Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.06) на тему:Биотесты на основе ферментных систем для оценки токсического действия ксенобиотиков на объекты ветеринарно-санитарного и экологического контроля



Па правах рукописи

ЛАВИНА СВЕТЛАНА АЛЕКСЕЕВНА

БИОТЕСТЫ НА ОСНОВЕ ФЕРМЕНТНЫХ СИСТЕМ ДЛЯ ОЦЕНКИ ТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ КСЕНОБИОТИКОВ НА ОБЪЕКТЫ ВЕ ГЕРИНАРНО-САНИ ГАРНОГО Н ЭКОЛОГИЧЕСКОГО КОНТРОЛЯ

16,00,06 - ветеринарная санитария, экология, зоогигиена и ветеринарно-санитарная экспертиза

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических паук

Москва - 2002

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной санитарии, гигиены и экологии РАСХН Научный консультант - заслуженный деятель науки РФ, доктор

ветеринарных наук, профессор. Таланов Г.Л,

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук, профессор

Аббасов Т.Г. (ВНИИВСГЭ) .доктор биологических наук, профессор Жуленко В.Н. (МГУПБ) доктор медицинский наук, профессор Суханов Б.П. (1 ММЛ им. И.М. Сеченова)

Ведущая организация - Всероссийский научи о-исследовательский

институт ветеринарной вирусологии и микробиологии (ВНИИВВиМ).

Защита состоится "_"_2002 года в_часов па заседании

диссертационного совета Д 006.008.01 при Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной санитарии, гигиены и экологии (123022, г. Москва, Звенигородское ш., 5).

С диссертацией можно ознакомиться и >>л.лиотеке Всероссийского научно-исследовательского института ветеринарной санитарии, гигиены и экологии.

Автореферат разослан "_"_ 2002 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Е.С. Майстренко

О В Щ Л Я X Л ГЛ К Т Б Г И С Т И К Л РА В О Т Ы.

Актуальность темы. В настоящее время происходит достаточно сильное -техногенное загрязнение окружающей среды. Различные загрязнители прямо или косвенно оказывают воздействие на организм животных и человека, часто вызывая развитие токсикозов, механизм возникновения которых нередко остается неясным. Кроме того, п процессе научно-технического прогресса разрабатывается большое количество веществ, предназначенных дня решения важных практических задач, например, дезинфекции, дезинсекции и т.п. 1!опалая в ор- -ганизм животных и человека, эти вещества также могут втыкать рати не определенных патологий, поэтому изучение механизма их действия на стадии разработки позволит оценить и прогнозировать возможные последствия их использования, а также выделить наиболее приемлемые диагностические критерии.

Механизм токсического действия большинства ксенобиотиков основан на влиянии на различные ферменты и ферментные группы (Каган Ю.С. н сотр., 1981; Папьшина Т., Сасинович Л.М., 1983; Соелг^ Р.Ь , Юааззеп С.О,, 1983; БЬеп У., Sangiah Э,, 1995). Поэтому изучение действия токсикантов на этн органические соединения может дать достаточно обширный и ценный материал.

При работе с различными токсика)Гтами исследователи часто сталкиваются с такими явлениями, как ингибироваине и активация ферментативной активности, которые часто остаются только констатированными без анализа причин их возникновения к характера проявления, При изучении изменении активности ферментов под влиянием различных токе и кантон большую помощь может оказать использование методов ферментативной кинетики. Однако использование традиционных подходов в этой области знаний часто приводит к путанице понятий и определений, поскольку до недавнего времени не было достаточно четкой дифференциации в разновидностях этих явлений (Келети Т., 1990; Березок Т.Т., Коровкин Б.Ф., 1982; Мусил Я., Новакопа О., Купц К., 1984). В настоящее время достаточно интересным подходом является разработанный Крупянко В.И. (1986) метод параметрической классификации типов ферментативных реакций, который может представлять определенную ценность при анализе ток-енкодинамики различных ксенобиотиков. Однако использование названной методики не отработано для применения в токсикологической практике, особенно для прогнозирования и предварительной оценки влияния ксенобиотиков на о(>-гаиизм животных.

Следует также учесть тот факт, что методы определения ферментативной активности предназначены преимущественно для биологических жидкостей (Меньшиков В,В., 1987; Налетов Е.А., Егорова Т.Д., 1980; Яе\уу1ег А. е( а!., 1989; \У1иНаскег М,, 1986), Исследование активности ферментов в отдельных органах и количественное представление д<шных_имеет риргдепешш®-.трудности, связанные с методологией их анализа! т.к. "конеч)гыкстракг, о роль-

I . ^ ..... I ' ■ . " 1 I г 1" Л 1

иду1-;; --

Мое:;, сс^ьскч

«п. К. Л. Ино.

щннстве случаев, должен быть бесцветным и прозрачным для устранения артефактов, поэтому отсутствуют достаточно простые, экспрессные и селективные методики, позволяющие вести определение в любых биомате риалах, В качестве метода, позволяющего преодолеть эти недостатки, может быть использована хроматография. Однако она не нашла широкого применения в лабораторной клинической практике при определении ферментативной активности.

Следует также отмепггь, что к недостаткам традиционно используемых методов ферментативного анализа можно отнести отсутствие использования системы единиц измерения ферментативной активности, В большинстве случаев используемые единицы измерения зависят от метода анализа, что затрудняет сравнение и сопоставление результатов разных авторов.

В настоящее время все большее распространение получают методы биотестирования, Биотестированпе объектов ветерннарно-санитарного и экологического контроля дает возможность оценивать степень их безопасности. Тест-организмы отличаются достаточно высокой чувствительностью к широкому спектру ксенобиотиков естественного н антропогенного происхождения. Оценка со поставим ости результатов, полученных с использованием биотестов на основе простейших, с результатами, полученными на высших животных, позволит существенно расширить сферу практического применения биотестовых методов, повысить их информативность и производительность, тем самым резко сократив использование в экспериментах высших животных, что важно как с экономической, так и с этической точек зрения (Долгов В Л , 1992).

Названные методологические вопросы требуют своего разрешения и проведения дальнейших исследований.

Цель и задач» исследований. Целью являлась разработка биогестов на основе ферментных систем для опенки токсического действия ксенобиотиков на объекты ветерннарпо-сгшитарного н экологического контроля.

В задачи исследований входило:

1. Совершенствование и разработка методов определения ферментативной активности в различных биологических объектах (органы и ткани лабораторных животных, сыворотка крови лошади, культура инфузорий).

2. Установление фонового уровня ферментативной активности аие-тилхолннэстеразы (АХЭ), бутнрнлхолинэстеразы (БуХЭ), 1-нафтилацетатэстеразы (1-НАЭ), щелочной фосфатазы (ЩФ) и оксидазы в различных биологических объектах.

3. Проведение сравнительного анализа влияния модельных токсикантов - ДДВФ, перметрина, свинца ацетата, кадмия нитрата - на ферментные системы различных тест-объектов,

4. Проведение сравнительного анализа кинетики ферментативных реакций в органах теплокровных животных для подбора оптимальных ферментных тестов диагностики токсикозов животных

5. Определение диагностической ценности исследованных ферментов в качестве критериев токсического действия экотоксикантов.

6. Изучение влияния модельных токсикантов на ферментные системы инфузорий Те1га11утепа рупГопт.

7, Разработка методических подходов к использованию биотестов па основе ферментных систем инфузорий для оценки токсичности объектов вете-ри парно-санитарного и экологического контроля.

Научная новизна результатов исследований состоит в следующем:

Разработаны методики прямого определения удельной каталитическое активности (УКА) ферментов в биологических субстратах, которые обеспечивают индикацию удельной каггалитической ферментов в органах и тканях животных при минимальной детектируемой чувствительности для ((кзефатаз 2 мккат/кг и для оксидаз 0,95 мккат/кг, что значительно превышает чувствительность существующих в настоящее время методов и снимает отраничения в выборе объектов исследования.

Установлен фоновый уровень удельной каталитической активности (УКА) ферментов - аиетилхолииэстеразы (АХЭ), бутирилхолннэстеразы (ВуХЗ), 1-изфтнпацетатэстеразы (1-НЛЭ), щелочной фосфатазы (1ЦФ) и оксидазы - в о|>-гаиах и тканях лабораторных животных. Проведено сравнение уровня актни-ности различных ферментов в органах животных. Установлено, что в органах и тканях животных наибольшей УКА обладает [-11АЭ, максимальный уровень ее активности регистрировался в печени и почках. Фоновый уровень УКЛ остальных ферментов был значительно ниже, при этом максимальная УКЛ АХЭ регистрировалась в ткани головного мозга, БуХЭ - в печени, ЩФ - в ткани головного мозга и почках, оксидазы - в почках. Наименьшей ферментативной акпт-ностыо обладала мышечная ткань. В культуре клеггок инфузорий Т, рупГогпн'з наибольшей УКЛ обладали ЩФ и 1 -ИЛЭ.

Изучено влияние различных токенкашов (ДДВФ, нерметрни, свиниа аистят, кадмия нитрат) на изменение ферментативной активности в органах лаб(ь раторных животных. Установлено, что эти изменения зависят от типа токсического соединения, его дозы, топографии и типа фермента.

Изучено изменение кинетики ферментативных реакций под влиянием названных токсикантов. Установлено, что разные токсиканты не одинаково влияют на изменение кинетических показателей ферментативных реакций. Эти изменения зависят от типа токсикантов и фермента, топ от рафии ферметгта.

Определена диагностическая ценность исследованных ферментов для диагностики токсикозов, вызываемых исследованными ксенобиотиками, Устано-плено, что при диагностике токсикозов, вызываемых фосфорорганичсскимн соединениями, наиболее показательно изменение УКЛ 1-НЛЭ, перметрин вызывал наибольшее снижение УКЛ ЩФ и оксидазы, соли тяжелых металлов вызывали снижение УКЛ ЩФ во всех органах, кроме селезенки, где УКЛ этих ферментов дозозависимо возрастала.

Разработаны методические подходы к изучению активное™ ферментов в культуре клеток Т, рупГопшз. Отработаны условия подготовки культуры для

исследования, получения ферментного препарата из культуры, подобраны условия определения УКА таких ферментов, как АХЭ, БуХЭ, 1-1-1ЛЭ, ЩФ, оксидаза.

Изучено влияние токсикантов на изменение ферментативной активности в культуре клеток Т. рупСопт. Показано сходство в изменении УКЛ и кинетики ферментативных реакций у инфузории и высших, животных. Установлено, что под влиянием изученных токсикантов происходило изменение ферментативной активности в культуре клеток. При этом под влиянием ДДВФ наиболее выраженным было снижение УКЛ 1-НЛЭ, перметрнп вызывал наибольшее снижение УКА оксидазы, солн тяжелых металлов вызывали снижение УКА ЩФ.

Разработаны методические подходы к использованию биотестов на основе ферментных систем инфузории для опенки токсичности объектов ветерннар-но-сашттарного и экологического контроля. .

Практическая ценность и реализация результатов работы. На основании результатов исследований разработаны:

"Методика определения удельной каталитической активности фосфатаз в биологических субстратах" (утверждена Отделением ветеринарной медицины РАСХН, 1997 г.);

"Методика определения удельно» каталитической активности оксидазы в биологических субстратах" (утверждена Отделением ветеринарной медицины РАСХН, 1997 г):

Материалы диссертационной работы пошли в следующие методические рекомендации и указания:

"Методические рекомендации по диагностике токсикозов кур, вызываемых фосфороргзннческнмн соединениям" (утверждены Отделением ветеринарной медицины РАСХН, 1994 г.);

"Методические рекомендации по использованию биологических тестов для индикации токсичных элементов в объектах ветеринарного надзора" (утверждены Отделением ветеринарной медицины РАСХН, 1997 г);

"Методические рекомендации по определению ферментативной активности в культуре клеток ТеНаЬутепа руп1Ъп1т при биотестнровапии" (утверждены Отделением ветеринарной медицины РАСХН 10.03,2002)',

"Методические рекомендации по определению удельной каталитической активности холинэстераз в бноматернале при проведении токсикологических исследований" (утверждены Отделением ветеринарной медицины РАСХН 10.03.2002);

"Методические указания по использованию инфузорий Те^аЬугаепа рупГопшз в качестве тест-кул ¡.туры в приборе ""Бнотестер-2" (утверждены Департаментом ветеринарии МСХ РФ, 16.10.2000, № 13-7-2/2157);

"Методические указания но ускоренному определению токсичности продуктов животноводства и кормов" (утверждены Департаментом ветеринарии МСХРФ 16.10,2000,№ 13-7-2/2156);

"Методические указания по определению остатков перметрина в биоматериале с использованием твердофазной экстракции" (представлены на утверждение в Департамент ветеринарии МСХ РФ).

Материалы диссертационной работы использованы при составлении "Наставления по применению эктоиида в борьбе с эктопаразитами птиц r помещениях", утвержден лого 23.04.94 Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода Российской федерации, Ка 19-4-2/51, per. № 10.07,122-94 ОВФП.

Основные положения, выносимые на защиту.

