Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.06) на тему:Методические аспекты и практическое применение ускоренной биологической оценки кормов, продуктов животноводства и других объектов ветеринарно-санитарного и экологического контроля

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТМЬСКИП ИНСТИТУТ ВЕТЕРИНАРНОЙ САНИТАРИИ, ШШШ И ЭКОЛОГИИ (ШИИВСГЭ)

На правах рукописи

долгов

Виктор Андреевич

методические аспекты и практическое применение ускоренной ш0л01ическ0й оценки кормов, продуктов

швашоводзтвА и другах объектов ветяринарно-санитарного и экологического контроля

16.00.06 - ветеринарная санитария, ветеринарно-санитчркая экспертиза и гигиена переработки продуктов животноводства

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора ветеринарных наук

Москв? - Г992

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной санитарии, гигиены и экологии (ШИКВГТГЭ)

Научный консультант - доктор ветеринарных наук,- профессор

ТАЛАНОВ Г.А.

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук, профессор

АЕБАСОВ Т.Г. (ШШВСГЭ)} доктор ветеринарных наук, профессор МЯГКОВ A.C. (МИПБ); доктор медицинских наук, профессор ГОРШКОВ А.И. (ША им. И.М.Сеченова).

Ведущая организация - Санкт-Петэрбургский ветеринарный

институт.

Защита состоится " " 1993 г. в час,

на заседании специализированного совета Д.020.50.01 при Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной санитарии, гигиены и экологии (123022, Москва, Звенигородское шоссе, Д. 5).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно-исследовательского института ветеринарной санитарии, гигиены и экологии.

Автореферат разослав * " 1992 г.

Учеыгй секретарь специализированного сонета,. кандидат биологических наук

Л.П.Ппмено&а

общая характеристика работы

Актуальность темы. В настоящее время большое значение приобретает проблемы, связанные о ветеринарно-санитарннм и экологическим благополучием кормов, продуктов животноводства и объектов окружающей среды (воды, почвы и др.). Их загрязнение различными ксенобиотиками естественного и антропогенного проасхождения, количество которых достигает многих десятков и сотен тысяч (Шашкина Л.Ф. с соавт., 1985; Трахтенберг И.М. с соавт., 1987, и др.), внедрение новых нетрадиционных технологий производства и переработки приводит к тому, что качественная оценка на основе физико-химических методоБ анализа, несмотря на ее большую информативность, в ряде случаев становится трудноосуществимой. Это связано с большими затратами времени я средств на проведение исследований, а также отсутствием методов индикации многих веществ, которые могут отрицательно влиять на здоровье человека и животных. Кроме того, количественное определение содержания ксенобиотиков или различных алиментарных факторов не позволяет в полной мере судить о главном - степени опасности измеренных уровней, их возможном токсико-биологиче-ском эффекте, который может существенно меняться в зависимости от формы соединений, взаимодействия различных веществ друг с другом и с компонентами окружающей среды, ее физико-химических и биологических характеристик (Патин С.А., 1981; Макарова К.В., 1988; Филе-hko О.Ф., I98b; Kopperman H.L.et al.,I974, и др.).

Не случайно поэтому в посяедние годы как у нас в стране, так и за рубежом уделяется большое внимание разработке методов биологической оценки качества кормов, продуктов животноводства и других объектов ветеринарно-санитарного и экологического контроля, поскольку лишь реакция живого организма может в интегрированной форме отразить все свойства анализируемого субстрата.

Однако применение для этих целей высших животных нередко бывает затруднительным по целому ряиу причин (методических, экономических, этических), вследствие чего во всем ¿/лре наблюдается тенденция к'их максимально возможной замене ачьтернативными живши моделями (культурами тканей, микроорганизмами, беспозвоночными и др.), среди которых несомненный интерес представляют простейшие -инфузории тетрахименн и парамеции , имеющие сходство с высшими животными по ряцу основных параметров обмена веществ. Преимуществом использования тест-организмов являются быстрота анализа, его относительная простота и дешевизна, высокая чувствительность к токсическим факторам и наглядность в проявлении биологического эф£<з-

кта; особенно продуктивно их применение при скрининговых исследованиях, что дает возможность ориентировочной оценки, большого количества испытуемых проб (Спесивцева Н.А., Очкина И.И,, i960; Ха-ратьян С.Г., Игнатьев А.Д., 1974; Беленький Н.Г., 1978; Таланов Г.А., 1979; Коржевенко Г.Н., 1980; Голубкова Э.Г., 1988; Крайню-кова А.Н., 1988; Годцберг A.M., Фрезьер Д.М., 1989; Флеров Б.А., 1989; Лахонина Г.М., ИрлинаИ.С.,' 1991; Кокова В.Е., I992;Apoatol С., 1972;Bovie E.G. et al., I982;Wiger R., 1985; Roben I., 1987; Bijl I.P. et al., 1988, и др.). Привлечение современных электронно-вычислительных и измерительных средств в сочетании с тест-организмом, выполняющим роль биологического индикатора, позволяет существенно повысить производительность, информативность и методические возможности анализа, о чем свидетельствует ряд созданных за рубежом автоматизированных аналитических систем ("Биоскрин","Микро-токе" и др.).

В то же время ускоренные методы биологической оценки не получили еще должного распространения в ветеринарно-санитарных исследованиях, что обусловлено нерешенностью ряда теоретических и практических аспектов данной проблемы, связанных с методическими подходами к биотестированию различных по своим свойствам веществ, поиском универсальных живых моделей с максимально широким спектром применения, выявлением наиболее показательных тест-функций и разработкой методов и средств их регистрация, определением чувствительности тест-организмов к различным токсическим веществам и алиментарным факторам; недостаточно изучены вопросы межвидовой экстраполяции результатов биотестирования, а также возможности его практического применения. Исследования в данном направлении являются актуальными и имеют большое теоретическое и прикладное значение.

Еель и задачи исследований. Целью данной работы являлось изучение методических аспектов ускоренной биологической оценки кормов, продуктов животноводства и других объектов ветеринарно-сани-тарного и экологического контроля с использованием тест-организма Тетрахимена пириформис, а также возможностей практического применения биотестовых методов.

Были поставлены следующие задачи:

- разработать ускоренные методы биологической оценки с использованием в качестве тест-пункций различных показателей жизнедеятельности тетрахкмен;

- создать биотестовый прибор с расширенными функциональными

возможностями для регистрации поведенческой (хемотаксической) реакции простейших; .

- изучить применение инфузорий в качестве тест-организма

в аналитической системе "Биоскрин" и разработать соответствующие методические подходы к проведению анализа;

- определить чувствительность тетрахимен к различным веществам, вмеххцим ветеринарно-санитарное и экологическое значение, и выявить корреляционную связь параметров их токсичности для инфузорий и высших животных (крыс);

- провести сравнительную биологичеокую оценку кормов и продуктов питания и определить взаимосвязь показателей их биологической ценности в оггчтах на инфузориях и высших животных (крысах и цып. лятах);

- изучить практические аспекты биотестирования кормов, про- •• дуктов животноводства и объектов окружающей среды;

- рассчитать экономическую эффективность использования биотестовых методов по сравнению с традиционными методами на высших животных.

Научная новизна. Впервые дано научное и практическое обоснование возможности применения ускоренных методов биологической оценки, разработанных наш,для спрешташя качества кормов, продуктов животноводства и других объектов ветеринарно-санитарного и экологического контроля. Изучены соответствующие методические подходы к проведению исследований,, а такзе вопросы комплексного использования в качестве тест-функций различных показателей жизнедеятельности инфузорий Тетрахимена пириформис (физиологи -ческих, биохимических, морфологических). Создана новая оригинальная биотестовая аппаратура с расширенными функциональными возможностями, предназначенная как для научных, так и практических целей. Определена чувствительность инфузорий к широкому спектру ксенобиотиков естественного и антропогенного происхождения и выявлены вещества, пригодные для биологической ивдикации; впервые показана возможность использования для этих целей поведенческой (хемотаксической) реакции тетрахимен и разработаны соответствующие методы и технические средства биотестирования. На основании сравнительной оценки параметров токсичности и биологической ценности в опытах на инфузориях и высших кивотных доказана возможность мехсвидовой экстраполяции результатов анализа, что имеет как теоретическое, так и прикладное значение; выведены соответ-

ствумцие математические формулы, которые можно использовать в прогностических целях. Показана целесообразность и эффективность применения разработанных методов биологической оценки для решения практических вопросов, связанных с изучением ветеринарно-са-нитарного и экологического качества кормов, продуктов питания, а также объектов окружающей среды, подвергнутых различным антропогенным воздействиям.

Практическая ценность и реализация результатов работы. Материалы диссертационной работы вошли в следящие методические рекомендации, которые широко используются в различных научно-исследовательских и учебных учреждениях страны, а также в сфере сельскохозяйственного и промышленного производства: "Методические рекомендации по биологической оценке продуктов животноводства и кормов о использованием тест-организма Тетрахимена пириформис ". (Утверждены ВАСХНИЛ. М., 197?); рекомендации "Применение реснитчатой инфузории для качественной экспресс-оценки технологий пищевых- и кор-моввх продуктов в условиях Крайнего Севера". (Утверждены НИИСХ Северного Зауралья. Тюмень, 1979); "Методические рекомендации по определению биологической ценности сельскохозяйственных продуктов". (Утверждены ВАСХНИЛ. Хкное отд. Киев, 1981); "Методические реко- • мендации по биологической оценке кормов и продуктов с использованием в качестве тест-организма цыплят". (Утверждены ВАСХНИЛ. Южное отд. Киев, 1983); "Методические рекомендации по использованию инфузорий Тетрахимена пириформис для токсико-баологической оценки сельскохозяйственных продуктов". (Утверждены ВАСХНИЛ. Юкное отд. Киев, 1983); "Методические рекомендации по повышению качества продуктов убоя свиней, выращенных по промышленной технологии".(Утверждены ВАСХНИЛ. Хкное отд. Киев, 1985); "Методические рекомендации по использованию инфузорий Тетрахимена пириформис для биологической оценки продуктов и кормов".(Утверждены ВАСХНИЛ. М., 1987); "Методические рекомендации для использования экспресс-метода биологической оценки продуктов и кормов". (Утверждены ВАСХНИЛ. М., 1990); "Методические рекомендации по ускоренной токсикологической оценке кормов с использованием прибора "Биотестер-2". (Утверждены ВАСХНИЛ. М., 1991); "Методические рекомендации по ускоренной ток-сико-биологической оценке продуктов и кормов". (Утверждены ВАСХНИЛ. М., 1991), методические рекомендации "Использование инфузорий (Тетрахимена пириформис) в качестве тест-культуры в приборе "Биотестер-2" (экспресс-метод)".(Утверждены Государственным лечебно-оздоровительным объединением. М., 1991).

