и Юго-Восточной Азии, Африки, Центральной и Южной Америки (112,183,224,235,254,302).

Вместе с тем ряд стран, особенно в Европе (Англия, Дания, Германия, Финляндия, Швеция, Норвегия, Швейцария, Чехия, Словакия, Румыния), а также Япония добились практически полной ликвидации этой болезни среди животных и людей (182,192,223,259,301,315,333). Успешно проводится борьба с бруцеллезом в Болгарии, государствах бывшей Югославии, где регистрируются единичные случаи болезни в отдельных регионах (249,290).

В 90-е годы истекшего столетия резко обострилась эпизоотическая и эпидемическая ситуация по бруцеллезу в странах СНГ и России в результате социально-экономических преобразований, в частности, интенсивного процесса приватизации в сельском хозяйстве. В немалой степени этому способствовали и экономические трудности, равно как и ослабление санитарно-ветеринарного надзора за животными индивидуальных хозяйств (69,109,137,156,334)

Возросшая в последние два десятилетия миграция населения, недостаточный ветеринарно-санитарный контроль за ввозом животных из стран неблагополучных по бруцеллезу, включая сопредельные государства СНГ, способны в настоящее время осложнить и без того напряженную эпизоотическую и эпидемическую ситуацию по этой инфекции.

Последнее диктует необходимость совершенствования эпиднадзора, долгосрочного прогнозирования динамики и интенсивности эпизоотического процесса и его эпидемических проявлений с целью своевременного осуществления адекватных профилактических мероприятий (111,120).

Несмотря на невысокий уровень официально регистрируемой заболеваемости людей бруцеллезом на протяжении последних 10-15 лет в Российской Федерации (0,3 — 0,4, не выше 0,5 на 100 тыс. населения), истинные показатели гораздо выше. При этом, регистрируют только впервые диагностированные (свежие) случаи, в то время как учет хронических форм не ведется. Соответственно, отсутствуют данные об истинной распространенности бруцеллеза среди населения России. Неполная информация о заболеваемости связана не только со снижением обращаемости сельских жителей за медицинской помощью, уменьшением объемов плановых диспансерных обследований людей, работающих в животноводстве, в том числе владельцев скота, но и с несовершенством лабораторной диагностики бруцеллеза, особенно его хронических форм (17,52,61,155). Вместе с тем, быстро и правильно поставленный диагноз, а также своевременно начатое лечение, значительно сокращают частоту хронизации инфекционного процесса и инвалидизации больных.

До начала наших исследований лабораторная диагностика бруцеллеза осуществлялась с помощью трудоемкого бактериологического и недостаточно чувствительных и специфичных серологических тестов, рекомендованных инструктивно-методическими материалами (МУ №28-1/6,1980). Это ставило важную научно-практическую задачу - разработать и внедрить в практическое здравоохранение комплекс современных методов и препаратов, направленных на эффективное выявление бруцеллезных антител и антигенов у людей на различных стадиях инфекционного процесса.

Решение этой задачи во многом определяется уровнем знаний об этиопатогенезе бруцеллезной инфекции. Особый интерес с практической точки зрения представляет изучение длительности персистенции возбудителя бруцеллеза, динамики синтеза специфических антител разных классов иммуноглобулинов (G,A,M) при инфекционном и вакцинальном процессах в эксперименте и при различных клинических формах бруцеллеза у людей. Расширение диагностического арсенала за счет новых методов иммуно- и генодиагностики позволит получить новые сведения об особенностях инфекционного и вакцинального процессов при бруцеллезе.

Цель исследования

Оценка влияния социально-экономических преобразований в Российской Федерации на эпизоотолого-эпидемические проявления бруцеллеза и тенденции их развития в современный период. Разработка и внедрение в практику здравоохранения современных методов иммуно- и генодиагностики бруцеллеза.

Задачами работы являлись:

-анализ эпизоотолого-эпидемической ситуации по бруцеллезу и причин ее осложнения в современный период (1997-2006гг.);

-идентификация бруцелл, впервые выделенных на территории РФ от собак, оценка эпидемиологической значимости Brucella canis;

-разработка и сравнительная оценка диагностической значимости иммунологических методов индикации бруцелл, их растворимых антигенов, а также определения специфических бруцеллезных антител;

-создание чувствительных и специфичных диагностических тест-систем и их внедрение в практическое здравоохранение в виде коммерческих препаратов;

-оценка диагностической эффективности ПЦР при исследовании материала их различных очагов бруцеллезной инфекции;

-определение диагностической значимости антител различной физико-химической природы для оценки активности течения бруцеллеза и эффективности проводимой терапии;

-определение длительности персистенции возбудителя в динамике инфекционного и вакцинального процессов с помощью разработанных методов и тест-систем при экспериментальном бруцеллезе и различных формах заболевания у людей.

Научная новизна

Впервые проведен анализ современной эпизоотолого-эпидемической ситуации по бруцеллезу в РФ, который позволил научно обосновать влияние социально-экономических факторов на эпидемические проявления бруцеллеза на конкретных территориях.