• методы определения удельной каталитической активности ферментов в различных биологических субстратах;

• результаты изучения фонового уровня активности ферментов - ане-тилхолннэстеразы, бутирилхолинэстеразы, 1-нафтилацетатэстеразы, шелочной фосфатазы н оксидазы - в органах лабораторных животных н культуре инфузорий Tetrabyinena pyriformis;

• результаты изучения влияния различных токсикантов (ДДВФ, пер-метрина, нитрата кадмия н ацетата свинца) на изменение ферментативной активности биотестов различного трофического уровня;

• результаты анализа изменения кинетических показателен в изучаемых биотестах под влиянием названных токсикантов;

• результаты анализа механизмов токсического действия ксенобиотиков с учетом изменения кинетики ферментативных реакций для оценки возможных диагностических тестов при токсикозах, вызываемых исследуемыми ксенобиотиками;

• результаты сравнительной оценки диагностической ценности исследуемых ферментов при изучении токсикозов, вызываемых токсикантами различных групп, на биотесты разных трофических уровней,

• методические подходы к использованию биотестов на основе ферментных систем инфузорий для оценки токсичности объектов ветеринарно-сянитарного и экологического контроля.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на научных конференциях:

"Экологические проблемы ветеринарной санитарии" (Москва, 1993 г.); "Гигиена, ветсанитария н экология животноводства." (Чебоксары; 1994 г.); Второй международной научно-практической конференции. "Актуальные проблемы ветеринарной медицины и ветеринарно-санитарного контроля сельскохозяйственной продукции" под девизом "Здоровое животное - безопасная пиша - здоровый человек" (Москва, 1997 г.); па научно-практической конференции "Актуальные проблемы ветеринарной медицины и экологии"' (Калининград, 1998 г.); на конференции "Интенсификация производства продукции в республике Беларусь" (Жодино, 1998 г.); на Всероссийской научно-производственной конференции "Гигиена содержания и кормления животных -основа сохранения их здоровья и получения экологически чистой продукции"

<>

(Орел, 2000 г.); па конференции, посвященной ]00-летию ВИЭВ (Москва, 1998 г.); на семинаре "КомпьтерХром-98" (Москва, 1998 г.); на Второй Российской школе "Геохимическая экология и бногеохнмнческое районирование биосферы" (Москва, 1999 г.); на международной конференции ВНИИВСГЭ (Москва, 1999 г.); на научной конференции, посвященной 80-летию МГЛВМнБ (Москва, 1999 г.); на научно-методической конференции на тему "Концепция научного обеспечения ветеринарной медицины Северо-Восточного региона Нечерноземья." (Н.-Новгород, 1999 г); на Международной конференции "Теоретические и практические аспекты возникновения и развития болезней животных и защита их здоровья в современных условиях" (Воронеж, 2000 г); на международной конференции "Биотехнология па рубеже двух тысячелетий" (Са|>анск, 2001 г); на заседаниях Секции ветеринарной санитарии, гигиены и экологии Отделения ветеринарной Медицины РЛСХН (1997 г., 2000 г., 2002 г); на заседаниях Ученого Совета Всероссийского научно-исследовательского института ветеринарной санитарии гигиены и экологии (1994-2002); на межлабораторном совещании ВНИИВСГЭ 13 апреля 2002 г.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 32 работы.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на_страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических предложений, списка литературы в приложений. Материал иллюстрирован_таблицами и_рисунками. Синеок литературы включает_источников, п том

числе_зарубежных авторов.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

МА ТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Исследования проводили в период 1990-2002 г.г. в лаборатории токсикологии и лаборатории ветсанэкспергизы мяса, рыбы и других пищевых продуктов ВНИИВСГЭ на основании плана научно-исследовательских работ, они являются частью следующих тем: "Изыскать скрининговые биотесты для экспресс-индикации антропогенных загрязнителей в объектах ветеринарного надзора и выдать рекомендации по их использованию в экологически неблагопо-лушых районах" (№ гос. регистрации 01.9.30 004729); "Разработать новые и усовершенствовать существующие методы определения пестицидов и лекарственных препаратов ветеринарного назначения в тканях животных, молоке, яйцах н меде" (№ гос. регистрации 01.9.60 012312); "Разработать микробиологические тесты для ускоренной индикации токсичных загрязнителей в продуктах животноводства н объектах окружающей среды" {№ гос. регистрации

01,99.00 06631); "Разработать теоретические ос попы, методическое и аппаратурное обеспечение ускоренного токсико-биологического анализа продуктов животноводства, кормов и других объектов ветеринарно-санитзриого и экологического контроля с использованная модельных тест-систем" (№ гос. регистрации 01.9.60 012310).

Отдельные исследования проводились в ГЕОХИ при участии кандидата биологических паук Карповой Е.Д., которой автор выражает искреннюю благ о-дарпость за оказанное содействие и помощь в работе.

Для химико-аналитических и токсикологических исследований использовали следующие препараты; ДДВФ технический 96%-ныЙ, перметрип технический 77,5%-иый, кадмия нитрат х.ч., свинца ацетат х.ч. Для химико-аналитических исследований использовали препараты фирмы "Реахим" и фирмы "Lpcliema" (ЧСФР).

Эксперименты проводили на беспородных белых крысах с начальной массой 200-250 г и беспородных белых мышах массой 18-20 г. Для исследований проводили у бон животных но группам в соответствии со схемами опыта и отбирали для анализа у крыс головной мозг, сердце, печень, селезенку, ночки, семенники, мышцы бедра, у мышей - печень, ночки, селезенку. В качестве тест-объектов использовали сыворотку крови лошади и культуру инфузории Tetrahymena pyriformis.

Разработку методики определения удельной каталитической актвности кислой и щелочной фосфатаз и оксидазы в б но материале проводили с использованием метода тонкослойной хромзпмрафнн.

Для определения влияния токсикантов на ферменты сыворотки крови лошади в экспериментах in vitro токсиканты вносили в сыворотку кропи лошади п количествах, не превышавших 10 мкл, в виде ацетоновых (ДДВФ* перметрип) и водных растворов (нитрат кадмия, ацетат свинца).

При определении влияния на активность ферментов в острых опытах ДДВФ и перметрин вводили мышам однократно в виде масляного раствора, нитрат кадмия и ацетат свинца - в виде водного раствора в количестве, не превышающем 1 мл. Дозы обработки; ДДВФ - 1, 10, 50 мг/кг, перметрин - 200, 1000, 2000 мг/кг, кадмия нитрат - 20, 100, 200 мг/кг, свинца ацетат - 300, 1500, 3000 мг/кг. Каждую дозу испытывали на 10 мышах. Мышам контрольных групп вводили растительное масло или воду в количествах, соответствующих максимальному объему препарата. В ходе эксперимента проводили учет клинического состояния мышей.

Для установления влияния ацетата свинца н нитрата кадмия на активность ферментов в условиях хронической шггоксикации водными растворами названных соединений обрабатывали корм из расчета на массу животных - ниг-рэт кадмад 3 и 15 мг/кг, ацетат свинца - 17 и 54 мг/кг. Крысам контрольной группы вводили в корм дистиллированную воду в объеме, соответствующем максимальному количеству раствора препарата. В процессе эксперимента проводили учет клинического состояния животных.

Влияние токсикантов па ферментативную активность культуры клеток Tetraliymena pyriFormis проводили в условиях in vitro и in vivo. Эксперименты in vitro проводили с использованием ферментного препарата с известной плотностью, в который вносили не более 10 мкл на 1 мл раствора токсикантов. После экспозиции в полученной пробе определяли УКА ферментов. Эксперименты in vivo проводили с использованием живой культуры Т. pyriformis, в которую вносили токсиканты. По окончании экспозиции из культуры клеток получали ферментный препарат, в котором определяли активность ферментов.

Анализ изменения кинетических показателей ферментативных реакций проводили с использованием параметрической классификации и метода векторных представлений ферментативных реакций по Крупянко В.И. (1987).

Удельную катал итнчес кую активность (УКА) 1 - н а фтила цетатэстеразы (1-НАЭ) в органах лабораторных животных определяли в соответствии с "Методическими указаниями по диагностике отравлений кур, вызываемых фосфорорганическнми соединениями" (М., 1994 г.)

Содержание остатков ДДВФ в органах и тканях животных определяли в соответствии с "Методикой определения остатков карбофоса и ДДВФ при их одновременном присутствии в органах кур" (М„ 1993).

Содержание остатков перметрина в органах и тканях животных определяли в соответствии с "Методикой определения синтетических пиретроидов в биологических субстратах методом газовой хроматографии" (М,, 1988).

Определение содержания кадмия и свинца в органах лабораторных животных проведено методом атомно-абсорбцнонной спектрометрии кандидатом ветеринарных наук Кроль М.Ю.(ВНИИВСГЭ), а также кандидатом биологических наук Карповой Е, А, (ГЕОХИ) по ГОСТ 30178-96.

Исследования на инфузориях Т. рупГопшз проводили со гл act to "Методических рекомендаций для использования экспресс-метода биологической оценки продуктов и кормов" (М., 1990) и "Методических рекомендаций по ускоренной токсико-биологнческой оценке продуктов и кормов (М., 1991).

Экспериментальные данные обрабатывали методом вариационной статистики в программе EXCEL for Windows,

РЕЗУЛЬТЛ ТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

I. Разработка мешдо» определения удельной ra талигпческоИ

активности ферментом,

Целью исследований была разработка простых, экспрессных методик определения удельной каталитической активности ферментов в любых биологических субстратах.

В результате проведенных экспериментов подобраны оптимальные условия определения удельной . каталитической активности (У К А) ферментов 1-нафтилацетатэстерззы, щелочной и кислой фосфатаз, оксидазы, ацетнлхолию-стеразы и бутнрилхолннэстеразы в разных бносубстратах - сыворотке крови, тканях животных, культуре клеток Т. рупГопшз, Отработаны условия приготовления ферментных препаратов с использованием данных тест-объектов.

Разработанные методики позволили проводить прямое определение удельной каталитической активности названных фермеров практически в любых биоматерчалах. Использование системных единиц определения УКА ферментов - мккат/кг для органов и тканей высших животных и пкат/клетку (пкат/кл) для культуры Т. рупГопша - позволило провести ее сравнительный анализ.

Разработанные методики использовались в дальнейшей работе для определения удельной каталитической активности ферментов в изучаемых тест-объектах.

2. Уровень удельной каталитической активности п органах

кяшшчеош здоровых лабораторных жп потных и культуге клеток

Телшпшш гт1г<тт.

Полученный нами экспериметальный материал послужил основой для установления среднего уровня удельной каталитической активности (УКА) различных ферментов в органах клинически здоровых лабораторных животных и культуре клеток Т. рупГопшк.

В результате проведенных исследований установлено, что уровень УКА различных ферментов зависел от их типа, локализации и вида биологического объекта.

Установлено, что максимальной УКА в органах лабораторных животных обладала 1-НАЭ. Уровень активности этого фермента в большинстве исследованных объектов значительно превышал уровень активности других ферментов. Минимальной была активность АХЭ и БуХЭ.

Среди исследованных органов наиболее насыщенными ферментами были печень, почки и гонады. Минимальной ферментативной активностью обладали мышцы бедра.

Наибольшая УКА 1-НАЭ регистрировалась в печени и ночках, УКА Шф и оксндазы не имела значительных колебаний в исследованных органах. Максимум активности БуХЭ приходился на печень, АХЭ - на ткань головного мозга.

Максимальный уровень УКА 1-НАЭ регистрировался в печени и почках, где составил, соответственно, у крыс 1200,4 мккат/кг и 700,6 мккат/кг и у мышей 1688 мккат/кг и 607,9 мккат/кг, В остальных органах УКА колебалась в предела* от 150 до 20 мккэт/хг,

Активность холннзстераз была сравнительно невелика в органах крыс и мышей. Она достаточно равномерно распределялась в органах животных, при этом следует отметить приоритетное содержание АХЭ в. ткани головного мозга (42,5 мккат/кг у крыс), а БуХЭ - в ткани печени, (46,1 мккат/кг у крыс и 49, 5 мккат/кг у мышей).

УКА ЩФ и оксндазы более равномерно была распределена в органах крыс и мышей. Активность их в большинстве исследованных органов колебалась в пределах 50-100 мккат/кг. Наиболее высокий уровень УКА-ЩФ установлен в ткани головного мозга, печени, почках, гонадах (соответственно, 191,1, 96,9, 94,б, 75,4 мккат/кг) у крыс и в печени и почках мышей {соответственно, 45,9 и 40,5 мккат/кг).УКА оксидазы была максимальной в почках, печени, ткани головного мозга и гонадах крыс (соответственно, 173,5, 117,4, 97,9, 96,1 мккат/кг) и селезенке мышей (179,4 мккат/кг).

Исследования по изучению УКА ферментов в культуре клеток Tetrahymena piriformis показали, что в них уровень УКА I-НАЭ составил для 1-НАЭ 52 пкат/кл, для ЩФ - 59 пкат/кп, оксндазы - 14 пкат/кл, ДХЭ - 4 пкат/кл, БуХЭ - 9 пкат/кл. Проведенные исследования показали, что распределение ферментативной активности в культуре клеток Т. pyriformis имеет определенное сходство с таковым у высших животных.

Полученные нами данные соответствуют литературным, опубликованным в работах Цапко В.П. (1966), Новгородской Н.И. (1968), Ждановнч Н.В., Удало-ва Ю.Ф. (1970), Новикова В.В. (1970), Карнаухова В.В. (1987, 1985), Лавиной С.А. (1994). Однако названные авторы применяли разные единицы измерения ферментативной активности, поэтому количественно сравнить их данные не всегда представляется возможным. Использованные нами единицы измерения УКА (мккат/кг и пкат/кл) позволили провести сравнение ферментативной активности разных ферментов в различных биологических объектах,

j. Изучение влияния различных тксиклнтоп на ферментные системы

высших животных, 3.1, Влияние ДДВФ на изменение ферментативной активности в органах высших животных в экспериментах in vitro и in vivo.

Целью дальнейших исследований был сравнительный анализ влияния токсических веществ на энзнматнческнн статус различных биотестов и подбор оптимальных ферментных тестов для диагностики отравлений животных.

В качестве базовой модели для экспериментов мы использовали ДДВФ, поскольку это соединение является достаточно изученным представителем группы фосфорорганнческих пестицидов. На его примере можио оценить возможности параметрит ее ко го анализа и хроматограф и чески х методов изучения ферментативной активности, сравнив полученные нами данные с имеющимися в литературе, а также на основании результатов исследования определить паи-

более значимые тесты для диагностики токсикозов, вызываемых фосфорорга-ннческимн соединениями,

П экспериментах тп у!1го с использованием сыпорот кп крови лошади усыновлено, 410 шнтине ДДВФ на исследуемую группу ферментов сопровождалось дозозависнмым снижением их УКД. При этом использование ДДВФ и минимальной дозе 0,3 мкг/мл вызывало достоверное снижение УКЛ 1-ПЛг) и 1>уХЭ на 50%. Эти ферменты максимально снижали УКА при всех использованных лозах. Минимальному шп иГжропапню подвергались ЩФ и ока глаза.

Анализ изменения кинетических параметров проводили с использованием параметрической классификации ферментативные реакций и векторного представления данных но Крунянко 13.И. (1987). Данная система не пропторечне общепринятой - конкурентной, но более тепт определяет мехакгпмм течения ферментативного процесса.

При исследовании характера течения ферментативного пронесся мод влиянием тою или иного токсиканта определяли следующие покупатели: зм ии-рнчески устанавливали величины максимальной скорости ферментативной реакции (Ушах), характеризующей количественный уровень фермент-субстратных комплексов, и констагпу Михаэлнса (Км), характеризующую степень связывания фермента и субстрата, расчетным путем устанавливали - степень связывания фермента и эффектора, выражаемую константой имгнбнропаиия или активации интенсивность взаимодействия фермента и оффектра (1.), сумчар-ную нпглбярующую (лкптирующую) активность токсиканта в отношении гот или иного фермента (р).

Проведенные исследования показали, что возрастание конпешраппп ДДВФ ш VIIго приводило к снижению степени насыщения фермента субсчетом, уменьшению н замедлению образования комплексов <|>ермен г-субстрат ятя всех ферментов, кроме оксидазы. При этом отмечалось возрастание связывания в фермент-ипгибиторпых комплексах (снижение показателя Ю), степень спя новация увеличивалась нрп возрастании лозы ДДВФ для всех фермент«, кроме ЩФ. Максимальный уровень связывания отмечен в комплексах ВуХЗ-ДДВФ, наименьшим было связывание в комплексах оксидаза-ДДВФ.

Интенсивность взаимодействия ДДВФ с нсслеловлшюй группой ферментов возрастала При увеличении дозы токсиканта. ДДВФ наиболее интенсивно взаимодействовал с 1-ПАЭ и БуХЭ. Наименее интенсивно ДДВФ взаимодействовал с сжсидазой. Сравнительно невысокой была интенсивность пзанмо.-юн-стпия ДДВФ с АХЭ и 1ЦФ,

Максимальная суммарная ннгнбирукмная активность ДДВФ отмечена но отношению к СуХЭ и Ы1АЭ (соответственно, 5,38*10 и 5.06*10^ М3) Суммарно проявляемая активность но отношению к АХЭ н ЩФ была несколько ниже (соответственно, и 3,&*ИУ10 М2), Ингибнруютая актттсн,

ДДВФ но отношению к оксидазе была минимальной (0,48*10""' Мг).