Результатн исследований использованы при разработке "Методических рекомендаций по ускоренному способу определения токсичности кормов" (Утверждены ГУВ при Госкомиссии СМ СССР по продовольствию и закупкам. М„ 1990), ГОСТ 28178-89 "Дрожжи кордовые. Методы испытаний" (Госкомитет СССР по стандартам. М., 1989), а также явились основанием для внесения изменений в "Правила ветеринарного осмотра убойных глвотных и ветеринарно-санитарной экспертизы мяса и мясных продуктов", раздел 10 "Лабораторное исследование мяса и мясных продуктов" (Утверждены ГУВ МСХ СССР 27.12.83 г. Внесены изменения и дополнения от 17.06.88 г.).

Совместно с сотрудник»® Ленинградского электротехнического института разработан биотестовый прибор с расширенными функциональными возможностями ("Биотестер-Н") и подготовлены соответствующие материалы для его патентования.

Результаты диссертационной работы использованы при проврдении лекционных занятий'на экологических курсах МГУ (Экоцентр МГУ), а также учебных сборах начальников ветеринарных лабораторий округов и флотов при военно-ветеринарном факультете МВА. им. К.И.Скрябина.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и одобрены яа заседаниях Ученого совета ШИИВСГЭ (1980-1992 г.г.), на конференции "Пути-рационального использования мясних ресурсов с целью повышения эффективности производства' и качества продукции" (Москва, 1980), Всесоюзном совещании "Новые источни.ти пищевого белка и их применена" (Тбилиси, 1980), конференции "Пути повышения качества продуктов животноводства и их ветеринарно-санитарная оценка" (Киев, 1981), XXI Международном молочном конгрессе (Москва, 1982), У1 научно-технической конференции "Повышение эффективности пгоизводства и качества молочных продуктов" (Каунас, 1982), конференции "Ветеринарные проблемы промышленного свиноводства" (Киев, 1983), Второй научно-технической конференции "Разработка процессов получения комбинированных продуктов питания (технология, аппаратурное оформление оптимизация)" (Москва, 1984), Всесоюзной научно-технической конференции "Совершенствование ветеринарного обслуживания животноводства в условиях интенсификации" (Махачка--ла, 1987), Республиканской конвенции "Еиотрансформапия вторичного растительного сырья в белковые кормовые продукты" (Тбилиси, 1987), Всесоюзной научной конференции "Совераеьствование ветеринарно-санитарной экспертизы продуктов животноводства и повышение уровня гигиены производства в перерабатывающей промшалонности АПК" (Казань, 1938).

Публикации результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 39 научных работ.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на-350 страницах машинописного текста и состоит из введения, двух частей -обзора литературы (3 главы) и собственных исследований (8 глав), выводов, практических рекомендаций, списка литературы из 469 источников (260 отечественных и 209 зарубежных авторов), содержат таблицы и 16 приложений, иллюстрирована 22 рисунками.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ;

Работа выполнена на основании плана научно-исследовательских работ ШИИБСГЭ в период с 1980 по 1992 г.г. в лаборатории ветери-нарно-санитарной экспертизы мяса, рыбы и других пищевих продуктов и является частью следующих тем: 13.7.8С.83, задание 06; 08.I6.I3.Ia.8I.83, задание 08; 0.51.09.08.16 (I3.Ia.8I.83); 0.51.09.08.16 (13.1в.84.85); 0.51.0Э.08.07.Д1. (13.1а.86.90); & гос. регистрации 01823003577; 13.1.92.96 НШ фундаментальных исследований 06.23.

Отдельные исследования проводились б лаборатории токсикологии института, а также лабораториях и отделах Укр.НЙШ, НПО "Комплекс", ШИИ животноводства, КШД АН СССР, ЛЭТИ при участии сотрудников данных учреждений, которым автор Еыражает искреннюю благодарность за оказанное содействие и помощь в работе.

Материал и метода исследований

В работе изучались различные продукты и корма животного, растительного и нетрадиционного происхождения (мясо, мясопродукты, рыба, молоко, творог, зерновые, бобовые, кормовая биомасса одноклеточных и др.), а также объекты окружаицей среды (природные и сточные воды, почва, полимерные и строительные материалы).

При определении чувствительности инфузорий к различным веществам использовали химически чистые соли металлов, органические кислоты и их производные, спирты, фенолы, пестициды, микотоксины, различные фарлшрепараты и другие соединения,',имеющие ветеринарно-санитарное и экологическое значение.

В работе применялись химические, биохимические, микробиологические, физиологические и математические методы'исследований. Изучения хшхческого в биохимического состава продуктов (содержания б;-лка, аминокислот, гликогена, редуцирующих сахаров и др.), а так-

'¡изЕчо-хшшческйх показателей мяса, служащих критериями его Еетс-рина,<но-санптарного качества (рН, реакции на пероксидазу и с

сернокислой медью, формольная проба) осуществляли по общепринятым методам (Крылова H.H., Лясковская D.H. Физико-химические методы исследования продуктов животного происхождения. М., 1961; Метода биологической оценки продуктов животпого происхождения. М., 1975; Правила ветеринарного осмотра убойных животных и взтеринар-но-санитарной экспертизы мяса и мясопродуктов. М,, 1988).

Опыты на инфузориях Тетрахимена пириформис проводили по методу, описанному stott j.a. , smitbTH.", (1963, 1966), а танке по разработанным нами методам определения безвредности и биологической ценности, изложенным в соответствующих рекомендациях, приведенных выше. В качестве тестируемых функций регистрзровали выживаемость тетрахимен, их ростовую (генеративную) и поведенческую (хе-мотаксическую) реакции, а также другие физиологические, биохимические и морфологические показатели. Баотестирование на парамециях 'проводили по методу Пожарова A.B. (1988) с некоторыми нашими модификациями. • ^

Биологическую оценку кормов и продуктов на крысах осуществляли по ускоренному методу (Bender A.b., Uliler D.S., 1953 ) с опытным периодом 10 дней, а также по общепринятому методу (Методические рекомендации по биологической оценке продуктов питания. М., 1973) о периодом опыта 21 день, /читывали изменения массы тела животных, потребление ими корма. Определяли следующие показатели биологической ценности - коэффициент эффективности балка (КЭБ), истинный коэффициент эффективности белка (ШЭБ), коэффициенты видимой утилизации (КВУ) и использования белка (КИБ) в организме. В сыворотке крови изучали содержание общего белка (рефрактометрическим методом по Лемперт, i960), мочевины (по петной реакции с диацетилмонооксимом), холестерина (унифицированным методом по ре-ахцва Златкис-Зака, 1973), ^-липопротеидов (по методу Бурштейна в модификации Ледвиной. i960). Рассчитывали липопротеидно-холесте-риновый индекс (ЛХИ), & по уровню мочевины - биологическую цон-вость протеина (БЦ по Эггум В., 1973). Определяла массу печени в ее процентное отношение к массе тала,' содержание в ней сухого вещества и азоте., процентной отнодэнив зедерванного в печени агстд к азот/ корма. Содержание общего азота в биологической материала устядлнлигажа фртокаяориметрячэсквы иетодоы о регкгявоы Ввнх*ера в моотфвгапвв Васильевой Г.Н. (1974).

Биологическая опенку на ццаяятах проводили пс методу, описанному Himers s.a., Scott НА. (ISS05, а также Hand ».s. (I96C), с некоторня наэдшк модификациями. Гивотяых содержат в термостат-

ном обменном боксе собственной конструкции. Учитывали изменения массу тела, потребление корт. Определяли коэффициенты эффективности (КЭБ) и использования белка (ТУЖ) в организме.

Расчет экономической эффективности применения ускоренных методов биологической оценки проводили в соответствии с "Методикой определения экономической эффективности использования в народном хозяйстве результатов научно-исследовательских и опытно-конструкторских работ, новой техники, изобретений и рационализаторских предложений"итверждена МСХ СССР 26.02.79 г.).

Результаты исследований обрабатывали статистически с определением средней арифметической величины, средней ошибки, критериев достоверности и коэффициента корреляции.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЗДОВАЖЯ

Разработка ускоренных методов биологической опенки. При решении данной проблемы изучались вопросы расширения -числа определяемых в эксперименте показателей жизнедеятельности инфузорий, их взаимосвязи и чувствительности к различным веществам и алиментарным факторам, разработки методов и технических средств регистрации тест-функций, удешевления и упрощения хода анализа, его авто-' матизации.

Для получения более объективной и достоверной информации нами предложено использовать в качестве тестируемых функций совокупность различных проявлений жизнедеятельности тетрахимен, в которую, входят выживаемость простейших, их поведенческая и ростовая реакции, длительность лаг-фазы, характер кривой роста популяции, размер клеток, количество выросшей биомассы, коэффициенты эффективности и использования белка, длительность жизни культуры, краситель-связывающая способность клеток, функциональные характеристики (степень подвижности, характер движения и др.), биохш/дческие (содержание сухого вещества, азота, белка, -аминокислот в других компонентов, активность ферментов) и морфологические показатели.Предложены соответствующие методические приемы (применение максимально переносимых величин навесок, экстракция органическими растворителями, создание градиента концентрации, культивирование в больших объемах среда, отмывка бямлассн и др.), позволяющие существенно повысить информативность данных тест-функций и облегчить их регистрацию, которые использованы в разработанных нами ускоренных методах определения безвредности я биологической ценности кормов, продуктов питания я объектов окружающей среды.