Установлено, что основное эпизоотолого-эпидемиологическое неблагополучие по бруцеллезу за период 1997-20,06 гг. определяли Южный (Республики Дагестан, Калмыкия, Северная Осетия, Карачаево-Черкесская, Кабардино-Балкарская и Ставропольский край) и Сибирский (Р.Тыва) Федеральные Округа, на которые приходится 72,7% больных людей бруцеллезом (впервые установленным), и большая часть пунктов, неблагополучных по бруцеллезу животных: 96,7% по бруцеллезу крупного- и 98,4% мелкого рогатого скота.

Выявлены особенности эпидемического проявления бруцеллеза в РФ, связанные с социально-экономическими преобразованиями в стране в 90-е годы, в том числе приватизацией в животноводстве, а также неадекватно проводимыми противобруцеллезными мероприятиями, которые выражаются в:

- росте числа больных людей с неустановленным источником инфекции на 25 территориях (28,4%) субъектов РФ. Последнее указывает на то, что больной бруцеллезом человек, по-прежнему, является «индикатором» эпизоотического неблагополучия территории;

- увеличении в 1,6 раза числа территорий, где регистрируется бруцеллез людей - с 33 (37,1%) в период 1991-1996гг до 52 (58,4%) в 1997-2006гг;

- изменении в социальной и возрастной структуре заболевших: увеличение доли городских жителей (до 24,9%), в том числе детей и подростков (до 27,1%), а также больных, профессионально не связанных с общественным животноводством (до 70,7%), включая безработных;

- росте числа больных с неблагоприятным трудовым прогнозом с 2003 по 2006гг в 1,5 раза, что составило 25,9% от общего числа больных хроническим бруцеллезом;

- расширении спектра эпидемически значимых резервуаров и источников бруцеллезной инфекции, вызываемой B.melitensis (козье-овечий тип), вследствии интенсификации миграции возбудителя на неспецифических хозяев (крупный рогатый скот);

Впервые на территории РФ, совместно с ветеринарными специалистами, выявлена циркуляция двух биоваров бруцелл вида canis среди собак. Получены эпизоотические и микробиологические данные, свидетельствующие о завозе В.canis из-за рубежа с собаками- компаньонами.

Впервые обоснована эффективность ИФА для лабораторной диагностики бруцеллеза в эпидемиологической и клинической практике, позволяющей выявлять бруцеллезный антиген и специфические антитела различных классов иммуноглобулинов. Применение только одного ИФА при обследовании людей в очаге бруцеллеза крупного рогатого скота повысило эффективность диагностики бруцеллеза в 11,9 раз по сравнению с реакцией агглютинации, в 6 раз - реакцией Хеддльсона, в 1,2 раза — антиглобулиновой пробой Кумбса (РК). У больных хроническим бруцеллезом с большой давностью заболевания (более 5 лет) ИФА превосходила диагностические возможности реакции агглютинации в 2,33 раза, РПГА - в 7 раз, РК - в 1,4 раза.

Установлено, что при диагностике бруцеллезной инфекции у людей ПЦР позволяет регистрировать активность инфекционного процесса при большой давности заболевания (60 мес. и более).

В эпидемиологической практике широкое использование ПЦР ограничено вероятностью выявления ДНК бруцелл у лиц без клинических проявлений, имеющих контакт не только с полевыми, но и с живыми вакцинными штаммами, применяемыми для иммунопрофилактики бруцеллеза животных.

С помощью современных методов детекции специфических антигенов и антител в эксперименте и клинике подтверждена длительная персистенция возбудителя бруцеллеза в макроорганизме и выявлены ранее неизвестные стороны патогенеза инфекционного и вакцинального процессов при бруцеллезе. Установлено, что в так называемую «стерильную» фазу инфекционного процесса, когда возбудитель бруцеллеза уже не выделяется (12 мес. от начала заражения вирулентной культурой бруцелл), наступает пик циркуляции специфического антигена и антител тестируемые в ИФА, продолжительностью до 23 мес. (срок наблюдения). При бруцеллезе у людей специфические антиген и ДНК выявляли также в течение длительного срока заболевания (более 5 лет). Практическая ценность работы: 1

- разработаны, апробированы и рекомендованы к практическому использованию современные методы микроанализа: иммуно-радиометрический (ИРМА), иммуноферментный (ИФА), реакция нейтрализации антител РНАт, латексагглютинации, иммунофлуоресценции, флуоресцентный иммуноанализ с временным разрешением, ПЦР. Определены основные параметры указанных тестов и их диагностическая значимость для идентификации, индикации и иммунологической диагностики бруцеллеза; внедрены в производство и используются в практике здравоохранения: -тест-система иммуноферментная для определения бруцеллезных антител ( ЭПР №185-89 от 2.06.1989; ФСП 42-214ВС-89 от 2.06.1989),

-тест-система иммуноферментная для определения бруцеллезного антигена (ЭПР №25-86 от 13.11.1986; ВФС 42-51ВС-86 от 24.11.1986),

-иммуноглобулины диагностические бруцеллезные люминесцирующие, сухие (РП №247-82 и ТУ 42.14-290-82.- 1982г),

-иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие R-бруцеллезные, сухие (ВФС 42/Д-018 ВС-95 от 10.05.1995; ЭПР №513-095 от 02.03.1995),

-диагностикум бруцеллезный жидкий для реакции агглютинации ( РП №1277-02 от 28.12.2002; ФСП 42-0180-4778-03 от 06.07.2004),

-вакцина бруцеллезная химическая жидкая (ФСП 42-0433376002.- 2002 РП № 1175-02), изготовлен и передан для практического использования в ГИСК им.Тарасевича:

-стандартный образец сыворотки бруцеллезной агглютинирующей сухой ОСО 42-28-6-88П,

-стандартный образец антигена бруцеллезного жидкого ОСО 42-28-5-88П, а также разработаны следующие методические материалы:

- Бруцеллез (методические рекомендации по диагностике, лечению и реабилитации). М., 1987, С.28

- Бруцеллез. СП 3.1.085-96. Профилактика и борьба с заразными болезнями, общими для человека и животных. Сб. сан. и вет. правил. М.1996, С.20-46.

Профилактика и лабораторная диагностика бруцеллеза людей Методические указания (МУ 3.1.7.1189-03) МЗ РФ, М., 2003. С.58

- Бруцеллез в Российской Федерации в 2001-2005 годах. Информационный бюллетень ФС по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Москва 2007. С. 12

Материалы диссертации используются в лекциях по эпидемиологии и микробиологии бруцеллеза на кафедрах микробиологии РМАПО и инфектологии ММА им.И.М.Сеченова, составлено и опубликовано учебное пособие «Лабораторная диагностика бруцеллеза» М.1988, а также учебно-методическое пособие для врачей-бактериологов «Полимеразная цепная реакция (ПЦР) и ее применение в бактериологии» М.2006.

Апробация работы

Основные результаты диссертационной работы были доложены на научных конгрессах, съездах, конференциях: Всесоюзная научно-практическая конференция «Актуальные вопросы иммунодиагностики особо опасных инфекций» Ставрополь, 1986;У съезд гигиенистов, санитарных врачей, эпидемиологов. Микробиологов и инфекционистов Узбекистана, Ташкент, 1987;Международный конгресс по зоонозам, Брно,ЧССР, 1988; Всесоюзная конференция «Актуальные вопросы профилактики бруцеллеза и организации медицинской помощи больным», Новосибирск, 1989; Всесоюзная конференция «Применение иммуноферментного анализа в медицине», Харьков,1989; Республиканская конференция «Новые методы диагностики СПИД, других вирусных и бактериальных инфекций в практике инфекционной и противоэпидемической службы», Алушта, 1990; Всесоюзная научная конференция «Новые методы прогноза патологического процесса.», Курск, 1991; Всесоюзная конференция «Актуальные проблемы химиотерапии бактериальных инфекций», Москва, 1991; Научная конференция «Современные аспекты профилактики зоонозных инфекций», Ставрополь, 1991; Научно-практическая конференция «Здоровье человека и экологические проблемы», Киров, 1991; Республиканская научно-практическая конференция по курортологии и физиотерапии, Махачкала, 1991; Съезд врачей инфекционистов в г.Суздале, 1992; Научно-практическая конференция «60 лет противочумной службы Кавказа».-«Актуальные вопросы профилактики особо опасных и других инфекционных заболеваний», Ставрополь, 1995; XY международный симпозиум «Salmonellosis-Brucellosis», Кипр, 1997; Совещание зам.главных врачей и заведующих отделами ООИ ЦГСЭН в субъектах РФ, начальников противочумных учреждений МЗ РФ.,Москва, 1999; YII, YIII, IX съезды Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, Москва, 1997, 2002, 2007г.г.; III международная конференция «Актуальные проблемы ветеринарной медицины мелких домашних животных на Северном Кавказе», Персиановский, 2000; 53 бруцеллезная научная конференция

Brucellosis 2000", Франция,2000; Девятый Московский международный ветеринарный конгресс, Москва, 2001; Научная конференция «Молекуляно-биологоческие и генетические методы диагностики в инфекционной патологии», Москва,2002; Международная конференция «Развитие международного сотрудничества в области изучения инфекционных заболеваний», Новосибирск,2004; Международное рабочее совещание «Бруцеллез -пограничная инфекция животных и человека, требующая общих усилий разных стран», Серпухов, Мос.обл., 2008; Международная научная конференция «Brucellosis 2008», Лондон 2008.

Апробация диссертации состоялась на научной конференции отделов Медицинской микробиологии, Эпидемиологии и Природноочаговых инфекций НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН 12 февраля 2009 г.

По теме диссертации опубликовано 82 работа, в том числе 20 в журналах, рекомендованных ВАК для публикаций материалов диссертаций на соискание ученой степени доктора наук. Результаты исследований вошли в 7 научных отчетов по плановым темам НИР, выполненным при участии автора в качестве руководителя, ответственного исполнителя и исполнителя (№№ госрегистрации 79049008, 01840011426, 01860012395, 01840016820, 01930004074, 01970005014, 01200110335). Полученные материалы нашли отражение в двух коллективных монографиях, двух рационализаторских предложениях и 3 патентах на изобретения.