Дальнейшие исследования крон од иди в :жсне[тмептах ш ^¡уо на белых мышах, которых обрабатывали масляным растеором ДДВФ я дозах 5, 15 и 50

мг/кг. Анализ клинических признаков и патолого-знатомических изменений в органах мышей показал, что при использовании ДДВФ в дозе 5 мг/кг животные не имели отклонений от контрольной группы. Животные, получившие ДДВФ в дозе 15 мг/кг, были угнетены после получения препарата в течение 1 часа после начала обработки, затем их состояние не отличалось от такового в контрольной группе; после убоя отмечена незначительная кровенаполненпость печени, в остальных органах изменений не зарегистрировано. Животные, получившие ДДВФ в дозе 50 мг/кг, погибали через 2-2,5 часа с клиникой, характерной для отравления фосфороргаиическими соединениями: затрудненное Дыхание, судороги. При осмотре внутренних органов отмечено увеличение и кровенаполненность печени, гиперемия тонкого отдела кишечника, наличие днапедезных кровоизлияний в печени, почках, сердца. Легкие быш заполнены слизистой пенистой жидкостью.

В результате проведенных исследований установлено, что накопление остатков токсиканта в органах мышей зависело от его дозы и топографии. При использовании ДДВФ в иелетальиых концентрациях максимальное содержание остатков препарата регистрировалось в печени, минимальное - в селезенке; при использовании ДДВФ в летальной концентрации максимальное содержание остатков ДДВФ отмечено в селезенкё,

В органах мышей как после убоЯ, так и в органах павших животных максимальному ингнбнроваиию подвергались 1-НАЭ и БуХЭ при всех дозах обработки. Снижение УКА остальных ферментов было менее выражено.

Изменение кинетики ферментативных реакций зависело от дозы токсиканта и топографии исследуемы* ферментов, При этом для всех исследованных ферментов, кроме АХЭ печени и почек и БуХЭ селезенки при нелетальных дозах токсиканта, отмечалось уменьшение образования фермент-субстратных комплексов (снижение Ушах), а для эстераз отмечалось снижение связывания фермента с субстратом (возрастание Км).

"При возрастании дозы токсиканта установлено возрастание связи в фер-мент-ингнбнторных комплексах ДДВФ с АХЭ и оксидазой печени, для остальных. ферментов эта связь либо снижалась при возрастании дозы токсиканта (АХЭ почек и селезенки, БуХЭ во всех органах, ЩФ селезенки н оксидаза почек), либо возрастала при использовании концентраций 5 и 15 мг/кг, но снижалась при летальной дозе ДДВФ - 50 мг/кг (1-НАЭ »о всех исследованных органах, оксидаза селезенки).

Наиболее интенсивно протекали реакции вданмодействдя ДДВФ и 1-НАЭ во всех исследованных органах. По степени интенсивности взаимодействия можно расположить исследованные ферменты в порядке убывания следующим образом: 1-НАЭ, БуХЭ, АХЭ, ЩФ, оксидаза. Можно также отметить, что если для гидролитических ферментов интенсивность взаимодействия с ДДВФ возрастала при возрастании содержания ДДВФ в органах, то для оксидазы печени она снижалась, а для оксидазы почек изменение интенсивности не зависело от дозы токсиканта.

п

По степени пнгибируюшего влияния ДДВФ на исследованную группу ферментов последние можно расположить в порядке убывания в печени, почках и селезенке следующим образом: I-НАЭ (значения Q, соответственно, 1,53*10"9, 2,76*10"9, 5,54*10"9 Мг), ЩФ (значения Q, соответственно, 1,24*1"'", 1,31*10"', 4,45*10"' Мг), БуХЭ (значения Q, соответственно, 0,89*10'9, 1,11*10", 2,68*Ю"® Мг), АХЭ (Q, соответственно, 0,59*10"', 0,73*10', 3,37* ю" М1), ок-сидаза (значения Q, соответственно, 0,0i ПО'4, 0,032*109, 0,26*10"' М2). Максимального ингибнрутощего эффекта на исследованные ферменты ДДВФ достигал в начальной области концентраций (7-14*10"7 М/кг). Исключение составляла ЩФ; иптбнругоший эффект ДДВФ но от/юшенмю к этому ферменту значительно возрастал в диапазоне концентрации, вызывающих отравление и гибель животных. При угом ингнбиругощцй эффект в отношении 1-НАЭ проявлялся раньше и достигал максимума при минимальных концентрациях ДДВФ в органах, '

Обращаясь к литературным данным и экспериментальным исследованиям в области анализа диагностической ценности различных эстераз по отношению к фосфорорганическим соединениям, следует обратить внимание на ют факт, что ингнбнрование неспецифических эстераз, в частности, 1-11АЭ, является вджболте r¡pí\mne.MUM для анагнта токсического действия фосфорорганнческих соединений- Согласно полученным данным, можно отметить, что эти ферменты изменяли свою активность в наибольшей степени при минимальной дозе токсиканта, Если иигибируюшиб эффект ДДВФ по отношению к АХЭ только начинал возрастать при минимальных концентрациях ДДВФ как в экспериментах m vktro, так и i» vivo, то при тех же концентрациях отмечена тенденция к усилению эффекта для БуХЭ и I-НАЭ. В начальной области концентраций ингибп-руташдй эффект ДДВФ по отношению к 1-НАЭ значительно превышал таковой для АХЭ, которая, согласно данным литературы (О'Ерайн р., 1960; Каган Ю.С., 1980), является мишенью действия для фосфорорганнческих соединений, а анализ изменения ее активности является диагностическим тестом при отравлении фосфорорганическимн соединениями (Покровский А.А., 1964). Рациональным тгегдатся tí№ иепйпъзовдние в качестве диагностического теста исследования активности БуХЭ (Bajgar J., 1985), поскольку ингнбнрованне этого фермента, так же, как и 1-НАЭ, было высоким и проявлялось при концентрациях, не вызывающих клинических признаков отравления у животных.

3.2. Влияние перметркна на изменение Ферментативной активности в эксиеримещ-ах in vino и щ vivo.

Представитель группы синтетических пнретроидов перметри» был использован в экспериментах в качестве модели по следующим причинам: соединения этой группы достаточно часто применяются в настоящее время в ветеринарной практике в качестве перспективных инсектицидов; влияние пнретроидов

на отдельные ферменты, в частности, на АХЭ, сходно с влиянием фосфорорга-ннческнх пестицидов, ко менее выражено (Глейберман С.Е. и др., 1983), В данном случае интерес представляло изучение различия влияния этих соединений на ферменты и подбор возможных оптимальных биохимических критериев оценки токсического действия перметрина,

Экспериме1ггы in vitro проводили с использованием сыворотки крови лошади, в которую вносили перметрпп в дозах 10, 50, 100 мкг/мл.

Исследованием уровня УКЛ установлено, что в условиях эксперимента in vitro изменение ферментативной активности зависело от типа фермента. Под влиянием перметрина снижалась УКА ЛХЭ, ЩФ и оксидазы, возрастала УКЛ 1-НАЭ до 70%, Максимальное снижение УКЛ до 80% отмечено для ЩФ и оксидазы. АХЭ снижала УКА прн использовании перметрина в дозах 50 и 100 мкг/мл до 40%, Изменение ферментативной активности всех ферметггов носило дозозависнмын характер.

Исследование кинетики ферментативных реакций показало, что под влиянием перметрина снижение образования фермент-субстратных комплексов регистрировалось для АХЭ и ЩФ; для остальных ферментов Vinax либо возрастала (1-НАЭ), либо не изменялась (оксндаза). При этом для всех исследованных ферментов, кроме l-IiA3, отмечалось уменьшение связывания в фермент-субстратных комплексах.

Степень связывания в фермент-эффекторных комплексах, выражаемая через константу ингибировання (активации) Ki(a), зависела от типа фермента и дозы токсиканта. Снижение связывания регистрировалось в комплексах перметрина с 1-НАЭ, ЩФ и оксидазой, в фермент-ингибиторных комплексах с АХЭ связывание возрастало прн возрастании дозы токсиканта. Проведенные расчеты показали, что минимальным среди исследованных ферментов было связывание в комплексах перметрин-1-НАЭ и АХЭ, максимальным - в комплексах с ЩФ и оксидазой.

Нами установлено, что при возрастании дозы перметрина отмечено увеличение интенсивности взаимодействия его с исследованными ферментами. При этом наиболее интенсивно токсикант взаимодействовал с оксидазой и ЩФ, значения L для этого фермента были максимальными.

Перметрин проявлял наибольшую суммарную ингибируюшую активность по отношению к оксидазе и ЩФ (значение Q для этих ферментов составило 1,8*10"® и 1,32*10'ЯМ1), Суммарно проявляемая ингибирующая активность перметрина по отношению к АХЭ была значительно ниже и составляла 0,3*10"я М5. Активирующий эффект перметрина по отношению к 1-НАЭ был минимален, значение Q для этого фермента составило 0,8*10"s М1. Ингибирующее влияние перметрина на исследованные ферменты достигало максимума при концентрации эффектора в сыворотке 10 мкг/мл Можно отметить, что иигиби-рующий эффект по отношению к АХЭ в названной области концентраций только начинал возрастать и достигал максимума прн концетрации перметрина 50

мкг/мл, в то время как по отношению к окендазе он значительно превышал таковой для АХЭ уже при минимальной концентрации токсиканта.

Дальнейшие исследования были направлены на изучение токсическою влияния перметрина на ферменты в условиях эксперимента in vivo. Опыты проводили на белых мышах, которых обрабатывали масляным раствором перметрина в дозах 200, 1000 и 2000 мг/кг. Анализ клинического состояния животных в течение эксперимента показал, что животные, получившие перметрин в дозе 200 и 1000 мг/кг, не имели отклонений в клинике от контрольной, группы. Животные, получившие перметрин в дозе 2000 мг/кг, были угнетены, затем состояние угнетения сменялось возбуждением, шерсть на животных была взъерошенной, отмечались признаки нарушения координации движений, гибели мышей в течение экспозиции не отмечено. При обработке в дозе 200 и 1000 мг/кг изменений во внутренних органах пе обнаружено, при обработке в дозе 2000 мг/кг отмечена кровенаполценность сосудов печени, желудка, тонкого отдела кишечника.

Содержание остатков перметрина во внутренних органах зависело от дозы токсиканта и топографии. Отмечено дозозависимое накопление остатков перметрина в исследованных органах. Максимальное определение остатков отмечено в печени при всех дозах обработки.

Исследования уровня УКА ферментов показали, что степень ее изменения зависела от дозы токсиканта, типа и топографии фермента. УКА АХЭ, ЩФ и оксидазы снижалась во всех исследованных органах на 10-70% в зависимости от дозы и типа фермента, при этом наибольшему ингибированню подвергалась оксидаза, Снижение УКА БуХЭ на 12-70% отмечено только в печени и селезенке, изменения УКА этого фермента в почках ие зарегистрировано. УКА t-НАЭ также изменялась только в печени и селезенке, при этом в печени отмечено снижение ферментативной активности на 13-85%, в селезенке - возрастание на 12-40% в зависимости от дозы токсиканта.

При этом для всех названых ферментов, кроме оксидазы селезенки, отмечалось уменьшение образования фермент-субстратных комплексов, н для всех ферментов, кроме Í-НАЭ селезенки, снижение степени связывания в этих комплексах.

Проведенные расчеты значения констант ингнбнрования и активации показали, что при возрастании дозы токсиканта отмечено снижение связывания в фермент-эффекторных комплексах для всех исследованных ферментов. При этом можно отметить, что минимальный уровень связи в ферме ит-эффектор пых комплексах зарегистрирован для 1-ПАЭ, наибольший - в комплексах с оксида-зой.

Наиболее интенсивно перметрин взаимодействовал с окендазой и ЩФ во всех исследованных органах, значения L для этих ферментов были максимальными. При этом наибольшей при минимальной дозе токсиканта была интенсивность взаимодействия перметрина с окендазой. По отношению ко всем нссле-

к,

дованиым ферментам пермегрип исчерпал свою ннгибирующую активность в начальной области ттетце1ттраций.

Наиболее интенсивно перметрин взаимодействовал с ферментами печени прн использовании токсиканта в минимальной дозе,* при возрастании дозы максимальная интенсивность взаимодействия отмечена для ферментов селезенки.

Наибольший иигибиругаший эффект перметрин проявлял по отношению к оксидазе и ЩФ Максимальная ингибиругашэя активность перметрина (Q) для этих ферме1гтов в печени, почках и селезенке составила, соответственно, П,4*10-* и Мг, 3,74*10"6 и 3,37*10* М3,2,4*10* и 3,$М0 Й Мг-

Оценивая результаты проведенных исследований, можно констатировать, что использованные методы хроматографического определения ферментативной активности обладали достаточной чувствительностью и были пригодны для анализа кинетики ферментативных реакций как в условиях in vilro, так и в условиях in vivo. Использованная методика параметрического анализа позвали- I ла оценить воздействие перметрина на исследованную группу ферментов. Полученные результаты соответствовали имеющимся в литературе данным о влиянии перметрина на кинетику ферментативных реакций, катализируемых АХЭ, и подтверждали факт, что перметрин выступает как ингибитор смешанного типа для этого фермента (Rao G.V., Rao K.S.J., 1985). Однако использованная методика позволила более детально оценить влияние перметрина на иссле-

дотаъиидъ фермента TI цепом.

При оценке диагностической значимости ферментов стоит обратить внимание на исследование оксидаз, поскольку они в наибольшей степени, среди изученных, подвергались ннгибированню перметрином. По отношению к ним это соедините проявляло максимальную ингибирующуга активность. Максимальной, особенно при концентрациях, не вызывающих изменения клинического состояния, была интенсивность взаимодействий перметрина и оксидазы. Полученные в условиях эксперимента in vitro данные оказались пригодны для прогнозирования токсического эффекта перметрина в условиях эксперимента in vivo. В качестве дополнительного критерия можно использовать снижение УКА 1ДФ, в отношении которой перметрин проявлял высокие интенсивность взаимодействия и суммарный ннгнбирующий эффект.

3.3. Влияние ацетата свинца на изменеиие Ферментативной активности в экспериментах in vilro и *m vivo.

Свинец является достаточно распространенным загрязнителем окружающей среды, механизм его токсического действия основан на нарушении системы построения гема. Однако влияние свинца не ограничивается только этими яаленнямп, поэтому целью наших исследований было изучение механизмов воздействия свинца на исследуемую ipynny ферментов с целью возможного ис-

пользования данных тестов для диагностики и прогнозирования свинцовых токсикозов.

tí качестве модельного соединения использовали ацетат свинца в кон-Не1гтрацнях дня эксперимента in vitro 10,50 н 100 мкг/мл.

Установлено, что в условиях экспериментов in vitro ацетат свинца вызывал дозозависимое снижение У К Л гидролитических ферментов. УКА окспдэты под влиянием этого соединения не изменялась. При этом максимальное снижение УКА зарегистрировано для ЩФ и 1-НАЭ, процент нпгибировапия которых составил 15-83% в зависимости от дозы и типа фермента. Изменение УКЛ ЛХЭ было недостоверно и не превышало 15%. Эго же относится и к БуХЭ, максимальное снижение УКА которой регистрировалось на уровне 29%.