Для изучения характера поведенческой реакции тетрахимен, являющейся наиболее быстро определяемым показателем и в ряде случаев превосходящей по чувствительности другие тест-функции (Флеров Б.А,, 1989; Bovie Е.С., 1975, и др.), нами использован принцип создания градиента концентрации между исследуемой жидкостью и средой с инфузориями, применявшийся ранее в опытах на парамециях (Пожаров -A.B. с соавт., 1988). УстедоЕлено, что он махет создаваться и стабильно поддерживаться в течение 12-18 часов за счет компонентов питательной среды, что существенно облегчает и упрощает ход анализа и. позволяет обходиться без дополнительных реактивов, в той или иной степени влияющих на результаты измерений. Показано, что для регистрации хемстаксиса тетрахимен можно использовать специализированный импульсный фотометр пБиотестер-2", дающий возможность определен« движущихся клеток инфузорий. Изучен характер хемотакси-ческой реакции различных штаммов тетрахимен и выбран штамм, в наибольшей степени отвечающий необходимым требованиям (vJHj^), установлены параметры проведения анализа - оптимальная плотность культуры (150-250 тыс. клеток в Г мл среды), ее возраст (2-3 суток), экспозиция (0,5-1,5 часа), режим измерения (х5), его кратность (3-5), pH (7-7,5) и температура тестируемого раствора,, допустимая концентрация в нем солей и органических растворителей (ацетона, эфира, этанола, метанола, диметилсульфоксида). Определены чувствительность хемотаксической реакции тетрахимен к различным соединениям (соли тдаелых металлов,, фармпрепараты, пестициды, микотокси-нн,. фенолу и др.) и ее взаимосвязь с\ ростовой реакцией инфузорий. Разработаны. соответствующие методы биотестирования жидких сред,спо-мсщел коТорых можно в течение 0,5-1,5 часов оценить токсические свойства вещества. Предложены также методические подходы, позволяющие в одном эксперименте изучать несколько основных тест-функций (выживаемость, ростовую и поведенческую реакции), что существенно повышает информативность анализа, и в ряде случаев дающие возможность обходиться без специальной измерительной аппаратуры.

Нами (Пожаров A.B., Шелемотов С.А., Долгов В.А.) разработан прибор "Екстсстер-Н", облат^ощии расширенными гоункциональкыш возможностям! и повшенпой чувствительностью, который мол;ет применяться как в практических целях при выполнении массовых анализов жидких проб по традиционным методикам, так и, глэеным образом, для глоди'Тзиглпи.к изЕестннх и создали новых оригинальных приборных биотестовкх методов контроля и анализа сред и материалов по биологически значимым показателям. "Биотестер-Н" позволяет не-

пользовать в качестве тест-культур простейших двух видов - тетра-химен и парамеций; определять их концентрацию в. верхней л нижней зонах измерительной кюветы, что значительно расширяет методические возможности прибора; тестировать, наряду с окрашенными, мут- • ные и непрозрачные среды, а также контролировать разбавленные взвеси инфузорий. С учетом'новых возможностей прибора нами разработаны методические подходы к проведению исследований, изложенные в соответствующих методических рекомендациях,. которые заключаются в использовании менее плотных культур простейших, отсутствии необходимости применения в ряде случаев положительного контроля, а также оценке результатов биотестирования на основании измерений двух каналов.

Кроме определения безвредности, инфузории Тетрахимена пири-формис, в отличие от многих других тест-организмов, могут использоваться и для изучения биологической ценности продуктов и кормов. Однако существующий метсд ( stott I.A., Smith Н., 1963, 1966) довольно трудоемок и требует большого числа химически чистых реактивов (солей, витаминов, нуклеотидов), многие из которых крайне дефицитны, что существенно ограничивает его практическое,применение.

В разработанном нами методе витамины и нуклеотиды заменены дрожжевым экстрактом, а соли - морской солью; в пять раз уменьшен объем анализируемой среды; вместо конических колб Эрленмейера использованы флаконы из-под антибиотиков и соответствующие штативы; смесь формалина и фосфорнокислых солей калия для фиксации клеток заменена 5#-ннм спиртовым раствором иода.- Значительно расширено число регистрируемых показателей биологической ценности, многие из которых (коэффициенты эффективности и использования белка, жизне-поддерживающие свойства, и др.) аналогичны определяемым на высших животных.

При сравнительной биологической оценке различных продуктов и кормов (казеин, творог, молоко, мясо, колбасы, рыба, рожь, пшеница, овес, кукуруза, рис, просо, соя, кормовая биомасса одноклеточных), проведенной общепринятым и разработанным наш.методами,получена высокая степень корреляции результатов анализа,(г = 0,95). Метод отличается простотой, высокой производительностью, дешевизной, доступностью, мальчл расходом реактивов и испытуемых веществ, компактностью и технологичностью, а .также высокой информативностью.

Наш установлено, что изменения основных тест-функций тетра-

химен в зависимости от биологической ценности исследуемых продуктов и кормов, а такие характер их взаимосвязи аналогичны таковым высших организмов. Так, генеративная реакция инфузорий коррелировала с интенсивностью прироста клеток по периодам эксперимента и их размерами (г =0,73-0,91), степенью эффективности и усвоения азота (г = 0,98), красительсвязыватапей способностью биомассы (г = 0,76-0,99); в то ;хе время мегду ростовой реакцией и продолжительностью жизни популяции наблюдалась обратная зависимость, что согласуется с результатами, получэнными в опытах на лабораторных животных и наблюдениях над лодьми (Крекер Ю.Н., 1955), и свидетельствует об общности метаболических процессов как на уровне клетки, так и целостного организма.

Все существующие методы биологической оценки с использованием тетрахимен характеризуются низкой степенью автоматизации, что ограничивает их возможности. Для решения этого вопроса нами изучено применение инфузорий в качестве тест-культуры в автоматизированной аналитической системе "Биоскрин", разработанной фирмой Лабсистемз (Финляндия) и предназначенной для кинетического измерения скорости роста клеток. Определены параметры эксперимента (штамм тетрахимен, состав питательных сред, ход и длительность анализа), а также'основные показатели, отракаодие характер и интенсивность роста тест-организма, которые можно использовать в качестве критериев безвредности и биологической ценности исследуемых веществ (величина абсорбции в начале и в конце измерения, время достижения минимального и максимального значения абсорбции, врет максимального изменения абсорбции, момент начала роста культуры и ее максимальная скорость). Разработанный нами метод с применением данного прибора позволяет резко сократить количество расходуемых роактивов для анализа и питательных сред; расширить спектр определяемых в одном опыте показателей; исследовать комплексное действие тестируемых веществ; повесить производительность и осуществлять автоматическое измерение параметров, запись и построение кривых роста тест-организма, их математическую обработку и внсачу ре^ультгтоз на печатающее устройство. Сравнительный анализ биотестирования различных тсксикантов (гликотоксинов, фенолов, солей гетелих металлов), проведенного на приборе "Биоскрин" и общепринятым методом (подсчет выросших клеток), показал сопоставимость полученных экспериментальных данных.

Изучение чувствительности тетрахимен к различным веществам.

Исследовали влияние различных соединений на ростовую и поведенческую реакции инфузорий, поскольку эти тест-функции наиболее показательны и могут использоваться при массовых анализах. Определяли концентрации веществ, вызывающие•их статистически достоверное ингибирование (1С - inhibitory concentration) - минимальное (ICmin.)' 50^"ное (1С5о^ 11 ЮО^-кое (ICI0Q). Ростовую реакцию учитывали через сутки при культивировании инфузорий на пептонной среде, содержащей испытуемые соединения,- поведенческую - с помощью прибора "Биотестер-2". Результаты исследований приведены в таблице I.

Из представленных данных видно, .что чувствительность тетрахимен к различным веществам неодинакова. Их минимальная концентрация, снижающая рост инфузорий, колебалась в широких пределах - от стотысячных долей мг/мл (веррукарин, диацетоксисцирпенол, Т-2 токсин, трихотецин) до целых его значений (Д.1С0, метанол, этанол, нитрат калия и др.). Аналогичная картина была и в отношение поведенческой реакции,, которая начинала ингибироваться в диапазоне концентраций от 1»10~® мг/мл (патулин) до 40 мг/мл (ДЛСО).

Хемотаксис тетрахимен оказался более чувствительным, чем ростовая реакция, при индикации IC^n 19 из 45 изученных веществ ; обратная картина наблюдалась при биотестировании 17 соединений, а для 9 чувствительность обеих тест-функций была'примерно равной.

В то же время в отношение отдельных групп веществ она несколько отличалась. Так, из 16 солей различных металлов для II (60,8% от общего числа) поведенческая реакция инфузорий оказалась более чувствительной, чем ростовая - различие составляло от 3-7 раз до 2-3 порядков. В их число входят соли таких ванных с ветеринарно-санитарной и экологической точек зрения тяжелых металлов, как медь, свинец, кадмий, цинк, таллий, ртуть, литий, кобальт. При биотестировании растворов хлористого натрия и жолезистосинеродистсго калия поведенческая реакция была менее показательна, чем ростовая, а в отношение сульфата железа и нитрата калия их чувствительность оказалась примерно одинаковой.

При изучении органических и ряда других соединений установлено, что чувствительность хемотаксической реакции тетрагтмен была в 2,5-130 раз выше, чем ростовой, при индикации минимальных ин-глбирующих концентраций резорцина, салициловой и акриловой кислот, •ш.-Е-ака/ эфира и фурацилина; обратная картина наблюдалась в отноше-!3'е ДМОО, хлороформа, ацетснитрила, ацетона, этанола, метанола, ДЦВ£,ци-

Таблица I

Чувствительность тетрахимен к различный веществам

; Ингибирующие концентрации и тест-функции

Тестируемые вещества : 1С пап ТС50 ■ 1С100

: рост |повед. рост |повед. 'I рост ¡повед.