Выводы

1.Впервые проведен анализ эпизоотолого-эпидемиологической ситуации по бруцеллезу в РФ за период 1997-2006 годы, который позволил выявить и научно обосновать влияние социально-экономических факторов на эпидемические проявления бруцеллеза на конкретных территориях.

2.Установлен рост числа территорий субъектов РФ с регистрацией бруцеллеза животных и людей с 39(43,8%) в 1991-1996 гг. до 58(65,9%) в анализируемый период. Основное эпизоотолого-эпидемиологическое неблагополучие по бруцеллезу за период 1997-2006 гг. определяли Южный (Республики Дагестан, Калмыкия, Северная Осетия, Карачаево-Черкесская, Кабардино-Балкарская и Ставропольский край) и Сибирский (Р.Тыва) Федеральные Округа, на которые приходится 72,7% больных людей бруцеллезом (впервые установленным), и большая часть пунктов, неблагополучных по бруцеллезу животных: 96,7% по бруцеллезу крупного и 98,4% мелкого рогатого скота.

3. Современные особенности эпидемического проявления бруцеллезной инфекции состоят в:

- преобладании острых клинических форм бруцеллеза у людей, в том числе детей до 14 лет с выделением гемокультур B.melitensis на территориях Южного и Сибирского ФО, неблагополучных по бруцеллезу КРС и МРС, и первично-хронических форм - на территориях Сибирского, Уральского, Приволжского, Дальневосточного ФО, неблагополучных или условно «благополучных» по бруцеллезу КРС;

- частой регистрации больных с неустановленным источником инфекции -25 территорий (28,4%) субъектов РФ. Последнее указывает на то, что больной бруцеллезом человек, по-прежнему, является «индикатором» эпизоотического неблагополучия территории;

- изменении профессиональной структуры заболеваемости в сторону значительного увеличения доли больных, не связанных с общественным животноводством -70,7% (50,8% - владельцы животных индивидуального сектора, 19,9% - не работающие лица, пенсионеры, домохозяйки и др.);

- значительной доле алиментарного пути заражения инфекцией (23,9%);

- удлинении сроков сезонности заболеваемости до 7-8 мес. в очагах смешанного типа;

- сохранении высокого уровня заболеваемости городских жителей (до 24,9%), в том числе детей до 14 лет (до 27,1%);

- росте числа больных с неблагоприятным трудовым прогнозом с 2003 по 2006гг в 1,5 раза, что составило 25,9% от общего числа больных хроническим бруцеллезом

4.Выявлено расширение спектра эпидемически значимых резервуаров и источников бруцеллезной инфекции, вызываемой B.melitensis (козье-овечий тип), за счет интенсификации миграции возбудителя на неспецифических хозяев (крупный рогатый скот).

5.Показано, что причинами непрогнозируемого осложнения эпидемиологической обстановки по бруцеллезу на благополучных территориях в современный период могут быть трансграничные перемещения животных.

6. Впервые на территории РФ выявлена циркуляция бруцелл вида canis (два биовара) среди собак. Получены данные, позволяющие предположить о завозе B.canis из-за рубежа с собаками-компаньонами.

7. Сравнительный анализ разработанных иммунологических тестов для обнаружения бруцелл и их растворимых антигенов (РИФ, ФИАВР, РПГА, РНАт, РАГА, РК, ИРМА), а также ПЦР, выявил различные диагностические возможности их использования в эпидемиологической и клинической практике. Показано, что методом выбора для выявления бруцелл и их растворимых антигенов в объектах внешней среды и биологическом материале являются РИФ, ИФА и ПЦР.

8.Обоснована универсальность использования ИФА для лабораторной диагностики бруцеллеза в эпидемиологической и клинической практике, позволяющего выявлять бруцеллезный антиген и специфические антитела разных классов иммуноглобулинов. Определение уровня специфических IgG,A,M позволяет судить об активности инфекционного процесса, вероятности повторного заражения, характере местных воспалительных изменений со стороны костно-суставной системы, что способствует улучшению диагностики и качества лечения.

9.Установлена высокая диагностическая эффективность ПЦР при бруцеллезной инфекции: высокая чувствительность и специфичность ПЦР обеспечивала возможность верификации диагноза на всем протяжении инфекционного процесса (в острой, подострой и хронической стадиях болезни) и выявления активности инфекционного процесса у больных хроническим бруцеллезом при больших сроках давности (до 60 мес и более);

- использование ПЦР в эпидемиологической практике позволило установить инфицирование людей в различных очагах инфекции гораздо чаще, чем традиционные методы серологической диагностики. При этом положительный результат в ПЦР имеет практическое значение только при наличии клинических признаков болезни из-за возможности определения ДНК бруцелл у лиц, имеющих контакт с живыми вакцинными штаммами, которые выделяются привитыми животными во внешнюю среду. Последнее необходимо учитывать при интерпретации положительных результатов данной реакции;

- применение ПЦР для регистрации ДНК бруцелл во внешней среде, искусственно контаминированной возбудителями бруцеллеза (B.abortus 99 и B.suis 1330), показало высокую чувствительность теста даже при минимальном содержании микробных клеток (10 - 10"), что указывает на перспективность использования этого теста в целях контроля пищевых продуктов.