Для исследованных ферментов установлено, что под влиянием свинца отмечал 9сь снижение образования фермент-субстратных комплексов со 1ЦФ. D то же время Vmax для БуХЭ и t-НЛЭ возрастала по сравнению с контролем, при этом ее изменения не зависели от доз токсиканта. Для БуХЭ, 1-НЛЭ и ГЦФ отмечалось возрастание значения константы Михаэлнса, что свндетельстповало о снижении связывания в комплексах фермент-субстрат.

При возрастании дозы токсиканта отмечено уменьшение связывания фермента и ингибитора. Наибольшее связывание регистрировалось в комплексах со ЩФ.

Интенсивность взаимодействия ацетата свинца с исследуемой группой ферментов была примерно одинаковой при незначительном превалировании уровня а отношении ЩФ.

Расчет суммарной ипгибнрующей активности ацетата свинца по очноше-Ш1ю к исследуемым ферментам показал, что максимальную ингнбируюшую активность свинец проявлял по отношению к ЩФ - 4,99*10* Мг, при этом взаимодействие свинца и ЩФ достигало максимума интенсивности в начальной области концентраций. Суммарно проявляемая ингибиругощая активность ацетата свинца к БуХЭ и 1-НАЭ была несколько ниже - 4,61*10"" и 2,25*10" Мг, соответственно.

Дальнейшие исследования были направлены на изучение влияния свинна на ферменты в условиях экспериментов in vivo. Для этого были проведены 2 серии экспериментов, включающие острые и хронические опыты.

Острые опыты ставили на беспородных белых мышах, которых обрабатывали водным раствором ацетата свинца в дозах 300, 1500 и 3000 мг/кг живой массы.

Клиническое состояние животных, получивших препарат в дозах 300 н 1500 мг/кг, не имело отклонений от контрольной группы. Животные, получившие ацетат свинца в дозе 3000 мг/кг, были угнетены, отмечался тремор мышц, гибель наступала через 2-2,5 часа лосле начала обработки. Осмотр внутренних органов показал, что при обработке в дозе 300 мг/кг изменений не обнаружено, при обработке в дозе 1500 мг/кг отмечена кровенаполнешюстъ сосудов стенки тонкого отдела кишечника, в остальных органах изменений не зарегнстрирова-

но. При обработке в дозе 3000 мг/кг отмечена гиперемия стенок желудка и тонкого отдела кишечника. Печень дряблая, с кровоизлияниями под капсулой.

Исследование содержания свинца в органах мышей продемонстрировало дозозависнмое его накопление. При использовании дозы 300 мг/кг максимальный уровень его обнаружен в печени, при дозе 1500 мг/кг - в почках, при дозе 3000 мг/кг - в селезенке.

Изучение изменения ферментативной активности показало, что под влиянием ацетата свинца отмечено снижение УКА АХЭ и оксидазы 6о всех исследованных органах при дозах 1500 и 3000 мг/кг, при этом уровень снижения ферментативной активности находился в пределах для АХЭ - 15-38%, для окси-дазы - 18-52%. БуХЭ снижала свою активность во всех исследованных органах при всех дозах обработки, при этом процент ингибировапия УКА не превышал 45%. 1-НАЭ не изменяла уровень УКА в печени и почках, в селезенке уровень УКА фермента возрастал максимально на 74%. ЩФ снижала уровень своей активности в почках максимально на 85%, уровень УКА в селезенке недостоверно снижался при использовании дозы 300 мг/кг и недостоверно возрастал при использовании доз 1500 и 3000 мг/кг на 18-25%. При этом для названных ферментов, кроме 1-НАЭ и ЩФ селезенки, отмечено снижение образования фермент-субстратных комплексов, для 1-НАЭ и 1ЦФ селезенки отмечен рост Ушах, В то же время для всех ферментов отмечалось снижение связывания в фермент-субстратных комплексах.

Расчет констант ингибировапия (активации) показал, что изменение этою показателя зависело от топографии ферментов и дозы токсиканта. В печени регистрировалось возрастание степени связывания ферментов и свинца, в почках этот эффект регистрировался для всех ферментов, кроме ЩФ, в селезенке возрастание связывания фермента и токсиканта отмечалось только у оксидазы. Остальные ферменты снижали связывание со свинцом при возрастании ею содержания в органах.

Под влиянием увеличения содержания свинца в органах мышей отмечено повышение интенсивности взаимодействия ферментов и свинца. Наиболее интенсивно свинец взаимодействовал с ферментами селезенки, проявляя максимальную интенсивность в отношении 1-НАЭ и ЩФ, в почках - в отношении ЩФ, В печени тггепсншоспъ взаимодействия ферментов и свинца была мини-мальвой даже при летальной концентрации токсиканта.

Йнгибирующее влияние свинца на ферментативную активность в исследованных органах зависело от типа фермента и его локализации. Максимальную ингибирующуто активность свинец проявлял по отношению к ЩФ 1-НАЭ селезенки и ЩФ почек. Значения С} для этих ферментов были максимальны для названных органов и составили, соответственно, 1,89*Ю"7, 1,13*3 О"7и 0,87*10"7 М1.

Для установления зависимости изменения ферментативной активности от длительности поступления токсиканта были проведены хронические экспери-

менты с использованием ацетата свинца в качестве модельного соединения, который ежедневно вводили в корм белым крысам в дозах 17 и 54 мг/кг.

Анализ клинического состояния животных показал, что животные обеих групп не имели отклонений в клинике от контрольной [руины в течение срока обработки. У животных, получавших ацетат свинца в дозе 54 мг/кг, к концу третьего месяца обработки на спине у основания хвоста появились области облысения, Отклонений в клиническом состоянии животных не установлено. Изменений во внутренних органах обнаружено не было, однако через 3 месяца после начала эксперимента отмечена повышенная ломкость костей у животных обеих групп.

Результаты исследования содержания свинца показали его дозозависимое возрастание в органах крыс; исключение составили почки при использовании дозы 54 мг/кг. В этом случае накопление свинца отмечено в течение 2 месяцев, через 3 месяца его уровень в почках снизился вдвое, при этом значительно возросло содержание свинца в ткани головного мозга и сердце. Проведенные исследования продемонстрировали, что максимальное содержание свинца отмечалось в ткани почек, минимальное - в мышечной ткани.

Исследованием ферментативной активности в органах установлено снижение УКА всех изученных ферментов; исключение составили 1-НАЭ, ЩФ в селезенки при обеих использованных дозах, где их активность возрастала, в зависимости от длительности эксперимента и дозы токсиканта, до 240% по сравнению с котролем. Максимальное снижение УКА до 94% регистрировалось в почках. Снижение активности ферментов в других органах было в пределах 6570%.

При этом для всех исследованных ферментов, кроме 1-НЛЭ и ЩФ селезенки, отмечалось снижение максимальной скорости ферментативных реакций, характеризующее уменьшение образования ферме!rr-cy бсграпiых комплексов, и возрастание Км, свидетельствующее об уменьшении связи в фермент-субстратных комплексах, 1-НАЭ и ЩФ селезенки при обеих дозах токсиканта повышали Vmax на фоне возрастания Км.

Определение констант ингибировапня и активации ферментов показало, что под влиянием накопления свинца в тканях отмечалось уменьшение связывания в ферме нт-эффекторных комплексах во всех органах при обеих дозах обработки.

Под влиянием свинца возрастала интенсивность его взаимодействия с исследуемыми ферментами в органах крыс при увеличении содержания в них металла, Наиболее интенсивно свинец взаимодействовал с ферментами почек, 1 -НАЭ и ЩФ селезенки. Наименьший уровень интенсивности отмечен в отношении ферментов мышечной ткани.

Наибольшую суммарную ингибирующую (активирующую) активность свинец проявлял в отношении ферментов селезенки и почек. При этом суммарная активирующая активность в отношении 1-НАЭ и ЩФ селезенки была равна

1,28*10"® и 2,57*10"s М1, а суммарная ингнбнрующая активность в почках с от-ношеннн этих же ферментов составила, соответственно, 5,11*10"* и 8,06*10 * М1. Для остальных исследованных ферментов уровень суммарной ингибируго-щей активности колебался в пределах от 0,0008* 10 я до 0,95* 10" М2.

Таким образом, резюмируя результаты проведенных исследований, можно отметить, что влияние свинца на ферменты определялось его дозой и длительностью воздействия. При этом в экспериментах in vivo отмечено достоверное возрастание активности 1-НЛЭ и ЩФ селезенки, которое сопровождалось снижением связывания в фермент-субстратных комплексах и возрастанием максимальной скорости ферментативной реакции. Такое изменение ферментативной активности объясняется Рашевской Л.М. (1973) тем, что свиней, поступая в организм, попадает в кровяное русло, где связывается с форменными элементами крови, в частности, с эритроцитами. Осаждаясь на их мембранах, свинец способствует разрушению эритроцитов, утилизация которых происходит в селезенке. При повышении утилизации отмечается повышение уровня клеточных ферментов в селезенке, чем объясняется возрастание скорости взаимодействия ферментов н субстрата. Однако снижение связывания в фермент-субстратных комплексах подтверждает токсическое действие свинца по отношению к этим ферментам, В остальных органах отмечено снижение активности ферментов, при этом тип изменения ферментативных реакций зависел от длительности эксперимента и дозы токсиканта. Интенсивность взаимодействия ферментов и свинца определялась локализацией ферментов. Наиболее интенсивно свинец взаимодействовал с энзимами в органах, где его содержание было максимальным - почках, печени, селезенке. При этом наибольшую ингибирую-щуго активность свинец проявлял к гидролитическим ферментам. Это объясняется тем, что свинец активно взаимодействует с тиоловыми энзимами, к которым относятся эстеразы и фосфатазы (Dobrovska-Boula В. et al., 1996, Lafínvo L.M., et al., 1996).

Оценивая возможную диагностическую ценность изученных нами ферментов, можно обратить внимание на определение удельной каталитической активности 1-НАЭ и ЩФ селезенки, которая достоверно возрастала при использовании свинца как в острых так и в хронических экспериментах, при одновременном снижении УКА этих ферментов в ткани почек. Изменение их активности было достаточно стабильным показателем свинцовой интоксикации. При проведении диагностических исследований с использованием биохимического анализа необходимо обратить внимание на факт снижения удельной каталитической активности названных ферментов в почках, поскольку это изменение носило достаточно стабильный характер как при проведении острых, так и хронических экспериментов. Интенсивность взаимодействия и ингибирующий эффект в отношении названных ферментов были наибольшими как в острых, так и в хронических опытах.

3.4. Влияние нитрата кадмия на изменение Ферментативной активности в экспериментах in vitro н in vivo.

Кадмий, так же как н свиней, является одним из саннтарно-нормируемых элементов. Он воздействует на целый спектр биохимических процессов в организме, в частности, на синтез ДНК, нарушает процесс окислительного <|юсфо-рилирования, взаимодействует с высокомолекулярными т иол содержащим и белками. Для изучения влияния кадмия на ферменты рассматриваемой группы нами были проведены две серии экспериментов - in vitro и in vivo. Целью их было изучение влияния нитрата кадмия на активность и кинетику ферментативных реакций, катализируемых исследуемыми ферментами, а также получение дополнительных сведений о механизме действия кадмия в условиях in vitro и in vivo и оценка информативности ферментных тестов при диагностике токсикозов, вызываемых солями кадмия. В качестве модельного соединения использовали нитрат кадмия.

В экспериментах in vitro, в которых нитрат кадмия вносили в сыворотку крови лошади из расчета 1,5, 10 мкг/мл, отмечено достоверное снижение УКЛ только ЩФ до 83%. Ингибирование ферментативной активности происходило за счет снижения образования фермент-субстратных комплексов при сохранении уровня связывания в этих комплексах. При этом степень связывания в фер-мент-ингибиторных комплексах не зависела от дозы токсиканта. Остальные исследованные ферменты свою активность в данном диапазоне концентраций не изменяли.

Увеличение дозы токсиканта, согласно проведенным расчетам, приводило к увеличению интенсивности взаимодействия нитрата кадмия и ЩФ, Ишнбн-рующий эффект нитрата кадмия по отношению к ЩФ составил 3,7*10'1'1 М5. Расчеты показали, что первичный максимальный иигибирующпп э<|»фект кадмия в отношении ЩФ достигался при концентрации ингибитора в 4 *! 0'Л М/л, Затем ингибирующий эффект нитрата кадмия оставался неизменным, по достижении концентрации 21*10"® М/л пнгибиругоший эффект соединения снова начинал возрастать и, достигнув значения 36-38*10^М/л, более ие изменялся.

Для установления влияния нитрата кадмия на ферменты в условиях ¡n vivo были поставлены 2 серии опытов - острые и хронические.

При проведении острых опытов мышей обрабатывали раствором unípara кадмия per os в дозах 20, 100 и 200 мг/кг. Анализ клинического состояния животных в течение эксперимента показал, что мыши, получившие шпрат кадмия в дозе 20 мг/кг, не имели отклонений в клинике от контрольной группы. Животные, получившие шпрат кадмия в дозе 100 мг/кг, были угнетены, отмечался тремор мышц, слюнотечение, взъерошенность шерсти. Гибель не регистрировалась. Мыши, получившие нитрат кадмия в максимальной дозе, были угнетены, гибель наступала через 2,5-3 часа после начала обработки. Патолого-анатомическое исследование органов павших и вынуждено убитых животных

показало, 'гто при обработке в дозе 20 мг/кг изменений во внутренних органах не обнаружено. При обработке в дозах 100 и 200 мг/кг отмечена кровенапол-ненность сосудов стенок желудка н тонкого отдела кишечника, в остальных органах изменений не зарегистрировано. При обработке в дозе 200 мг/кг отмечена гиперемия стенок желудка и тонкого отдела кишечника, дряблость печени, кровоизлияния в сердечной мышце.

Исследование уровня кадмия продемонстрировало дозозависимое накопление его в органах мышей. При использовании дозы 20 и 100. мг/кг максимальное его содержание регистрировалось в селезенке, при дозе 200 мг/кг - в печени.

Исследованием ферментативной активности установлено, что под влиянием возрастающих концентраций кадмия в органах животных отмечалось снижение УКА АХЭ, БуХЭ н оксндазы, однако это снижение регистрировалось только при максимальной дозе обработки и было недостоверным, nponeirr ин-гибировання УКА этих ферментов не превышал 30%, При обработке в дозах 20 и!00 мг/кг УКА l-НАЭ возрастала в печени и селезенке на 80-100%. Возрастание активности фермента регистрировалось н в почках при дозе токсиканта 20 мг/кг. При использовании летальной дозы изменения УКА 1-НАЭ в печени и селезенке не отмечено, в почках активность снизилась на 98%. Изменение УКА ЩФ зависело от дозы и топографии фермента. В печени отмечалось достоверное снижение УКА ЩФ на 72% только при использовании нитрата кадмия в максимальной дозе; в почках достоверное снижение УКА фермента до 64% регистрировалось ирн всех использованных дозах, однако не зависело от концен-трашш токсиканта в органе и дозы препарата, В селезенке отмечено дозозависимое возрастание УКА фермента па 50-300%. При этом изменение ферментативной активности ЩФ в почках и селезенке протекало при возрастании максимальной скорости ферментативных реакций и снижении связывания в фер-мент-субсгратиых комплексах.