I : 2 : з 4 : 5 : 6 : 7

Соли металлов (мг/мл)

Сульфат железа 0,05 ■ 0,05 0,25 1,0 5,0 >5,0

Нитрат 'калия 2.0 2,5 6,0 6,5 17,0 >11,0

Нитрит натрия 0,15 0,04 0,3 0,7 1,5 0,8

Хлорид натрил 3,0 8,0 11,0 12,5 17,0 >15,0

Карбонат таллия 0,075 0,001 0,15 0,085 0,7 1,0

Сульфат цинка 0,025 0,0001 0,2 0,03 1,0 0,085

Гексациано-(П) 6,5 2,5 7,0 >35,0 >13,0

феррат калия 0,6

Ацетат свинца 1,0 0,0045 1,3 0,05 2,0 од

Иодид кадмия 0,001 0,00006 0,0045 0,0004 0,02 0,001

Сульфат када.1ия 0,001 0,001 0,0025 0,С25 0,025 0,045

Сульфат меди 0,45 0,0004 0,75 0,0075 2,4 0,05

Нитрат меди 0,5 0,0005 0,8 0,007 2,0 0,05

Иодид ртути 0,00025 0,00001 0,0004 0,0005 0,002 0,004

Карбонат лития . 0,09 0,009 0,25 0,1 1,8 0,5

Хлорид кобалыа 0,002 0.0С001 0,025 0,005 О о 3,0

Перманганат калия 0,025 0,0005 0,4 0,01 0,5 0,1

Ооганические и другие соединения (мг/мл)

Диметилсульфоксид 12 40 15 >80 23 -

Хлороформ 0,001 0,1 .0,3 0,5 1,8 2,5

Ацетонитрил 0,9 5,0 6,0 17,0 16,0 32,0

Фенол 0,С8 0,1 0,14 0,25 0,27 0,8

Пикриновая кислота 0,04 0,С6 0,13 0,1 0,55 0,25

Резорцин 0,022 0,0001 0,09 0,25 0,91 0,6

Салициловая кислота 0,04 0,001 0,08 0,025 0,25 0,05

Акриловая кислота 0,005 0,00045 0,03 0,006 0,08 0,01

Аммиак 0,025 0,01 0,08 0,03 0,18 0,05

Дизтилобый эфир 5,6 0,5 13,5 7,5 22,0 10,0

Ацетон 2,8 15,0 8,9 30,0 24,0

Этанол 4,5 15,0 8,5 20,0 28,0 >40,0

I : 2 : з : 4 : 5 ! 6 • ! 7 •

Метанол 6,0 30,0 . 9,0 40,0. 36,0. >6о,0

Фурацилнн 0,043 0,0001 0,15 0,18 >0,24 >0,24

Фураэолидон 0,00035 0,05 0,0035 >0,05 0,055

Хлорофос 0,65 1.0 1.4 6,5 4,5 10,0

ДДВФ 0,0025 0,15 0,03 0,25 0,15 0,45

Циодрин 0,0005 0,1 0,03 0,15 '0,025 >0,3

Моющий порошок 0,008 0,007 0,06 о.рз - 0,09 0,075

Масляная кислота 0,02 - 0,068 0,15 -

А.нилпн 0,015 - 0,032 - 0,12 -

Бутанол 0,65 - 1,1 1,72 -

Иэобутиловый 0,25 0,6 3,12

сдврг - — —

Аминазин 0,00001 - 0,0001 - 0,005 -

Сульфоксимин 0,6 1,75 2,4

метионин (ССМ) — - —

Антибиотики в сульФянияАмипн (мт/мл^

Пенициллин 1.0 1,0 16,3 12,0 27,0 25,0

Стрептомицин 0,45 0,25 7,6 8,0 25,0 >20,0

Стрептоцвд 5,0 10,0 12,0 20,0 55,0 >22,0

Тетрациклин 0,063 - 0,092 5,5 -

Тетраолоан 0,1 - 0,55 - 3,8 -

Гентамицин 0,15 - 0,8 - 5,3

Тримеразин 7,0 - 12,0 - 85,0 —

Микотоксины (ихг/мя)

Веррукарвн 0.01 0,02 0,03 2,5 0,25 >5,0

Патулнн 0,15 0,001 С.8 2.4 1.0 >10,0

Диацетокси-сцирпенол 0,015 0,08 0,06 1,25 0,25 >10,0

Роридин А 0,015 0,01 0,07 0,31 о,з ■>1.25

Т-2 токсин 0,02 0,5 • 0,05 >10,0 „ 0,25 —

Зеареленон 1,3 1,35 5,4 6,0 7,8 >10,0

Пепвцвллот?ая 1С,0 >10,0 15,0

кислота 2,0 0,55

Трихотепин 0,08 т 0,55 - • 2,7 -

вузареРон-Х 0,35 - 1,4 - 4,5 —

дш 0,45 - 1,6 - 5,2 шт

НиЕалрнол 1,1 - 4,6 - 10,0 — -

Рубратоксвн А 1,5 - 7,6 - >10,0

б

Рубратоксин В 3,2 - >10,0 Охратоксин А 8,2 - >10,0

Афлатоксины

(Вг.вх) >Ю,0

одрина и фуразолидона - здесь ростовая реакция позволяла определять в 3,3-200 раз более низкие концентрации. При биотестировании растворов фенола, пикриновой кислоты и хлорофоса различия в чувствительности обеих тест-функций не превышали в среднем 25-50*.

В .целом аналогичная картина, хотя и выраженная в меньшей сте--пени, сохранялась и при других ингибирующих концентрациях ( Ю^ и 1С100).

Из представленных в таблице I антибиотиков и сульфаниламидов тетрахимены наиболее чувствительны к тетрациклину, угнетающему их рост в концентрации 0,063 мг/мл. Примерно в 1,5-2 раза вше устойчивость инфузорий к тетраолеану и гентамицину, и в еще большей степени - к стрептомицину и пенициллину. Стрептоцид и тримеразин является для тетрахимен наименее токсичными соединенны®. Сравнительная оценка чувствительности обеих тест-функций показывает, что в отношение пенициллина она практически одинакова; при индикации стрептомицина поведенческая реакция позволяет определять примерно в два раза более низкую минимальную ингибируащую концентрацию, чем-ростовая" (при бояае высоких концентрациях эти различия несущественны),^ в отношение стрептоцида она, наоборот, оказалась в два раза менее чувствительной.

В целом моляо отметить довольно высокую устойчивость инфузорий к изученным препаратам, на несколько порядков превышающую таковую бактерий (Навашин С.М., 1974), что объясняется специфично^ отью дапных лекарственных веществ.

Из микотоксинов тетрахимены наиболее чувствительны к ворру^ карину, даацетокеиспирленолу, роридину и Т-2 токсину, котэрьо начинают подавлять роот клеток в ионцзктрации 0,01-0.02 мкг/мл. Несколько вше минимальная ингибирукгцая концентрация трихотбцрда ' (0,03 мкг/мл), затем следуют патулин, $узаренон-Х и Д® (сотгот-0ТЕ9НН0 0,15, 0,35 я 6,45 мкгДш). Аналогичный показатель для на-валенола, зеараюкона и рубратоксяна А составлял 1,1-1,5 мир/зд, пеяицклловой клелогы и рубратоксина В - соответственно 3,0 л 3,2

мкг/мл. Наиболее устойчивы тетрахимены к охратоксину А (Ю^ » 8,2 мкг/мл) и афлатоксинам Bj a Gj (ICmjjj >10 мкг/мл).

По влиянию на поведенческую реакцию инфузорий мико^гоксинн располагается следующим образом (в порядке увеличения )■ -патулик, роридин А, веррукарин, диацетоксисцирпенол, Т-2 токсин,-пеницилловая кислота и зеараленон: 1Сд£П для них находится в пределах от 0,001 до 1,35 мкг/мл. Данная тест-функция более чувствительна, чем ростовая реакция, при обнаружения Минимальных ин-гибирупцих концентраций пеницилловой кислоты и патулина (соответственно в 3,6 я 150 раз) и примерно равна ей а отношение роридина и зеараленона. Другие микотоксины (диацетоксисцирпенол, веррукарин, Т-2 токсин ) оказывали минимальное ингибирущее воздействие на поведенческую реакцию в более высоких концентрациях, чем на ростовую (соответственно в 0,5, 2 а 25 раз)«

Что касается концентраций, вызывающих 50£-е ингибирование данных тест-функций, то они оказались приблизительно равными лишь в отношение зеараленона. Для других микотоксинов ах концентрации, влияющие на хемотаксис инфузорий, были в 3-83,3 раза выше, чем подавляющие рост тетрахиыен. Аналогичная картина наблюдалась а в отношение показателя ICjqq.

Несмотря на различия в чувствительности поведенческой и ростовой реакций, в целом эти тест-функции являются тесно взаимосвязанными (табл. 2). Для солей металлов коэффициент корреляции наиболее высок при концентрациях, ингибируицих показатели на 50 a 100£ (соответственно 0,94 a 0,79); при он носа* умерен-

ный характер (г =0,44), что объясняется существенным различием в чувствительности ростовой и поведенческой реакций в, как следствие, большим разбросом цифровых значений. В отношение органических и ряда других соединений взаимосвязь тест-% цкций была высока при всех ингибирувдих концентрациях (г »0,77-0,89)♦ Сходные данные получены и при биотестировании микотоксинов; что касается антибиотиков я сульфаниламидов, то высокая степень корреляции (г «0,99) проявлялась лишь при минимальной ингабирущей концентрации, в то время как при IC^q эта взаимосвязь носила умеренный характер (г =0,33), что может объясняться, наряду с неодинаковой чувствительностью данных тест-функций, главным образом малым числом изученных соединений, не позволившим получить более представительные результаты.

В целом в отношение всех исследонанн-я веществ взаимосвязь поведенческой в ростовой реашь* била высокой (г = 0,71-0,89),что свидетельствует об общности проявлений жизнедеятельности инфузорий.

Таблица 2

Взаимосвязь поведенческой и ростовой реакций тетрахимен

Тестируедае •вещества Ингибируюцие концентрации и показатели корреляции

ICmin ; -1С50 1С100

г и« I г Г i Ш-- г г - а

Соли металлов (и * 16) 0,44 0,048 0,94 0,027 0,79 0,094

Органические и другие соединения ( п = 19) 0,89 0,049 0,81 0,083 0,77 0,097

Антибиотики и сульфаниламиды 0,99 0,011 0,33 0,520

Микотоксины (п«7) 0,66 0,210 0,93 0,063 - -

Все вещества (й » 45) 0,89 0,032 (Р<0,01) 0,73 0,072 (Р< 0,01) 0,71 0,076 (Р< 0,01)

Математически ее можно выразить в виде следующих формул (при различных ингибирупцих концентрациях):

а) lg ICiain (Рос») " 0.75 + 0,714 lg IC^jj (повед.);

б) lg ICgQ (рост) - 0,952 lg 1С50(повёд.);

в) lg ICIC0 .(рост) = lg 1С100(поввд.).