10.Подтверждена длительная персистенция возбудителя бруцеллеза в макроорганизме с помощью современных методов детекции специфических антигенов и антител в эксперименте и клинике. Установлено, что в так называемую «стерильную» фазу инфекционного процесса, когда возбудитель бруцеллеза уже не выделяется (12 мес. от начала заражения вирулентной культурой бруцелл), наступает пик циркуляции специфического антигена и антител продолжительностью до 23 мес. (срок наблюдения), определяемый в ИФА. Специфический антиген и ДНК бруцелл выявлялись также в течение длительного срока (более 5 лет) заболевания у людей.

Заключение

Социально-экономические преобразования в стране в 90-х годах способствовали тому, что около 80% поголовья мелкого и 50% - крупного рогатого скота от общего количества его в стране переместились в частные и фермерские хозяйства и совместное содержание в них различных видов животных стало ведущей формой ведения животноводства. Основное эпизоотолого-эпидемиологическое неблагополучие по бруцеллезу за последние 10 лет (1997-2006 гг.) определяют Южный (Республики Дагестан, Калмыкия, Северная Осетия, Карачаево-Черкесская, Кабардино-Балкарская и Ставропольский край) и Сибирский ФО (Р.Тыва), на которых приходится 72,7% больных бруцеллезом людей, впервые установленным, и большая часть пунктов, неблагополучных по бруцеллезу животных (78,8% по бруцеллезу крупного рогатого скота и 77,4% - мелкого за 2002-2006 гг.).

Анализ эпизоотолого-эпидемиологической ситуации по бруцеллезу в указанных регионах позволил научно обосновать наличие социально-экологических факторов среды, определяющих эпидемические проявления бруцеллеза на конкретных территориях. В Р.Дагестан оказали влияние такие факторы, как перемещение сельскохозяйственных животных из неблагополучных по бруцеллезу районов: а) с арены боевых действий (1999 г.); б) из пострадавших от стихийных бедствий районов (наводнение 2002 г.); в) вместе с мигрантами коренной национальности, возвращающихся на родину из эндемичных регионов Азербайджана, Калмыкии, Чеченской Республики, Грузии, Ставропольского края и др.; значительное сокращение территории скотопрогонной трассы в результате заселения ее мигрантами, затруднившее возможность изолированного перемещения животных; национальные обычаи -изготовление сычужного сыра из овечьего молока; изменение тактики контроля эпизоотической ситуации со стороны ветеринарной службы путем отказа от серологических методов исследований и замены их бактериологическими в уменьшенном объеме. В Р.Калмыкия сыграли негативную роль крупные закупки овцепоголовья с 90-х годов из неблагополучных по бруцеллезу приграничных территорий (Ставропольский край, Северная Осетия, Р.Казахстан). Аналогичная ситуация имела место в Карачаево-Черкесской Республике (пополнение овцепоголовья из Ставропольского края и Калмыкии), в Р.Тыва (из Монголии). В Ставропольском крае ухудшению ситуации по бруцеллезу способствовали непроведение радикальных мер борьбы среди племенного овцепоголовья, нарушения санитарно-ветеринарных правил содержания последнего (выпас на «черных землях» Калмыкии, неблагополучной по бруцеллезу). В Р.Северная Осетия и Кабардино-Балкарской Республике негативное влияние на эпидситуацию оказали прекращение плановых серологических исследований на бруцеллез мелкого рогатого скота, сосредоточенного в частных хозяйствах (до 95% от всего овцепоголовья) и его иммунопрофилактики.

Общими социально-экологическими причинами, повлиявшими на обострение эпизоотолого-эпидемиологической ситуации на указанных территориях, являлись значительное увеличение поголовья сельскохозяйственных животных в индивидуальных и фермерских хозяйствах, интенсификация путей и факторов передачи инфекции, вызванной B.melitensis, в результате создания благоприятных условий для миграции данного возбудителя на крупный рогатый скот при доминировании новой технологии ведения животноводства в указанных хозяйствах — совместном содержании различных видов животных, нередко, с нарушением санитарно-ветеринарных правил, и передачи его через молоко коров.