При расчете констант ингибирования (активации) установлено, что с возрастанием содержания кадмия в исследованных органах отмечалось снижение Связывания в фермеит-эффекторных комплексах с 1-НАЭ и ЩФ. Для остальных ферментов не выявлено зависимости изменения связывания от концентрации токсиканта в тканях.

Для всех ферментативных реакций регистрировалось возрастание интенсивности взаимодействия ферментов с кадмием при накоплении токсиканта в органах. При этом наибольшую интенсивность кадмий проявлял в отношении ЩФ во всех исследованных органах, а также наибольшую суммарную активирующую (в селезенке) и иигнбнрующую (в печени и почках) активность.

В хронических экспериментах с нитратом кадмия показано, что при использовании дозы 3 мг/кг живой массы нитрат кадмия не вызывал изменения клиники и состояния внутренних органов. При использовании дозы 15 мг/кг живой массы к концу третьего месяца эксперимента животные стали угнетенными, малоподвижными, плохо принимали пищу. Однако выраженных измене-

мин во внутренних органах не установлено. Отмечены лишь незначительное увеличение печени, которая имела металлический оттенок, а также повышенная ломкость костей.

Накопление кадмия зависело от длительности эксперимента н дозы нитрата кадмия. Максимальное его содержание отмечено в печени и почках.

Изучение уровня ферментативной активности в органах крыс показало, что кадмий вызывал снижение УКА во всех исследованных органах. Исключение составила ЩФ селезенки при всех дозах обработки и 1-ИАЭ селезенки при использовании нитрата кадмия более 2 месяцев; активность этих ферментов возрастала по сравнению с контролем на 50-300% в зависимости от дозы н длительности эксперимента. Степень ингибировапня УКА зависела от топографии исследуемых ферментов. Максимальное снижение УКА отмечено для ферментов печени, почек и сердечной мышцы.

Наиболее интенсивно кадмий взаимодействовал с ферментами печени, почек и селезенки, проявляя наибольшую ннгнбирующую (активирующую) активность в отношении 1 -НАЭ и ЩФ,

Оценивая диагностическую ценность исследованных ферментов, можно рекомендовать исследование активности ЩФ селезенки и ингибировапие УКА этого фермента в почках как дополнительного диагностического теста при кадмиевых токсикозах, поскольку активность этого фермента достоверно возрастала при воздействии кадмия как в острых, так и в хронических экспериментах. Активирующий эффект кадмия в отношении этого ферметп хотя и был невысок, но достигал максимума при достаточно низких концентрациях кадмия в ткаин селезенки и оставался постоянным при возрастании содержания токсиканта. Несколько менее чувствительным проявил себя тест на активацию 1-НЛЭ селезенки, однако он также может быть учтен при диагностике токсикозов, вызываемых солями кадмия.

4. Изучение влияния токсикантов на ферментные системы инфуюпШ

tetrah ymena pyriformis.

Нами проведено изучение влияния различных токсикантов на культуру клеток Т. pyrjformis и ее ферментные системы. Исследования проводили в условиях экспериментов in vitro И in vivo. Эксперименты in vitro ставили па ферментном препарате, полученном из трехсуточной отмытой и сконцентрированной культуры Т. pyriformis. Эксперименты ¡n vivo включали внесение токсиканта в культуру Т. pyriformis. Для постановки экспериментов использовали те же токсиканты, что и в опытах на высших животных - ДДВФ, перметрип, нитрат кадмия, ацетат свинца.

При постановке экспериментов in vitro названые токсиканты вносили в ферментный препарат в виде водных или водно-ацетоновых растворов с известной концентрацией в количествах, не превышающих 0,01 мл на I мл фермент-

ното препарата. По окончании экспозиции определяли УКА ферментов н изменение кинетических показателен.

4.1. Влияние ДДВФ на изменение ферментативной активности в культуре клеток Т. pyrifomiis в экспериментах in vilro и in vivg.

В результате проведенных экспериментов in vilro установлено, что иод влиянием ДДВФ (концентрации 0,001, 0,0025, 0,01, 0,03 мг/мл) ферменты снижали свою активность. При этом максимальное снижение УКА отмечено для I-НАЭ. Снижение ферментативной активности носило дозозависимый характер и составило для 1-НАЭ 40, 78, 85, 99% в зависимости от возрастающей концентрации токснкшгта, для АХЭ - 29, 76, 82,98%, для БуХЭ - 35,41, 89, 98%, для ЩФ - 16,35, 57,88%, для оксндазы - 0,37, 51,52%.

Исследование кинетики ферментативных реакций показало, что под влиянием ДДВФ для эстераз возрастало связывание в фермеит-ингибиторных комплексах. Для фосфзтаз и оксндазы это изменение не зависело от концентрации токсиканта.

При увеличении конце1гтрации ДДВФ возрастала интенсивность взаимодействия фермента н эффектора. Наиболее интенсивно протекали реакции, катализируемые 1-НАЭ и БуХЭ. Интенсивность взаимодействия с АХЭ была несколько ниже.

Наибольшую суммарную нигибируюшую активность ДДВФ проявлял в отношении БуХЭ (22* Ю^М2), однако изменение ферментативной активности и максимальная интенсивность ферментативной реакции при низкой концентрации ДДВФ отмечена для 1-НАЭ (14*10"® М1). Суммарная ингибиругощая активность в отношении АХЭ также была высокой и приближалась к таковой для БуХЭ (19*10"® М1). Но при этом максимум ннгибирующего действия на фермент достигался токсикантом при высоких концентрациях.

Эксперименты ¡n vivo включали в себя внесение ДДВФ в концентрациях 0,001, 0,0025, 0,01, 0,03 мг/мл в питательную среду с культурой Т. рупГоптнз, экспозицию в течение 4 суток, учет ростовой реакции, отмывку культуры от остатков шгтательиой среды, подготовку ферментного препарата и определение в нем уровня ферментативной активности и изменения кинетики ферментативных реакций.

В результате проведенных исследований установлено, что под влиянием ДДВФ при концентрациях 0,0025, 0,01 и 0,03 мг/мл отмечено снижение ростовой реакции на 15,41 и 52%, при использовании концентрации 0,001 мг/мл изменений ростовой реакции не обнаружено.

Нами установлено, что под влиянием ДДВФ отмечалось снижение УКА эстераз при всех тупейных концентрациях до 99%, фосфатаз - при содержа-НШ1 препарата 0,01 и 0,03 мг/мл (на 19 и 43%, соответственно), оксндазы снижали активность на 41% только при уровне ДДВФ 0,03 мг/мл. При этом сииже-

ние УКА АХЭ было на 11%, 17%, 39% и 53% при уровнях токсиканта, соответственно, 0,001, 0,0025,0,01 и 0,03 мг/мл. БуХЭ снижала свою активность па 14, 26, 29, 62%, t-НАЭ - на 29,37, 61 и 89%, соответственно. Таким образом, установлено, что под влиянием ДДВФ отмечено преимущественное снижение УКА 1-НАЭ.

Проведенные расчеты показали, что при возрастании концентрации ДДВФ изменялась степень связывания фермента и токсиканта. Наибольшая степень связывания отмечена в комплексах с 1-НАЭ, Связывание, в комплексах фермент-эффектор для этих ферментов увеличивалось при возрастании уровня TOKCHKairra, В комплексах ДДВФ с АХЭ и БуХЭ степень связывания была несколько ниже, хотя и увеличение содержания ДДВФ приводило к возрастанию степени связывания.

Наиболее интенсивно протекали ферментативные реакции взаимодействия 1-НАЭ и ДДВФ, значения L для них были максимальны. По отношению к этому ферменту ДДВФ проявлял максимальную суммарную ннгибируюшую активность. Несколько менее интенсивно протекали реакции взаимодействия АХЭ и БуХЭ. Интенсивность взаимодействия токсиканта с этими ферментами также была невелика; суммарная ингибирующая активность, проявляемая ДДВФ в отношении АХЭ и БуХЭ, была ниже чем для 1-НАЭ. При этом следует отметить, что если ингибирующнй эффект в отношении холинэстераз достигал максимума в исследуемом диапазоне концентраций при дозе 0,01 мг/мл, то для 1-НАЭ ингибирующнй эффект достигал максимума и значительно превышал таковой для АХЭ и БуХЭ при концентрации ДДВФ 0,0025 мг/мл. Наименее интенсивно протекали реакции взаимодействия ДДВФ с ЩФ и оксндазой. Суммарная ингибирующая активность в отношении этих ферментов была минимальной.

Сравнивая результаты экспериментов, проведенных на инфузориях и высших животных, можно отметить наличие сходства такого взаимодействия, которое проявлялось в наиболее раннем и максимальном снижении УКА 1-НАЭ. Этот фермент можно считать индикаторным при оценке влияния фосфо-роргаиических соединений на различные организмы, в том числе и на организмы разного трофического уровня. На это указывает и высокая степень корреляции результатов экспериментов на высших животных и инфузориях (г >0,7),

Таким образом, на основании проведенных нами исследований можно отметить, что наибольший ингибнрующий эффект ДДВФ проявлял в отношении 1-НАЭ как в экспериментах in vitro, так и в экспериментах in vivo. Полученные данные были сходны с таковыми для высших животных и также могут использоваться для оценки токсического действия ДДВФ на Т. piriformis. Кроме того, учитывая сходство токсического действия ДДВФ на высших животных и культуру клеток простейших, а также высокий уровень корреляции результатов, данные тесты могут быть с успехом использованы для оценки токсичности объектов ветеринарно-саннтарного и экологического контроля.

4,2. Влияние пермсшша un изменение ферментативной активности в культуре клеток Т. uvrifomiis в экспериментах in vitro и in vivo.

Для изучения влияния пнретроидных инсектицидов на ферментативную активность Г. pyriformis были поставлены эксперименты in vilro в ферментном препарате с использованием перметрнна в следующих концентрациях - 0,01, 0,05,0,1,0,5 мг/мл.

В результате проведенных исследований было установлено, что иод влиянием перметрнна отмечено угнетение ферметативпоп активности. Снижение УКА оксидазы регистрировали при всех изученных концентрациях перметрнна. Это снижение носило лозтаапненмий характер и было равно при 0,01 мг/мл -16%, при 0,05 мг/мл - 32%. при 0,1 мг/мл - 61%, при 0,5 мг/мл - 79%. Изменения УКА эстераз отмечены при уровнях препарата 0,05, 0,1, 0,5 мг/мл и составили для АХЭ - 0, 0, 21 %. БуХЭ - 0. 14, 17%, 1-ИАЭ - 14, 18. 38%. 1ЦФ изменяла свою активность при использовании всех концентрации, эти изменения составили 8, 22,35,41%.

При опенке степени связывания фермента и ингибитора установлено, что наибольшее связывание отмечено в комплексах с оксидазой, Изменение K¡ для ЩФ было несколько меньше, чем для оксидазы, при этом степень связывания фермента и токсиканта для этих ферментов зависела от концентрации перметрнна, Степень связывания в фермент-ннгнбнторных комплексах с эстеразами была не велика, наименьшее связывание отмечено в комплексах перметрнна с БуХЭ.

Расчет интенсивности взаимодействия фермента и ингибитора показал, что наиболее интенсивно токсикант взаимодействовал с окештой (6,2* КГ|0М), затем по степени интенсивности взаимодействия стояла ЩФ, Наименьшей была интенсивность взаимодействия перметрнна с эстеразами.

Наибольшую суммарную ннгнбирующую активность перметрии проявлял также в отношении окендаз (1,7*10"ш М1). При этом можно отметить значительный зровень суммарной ипгнбирующей активности в отношении БуХЭ, однако в отношении оксидазы ннгнбируюшнй эффект проявлялся и достигал максимума знач1гтелыю раньше и был более устойчив. В отношении остальных ферментов суммарная ингнбнрукчная активность перметрнна была невелика н находилась в пределах 0,1-0,7* 10 М1,

При исследовании влияния перметрнна па культуру клеток в условиях эксперимента in vivo использовали следующие концентрации токсиканта: 0,05, 0,1, 0.5, 1 мг/мл. Установлено, что при использовании перметрнна в количестве 0,1, 0,5 и 1 мг/мл ростовая реакция инфузорий снижалась на 16, 31, 58%, при 0,02 мг/мл она не отличалась от таковой в контроле.

Нами установлено, что под влиянием перметрнна происходило снижение активности исследованных ферментов в зависимости от уровня токсиканта, Окс!там снижала свою активность при всех изученных концентрациях па 1873%. ЩФ и 1-НАЭ снижали активность при концентрациях 0,1, 0,5 и I мг/мл,

соответственно, на 17, 38, 51%, н 19, 31, 59%. Снижение активности холню-стераз регистрировалось при уровне нерметрина 0,5 и 1 мг/мл. При этом ЛХЭ снижала свою активность па 38 и 71%, а БуХЭ - на 41 н 85%, соответственно.

Проведенные расчеты степени связи в фермент-ипгибиторпых комплексах показали, что наибольшее связывание отмечено в комплексах ттерметрнпа с ок-сидазой. Реакции взаимодействия оксидазы и нерметрина протекали 1гапболее интенсивно и устойчиво по сравнению с остальными исследованными ферментами, В отношении оксидазы перметрин проявлял наибольшую ннгнбнрующую активность - 14П0"'°Мг.

Меньшая степень связывания отмечена в комплексах со ЩФ. Реакции взаимодействия этого фермента и нерметрина протекали менее интенсивно, чем с оксидами, суммарная ингибирующая активность в отношении фермента была минимальной - 0,1*10"11 М2.

Степень связывания с холинэстеразами в экспериментах была незначительной, однако перметрин достаточно интенсивно взаимодействовал и с ЛХЭ и БуХЭ, При этом течение ферментативных реакций было неустойчиво, хотя суммарная ингибирующая активность в отношении БуХЭ была лишь незначительно меньше таковой для оксидазы - 5*10",й М1. ¡i

, Проведенные исследования показали, что действие нерметрина на ферменты инфузории Т. pyriFonnts имеет определенное сходство с таковым для высших животных. Установлено, что наибольшему ингибированию иод влиянием нерметрина подвергались оксидазы как в органах высших животных, так п в культурах клеток Т. pyriforaiis. Это ингибирование носило дозозависимый характер и было максимальным среди исследованных ферментов.

4.3. Влияние ацетата свинца на изменение ферментативной активности в культуре клеток Т. pyrtformis в экспериментах in vitro и in vivo.

Ацетат свинца вносили в пробы ферментного препарата в виде водных растворов. Содержание токсиканта в пробах составляло 0,25,0,5, 1,2 мг/мл.

В результате проведенных исследований установлено, что ацетат свинца вызывал снижение активности ферментов в ферментном препарате. 1-НЛЭ снижала свою активность в пробах на 25, 52, 66, 72%, соответственно. Снижение активности ЩФ регистрировалось только при концентрациях I и 2 мг/мл и составило 16 и 36%. Снижение УКА холинэстераз наблюдалось лишь при концентрации 2 мг/мл и составило 27% для ЛХЭ и 39% для БуХЭ. УКЛ оксидазы под влиянием ацетата свинца не изменялась.