Данные формулы можно использовать для ориентировочной оценки влияния различных соединений на рост инфузорий на основании измерения величины поведенческой реакции; в то же время, ввиду специфики хемотаксиса,получаемый прогноз в известной мере носит условный характер и может существенно отличаться от фактического результата.. '

Сравнительная опенка параметров токсичности различных веществ для инфузорий и крыс

Установленные нами для тетрахимен параметры токсичности (ин-гибирупцие концентрации) 21 соединения сравнивали с их LDgg при впутрижелудочном введении крысам. Количественные значения ЬБэд, взятые из литературных источников (Вредные вещества в промышленности. Л., 1976; Микотоксины. ВОЗ, Еенева, 1982; Шамшурин А.А., Кри-ммер М.З. Физико-химические свойства пестицидов. М., 1976), составляли (от/кг живой массы): для перманганата калия - 750, сульфата железа - 533, нитрита натрия - 200,5, нитрата калия - 3540, карбо-

ната лития - 553, карбоната таллия - 15, сульфата меди - 450, сульфата калмия - 60, хлорида кобальта - 80, фенола - 512, хлороформа - 1750, ацетонитрила - 3800, этанола - 8500, резорцина -239, фурацилина - 600, даметилфльфоксида - 24000, цаодрина - 35, хлорофоса - 630, МВБ - 80, диацетоксисцирпенола - 7,3, Т-2 токсина -3,8. Количественные значения Ю50, как можно заметить, в целом сопоставимы с величинами ингабирувдих концентраций, выраженными в мг/л среды, а для многих соединений (перманганат калия, сульфаты меди~и железа, нитрит натрия, ацетонитрил, резорцин и др.) они близки и в абсолютном значении, в особенности при сравнении Ьр^о с концентрациями, подавляющими ростовую реакцию инфузорий.

Сравнительная оценка данных параметров показала высокую степень их корреляционной связи. Так, коэффициент корреляции между Юзд и концентрациями * угнетающими рост тетрахимен (1<эдП , 1С1(Ю) равнялся соответственно 0,99, 0,94 и 0,77; между Ю^ и аналогичными концентрациями, ингибируицими хемотаксис - 0,99, 0,98 и 0,91, что свидетельствует о сходстве токсико-биологической реакции инфузорий и крыс.

Разумеется, не все.существующие токсиканты могут в одинаковой степени угнетать жизнедеятельность тетрахимен и высших животных, поскольку видовые отличия неизбежно будут оказывать на это влияние, что наблюдается даже среди высших организмов (Гуськова Т.А., 19в5{ Трахтенберг И.М. с соавт., 1991, и др.). Тем не менее полу- • ченныа данные подтверждают возможность межвидовой экстраполяции результатов исследований (Курбацкая З.А., 1985; Этлин С.Н. с соавт.; 1987; "ГовЫока I. еЪ а1„ 1985, и др.) и могут применяться с целш ориентировочного определения параметров токсичности различных веществ для высших животных.

Наш выведены соответствующие математические формулы, отражающие представленную на рисунке I взаимосвязь мезду ингибаругацими концентрациями (1С) и показателем 10^. При расчетах для получения более стабильных-и близких к фактическим значений П^ предпочтительнее брать в качестве критерия ростовую реакцию тетрахимен (формулы 1-3), которая является интегрированным выражением протекапцих в клетке обменных процессов* при использовании поведенческой реакции целесообразно применять концентрации, ингибирух>-яие дашдгю тест-функци» на 50 и 100^ ('формулы 5 в 6).

Ряс; I. Взаимосвязь логарифмов ДОзд и 1С

( - ростовая реакция;

----- поведенческая реакция)

1. 1в ЬОвд = 1,67 + 0,588 Ю^ь

(р= 0,99; т^ = 0,031; п = 21; Р<0,01)

2. 1& Шэд = 1,20 + 0,625 1в 1С5о

(г . 0,9<. = 0,025; п = 21; Р<0,01)

3. Ю^ = 0,36 + 0,756 1С100

( 0,77; *г = 0,091; п. - 21; Р<0,01)

4. 18 Ы)^ = 1,87 + и,455

( г = 0,99; т*. = 0,0004; п = 21; Р<0,01)

о. 1Б 1Г50 = 1,38 + 0,450 1е Ю^

(г = С,£8; Йг = 0,006; П = 21; Р<0,01)/

6. 1В Ю50 = 0,15 + 0,787 1Е 1С1СС

( г= 0,01; ш-; = 0,03; п = 21; Р<0,С1}

Корреляционная связь показателей биологической ценности продуктов и кормов в опытах на инфузориях и высших кнвотшдс

Результаты биологической оценки различных продуктов питания и кормовых средств на тетрахим^нах и лабораторных животных (кры- • сах и цыплятах) представлены в таблице 3.

Из приведенных данных видно,, что показатель ОБЦ, характеризующий ростовую (генеративную) реакцию инфузорий, имел высокую степень корреляции с такими важнейшими параметрами биологической ценности, как коэффициенты эффективности и использования белка (КЭБ, КИБ), которые являются общепризнанными критериями его биологического качества и имеют официальный статус (АОАС, 1975). Эти показатели также отражают анаболическую (росто-весовую) эффективность протеина, что свидетельствует о сходстве основных обменных процессов у инфузорий и высших животных, связанных с его утилизацией в организме. В отношение других изученных наш физиологических и биохимических параметров биологической ценности (табл. 4) высокая степень их корреляции с ОБЦ (как, впрочем, и с КЭБ и КИБ) наблюдается лишь в том случае, если они отражают интенсивность белкового обмена (прирост массы тела, потребление корма, концентрация общего белка и мочевины в сыворотке крови, содержание сухого вещества и азота в печени, и др.) , а также протеолитическую доступность белков (перевар^/лсть "in vitro"). В меньшей степени выражена корреляционная связь между ОБЦ и уровнем холестерина и jl-липопротевдов в сыворотке крови, который в существенной мере зависит от происхождения и особенностей состава потребляемых продуктов. Что касается аминокислотных показателей, то в данном случав их низкая взаимосвязь с биологической ценностью белка объясняется как малым коли- • чеством изученных кормовых средств, не позволившим получить более достоверные результаты, так и теп», что анаболическая эффективность определяется не только содержанием аминокислот, но и рядом других факторов, в частности, влиянием различных пищевых компонентов (ли-падов, углеводов и др.) , степенью атакуемости белков протеолити-ческими ферментами, наличием биологически активных веществ, структурой белковой молекулы, количеством в ней функциональных групп и т.д. (Абрамова Е.П., Черников. М.П., 1964; Беспалов А.Н., 1971; Шаблкй В.Я., 1974; Еуравская Н.К.,1980; Высоцкий З.Г. .Тулвльян В.А., 1987; Горлков А.И.,1990, и др.). Прогнозировать эффект их слозяого взаимодействия на основании результатов физико-химического и биохимического анализов крайне затруднительно; его мочно выявить лтаь пгк биологической оценке на кивом организме, в том числе и

Таблица 3

Результаты биологической оценки продуктов и кормов на инфузориях и высших животных (М+а)

Показатели биологической ценности

Исследуемые продукты : сш, в % :к казеину ;(инфузории) КЭБ ШБ,%

I : 2 3 4

Опыты на кшсах

Казеян 100,0 2,77+0,07 74,4+0,7

Пшеница 53,8+0,8 1,57^,05 60,0+0,9

Яйцо (цельное) 125,0+0,7 3,31+0,09 78,МД

Свинина 146,0+1,1 3,92+0,08 77,3+0,7

Говядина 140,0+0,6 3,59+0,10 76,9+0,8

Баранина 117,0+0,5 3,13+0,05 78,0+0,5

Мясо кур 106,0^3,7 2,88+0,07 . 75,З5).3

Печень (говяжья) 120,0^3,9 3,00+0,07 75,4+0,8

Печень (свиная) 117,0^3,8 2,89+0,06 76,5+1,0

Творог (свежий) 135,2+1,1 2,645), 06 72,15>, 4

Творог (свежезамороженный) 124,1+1,3 2,56^0,04 71,4+2,1

Творог (замороженный, 2,42+0,08 70,6+1,3

хранившийся) 118,3+0,8

Творог (сублимированный, свежий) 115,9+2,0 2,43+0,07 70,0+1,2

Творог (сублимированный, хранившийся) III,3+1,2 2,34*0,09 72,0+1,0

Колбаса ("Отдельная") 98,7+1,3 2,875), 09 77,9+0,9

Колбаса с 2% соевого изолята 87,0^0,6 2,45+0,12 63,9»0,8

Колбаса с 2% соевого концентрата ' 91,94:1,1 2,77+0,11 67,7*0,9

Колбаса с 2,5% соевого концентрата 90,4+0,5 2,57*0,08 66,3+0,5

Колбаса с 2$ соевой муки 86,0+0,6 2,49+0,11 61,9+0,5

Колбаса с 3,3% соевой муки 78,1+1,0 2,475),08 60,1+0,6

Говядина (лиофилизированная) 132,0±1,2 3,5с5),08 75.С+0.8

Говядина (лиойилизированная, хранившаяся при +40СС) 74,0+0,7 1,95+0,09 7С.2Щ0.4

Говядина (лпо^илизкроЕаннач, хранившаяся при +20°С) 108,0+1,1 2,61+0,10 73,4+0,3

Говядина (лио^иллзихюванная, хрспнвиаяся при -Ю°С) 117,0*0,8 3,18+С,С7 74,0+0,2

Треска 97,0+0,7 2,475^, 09 68,3+0,5

I : 2 ; : 3 4

Молоко (свежее) 120,4+0,7 3.2С+Р.06 80,5+0,5

Молоко (пастеризованное) 113,0+1,3 3,08+0,08 77,4^0,6

Молоко (стерилизованное) 97,0+0,8 2,70+0,07 75,(¿0,2

Ячмень 58,9+1,3 1,7040,05 62,14р.4

Рожь 56,4+0,8 1,52^0,08 60,4^0,6

Овес 72,4±1,8 2,11^3,06 С4,5+1,1

Кукуруза . 40,1+0,9 1,20+0,11 56,3+0,9

Рис 53,7+1,2 1,5040,07 58,240,7

Просо 30,6±1,1 1,Ю±Р,09 54,6+1,2

Дрожжи кормовые (цельные) 41,1*1,3 0,92+0,08 46,140,9

Дрожжи кормовые (деструктат) 63,511,6 1,42*0,07 51,34;1,2

Бактерии кормовые (цельные) 63,940,9 1,58+0,05 58,4±1,1

Бактерии кормовые (деструктат) 77,9+1,6 2,0710,07 65,(^1,3

Хлорелла (естественная сушка) 19,94:1,7 0,36+0,05 34,2£,0

Хлорелла (распылительная 20,8+1,2 ■36,4±1,2

сушка) 0,35+0,06 .