Особенностью эпидемических проявлений современного бруцеллеза является неравномерное распределение заболеваемости на территории России: сосредоточенность большей части (73,4%) заболевших в Южном и частично -Сибирском ФО (Р.Тыва), заражение которых произошло в хозяйствах с совместным содержанием различных видов животных на территориях 9(10,2%) субъектов РФ. Заболеваемость носила эпидемический характер (преобладали острые формы бруцеллеза, изолировались гемокультуры B.melitensis, прослеживалась сезонность заболеваемости и удлинение ее сроков до 7-8 мес., в эпидемический процесс вовлекался детский контингент), отмечалось смещение в профессиональной структуре заболевших в сторону увеличения числа больных, не связанных с общественным животноводством (70,7%), росте числа больных среди городских жителей (24,9%), в том числе детей до 14 лет (27,1%), увеличении числа больных с неблагоприятным трудовым прогнозом (инвалидизация) в связи с поздней диагностикой, неполноценным лечением и диспансерным наблюдением. К современным особенностям эпидемических проявлений относятся и значительный рост регистрации бруцеллеза у людей на территориях (28,4%), «свободных» от бруцеллеза животных, т.е. с неустановленным источником инфекции, а также недоучет заболеваемости в стране из-за выявления больных только по обращаемости, непроведения углубленного обследования положительно реагирующих на бруцеллез людей и диспансерного обследования владельцев животных. Официальные сведения о ведущей роли крупного рогатого скота как источника инфекции на территории России (в среднем за последние 5 лет 86,1 неблагополучных пунктов против 13,9 — по мелкому рогатому скоту) не соответствуют эпидемиологическим данным. Эпидемический характер заболеваемости в Южном ФО, выделение от больных острым бруцеллезом B.melitensis (за указанный период в регионе было сосредоточено 78,8%) и 77.4% пунктов, неблагополучных по бруцеллезу крупного и мелкого рогатого скота от всех зарегистрированных в стране) свидетельствуют о возросшей роли КРС как источника B.melitensis в условиях совместного содержания разных видов животных, что необходимо учитывать при проведении противобруцеллезных мероприятий. Однако сведение к минимуму бактериологических методов исследования крупного рогатого скота, в том числе молока коров, отсутствие официальной отчетности ветеринарной службы о пораженности КРС B.melitensis не позволяют считать данное положение доказанным. Отсутствие данных об источнике инфекции влечет за собой неполучение информации о характере очага инфекции и непроведение целенаправленных противобруцеллезных мероприятий, в т.ч. специфической иммунопрофилактики угрожаемых групп населения, которая с 90-х годов снизилась в 6-7 раз.

Неэффективность проводимых профилактических мер в новых условиях ведения животноводства связана с отсутствием комплексного противобруцеллезного надзора при участии ветеринарной, медицинской и хозяйственной служб, ориентированного на сельскохозяйственных животных разных форм собственности, на социально-экологические факторы среды, определяющие эпизоотический процесс на конкретных административных территориях. В сложившихся условиях, по-прежнему, индикатором неблагополучия по бруцеллезу в России является человек. В связи с этим положительно реагирующих на бруцеллез людей в хозяйствах крупного рогатого скота необходимо расценивать как сигнальный признак для более углубленного обследования этого хозяйства.

В системе эпидемиологического надзора наиболее важную роль играет своевременная диагностика бруцеллеза, осуществляемая высоко специфичными и чувствительными методами, регистрирующими как наличие антигена, так и специфических антител с различными физико-химическими свойствами, формирующихся в различном соотношении на протяжении инфекционного и вакцинного процессов. Применение метода иммуноферментного анализа (ИФА), отработка оптимальных условий его проведения при различных клинических формах бруцеллеза позволили выявить высокую специфичность и чувствительность метода для регистрации специфических антител различных классов (JgA, JgG, JgM, JgE) при бруцеллезе у людей, оценить характер инфекционного процесса. Метод ИФА оказался высоко специфичным как для острых, подострых форм (97,8%), так и со стертой клинической картиной — первично-хронической формы (93,7%), превосходя диагностические возможности традиционных тестов - РА (в 5,1 раза) и,РПГА (в 1,5 раза), и вторично-хронической (92,0%) - соответственно в 2,3-2,2 раза.

Изучение иммуноглобулинового профиля с помощью ИФА дало возможность судить об активности инфекционного процесса (активация продукции иммуноглобулинов всех классов), повторном инфицировании больных (активация синтеза JgM антител), давности инфекционного процесса интенсивность продукции иммуноглобулинов выше 6-10 лет болезни), эффективности специфической (лечебная бруцеллезная вакцина) и неспецифической (имунофан) иммунотерапии. Интенсивная активация продукции специфических иммуноглобулинов всех классов у большинства больных хроническим бруцеллезом и половины больных - острым, подострым при лечении вакциной создает угрозу аутоиммунной патологии, а умеренная активация гуморального ответа имунофаном (синтетическим I иммуномодулятором) позволяет сделать выбор в пользу последнего в лечении больных хроническим бруцеллезом. Все это представляет интерес для клинической и эпидемиологической практики.

Выявление специфического антигена и иммуноглобулинов различных классов с использованием ИФА на экспериментальной модели инфекционного и вакцинного процессов позволило получить новые представления о патогенезе бруцеллеза. Длительная циркуляция иммуноглобулинов после завершения указанных процессов - более 18 мес. должна учитываться в эпидемиологической практике при планировании ревакцинаций профессиональных контингентов населения, поскольку вторичный иммунный ответ при ревакцинации формируется преимущественно за счет синтеза IgG антител (35). Полученные результаты представляют интерес и для ветеринарных специалистов.