Расчет констант ингибнрования ферментативных реакции показан, что наибольшее связывание ферментов регистрировалось в комплексах с 1-ПЛЭ. Для остальных ферментов связывание ферментов и токсиканта было незначительным.

Наиболее интенсивно среди исследованных ферментов с ацетатом свинца взаимодействовала также 1-НЛЭ. Значения L для этого фермента изменялись в

IB

пределах I6*I0"W-21*!010 М. Интенсивность взаимодействия остальных ферментов с ацетатом свинца была незначительной.

Ацетат свинца проявлял максимальную суммарную ингнбнрующую активность в отношении 1-НЛЭ, она составляла 30* I0'M М1. В отношении остальных ферментов суммарная ннгибирующая активность была незначительна.

Прн проведении экспериментов гп vivo ацетат свинца использовали в тех же концентрациях - 0,25, 0,5, I и 2 мг/мл. Установлено, что при внесении токсиканта в питательную среду с культурой клеток через сутки ростовая реакция инфузорий снижалась прн использовании концентраций 1 и 2 мг/мл. Активность исследованных ферментов снижалась при всех уровнях ацетата свинца. Наибольшее снижение активности отмечено для 1-НАЭ п ЩФ, оно составило 21,60,68, 79 % п 16, 42, 48, 57 %, соответственно. Снижение активности холи-нэстераз отмечалось также прн всех концентрациях токсиканта, однако при 0,25 и 0,5 мг/мл оно было недостоверно и не превышало 8 %. Изменение активности оксидазы не зависело от уровня токсиканта и составило 14, 27, 8, 41 % , соответственно, при концентрации аиетата свинца 0,25,0,5, I и 2 мг/мл.

Проведенные расчеты показали, что прн повышении содержания ацетагга свинца в культуре инфузорий возрастала степень связывания ЩФ и токсиканта. Степень связывания остальных ферментов не зависела от концентрации токсиканта. Однако наибольшее связывание отмечено в комплексах свинца с 1 -Н АЭ.

Наиболее интенсивно с ацетатом свинца взаимодействовали 1-НАЭ и ЩФ, в их отношении этот токсикант проявлял наибольшую суммарную ингнбнрующую активность (51*10"н н 35*10"14 М1, соответственно). Интенсивность взаимодействия, а также суммарная ннгибирующая активность ацетата свинца, проявляемая в отношении других ферментов, были значительно ниже и не зависели от его концентрации.

Таким образом, в результате проведенных экспериментов установлено, что наиболее показательным прн исследовании свинцовых токсикозов было изменение активности 1-НАЭ. При постановке экспериментов in vivo следует учитывать также изменение УКА ЩФ. В отношении этих ферментов токсикант проявлял максимальный ингпбирующнй эффект

Сравнивая полученные результаты с таковыми, полученными в опытах на высших животных, можно отметить наличие определенного сходства изменения ферментативных реакций. Так, наибольшее снижение активности, максимальное изменение кинетических показателей регистрировалось для 1-НАЭ и ЩФ. При этом влияние ацетата свинца на названные ферменты было менее выраженным, чем влияние других токсикантов - ДЦВФ и перметрина.

4.4. Влияние нитрата кадмия на изменение ферментативной активности в культуре клеток Т. pvrifonnis в экспериментах in vitro и in vivo.

При постановке экспериментов in vitro кадмия нитрат вносили в пробы ферментного препарат в количествах 0,0025,0,0005,0,001,0,005 мг/мл.

Проведенные эксперименты показали, что под влиянием нитрата кадмия отмечалось снижение активности ЩФ при использовании концентрации 0,0005,0,001,0,005 мг/мл Изменения остальных ферментов при обработке этим токсикантом не установлено. Изменение ферментативной активности cohjxjbo-ждалось возрастанием связывания в фермеит-эффекторных комплексах и увеличением интенсивности взаимодействия фермента и токсиканта. Суммарная ингибнрующая активность кадмия нитрата в отношении ЩФ была невелика и составила 0,21*10"|ПМ\

В экспериментах iti vivo использовали концентрации нитрата кадмия 0,0005,0,001, 0,0015,0,0025 мг/мл. Нами установлено, что через сутки отмечалось снижение роста культуры при его уровнях 0,001, 0,0015, 0,0025 мг/мл. При содержании токсиканта 0,0005 мг/мл изменения ростовой реакции не регистрировалось.

Исследование ферментативной активности показало, что под влиянием кадмия нитрата отмечалось дозозавнсимое возрастание УКА ЩФ на 20-¡50%, УКА 1-НАЭ снижалась на 14 - 57%, БуХЭ - до 35%. Изменение УКА АХЭ регистрировалось только при максимальной концентрации токсиканта, а окспдаза в изученном диапазоне концентраций не изменяла свою активность.

Наиболее интенсивно нитрат кадмия взаимодействовал со 1ЦФ, несколько ниже была интенсивность его взаимодействия с 1-НАЭ и БуХЭ. Наибольшую активирующую активность нитрат кадмия проявлял в отношении ЩФ.

Сравнивая полученные данные с аналогичными, полученными па высших животных, можно отметить наличие сходства в течении ферментативных процессов под влиянием нитрата кадмия.

5. Сравнение эффективности исследованиях фегмеитов для

использования в целях диагностики.

Проведенные исследования дают возможность, опираясь на расчетные данные, оценить информативность исследованной группы ферментов по отношению к экотоксикантам.

Использованная для обработки данных система параметрического анализа позволила рассчитать и обосновать выбор наиболее оптимальных ферментативных критериев для оценки токсического действия ксенобиотиков. Данная методика дала возможность сравнить механизм действия отдельных токсикантов на разные ферменты. При этом необходимо вычленить наиболее информативные показатели, позволяющие сделать вывод о эффективности того или иного теста. Такими являются уровень изменения активности фермента под влиянием токсикантов, выражаемый через % ингибирования (активации) фермента, показатель интенсивности взаимодействия фермента и токсика!гга, рассчитанный с помощью эмпирически установленных коистанты Михаэлиса и максимальной скорости ферментативной реакции, графическое представление зависимости

интенсивности течения ферментативного процесса от количества токсиката, а также суммарная иигибиругащая активность токсиканта, определенная в результате такого построения. Эти показатели являются обязательным минимумом при определении эффективности ферментного теста.

Нами установлено, что наибольшее снижение УКА и наиболее высокая интенсивность взаимодействия с исследованными ферментами отмечена для ДДВФ. Суммарно проявляемая активность этого соединения к ферментам исследованной группы была максимальной при минимальных дозах препарата. Среди ферментов наибольшей информативностью при токсикозах, вызываемых фосфорорганнческимн соединениями, в экспернмшгтах in vitro и in vivo обладали неспецнфпческне эстеразы -1 -НАЭ н БуХЭ - как на высших животных, так и на культуре клеток Т. pyrifonnis. Проведенные нами исследования позволили математически подтвердить правильность выбора этих ферментов в качестве диагностических тестов отравления фосфорорганическими ядами (Таланов В.В., Карнаухов В.В., 1989; Карнаухов В.В., Лавина С.А., 1993),

Пер метрик также достаточно шггенсивпо взаимодействовал с изученной группой ферментов. При этом максимальная интенсивность его взаимодействия отмечена для оксидазы и ЩФ во всех проведенных экспериментах. Значения максимальной пнгнбирующен активности токсиканта по отношению к этим ферментам были наибольшим» при использованных дозах и концентрациях перметрина. Таким образом, в качестве диагностического теста при отравлении перметрином можно предложить изменение УКА оксидазы и ЩФ, поскольку глубина ингибирования ферментов, интенсивность взаимодействия их с перметрином и ингнбируюшая активность перметрина в их отношении были наибольшими при минимальных концентрациях токсиканта во всех проведенных сериях экспериментов

Степень влияния солей тяжелых металлов на исследованную группу ферментов была значительно ниже. Интенсивность взаимодействия ферментов с ними была минимальной в проведенных сериях исследований. При этом следует отметить некоторые особенности воздействия тяжелых металлов на ферменты. В экспериментах in vitro наиболее уязвима в отношении исследованных токсикантов была ЩФ, по отношению к ней металлы проявляли максимальную эффективность действия (сравнительно высокий процент ингибирования активности, наибольшее значение интенсивности взаимодействия, высокое значение суммарной ннгибирующей активности Q). В экспериментах in vivo на высших животных УКА ЩФ, так же, как и 1 -НАЭ, снижалась во всех исследованных органах, кроме селезенки, где активность ферментов достоверно возрастала в зависимости от длительности экспериментов. Влияние на эти ферменты можно использовать как дополнительный диагностический критерий отравления животных соединениями тяжелых металлов, В то же время УКА 1-НАЭ и ЩФ значительно снижалась при воздействии солен свинца н кадмия на культуру клеток Т. pyrifonnis. При этом изменение УКА других исследованных ферментов было незначительным.

Срзвнивая ингибиругощуто активность солен тяжелых металлов н пестн-ннлов, можно отметить, что пестициды проявляли большую эффективность токсического действия, нежели тяжелые металлы. При этом не стоит исключать специфичность увеличения УКА 1-НАЭ н ЩФ селезенки у высших животных при свинцовой и кадмиевой интоксикациях. Данный тест может бы гь учтен при диагностике токсикозов, вызываемых соединениями этих металлов.

Учитывая результаты взаимодействия ферментов и токсикантов в разных биологических объектах (высших животных и инфузориях), следует отметить высокую степень корреляции полученных результатов на этих группах жнвых организмов. Так же, как и для высших животных, при воздействии фосфорорга-ннческого соединения наиболее выражено снижение активности 1-НАЭ, пирет-роиды вызывали снижение активности оксидаз, ацетат свинца вызывал угнетение ферментативной активности фосфатаз в экспериментах in vivo и in viiro, а кадмий вызывал снижение активности фосфатазы в экспериментах in vitro, но возрастание в экспериментах in vivo. Это позволяет экстраполировать результаты анализов на инфузориях на высших животных, что крайне важно как с научной, так и с практической точек зрения. При этом важным является то, что в отличие от ростовой реакции тетрахимен, являющейся основным критерием токсичности при биотестировании, ферментативный тест гораздо более чувствителен, поскольку реагирует на концентрации токсикантов, не оказывающих ингибиругощего действия на рост инфузорий. Кроме того, он дает возможность ориентировочного определения принадлежности токсиканта к той или иной группе соединений, что позволяет проводить не только индикацию, но и дифференциацию токсических веществ в исследуемых объектах ветерниарно-саннтзрного и экологического контроля.

Разработанные нами методические подходы по использованию ферментативного теста на инфузориях для оценки токсичности продуктов, кормов и различных объектов окружающей среды заключаются в подборе оптимальных параметров получения биомассы тетрахимен, ее отделении от остатков питательной среды, концентрировании, разрушении клеток, отработке условий хранения ферментного препарата, постановке биотестового анализа, учете его результатов и обработке экспериментальных данных.

ВЫВОДЫ.

1. Разработаны методики определения удельной каталитической активности фосфатаз н оксидаз в биологических материалах методом тонкослойной хроматографии, которые обеспечивают определение удельной каталитической активности кислой и щелочной фосфатаз и оксидазы в органах и тканях животных при минимальной детектируемой чувствительности для фосфатаз 2 мккат/кг и для оксидаз 0,95 мккат/кг, что значительно превышает чувствительность существующих в настоящее время методов и снимает ограничения в выборе объектов исследования.

2. Определен фоновый уровень удельной каталитической активности ферментов в органах лабораторных животных (мышей и крыс), который зависел от типа фермента, его топографии и вида животного. Максимальной удельной каталитической активностью обладала 1 -нафтнлацетатэстераза, наивысший уровень которой регистрировался в печени и ночках. Удельная каталитическая активность щелочной фосфатазы и оксндазы не имела значительных колебаний в исследованных органах. Максимум активности бугирилхолшостеразы приходился на печень, ацетнлхолинэстеразы - на ткань головного мозга. Уровень удельной каталитической активности ферментов в органах крыс несколько превышал таковой в органах мышей.

3. Установлено, что изменение удельной каталитической активности ферментов и кинетики ферментативных реакций под влиянием исследованных токсикантов зависит от типа токсикаггта, его дозы н длительности взаимодействия с ферментами, типа изучаемых энзимов и их топографии.

4. При отравлении ДДВФ тест ингнбицнн 1 -нафтнлацетатэстеразы является наиболее специфичным, поскольку для этого фермера отмечено максимальное и наиболее раннее снижение удельной каталитической активности, устойчивое изменение типа ферментативной реакции, наибольшая интенсивность взаимодействия с ДДВФ и высокая ннгнбирующая активность ДДВФ.

5. Наиболее эффективным тестом при отравлении животных пермет-рииом является снижение удельной каталитической активности оксидазы. Этот фермент достоверно снижал свою активность под влиянием перметрнна как в экспериментах i» vitro, так и in vivo. Интенсивность его взаимодействия с пер-метрином и ингибирующая активность перметрина, проявляемая по отношению к оксидазе, были наибольшими. Тест на снижение удельной каталитической активности оксидазы может быть использован в качестве диагностического критерия при отравлении перметрнпом.

6. При отравлении ацетатом свинца происходит снижение активности всех исследованных ферментов, кроме 1-иафтилацетатэстеразы и щелочной фосфатазы селезенки, удельная каталтпческая активность которых возрастала в острых и хронических экспериментах in vivo.

7. При отравлении нитратом кадмия происходит снижение удельной каталитической активности щелочной фосфатазы в экспериментах in vitro и снижение в различной степени удельной каталитической активности всех исследованных ферментов, кроме 1-нафтнлацетатэстеразы и щелочной фосфатазы селезенки, в экспериментах in vivo.

8. Показано, что тест на возрастание удельной каталитической активности 1 -нафтнлацетатэстеразы н щелочной фосфатазы селезенки является системным тестом при отравлении животных солями кадмия и свинца.

9. Отработаны методические подходы по определению удельной каталитической активности ферментов инфузорий Т. pyriformis и установлен их фоновый уровень. Максимальной была активность щелочной фосфатазы, минимальной - ацетилхолннэстеразы.

10. Установлено, что изменение ферментативной активности в культуре клеток Т. рупГопшБ и ферментных препаратах из нее под влиянием токсикантов сходно с таковым у высших животных. Это свидетельствует о возможности межвидовой экстраполяции результатов бнотестового анализа, что является важным как с научной, так и практической точек зрения.

11. Определены наиболее значимые ферменты простейших, изменение активности которых можно использовать в качестве критерия токсичности различных объектов ветеринарно-санитарного и экологического контроля. При воздействии ДДВФ показательным является изменение удельной каталитической активности 1-нафтилацетзтэстеразы, под влиянием перметрнна - оксидазы, нитрат кадмия н ацетат свинца наиболее выражено влияют па щелочную фос-фатазу и 1-нафтилацетатэстеразу.