Хлорелла (паста) 58,8±1,4 1,30+0,04 35,4+1,3

г 0,94 0,87

0,018 • 0,038

• а 41 41

Р ¿0,01 ¿0,01

Опыты на цыплятах

Казеин 100,0 1,83+0,06 60,4±1,1

Яйцо (цельное) 125,0±1,5 2,02^0,08 66,8^0,6

Пшеница 58,2+0,6 I,47^0,08 35,6^0,4

Дрожжи кормовые (цельньз) 41,1±1,3 0,87+0,05 34,4^0,7

Дрожжи кормовые (деструктат) 63,5+1,6 I,27^0,10 39,540,4

Бактерии кормовые (цельные) 63,9±0,9 1,16^0,09 38,¿0,5

Бактерии кормовые (деструктат) 77,9+1,6 1,60+0,09 44,3^0,8

Хлорелла (сухая) 19,9+1,7 0,3540,06 22,1^3,6

г п,95 0,98

% 0,035 0,011

и 8 8

р <¿0,01 < 0,01

Таблица 4

Корреляционная связь ОЕЦ с физиологическими и биохимическими показателями качества белка

Показатели • : г • * ™ - : : : п

КЭБ 0,94 0,018 41

ИКЗБ 0,82 0,088 14

КИБ 0,87 0,038 41

Прирост массы тела 0,97 0,018 II

Потребление корма (белка) 0,94 0,035 II

Содержание в сыворотке крови:

общего белка 0,93 0,042 10

холестерина -0,62 0,195 10

>-липопротеидов , -0,64 0,187 10

мочевины -0,83 0,098 10

Липопротеидно-холестериновый индекс -0,34 0,279 10

БЦ по мочевине 0,83 0,098 10

Сухое -вещество печени о.ёз 0,042 10

Азот печени 0,98 0,012 10

Отношение азота печена к азоту потребленного корШ 0,96 0,025 10

Отношение массы печени к массе тела -0,73 0,147 10

Переваримость в1п VI гго " 0,86 0,087 9

Сумма ашнокислот 0,45 0,325 6

Сумма незаыенг...шх аминокислот 0,49 0,310 6

Отношение суммы незаменимых аминокислот к общему, азоту 0,46 0,394 4

Отношение судаы незаменимых аминокислот х заменимым 0,47 0,390 4

"Химическое число" 0,55 0,285 6

Щ по Озеру 0,49 0,310 6

модельном, каким является инфузория Тетрахимена пириформис.

Графически взаимосвязь между ОБЦ и коэффициентами эффективности и использования белка представлена на рисунках 2 и 3. Исходя из полученных данных, наш шеедены соответствующие математические формулы, дающие возможность ориентировочного определения показателей КЭБ и ККБ для крыс и цыплят на основании результатов биологической оценки на инфузориях, что имеет как теоретическое, так и практическое значение.

Рис .2. Взаимосвязь показателей ОЕЦ и КЭБ

1. КЭБ (крысы) в 0,0266 ОЕЦ

2. КЭБ (цыплята) ■ 0,0X92 ОБЦ

Рпс.З. Взаимосвязь показателей СЕ! я КИБ

1. КИБ (1фысы) = 39 + 0.3С7 ОЩ

2. КИБ (цшлята) = 11,5 + 0,. 135 ОШ

Практическое использование ускоренных методов биологической опенки

Определение токсичности микроскопических грибов, поражающих зернофураж. Для этих целей, как правило, используются белые мыши и кролики; применение инфузорий, наряду с сокращением сроков анализа, позволяет существенно уменьшить количество лабораторных животных без ущерба достоверности получаемых данных.

В качестве примера приводим результаты определения токсичности грибов рода Фузариум, которое осуществлялось на белых мышах (введение экстракта в желудок) и кроликах (кожная проба)*, а также на тетрахрченах по разработанному нами ускоренному методу, основанному на определении выживаемости инфузорий в среде, содержащей исследуемую биомассу гриба (или его экстракт) в течение 3-х часов.

Из 89 изученных штаммов токотвши для тетрахимен оказались 64 (71,9£ от общего числа), для мышей - 53 ( 59,6^) для кроликов (с учетом сомнительных результатов) - 31 (34, с$). Штамш, токсичные для мышей, почти во всех случаях (в 51 из 53) были токсичными а для инфузорий, что составляло 96,2# (оставшиеся два штамма давали сомкителыше результаты анализа на мышах и отрицательные -на кроликах). Из 31 штамма, давшего положительную реакцию при постановке кожной пробы, 30 были токсичными и для инфузорий (96,8;?), что свидетельствует о практически полном совпадении результатов анализа (оставшийся штамм в опытах на кроликах давал сомнительный результат).

Таким образом, использование тетрахимен позволило обнаружить практически все штаммы, токсичные и для высших организмов, и почта на треть (на 28,15?) сократить объем дальнейших исследований на лабораторных животных, а также выявить больше токсичных штаммов, чем при исследовании на мышах и кроликах (соответственно на 20,8 а 106, 5%), что свидетельствует о более высокой чувствительности данного тест-организма.

Определение биологической ценности продуктов и кошов. подвергнутых различной технологической обработке. Преимущества использования ускоренных методов биологической оценки заключаются в том, что позволяют выбрать оптимальные технологически^ режимы'об-

Исследования на хивотннх проводились в лаборатории миколо-логии к санитарии кормов НПЗЖСГЭ под руководством зав. лабораторией доктора веторинарннх наук Иванова В.Г.

работки, резко сократить время исследований и количество требуемого материала, оценивать качество различных субстратов, в том числе малопригодных для анализа на высших животных (жидких, с низким содержанием белка, и т.д.)

Нами показана возможность применения разработанных методов биотестирования с помощью тетрахимен для.изучения влияния различных способов консервирования (замораживания и сублимации), а также условий хранения на биологическую ценность творога. Установлено, что сублимация, наряду с рядом технологических преимуществ, не оказывает заметного воздействия на качество продукта и позволяет сохранять ее на достаточно высоком уровне на протяжении длительного срока хранения, что подтверждалось и результатами опытов на крысах (табл. 3).

Актуальным является использование биотестовгя методов при оценке искусственных-молочных смесей и ЕЩ, поскольку с помощь» тетрахимен можно сравнить их биологическую ценность с таковой натурального молока и „определить, насколько продукт соответствует своему предназначению, так как сходство химического состава, на основании которого составляется рецептура заменителей; еще не гарантирует соответствия биологического качества. Это подтверждается результатами ваших исследований, которые показали, что анаболическая эффективность большинства искусственных молочных смесей ("Здоровье", "Крепыш", "Малыш") на 18,5-41,05? превосходит таковую женского молока и примерно равнялась коровьему. Подобное положение вряд ли целесообразно, так как форсированное питание в детском возрасте неблагоприятно отражается в дальнейшем на здоровье взрослого организма (Никитин БД., 1961; Епоа е1 а!., 1953; ВаШл Н., 1964, а др.). В то же время многие заменители цельного молока (31Щ предназначенные для кормления молодняка крупного рогатого скота, на 4,4-31,6^ уступала по биологической ценности натуральному коровьему молоку, что также является неприемлемым, поскольку не обеспечивает необходимой интенсивности роста и развития животных. Та-, киц образом, решение данной проблемы возыокно лишь с привлечением методов биологической оценки, давдих возшяность нахождения оптимального состава колочннх смесей.

Этот вопрос крайне актуален и при создании комбинированных продуктов питания, в которых белки животного происхождения частично заменяются растительными. При разработке их рецептур применение биотестовых методов позволяет определить как наиболее полноценный заменитель, так в уровень его включения в состав продукта, не приводящий к снижению качества последнего. Использование высших живо-

тных в данном случае затруднительно из-за большого объема предварительны* исследований п. является целесообразным лишь на последнем этапе работы при биологической оценке готового изделия. Так, при изучении возможности применения соевых белков в качестве заменителей мяса в составе колбас наш с помощью тетрахиыен из 23 соевых препаратов (изолятов, концентратоз, .соевой муки) преимущественно зарубежного производства выбраны наиболее биологически полноценные, определен оптимальный уровень их включения в состав колбас различных сортов, а уже затем проведена биологическая оценка выбранных образцов готового продукта на крысах с изучением росто-ве-совых и биохимических показателей, причем результаты исследований были аналогичны данным, полученным яа инфузориях (табл. 3). Установлено, что при введении соевых препаратов в количестве 2-55 в состав колбас "Чайная" и "Столовая" биологическая ценность последних, в зависимости от используемого заменителя, возрастала на 10,8-22,а при более высоких уровнях замены мяса ча белки сои - снижалась. Е отнесение болез высококачественной колбасы "Отдельная" применение белковых препаратов приводило к ухудшению ее качества пропорционально количеству вводимого в продукт соевого белка.