Поскольку лабораторная диагностика бруцеллеза включает в себя не только подтверждение диагноза, но и выявление источника заражения и факторов передачи инфекции, в настоящее время применительно к бруцеллезу разработаны и используются на практике иммунологические и молекулярно-биологические тесты. Наиболее перспективными являются тесты, основанные на использовании иммуноглобулинов, меченых флуорохромами, ферментами, радиоактивными изотопами и т.д. Проведение сравнительного анализа иммунологических реакций (РИФ, ФИАВР, РПГА, РНАт, РАГА, ИФА, ИРМА, РКА, ИБ, ПЦР) для индикации бруцелл и их растворимых антигенов, влияния посторонней микрофлоры и органических и неорганических примесей на чувствительность тестов, а также обнаружение антигена в биологических объектах показало различные диагностические возможности использования их в эпидемиологической и клинической практике. Установлено преимущество метода ИФА перед традиционными иммунологическими тестами в результате высокой чувствительности, специфичности, воспроизводимости, возможности автоматизации всех этапов постановки реакции и получения количественных данных, возможности исследований сильно загрязненных образцов, биологических жидкостей и экстрактов, что делает его универсальным в лабораторной диагностике бруцеллеза. Как показали исследования, данный метод может быть применен для определения чувствительности бруцелл к антибиотикам непосредственно в первичном посеве исследуемого материале, что позволяет получить быстрый ответ (через 24 часа).

Для осуществления эффективного эпидемиологического надзора необходимы, прежде всего, сведения о возбудителе инфекции. Кроме затратного и длительного бактериологического метода диагностики, в настоящее время для детекции и идентификации бруцелл используют молекулярно-биологические методы, в частности, полимеразную цепную реакцию (ПЦР). Нами использована ПЦР с целью идентификации возбудителя у 10 штаммов не идентифицированных микроорганизмов, выделенных от больных собак, находящихся в питомнике и в индивидуальном пользовании. Применение ПЦР позволило в короткие сроки (в течение 1 дня) установить их принадлежность к бруцеллам, а изучение фенотипических свойств — к возбудителю B.canis.

Оценку эффективности ПЦР в лабораторной диагностике осуществляли при исследовании образцов сывороток крови больных с различными клиническими формами бруцеллеза, в результате получили положительный ответ как в острой (96,3%), подострой (100%), так и хронической (95,9%) стадиях болезни. ДНК бруцелл выявлена у всех стационарных больных, что свидетельствует об активности инфекционного процесса. При анализе результатов ПЦР у больных хроническим бруцеллезом с различной давностью инфекционного процесса установлена высокая чувствительность и специфичность ее при большом сроке заболевания (до 60 мес. и более), что доказывает длительное сохранение возбудителя, а также не исключает возможность повторного инфицирования этих лиц в очагах инфекции. В связи с этим ПЦР может быть использована в клинической практике для оценки активности инфекционного процесса в хронической стадии бруцеллеза, что всегда являлось нелегкой задачей, а также в эпидемиологической практике для установления очага бруцеллеза. Оценка индикации бруцелл в объектах внешней среды и биологических объектах проведена с использованием ПЦР в тест-пробах, искусственно контаминированных B.abortus 99 и B.suis 1330 в различных концентрациях. При контаминации обоими видами бруцелл в концентрации 1 х 104 м.кгг./мл ПЦР была положительной в 100% случаев. Процент положительных результатов ПЦР снижался параллельно уменьшению числа клеток бруцелл, но оставался значительным при исследовании проб речной воды (60,0%) и почвы (50,0%), содержащих всего 10 клеток. Хотя при этой же концентрации (10 клеток) результат был ниже в пробах крови (20,0%) и органов животных (23,0%).

Применение ПЦР в различных эпидемиологических очагах (сотрудники лаборатории бруцеллеза, работники биокомбината, рабочие мясокомбината, мол очно-товарной фермы (МТФ), контактные лица в очаге мелкого и в очаге крупного рогатого скота) в сравнительном аспекте с традиционно используемыми серологическими реакциями (РА, РК, РПГА, РХ, а также ИФА) дало неоднозначные результаты.

Все сотрудники лаборатории бруцеллеза положительно реагировали в ПЦР РК и ИФА и вдвое реже - в РХ, что может быть, в определенной мере, связано с вакцинацией этого контингента живой вакциной из штамма ВА-19, поскольку клинические проявления бруцеллеза у них отсутствовали.

Обследование работников биокомбината, которые никогда не прививались, против бруцеллеза, выявило ДНК бруцуелл в ПЦР у большинства работающих (91,1%). Кроме того у этих сотрудников определялись специфические антитела в РК, РПГА и ИФА (74,7-89,9%), а также частично в РХ (48,1%) и РА (32,2%). Наряду с этим у большинства обследованных были клинические проявления хронического бруцеллеза. Причиной этого могло явиться инфицирование людей вакцинными штаммами бруцелл ( В.abortus 82 и 19), имеющих высокую остаточную вирулентность (59,64), при нарушении санитарных правил работы с живыми вакцинными культурами. Результаты наших исследований позволили пересмотреть показания к проведению специфической иммунопрофилактики данного контингента.