12. Для подбора оптимальных биохимических критериев токсического действия ксенобиотиков и оценки результатов токсикологического эксперимента рационально использовать метод параметрического анализа ферментативных реакций позволяющий выделить наиболее чувствительные ферментные тесты по следующим параметрам: интенсивность взаимодействия токсиканта и фермента, графическое построение зависимости интенсивности взаимодействия от концентрации токсиканта и вычисляемая на основании этих построений суммарная ингибируюшая активность, проявляемая токсикантом в отношен ни фермента (группы ферментов). Такие показатели, как константа ингнбировання, устойчивость течения ферментативного процесса, графические трехмерные и двухмерные представления ферментативных реакций наиболее показательны для оценки механизмов взаимодействия токсикантов и ферментов,

13. Разработанные нами биотесты на основе ферментных систем высших животных и простейших, методические подходы к изучению механизма токсического действия ксенобиотиков и критерии его оценки могут быть использованы при диагностике токсикозов животных и контроле за безопасностью различных объектов ветеринарно-санитарного и экологического надзора.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

В практике работы научно-исследовательских учреждений и производственных лабораторий могут быть использованы следующие разработанные нами методики, методические рекомендации и указания:

"Методика определения остатков карбофоса я ДДВФ при их одновременном присутствии в органах кур" (М., 1993);

"Методика определения удельной каталитической активности фосфатаз в биологических субстратах" (утверждена Отделением ветеринарной медицины РАСХН, 1997 г.);

"Методика определенна удельной каталитической активности оксидазы в биологических субстратах" (утверждена Отделением ветеринарной медицины РАСХН, 1997 г).

"Метод! пес кие указания но диагностике отравлений кур, вызываемых фосфороргаинческими соединениями1' (М,, 1994 г.);

"Методические рекомендации но использованию биологических тестов для индикации токсичных элементов в объектах ветеринарного надзора" (утверждены Отделением ветеринарной медицины РАСХН, 1997 г);,

"Методические рекомендации по определению ферментативной активности в культуре клеток Tetraliytnena руНГогниэ при биотестировании" (утверждены Отделением ветеринарной медицины РАСХН 10.03.2002);

"Методические рекомендации по определению удельной каталитической активности холинэстераз в биоматериале при проведении токсикологических исследований" (утверждены Отделением ветеринарной медицины РАСХН 10.03,2002);

"Методические указания по использованию инфузорий Tetraliymena pyrifomiis в качестве тест-культуры в приборе ""Биотестер-2" (утверждены Департаментом ветеринарии МСХ РФ 16.10.2000, № 13-7-2/2157);

"Методические указания по ускоренному определению токсичности продуктов животноводства и кормов" (утверждены Департаментом ветеринарии МСХ РФ 16.10.2000, № 13-7-2/2156);

"Методические указания по определению остатков перметрина в биома-тернале с использованием твердофазной экстракции" (представлены на утверждение в Департамент ветеринарии МСХ РФ);

"Наставление по применению эктоцнда в борьбе с эктопаразитами птиц в помещениях" (утверждено Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода Российской федерации 23.04.94, № 19-4-2/51, per. № 10.07.122-94 ОВФП).

СПИСОК

о ¡7 у бл и копа пгшх ра бог по теме д11ссепа цп п.

1. Карнаухов В.В., Лавина С.А., Холодов 11.Я. Влияние аэрозолей эк-тоцида на активность эстераз органов и тканей кур, - В кн.: Материалы Всероссийской науч. конф. "Экологические проблемы животноводства и совершенствование подготовки ветеринарных врачей". Троицк, - Челябинск, 1992, с, 36.

2. Лавина С.А. Влияние хронической фториднон интоксикации на активность эстераз органов и тканей кур. - В кн.: Экологические проблемы ветеринарной санитарии, Тез, докл. науч.-пракг.конф. - М., 1993, с. 71-72.

3. Карнаухов В.В., Лавина С.А. Влияние реактиваторов эстераз на активность 1-нафтнлацетатэстераз, угнетенных фосфороргаинческими и кзрба-

матными пестицидами, - В кн.: Гигиена, ветсанитария и экология животноводства. Материалы Всероссийской научно-практической конференции. Чебоксары, 1994,с.36.

4. Лавина СА-, Кроль М.Ю, Влияние токсичных элементов на активность эстераз в условиях экспериментальной интоксикации лабораторных животных, - В кн.: Проблемы ветеринарной санитарии и экологии- Сб. науч. тр. ВНИИВСГЭ. М.., 1996, ТЛ02, с. 53-61.

5. Лавина С,А. Влияние хронической ртутной интоксикации на активность гидролитических фермекгов органов крыс. - Проблемы ветеринарной санитарии и экологии. Сб. науч. тр. ВНИНВСГЭ. М., 1998, т. 104, с. 36-40.

6. Лавина С.А. Фоновые уровни активности ферментов в органах лабораторных животных. - В кн.: Проблемы ветеринарной санитарии и экологии. Сб. науч. тр. ВНИНВСГЭ. М„ 1998, т. 104, с. 40-43,

1. Лавина С.А., Карпова Е.А. Влияние свшндовой шггоксиканни на ферментные системы органов крыс. - Тез. докл. 2-ой Международно!] научно-практической конф. "Актуальные проблемы ветеринарной медицины и вете-рннарно-санитарного контроля сельскохозяйственной продукции" пол девизом "Здоровое животное - безопасная пища - здоровый человек". М., 1997, с. 128.

8. Лавина С.А, Влияние а пета та свинца и нитрата кадмия на кинетику ферментативных реакций in vitro. - В кн.; Проблемы ветеринарной санитарии и ■мтолотии. Сб. тауч. тр. ВНИИВСГЭ. - М., 199S, т. 105, с. 119-124.

9. Лавина С.А- Влияние отдельных пестицидов на кинетику ферментативных реакций in vitro. В кн.: Проблемы ветеринарной санитарии и экологии. Сб. науч. тр. ВНИИВСГЭ. M., 199$, т. 105, с. 79-86.

10. Лавина С.А. Влияние перметрнна на кинетику ферментативных реакций in vivo. - В кн.: Проблемы ветеринарной санитарии и экологии. Сб. науч. тр. ВНИИВСГЭ. М., 1998, т. 105, с. 86-93.

11. Лавина С.А, Сравнительный анализ кинетики ферментативных реакций in vitro под влиянием некоторых пестицидов. - В кн.: Проблемы ветеринарной санитарии и экологии. Сб. науч. тр. ВНИИВСГЭ. - М,, 1998, т. 105, с, 93-101.

12. Лавина С.А. Влияние различных токсикантов на ферменты in vivo. -В кн.: Проблемы ветеринарной санитарии и экологии. Сб. науч. тр. ВНИИВСГЭ.-М., 1998, т.105,с, 101-103.

13. Лавина С.А, Влияние ДДВФ на кинетику ферментативных реакций in vivo.- В кн.: Проблемы ветеринарной санитарии и экологии. Сб. науч. тр. ВНИИВСГЭ. - М., 1998, т,105, с. 103-115.

14. Лавина С.А. Влияние реактваторов эстераз на активность i-нафтилаиетатэстеразы, угнетенной солями кадмия и свинца в эксперименте in vitro. - В кн.: Проблемы ветеринарной санитарии и экологии. Сб, науч. тр. ВНИИВСГЭ. - М„ 1998, т. 105, с.115-119.

15. Лавнна C.A, Влияние ацетата свинца и нитрата кадмия на кинетику ферментативных реакции in vitro, - В кн.: Проблемы ветеринарной санитарии и экологии. Сб. науч. тр. ВНИИВСГЭ. - М., 1998, т. 105, с. 119-124.

16. Лавнна С.А, Анализ токсического действия ДДВФ на эстеразы в экспериментах ¡n vitro. - В кн.: Проблемы ветеринарной санитарии и экологии. Сб. науч. тр. ВНИИВСГЭ. - М., 1998, т. 105, с.124-129.

17. Таланов Г.А., Лавнна С,А, Анализ токсического действия пермет-рина в модельных острых опытах на белых мышах. - В кн.: Тез« докл. науч. конф. "Актуальные проблемы ветеринарной медицины и экологии". НИВС. Калининград, 1998, с. 55,

18. Лавнна С.А., Карпова Е.А. Анализ токсичности ксенобиотиков в условиях экспериментов in vitro, - В кн.: Тез, докл. науч. конф. "Актуальные проблемы ветеринарной медицины и экологии", НИВС, Калининград,. 1998, с. 57.

19. Таланов Г.А., Лавина С,А. Сравнение эффективности различных ферментов для использования в целях диагностики. - В кн.: Тез. докл. конф. "Интенсификация производства продукции в республике Беларусь.", Бел НИ-ИЖ. — Жоднно, 1998, с. 39,

20. Лавина С.А. Воздействие солей свинца и кадмия на ферментативную активность органов лабораторных животных, - Материалы Второй Российской школы "Геохимическая экология и биогеохнмическое районирование биосферы" (посвящается 70-летию организации В,И, Вернадским Биогеохимической лаборатории и 100-летню со дня рождения В.В. Ковальского). - М., 1999, с. 155,

21. Лавнна С,А., Карпова Е.А. Влияние нитрата кадмия на ферментативную активность органов белых крыс в условиях хронической интоксикации. -Тр. ВИЭВ, 1999,с. 43.

22. Таланов Г,Л., Карнаухов В,В., Лавина С.А. Хроматографические методы для анализа ферментативной активности, - В кн.: Проблемы ветеринарной сашгтарни н экологии. Сб. науч. тр. ВНИИВСГЭ. - М,, 1998, т. 106, с. 1924.

23. Лавина С,А. Сравнительный анализ влияния перметринз на ферменты в условиях экспериментов in vivo, - Сб. науч. трудов, посвященпый 80-летию МГАВМнБ. М., 1999, т. 2, с. 143.

24. Лавнна С,А. Оценка значимости критериев токсичности, - Материалы науч.-методич. конф. на тему "Концепция научного обеспечения ветеринарной медицины Северо-Восточного региона Нечерноземья." - Н.-Новгород, 1999, с. 48.

25. Лавина С.А, Современные методы анализа синтетических пирет-роидов с использованием новых способов извлечения их из проб биоматериала, - Тезисы докладов Межд. науч. конф. «Проблемы ветеринарной санитарии, гигиены и экологии». ВНИИВСГЭ. М., 1999, с. 136-137.

26. Долгов В.А., Лавина С.А., Фролова И.А. Проблема повышения информативности биотестового анализа. - Тезисы докладов Межд. науч. конф. «Проблемы ветеринарной санитарии, гигиены и экологии». ВНИИВСГЭ. М., 1999, с. 173-174.

27. Лавина С.А,, Долгов В.А. Методологические проблемы оценки безопасности объектов ветеринарно-саиитарного и экологического контроля с помощью биотестирования. - Тез. докл. Международной конференции "Теоретические и практические аспекты возникновения и развития болезней животных и защита их здоровья в современных условиях", Воронеж, 2000 г. с.

28, Долгов В,А., Лавнна С.А. Методологические аспекты повышения информативности биотестового анализа,. - Матер. Всеросс, н.-произв. конф, «Гигиена содержания и кормления животных - основа сохранения нх здоровья я получения экологически чистой продукции». Орел, 2000, с. 44,

29. Лавина С.А. Использование биохимических показателей инфузорий тетрахимен при биотестированин объектов окружающей среды. - Матер. Все росс. н.-произв. конф, «Гигиена содержания и кормления животных - основа сохранения нх здоровья и получения экологически чистой продукции». Орел, 2000, с.90-92.

30. Лавина С.А. Методические приемы повышения информативности биотестового анализа. - Тез. докл. Междунар. конф. "Биотехнология па рубеже двух тысячелетий" Саранск, 2001, с. 59-60.

31, Лавина СА, Влияние токсикантов на активность I-нафтилацетатэстеразы различных биологических объектов. - Ветеринария, 2002, № 8, с 35.

92.

ГУ ВНИИВСГЭ, 1 городское ш,, д. 5.

■■ i »12 5 83 ^

Актуальность темы. В настоящее время происходит достаточно сильное техногенное загрязнение окружающей среды. Различные загрязнители прямо или косвенно оказывают воздействие на организм животных и человека, часто вызывая развитие токсикозов, механизм возникновения которых нередко остается неясным. Кроме того, в процессе научно-технического прогресса разрабатывается большое количество веществ, предназначенных для решения важных практических задач, например, дезинфекции, дезинсекции и т.п. Попадая в организм животных и человека, эти вещества также могут вызывать развитие определенных патологий, поэтому изучение механизма их действия на стадии разработки позволит оценить и прогнозировать возможные последствия их использования, а также выделить наиболее приемлемые диагностические критерии.

Механизм токсического действия большинства ксенобиотиков основан на влиянии на различные ферменты и ферментные группы (Каган Ю.С. и сотр., 1981; Паныпина Т., Сасинович Л.М., 1983; Goering P.L., Klaassen C.D., 1983; Shen Y., Sangiah S., 1995). Поэтому изучение действия токсикантов на эти органические соединения может дать достаточно обширный и ценный материал.

При работе с различными токсикантами исследователи часто сталкиваются с такими явлениями, как ингибирование и активация ферментативной активности, которые часто остаются только констатированными без анализа причин их возникновения и характера проявления. При изучении изменений активности ферментов под влиянием различных токсикантов большую помощь может оказать использование методов ферментативной кинетики. Однако использование традиционных подходов в этой области знаний часто приводит к путанице понятий и определений, поскольку до недавнего времени не было достаточно четкой дифференциации в разновидностях этих явлений (Келети Т., 1990; Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф., 1982; Мусил Я., Новакова О., Кунц К. 1984). В настоящее время достаточно интересным подходом является разработанный Крупянко В.И. (1986) метод параметрической классификации типов ферментативных реакций, который может представлять определенную ценность при анализе ток-сикодинамики различных ксенобиотиков. Однако использование названной методики не отработано для применения в токсикологической практике, особенно для прогнозирования и предварительной оценки влияния ксенобиотиков на организм животных.

Следует также учесть тот факт, что методы определения ферментативной активности предназначены преимущественно для биологических жидкостей (Меньшиков В.В., 1987; Налетов ЕЛ., Егорова Т.А. 1980; Rewyler A. et al., 1989; Whittacker М., 1986). Исследование активности ферментов в отдельных органах и количественное представление данных имеет определенные трудности, связанные с методологией их анализа, т.к. конечный экстракт, в большинстве случаев, должен быть бесцветным и прозрачным для устранения артефактов, поэтому отсутствуют достаточно простые, экспрессные и селективные методики, позволяющие вести определение в любых биоматериалах. В качестве метода, позволяющего преодолеть эти недостатки, может быть использована хроматография. Однако она не нашла широкого применения в лабораторной клинической практике при определении ферментативной активности.

Следует также отметить, что к недостаткам традиционно используемых методов ферментативного анализа можно отнести отсутствие использования системы единиц измерения ферментативной активности. В большинстве случаев используемые единицы измерения зависят от метода анализа, что затрудняет сравнение и сопоставление результатов разных авторов.

В настоящее время все большее распространение получают методы биотестирования. Биотестирование объектов ветеринарно-санитарного и экологического контроля дает возможность оценивать степень их безопасности. Тест-организмы отличаются достаточно высокой чувствительностью к широкому спектру ксенобиотиков естественного и антропогенного происхождения. Оценка сопоставимости результатов, полученных с использованием биотестов на основе простейших, с результатами, полученными на высших животных, позволит существенно расширить сферу практического применения биотестовых методов, повысить их информативность и производительность, тем самым резко сократив использование в экспериментах высших животных, что важно как с экономической, так и с этической точек зрения (Долгов В.А., 1992).