Таким образом, биотестирование дает возможность находить пути рационального использования сырья в мясной промышленности и предотвращать снижение биологической полноценности готовых изделий, которое может быть следствием технологических режимов их обработки. Так, к примеру, при изготовлении некоторых мясопродуктов предусматривается образование в них мелаидинов как необходимого компонента, создающего специфические органолептическив показатели (цвет, запах, вкус). Данные соединения, прадставяящие собой результат взаимодействия активных • £-аминогрупп некоторых аминокислот Ь зарбонильны&в! группами редуцирующих сахароя, снижают усвояемость протеина в ингибяруют ряд пищеварительных ферментов (Maillard I.C., 1912, 1916;Hodge I.B., 1953;Keynold* TJi„ I963„I9G5). Постольку процесс одлаидинообразования шкет происходить во многих продуктах и кормах зри воздействия на них различных факторов (высокой температуры, влажности, длительного хранения и др.), то применение ускоренных методов биологической опенки для текучего контроля их качества является крайне актуальным.

Нами показано, что тетрахимена отличается внооксЯ чувствительностью к данным веществам. Тал, при биологической оценке явофлэтэи-роваяной говядины пропорционально увеличение содержания в. ней мела-

здинов (что достигалось изменением условий ое хранэния) установлено сшшзнио ростовой решении инфузорий и степени усвоения ими азота (соответственно на 46,4 и 51,4$).. Полученные данные были подтверждены и в опытах на крысах (табл. 3), что свидетельствует о сходстве ферментных систем высших .животных и тетрахимен, связанных с протеолизом и усвоением белков. Поскольку функциональные белковые группы играют важную роль в процессе транспорта аминокислот (Heinz Е., IS6I ), можно полагать, что у инфузорий и-высших организмов наблюдается сходство основных этапов белкового обмена, связанных с транспортом аминокислот через клеточные мембраны и включением их в метаболические процессы организма.

Об этом свидетельствуют и результаты биологической оценки кормовой биомассы одноклеточных (дрохкэй, бактерий, микроводорослей), подвергнутых различным видам деструкции, которая, как показано нами, ведат не Только к разрушению клеточной оболочки и ее органелл, но и к ыякростругсгурным изменениям на молекулярном уровне, сопровождающимся, е частности, возрастанием у деструктатов, по сравнению с цельной биомассой,количества основных функциональных групп протеина (на 14-50$) и, Kai: следствие, повышением его анаболической эффективности. В данном случав биотвотирование занимает основное место при их качественной оценке, поскольку химический состав биомассы и содержание в ней основных пищевых компонентой пря деструкции не меняются. К точу ке на первом этапе исследований, когда необходимо определить наиболее Еффективный с биологической тошж зрения способ клеточного разрушения, количество получаемого дестоуктата может быть незначительным, а число различных вариантов обработки - большим, что затрудняет эксперименты на высших животных.

С помощью биотестовнх методов нами были- определены наиболее эффективные способы клеточного разрушения: для дрожжей - баллистическая дезинтеграция, обработка на кавитационной мельнице и экструзия, -повышающие ОЕЦ соответственно на 87,5, 54,5 и 50,6$; для бактерий - докомпрессионный шок, увеличивающий этот показатель на 21,9$; для микроводорослей (хлореллы) - '.ферментная деструкция, повппающая биологическую ценность биомассы на 23,5-55,8$. Использование тетрахимен позволило тайке установить оптимальней уровень самены протеина ячменя на протеид хлореллы в составе откормочного рациона подсвинков (1С-15$), приводящий к возрастанию ОБЦ ког-гэвоГ: смеси на 60$, г е итоге при проведении опыта на сельскохозяйственных животных получить положительные результаты откорма,

которые'выражались в увеличении прироста их массы (на 12,5$), повышении переваримости (на 6,9$) и усвоения азота (на 18,2$), а также эффективности использования корма и ряде других физиологических а биохимических показателей организма.

Результаты биотестирования послужили основанием для разработки способов деструкции кормовых дрожжей, бактерий и хлореллы, па которые получены соответствующие авторские свидетельства на изобретение 794072 от 08.09.80 г.; » 858722 от 04.05.81 г.; Л 893201 от 01.09.81 г.) .

' Биологическая опенка сырья и продукции с измененными ветери-пашо-санитарными и технологическими качествами. В данном случае применение биотестовых методов позволяет быстро получить информацию о качестве исследуемого продукта, необходимую для решения вопросов, связанных с его технологической реализацией. '

Одним из примеров может служить мясо с измененным рН, значения которого выходят за установленные ветеринарно-санитарными правилами границы (5,7-6,2), характеризующие доброкачественную про- • дукцшо. в то же время, по нашим данным, этим требованиям соответствует лишь 30,0-33,4$ мяса крупного рогатого скота, а 60-70$ его имеет рН в пределах 6,3-6,7. Сходная картина наблюдается и в отношение мяса свиней, рН которого нередко бывает ниже 5,7. Изменения рН могут быть связаны с органолептическими пороками сырья (Р5Е,Ш) хотя этот вопрос является довольно сложным и неоднозначным (Грау Р., 1964; Кальк Э.М., 1969; Мглннец А.И., 1982, п др.).

При изучении мяса крупного рогатого скота нами установлено, что по мере возрастания его рН с 5,33 до 6,69 увеличивается и биологическая ценность - на 7,4-20,7? (г = 0,83-0,96), что может объясняться лучшей протеолитической доступностью белков при той степени автолиза, которая соответствует более высоким значениям рН, а также меньшими потерями водорастворимых белков. Проведенные нами исследования качества быстрозамороженных комбинированных полуфабрикатов в связи с характером автолиза мясного сырья показали, что продукты, изготовленные из мяса с высоким рН, на 17$ превосходили по биологической ценности полуфабрикаты из мяса с более низким рН, а при варке это различив возрастало до 38$. Кроме того, экспериментально было подтверждено также увеличение сроков качественного хранения замороженных полуфабрикатов с разным уровнем замены мяса белково-молочными концентратами, соевым изолятом и комбинацией указанных белков, если эти полуфабрикаты изготовлялись

из мяса с высоким рН.

Более сло.тлой задачей является технологическая реализация мяса с низким рH (5,2-5,5), которое часто встречается у свиней (т.н."экссудат1!Вное" мясо) и характеризуется низкой влагоудержи-вагацей способностью, грубо" волокнистой структурой и специфическим запахом. Нами изучена возможность использования такой свинины для лзготовленгл ветчины в форме с применением различных добавок (гндролизатов соединительной ткани, Леркенткых препаратов, стабилизированной пищевой крови), оптимальная концентрация которых в продукте устанавливалась на основании его органолептических показателей, к биологической ценности. Установлено, что лучшим вариантом является стабилизированная пищевая кровь, существенно улучшающая органолептику готового изделия. С помощью бкотестирования была определена оптимальная концентрация этой добавки в рассоле (5*), повисающая ОБЦ ветчины на 12,5приближающая ее к таковой продукта из нормального мяса; более высокий уровень вводимой крови (10 к 153) приводил к ухудшению качества изделия. ' "

Небезынтересно отметить, что усвояемость белков самой крови довольно низкая (ОЕЦ составляет 23,2$ по сравнению с казеином), в то время как ее сочетание в определенных пропорциях с экссудатив-нол свининой приводило к возрастанию биологической ценности продукта с 70,3 До 79,1%. Этот обогатительный эффект может быть связан с улучшением качественного состава белков мяса, которое, в частности, характеризуется пониженным содерканиач миоглобина (Ra-nelic 0..et al.,1965), а так.;е обусловлен влиянием различных компонентов крови (микроэлементов.и др.).

Крайне ваглш является использование бпотестирования при пс-следованип мясопродуктов, содержащих остаточные количества фармпрепаратов. Связано это с тем, что при их биотрансформации в организме могут образовываться более токсичные, чем исходное вещество, соединения, не обнаруживаемые существующими физико-химическими методами анализа, которые не позволяют к тому же судить о степени токсичности метаболитов.

Так, к примеру, нами установлено, что если нативный фуразо-лидон начинал иигибировать рост тетрахимен при содержании в среде 0,00035 мг/мл (табл. I), то остатки препарата в печени кроликов оказывали аналогичное действие в концентрации 0,000011 мг/мл, то есть в 30 с лишним раз более низкой. Совершенно очевидно, что такая резко возросшая токсичность может быть связана с биотрансформацией фуразолпдона, которая , в частности, сопровождается

восстановлением нитрогруппы у фурзносого кольца до аглиогруппы ■ и ее последующим ацетилированиемх.

В то же время некоторые фармпрепараты (например, трашеви-лизаторы) рекомендуется использовать не только в лечебных целях и при различных технологических .операциях, но и для снижения потерь массы жиеотных при их транспортировке на мясокомбинаты, в результате чего продукты убоя могу г представлять потенциальную опасность для здоровья потребителя. Так, нами установлено, что мясо кур, получавших для снятия транспортного стресса аминазин и содержащее остаточные количества этого препарата (0,1-0,3 мг/кг ткани), подавляет ростовую реакцию тетрахимен на 15-205 по сравнению с контролем. Данная концентрация транквилизатора может сохраняться в органах и тканях животного в течение нескольких дней, что сви-г детельствует о недопустимости его применения за 1-2 суток поред убоем.

Чувствительность биотестового метода с использованием инфузорий в этом случае была сопоставима с таковой метода ТСХ (Гри- . шина Т.В., 1978), определяющего минимальный уровень аминазина в количестве 0,2-0,3 мг/кг ткани.

Различные фармпрепараты (антистрессовые, стимуляторы откорма И лактация, и др.) могут содержаться и в поступающих в нашу страну импортных мясопродуктах. В то же время в отношение такого сырья контроль, как'-правило, ограничивается общепринятыми методами определения качества, которые не дают ответа на вопрос о его биологической полноценности. Использование биотестирования позволяет восполнить этот пробел, что имеет непосредственное практическое значение. Это видно из результатов проведенного нами с помощью тетрахимен исследования импортного мяса (говядины, баранины, свинины, мяса бройлеров), поступившего из различных стран-производителей (ЖГ, Дании, Голландии, Венгрии, Франции, Румынии, Ирландии, Австралии). Установлено, что в целом его биологическая ценность была на 3,0-13,1/5 ниже, чем' отечественного мяса,и в лучшем случае лишь приближалась к нему. Нередко отличались внешний вид сырья (обильное содержание жира, его характерное распределение и цвет, полное отсутствие остатков оперения на тушках бройлеров), а также органолептпческие показатели мяса и бульона при варке. Причиной этого могут являться специфические условия содержания и кормления

х Количественное определение содержания фуразолидона в тканях проводилось кандидатом ветеринарных наук Карнауховым В.В.