Иные результаты получены у работников мясокомбината, где не проводится убой животных и они контактируют с охлажденным мясом: положительный результат ПЦР был только у 4 человек (2,0%), у такого же количества выявлены специфические антитела в ИФА, вдвое реже — в РА, РХ, РК. Среди положительно реагирующих в ПЦР был выявлен один больной бруцеллезом. Результаты обследования указанного контингента свидетельствуют о почти полном отсутствии факторов передачи инфекции, что важно для эпидемиологической службы.

При обследовании работников МТФ положительные находки в ПЦР были частыми (89,3%), специфические антитела в ИФА обнаружены у 42,9% обследованных, в РК - 35,7%. Однако ни у одного положительно реагирующего не выявлены клинические признаки бруцеллеза. Следовательно, обнаружение ДНК бруцелл в крови обследованных и специфических антител свидетельствуют лишь о «проэпидемичивании» контингента в результате попадания во внешнюю среду, в том числе в молочные продукты, вакцинных штаммов, которыми прививают КРС (ВА-19, шт. 82).

Обследование контактных лиц в очаге бруцеллеза мелкого рогатого скота (работники питомника Московского зоопарка, куда были завезены овцы гиссарской породы из Таджикистана, оказавшиеся больными бруцеллезом) выявило 34 (32,7%) человек положительно реагирующих в ПЦР, и только 2,812,5% - в других тестах. Среди положительно реагирующих на бруцеллез людей в 6 случаях верифицирован диагноз бруцеллеза. Следовательно, в очаге бруцеллеза мелкого рогатого скота наиболее информативным тестом была ПЦР.

При обследовании лиц в очаге крупного рогатого скота во всех случаях (100%) получен положительный результат в ПЦР, тогда как специфические антитела не регистрировались ни в одном тесте. Не было и клинических проявлений бруцеллеза среди обследованных. Положительные результаты ПЦР свидетельствуют о «проэпидемичивании» контактных лиц слабо вирулентным коровьим штаммом бруцелл, поскольку скот не был вакцинирован. Все положительно реагирующие в ПЦР лица подлежат диспансерному наблюдению, согласно существующей инструкции.

Таким образом получены данные о высокой чувствительности и специфичности ПЦР при исследовании различных объектов окружающей среды и патологического материала. Однако попадание возбудителя бруцеллеза в организм, особенно слабо вирулентного или малых доз патогенных штаммов, не всегда вызывает развитие инфекционного процесса (Elberg S.S., 1985). Кроме того, для вакцинации животных используются вакцины с высокой остаточной вирулентностью (B.melitensis Рев-1, B.abortus шт. 82). Они попадают во внешнюю среду с физиологическими выделениями животных или сохраняются в продуктах животноводства (мясо, шерсть, молоко), с чем соприкасается человек. В связи с этим наличие положительного ответа в ПЦР при отсутствии клинических проявлений болезни не может служить доказательством инфицирования полевыми штаммами бруцелл, так как это может быть ДНК вакцинной культуры. В этих случаях важным является тщательно собранный эпидемиологический анамнез и клинико-лабораторное обследование пациента. При обнаружении положительного результата ПЦР при исследовании объектов внешней среды также следует учитывать возможный дрейф вакцинных штаммов в случаях вакцинации животных. Дифференциацию ДНК бруцелл вакцинных и полевых штаммов можно провести с помощью MLVA, хотя этот метод используется пока только в научных целях.).

При проведении эпидемиологического надзора за бруцеллезом принято осуществлять мероприятия, касающиеся крупного (B.abortus) и мелкого (B.melitensis) рогатого скота. Однако с 1994 года в России расширился спектр источников бруцеллезной инфекции. Впервые на территории РФ, совместно с ветеринарными специалистами, от больных собак был изолирован возбудитель B.canis. Используя метод ПЦР нами идентифицирован указанный возбудитель в течение короткого времени (24 часа). Как показали эпизоотологические расследования и генетический анализ изолированных нами культур, бруцеллез собак был завезен из США. При обследовании контактных собак в ИФА были получены положительные результаты во всех случаях. Кроме этого часть собак имела клинические проявления бруцеллеза в виде абортов и мертворождений. Диспансерное обследование владельцев животных и сотрудников питомника также выявило положительно реагирующих на бруцеллез лиц, в одном случае у хозяйки собаки обнаружены клинические проявления бруцеллеза, потребовавшие проведения лечения. Нами идентифицированы культуры B.canis, изолированные от собак в Волгоградской, Ленинградской, Московской областях и г.Санкт-Петербурге, а ветеринарными специалистами - от собак в Омской, Новосибирской, Ростовской областях, Красноярском крае. Учитывая быстроту распространения бруцеллезной инфекции среди популяции собак, вирулентность возбудителя (имеются сведения о тяжелых клинических проявлениях бруцеллеза у людей, вызванных B.canis), возросшую миграцию людей и животных, необходим эпизоотологический надзор за этим видом животных и усиление таможенного контроля за ввозом этого вида животных в нашу страну. Поскольку B.canis существует только в R-форме, а имеющиеся диагностические препараты рассчитаны на диагностику бруцеллеза, вызванного S-формами бруцелл, то требуется разработка и внедрение диагностикумов и тест-систем, выявляющих специфические антитела к R-формам бруцелл.