Названные методологические вопросы требуют своего разрешения и проведения дальнейших исследований.

Цель и задачи исследований. Целью данной работы явилась разработка биотестов на основе ферментных систем для оценки токсического действия ксенобиотиков на объекты ветеринарно-санитарного и экологического контроля.

В задачи исследований входило:

1. Совершенствование и разработка методов определения ферментативной активности в различных биологических объектах (органы и ткани лабораторных животных, сыворотка крови лошади, культура инфузорий).

2. Установление фонового уровня ферментативной активности аце-тилхолинэстеразы (АХЭ), бутирилхолинэстеразы (БуХЭ), 1-нафтилацетатэстеразы (1-НАЭ), щелочной фосфатазы (ЩФ) и оксидазы в различных биологических объектах.

3. Проведение сравнительного анализа влияния модельных токсикантов - ДДВФ, перметрина, свинца ацетата, кадмия нитрата - на ферментные системы различных тест-объектов.

4. Проведение сравнительного анализа кинетики ферментативных реакций в органах теплокровных животных для подбора оптимальных ферментных тестов диагностики токсикозов животных

5. Определение диагностической ценности исследованных ферментов в качестве критериев токсического действия экотоксикантов.

6. Изучение влияния модельных токсикантов на ферментные системы инфузорий Tetrahymena pyriformis.

7. Разработка методических подходов к использованию биотестов на основе ферментных систем инфузорий для оценки токсичности объектов ветеринарно-санитарного и экологического контроля.

Научная новизна результатов исследований состоит в следующем:

Разработаны методики прямого определения удельной каталитической активности (УКА) ферментов в биологических субстратах, которые обеспечивают индикацию удельной каталитической ферментов в органах и тканях животных при минимальной детектируемой чувствительности для фосфатаз 2 мккат/кг и для оксидаз 0,95 мккат/кг, что значительно превышает чувствительность существующих в настоящее время методов и снимает ограничения в выборе объектов исследования.

Установлен фоновый уровень удельной каталитической активности (УКА) ферментов - ацетилхолинэстеразы (АХЭ), бутирилхолинэстеразы (БуХЭ), 1-нафтилацетатэстеразы (1-НАЭ), щелочной фосфатазы (ЩФ) и оксидазы - в органах и тканях лабораторных животных. Проведено сравнение уровня активности различных ферментов в органах животных. Установлено, что в органах и тканях животных наибольшей УКА обладает 1-НАЭ, максимальный уровень ее активности регистрировался в печени и почках. Фоновый уровень УКА остальных ферментов был значительно ниже, при этом максимальная УКА АХЭ регистрировалась в ткани головного мозга, БуХЭ - в печени, ЩФ - в ткани головного мозга и почках, оксидазы - в почках. Наименьшей ферментативной активностью обладала мышечная ткань, В культуре клеток инфузорий Т. pyriformis наибольшей УКА обладали ЩФ и 1-НАЭ.

Изучено влияние различных токсикантов (ДДВФ, перметрин, свинца ацетат, кадмия нитрат) на изменение ферментативной активности в органах лабораторных животных. Установлено, что эти изменения зависят от типа токсического соединения, его дозы, топографии и типа фермента.

Изучено изменение кинетики ферментативных реакций под влиянием названных токсикантов. Установлено, что разные токсиканты не одинаково влияют на изменение кинетических показателей ферментативных реакций. Эти изменения зависят от типа токсикантов и фермента, топографии фермента.

Определена диагностическая ценность исследованных ферментов для диагностики токсикозов, вызываемых исследованными ксенобиотиками. Установлено, что при диагностике токсикозов, вызываемых фосфорорганическими соединениями, наиболее показательно изменение УКА 1-НАЭ, перметрин вызывал наибольшее снижение УКА ЩФ и оксидазы, соли тяжелых металлов вызывали снижение УКА ЩФ во всех органах, кроме селезенки, где УКА этих ферментов дозозависимо возрастала.

Разработаны методические подходы к изучению активности ферментов в культуре клеток Т. pyriformis. Отработаны условия подготовки культуры для исследования, получения ферментного препарата из культуры, подобраны условия определения УКА таких ферментов, как АХЭ, БуХЭ, 1-НАЭ, ЩФ, оксид аза.

Изучено влияние токсикантов на изменение ферментативной активности в культуре клеток Т. pyriformis. Показано сходство в изменении УКА и кинетики ферментативных реакций у инфузорий и высших животных. Установлено, что под влиянием изученных токсикантов происходило изменение ферментативной активности в культуре клеток. При этом под влиянием ДДВФ наиболее выраженным было снижение УКА 1-НАЭ, перметрин вызывал наибольшее снижение УКА оксидазы, соли тяжелых металлов вызывали снижение УКА ЩФ.

Разработаны методические подходы к использованию биотестов на основе ферментных систем инфузорий для оценки токсичности объектов ветеринар-но-санитарного и экологического контроля.

Практическая ценность и реализация результатов. На основании результатов исследований разработаны:

Методика определения удельной каталитической активности фосфатаз в биологических субстратах" (утверждена Отделением ветеринарной медицины РАСХН, 1997 г.);

Методика определения удельной каталитической активности оксидазы в биологических субстратах" (утверждена Отделением ветеринарной медицины РАСХН, 1997 г).

Материалы диссертационной работы вошли в следующие методические рекомендации и указания:

Методические рекомендации по диагностике токсикозов кур, вызываемых фосфорорганическими соединениям" (утверждены Отделением ветеринарной медицины РАСХН, 1994 г.);

Методические рекомендации по использованию биологических тестов для индикации токсичных элементов в объектах ветеринарного надзора" (утверждены Отделением ветеринарной медицины РАСХН, 1997 г);

Методические рекомендации по определению ферментативной активности в культуре клеток Tetrahymena pyriformis при биотестировании" (утверждены Отделением ветеринарной медицины РАСХН 10.03.2002).

Методические рекомендации по определению удельной каталитической активности холинэстераз в биоматериале при проведении токсикологических исследований" (утверждены Отделением ветеринарной медицины РАСХН 10.03.2002);

Методические указания по использованию инфузорий Tetrahymena pyriformis в качестве тест-культуры в приборе "'Ъиотестер-2" (утверждены Департаментом ветеринарии МСХ РФ, 16.10.2000, № 13-7-2/2157);

Методические указания по ускоренному определению токсичности продуктов животноводства и кормов" (утверждены Департаментом ветеринарии МСХ РФ, 16.10.2000, № 13-7-2/2156);

Методические указания по определению остатков перметрина в биоматериале с использованием твердофазной экстракции" (представлены на утверждение в Департамент ветеринарии МСХ РФ).

Материалы диссертационной работы использованы при составлении "Наставления по применению эктоцида в борьбе с эктопаразитами птиц в помещениях", утвержденного 23.04.94 Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода Российской федерации, № 19-4-2/51, per. № 10.07.122-94 ОВФП.

Основные положения, выносимые на защиту.

• методы определения удельной каталитической активности ферментов в различных биологических субстратах;

• результаты изучения фонового уровня активности ферментов - аце-тилхолинэстеразы, бутирилхолинэстеразы, 1-нафтилацетатэстеразы, щелочной фосфатазы и оксидазы - в органах лабораторных животных и культуре Tetrahymena pyriformis;

• результаты изучения влияния различных токсикантов (ДДВФ, пер-метрина, нитрата кадмия и ацетата свинца) на изменение ферментативной активности биотестов различного трофического уровня;

• результаты анализа изменения кинетических показателей в изучаемых биотестах под влиянием названных токсикантов;

• результаты анализа механизмов токсического действия ксенобиотиков с учетом изменения кинетики ферментативных реакций для оценки возможных диагностических тестов при токсикозах, вызываемых исследуемыми ксенобиотиками;

• результаты сравнительной оценки диагностической ценности исследуемых ферментов при изучении токсикозов, вызываемых токсикантами различных групп, на биотесты разных трофических уровней;

• методические подходы к использованию биотестов на основе ферментных систем инфузорий для оценки токсичности объектов ветеринарно-санитарного и экологического контроля.

ЧАСТЬ I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

ВЫВОДЫ.

1. Разработаны методики определения удельной каталитической активности фосфатаз и оксидаз в биологических материалах методом тонкослойной хроматографии, которые обеспечивают определение удельной каталитической активности кислой и щелочной фосфатаз и оксидазы в органах и тканях животных при минимальной детектируемой чувствительности для фосфатаз 2 мккат/кг и для оксидаз 0,95 мккат/кг, что значительно превышает чувствительность существующих в настоящее время методов и снимает ограничения в выборе объектов исследования.

2. Определен фоновый уровень удельной каталитической активности ферментов в органах лабораторных животных (мышей и крыс), который зависел от типа фермента, его топографии и вида животного. Максимальной удельной каталитической активностью обладала 1-нафтилацетатэстераза, наивысший уровень которой регистрировался в печени и почках. Удельная каталитическая активность щелочной фосфатазы и оксидазы не имела значительных колебаний в исследованных органах. Максимум активности бутирилхолинэстеразы приходился на печень, ацетилхолинэстеразы - на ткань головного мозга. Уровень удельной каталитической активности ферментов в органах крыс несколько превышал таковой в органах мышей.

3. Установлено, что изменение удельной каталитической активности ферментов и кинетики ферментативных реакций под влиянием исследованных токсикантов зависит от типа токсиканта, его дозы и длительности взаимодействия с ферментами, типа изучаемых энзимов и их топографии.

4. При отравлении ДДВФ тест ингибиции 1 -нафтилацетатэстеразы является наиболее специфичным, поскольку для этого фермента отмечено максимальное и наиболее раннее снижение удельной каталитической активности, устойчивое изменение типа ферментативной реакции, наибольшая интенсивность взаимодействия с ДДВФ и высокая ингибирующая активность ДДВФ.

5. Наиболее эффективным тестом при отравлении животных пермет-рином является снижение удельной каталитической активности оксидазы. Этот фермент достоверно снижал свою активность под влиянием перметрина как в экспериментах in vitro, так и in vivo. Интенсивность его взаимодействия с пер-метрином и ингибирующая активность перметрина, проявляемая по отношению к оксидазе, были наибольшими. Тест на снижение удельной каталитической активности оксидазы может быть использован в качестве диагностического критерия при отравлении перметрином.

6. При отравлении ацетатом свинца происходит снижение активности всех исследованных ферментов, кроме 1-нафтилацетатэстеразы и щелочной фосфатазы селезенки, удельная каталитическая активность которых возрастала в острых и хронических экспериментах in vivo.

7. При отравлении нитратом кадмия происходит снижение удельной каталитической активности щелочной фосфатазы в экспериментах in vitro и снижение в различной степени удельной каталитической активности всех исследованных ферментов, кроме 1-нафтилацетатэстеразы и щелочной фосфатазы селезенки, в экспериментах in vivo.

8. Показано, что тест на возрастание удельной каталитической активности 1-нафтилацетатэстеразы и щелочной фосфатазы селезенки является системным тестом при отравлении животных солями кадмия и свинца.

9. Отработаны методические подходы по определению удельной каталитической активности ферментов инфузорий Т. pyriformis и установлен их фоновый уровень. Максимальной была активность щелочной фосфатазы, минимальной - ацетилхолинэстеразы.

Ю.Установлено, что изменение ферментативной активности в культуре клеток Т. pyriformis и ферментных препаратах из нее под влиянием токсикантов имеет сходство с таковым у высших животных. Это свидетельствует о возможности межвидовой экстраполяции результатов биотестового анализа, что является важным как с научной, так и с практической точек зрения.

11. Определены наиболее значимые ферменты простейших, изменение активности которых можно использовать в качестве критерия токсичности различных объектов ветеринарно-санитарного и экологического контроля. При воздействии ДДВФ показательным является изменение удельной каталитической активности 1-нафтилацетатэстеразы, под влиянием перметрина - оксидазы, нитрат кадмия и свинца ацетат наиболее выражено влияют на щелочную фосфатазу и 1-нафтилацетатэстеразу.

12.Для подбора оптимальных биохимических критериев токсического действия ксенобиотиков и оценки результатов токсикологического эксперимента рационально использовать метод параметрического анализа ферментативных реакций, позволяющий выделить наиболее чувствительные ферментные тесты по следующим параметрам: интенсивность взаимодействия токсиканта и фермента, графическое построение зависимости интенсивности взаимодействия от концентрации токсиканта и вычисляемая на основании этих построений суммарная ингибирующая активность, проявляемая токсикантом в отношении фермента (группы ферментов). Такие показатели как константа ингибирования, устойчивость течения ферментативного процесса, графические трехмерные и двухмерные представления ферментативных реакций наиболее показательны для оценки механизмов взаимодействия токсикантов и ферментов.

13. Разработанные нами биотесты на основе ферментных систем высших животных и простейших, методические подходы к изучению механизма токсического действия ксенобиотиков и критерии его оценки могут быть использованы при диагностике токсикозов животных и контроле за безопасностью различных объектов ветеринарно-санитарного и экологического надзора.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

В практике работы научно-исследовательских учреждений и производственных лабораторий могут быть использованы следуюпще разработанные нами методики, методические рекомендации и указания:

Методика определения остатков карбофоса и ДДВФ при их одновременном присутствии в органах кур" (М., 1993);

Методика определения удельной каталитической активности фосфатаз в биологических субстратах" (утверждена Отделением ветеринарной медицины РАСХН, 1997 г.);

Методика определения удельной каталитической активности оксидазы в биологических субстратах" (утверждена Отделением ветеринарной медицины РАСХН, 1997 г).

Методические указания по диагностике токсикозов кур, вызываемых фосфорорганическими соединениям" (М., 1994 г.);

Методические рекомендации по использованию биологических тестов для индикации токсичных элементов в объектах ветеринарного надзора" (утверждены Отделением ветеринарной медицины РАСХН, 1997 г);

Методические рекомендации по определению ферментативной активности в культуре клеток Tetrahymena pyriformis при биотестировании" (утверждены Отделением ветеринарной медицины РАСХН 10.03.2002).

Методические рекомендации по определению удельной каталитической активности холинэстераз в биоматериале при проведении токсикологических исследований" (утверждены Отделением ветеринарной медицины РАСХН 10.03.2002);

Методические указания по использованию инфузорий Tetrahymena pyriformis в качестве тест-культуры в приборе ""Биотестер-2" (утверждены Департаментом ветеринарии МСХ РФ, 16.10.2000, № 13-7-2/2157);

314

Методические указания по ускоренному определению токсичности продуктов животноводства и кормов" (утверждены Департаментом ветеринарии МСХ РФ, 16.10.2000, № 13-7-2/2156);

Методические указания по определению остатков перметрина в биоматериале с использованием твердофазной экстракции" (представлены на утверждение в Департамент ветеринарии МСХ РФ).

Наставление по применению эктоцида в борьбе с эктопаразитами птиц в помещениях" (утверждено Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода Российской федерации 23.04.94, № 19-4-2/51, per. № 10.07.122-94 ОВФП).