животных, в частности, применение различных анаболических препаратов, нейролептиков, специальных премиксов и кормовых добавок, о чем в больхшстпе случаев мы имеем сауое ограниченное представление. В такой ситуации мзксж,куплю информативными могут быть лишь биологические методы опенки качества продукции, позволяющие прогнозировать се возможное неблагоприятное действие на здоровье потребителя.

Представляет несомненный интерес использовглие биотестирова-1шя при изучении продуктов гхвотноводства и кормов, получаемых в зонах радиоактивного загрязнения, поскольку этот вопрос практически не изучен. Нами с помощью тетрахилен проведена биологическая оценка мяса крупного рогатого скота, выращенного в такой зоне (Ветковскии район Гомельскол обл.) и получавшего рационы с суммарной активностью 2-3 • 10"^ ки.х Результаты исследований показали, что данное мясо, удельная радиоактивность которого составляла от 6,6 • I0"0 до 1,5 • Ю~7 ки/кг (82,5-187,5$ от ВДУ), по всем общепринятым взтерпнарно-санитарним показателям (pH, амино-ашиачный азот, реакция с сернокислой медью и на пероксидазу, формольная проба, органолептика мяса и бульона) соответствовало доброкачественному продукту; в то же время оно проявляло зазлетное ингибирую-щее действие на рост инфузорий, снижая его на 14,2-32,0$. При даче животным карбоната лития и жолезистосинеродистого калия с целью снижения уровня радинуклидов в организме наряду с их выведением происходило повышение биологической ценности мл са на 20,6$ по сравнению с мясом животных, не получавших солей, однако и в этом случае оно уступало контрольноцу (не содержащему радионуклидов) в среднем на 18$.

Хотя этот вопрос требует более углубленных исследований с привлечением дополнительных методов ан&чиза и изучаемых показателей, тем не менее получрчные результаты свидетельствуют о'-ваяно— сти данной проблемы как в плане безопасности получаемых продуктов питания и кормовых средств, так и биологической обоснованности существующих ВДУ.

Биотестирование объектов окружающей среды. Кроме пищевых и кормовых продуктов, разработанные нами ускоренные биотестовые методы могут использоваться и при оценке безвредности

х Опыты на животных и радиологические исследования проводились сотрудниками Гомельского филиала НШСХР.

различных объектов окрукаицей среды, являющихся предметом ветери-нарно-санитг.рного и экологического контроля. Показана возможность применения данных методов при биотестировании природннх и сточных вод, почвы, полимерных и строительных материалов. Так, хзмотакси-ческая реакция инфузорий оказалась весьма чувствительным показателем при исследовании речной воды, причем несмотря на то, что содержание в ней различных ксенобиотиков (нефтепродуктов, фенола, солей тяжелых металлов, хлорорганических пестицидов, детергентов) было на 1-3 порядка ниже ДЦК, изученные пробы оказывали слаботскси-ческое действие на инфузорий, а в некоторых случаях-итоксическое. Это может объясняться как комплексным влиянием ксенобиотиков, так и возможным наличием в воде неидентифицированных токсикантов.

С помощью биотестовых методов установлена взаимосвязь степени токсичности водных вытяжек аз почвы и характера антропогенного загрязнения. Показано, что образцы почв, находящиеся в непосредственной близости к автомобильной и железнодорожной магистралям, в местах хранения нефтепродуктов и заправки сельскохозяйственной техники оказывали преимущественно слаботоксический эффект на поведенческую реакцию простейших, а почвы, расположенные в районе хранения, минеральных удобрений, химических средств защиты растений и дезинфектантов в большинстве случаев полностью ингибировали данную тест-функчию.

Установлена высокая чувствительность разработанных нами биотестовых методов при. определении токсичности сточных вод сельскохозяйственных и промышленных предприятий (животноводческих комплексов, мясокомбинатов, заводов микробиологического синтеза), а также различных строительных и полимерных материалов (фосфогипса в фенолформальдогидной и эпоксидной смолами, многослойного пластика, многослойного пластика с латексом, битума), причем результаты экспериментов на тетрахяменах коррелировали с данными, полученными на рыбах-гуппи (Аббасов Т.Г.).

Экономическая э^ктизгость использования ускоренных :лото:тсп биологической оттенки

Расчет проведен в соответствии с существующей петодаг.ой цо сравнению с общепринятыми методами на белых крысах по следующим параметрам - затрате времени труда на исследование; затрате на оплату труда работникам лаборатории; затрате на ириобрзтонпа ги-сотных, продукты и реактивы; затрате на амортизацию и текущий ремонт оборудования; прочих прямых расходов; нахигаднкх расходов

(при расчете использованы цены, суиествовавшие до 1 мая 1991 г.).

Результаты расчетов показали, что стоимость проведения одного анализа на тетрахимонах в 5,5 раз дешевле, чем на крысах (соответственно 11,6 и 63,99 руб.). Кроме того, методы с использованием инфузорий позволяют в 7-10 и более раз быстрее получать необходимую информацию. Практическое применение ускоренных методов биологической оценка дает годовой экономический эффект в расчете на одну ветеринарную лабораторию с годовым объемом исследований 100 проб на сумму 5400,7 руб.

ВЫВОДЫ

1. Инфузории Тетрахямена пириформис являются универсальным тест-организмом, пригодным для изучения как безвредности, так и биологической ценности кормов, продуктов животноводства и объектов окружающей среды." Разработаны соответствующие ускоренные метода биологической оценки с использованием в качестве тест^функ-ций различных показателей жизнедеятельности инфузорий.

2. Определены методические подходы к проведению анализа, позволяющие регистрировать поведенческую (хемотаксическую) реакцию тетрахимен с помощью специализированного импульсного фотометра "Биотестер-2" и применять ее при оценке токсичности жидких сред. С08дая биотестовый прибор "Биотестер-Н" с расширенными функциональными возможностями в повышенной чувствительностью, позволяющий использовать в качестве тест-организмов инфузорий двух видов (тетрахимен и парамеций) и исследовать окрашенные, мутные и непрозрачные среды.

3. Разработан ускоренный метод определения биологической ценности продуктов в кормов с помощью тетрахнмен, основанный на применения простых отечественных реактивов, отличающийся дешевизной, высокой производительностью в информативностью, а также доицид результаты анализа, аналогичные получаемый общеприняты« методом

(х = 0,95).

4. Установлена возможность использования тетрахвмея в качестве тест-организма в автоматизированной аналитической системе "аюскрен" * определеня методические условии проведения иссладо-вапй. Показав* сопоставимость результатов, полученных автошяю-ройшшш ■ обычным методами яр* хндмсапп солей тяжелых металлов, фешыюа, мпсотоксяяов.

5. Шявлева высокая чувствительность инфузорий к ряду вещеотв,

имеющих ветеринарно-санитарное и экологическое значение (солям тяжелых металлов; микотоксинам, некоторым органическим соединениям, фармпрепаратам и продуктам их биотрансформации, и др.)» что позволяет использовать тётрахимен для их обнаружения в кормах, продуктах питания и объектах окружающей среды.

6. Показано, что чувствительность ростовой и поведенческой реакций инфузорий к различным веществам неодинакова и может отличаться на. несколько порядков; в то же время между характером изменений данных тест-функций существует высокая корреляционная связь (г = 0,77-0,99), свидетельствующая об общности проявлений жизнедеятельности тётрахимен. Определены ксенобиотики естественного и антропогенного происхождения, для индикации которых целесообразно применять ту или иную реакцию простейших.

7. Установлена высокая корреляционная связь параметров токсичности различных веществ для тетрахимен и белых крыс (г = 0,770,99), что позволяет использовать результаты биотестированкя на инфузориях с целью ориентировочного определения показателя , XX) выведены математические формулы, которые можно применять для соответствующих расчетов.

8. При биологической оценке кормов и продуктов питания на инфузориях и лабораторных животных (крысах и цыплятах) установлена высокая положительная корреляционная связь ростовой реакции тетрахимен с физиологическими и биохимическими показателя!® качества белка, определяемыми на высших животных - коэффициентами его эффективности и'использования, приростом массы тела, потреблением корма, уровнем общего белка в сыворотке кровп, содержанием сухого вещества и. азота в печени, а также переваримостью белков

Пз.п у1Ьго" (г = 0,82-0,98); высокой являлась отрицательная корреляционная связь ростовой реакции инфузорий' с 'содержанием мочевины в оыворбтке крови (г = -0,83), заметной - с уровнем холестерина и )-липопротеидов (г равнялся соответственно -0,62 и -0,64). Выведе-ш математические формулы для ориентировочного расчета показателей 1ЭБ и КИБ на основании результатов биологической оценки на тетра-сименах.

9. Сходство метаболической реакции инфузорий и высших организмов на токсические вещества, а также белковые продукты и корта, взаимосвязь и аналогичная направленность изменений различных оказателей жизнедеятельности тетрахимен (ростовой я поведенческой «акций, размера клеток, степени эффективности и утилизации азота, лительности жизни популяции, и др.) свидетельствуют о допустимо-

ста межвидовой экстраполяции результатов биотестирования и возможности их использования в практике токсикологических и биологических исследований на высших животных.

10. Показана высокая информативность и эффективность применения разработанных нами биотестовых методов при определении токсичности микроскопических грибов, поражающих зернофураж; изучении влияния технологий обработки и условий хранения на качество мясных и молочных продуктов; выборе оптимального состава искусственных молочных смесей и заменителей цельного молока; сравнительной оценке различных белковых препаратов из сои и нахождении оптимального уровня их включения в состав колбасных изделий; поиске путей технологической реализации мяса с измененным рН; выборе наиболее аффективных способов деструкции кормовой микробной биомассы одноклеточных и определении оптимального уровня ее добавки к откормочному рациону сельскохозяйственных животных; изучении безвредности мяса и мясопродуктов, содержащих остаточные количества фармпрепаратов; определении качества импортного мяса; биологической оценке мяса, получаемого в зонах радиоактивного загрязнения. Во всех случаях при использовании в экспериментах высших животных <крыс, цыплят, мышей, кроликов) получено совпадение результатов анализа.

11. Применение ускоренных методов биологической опенки позволило установить токсический эффект комплексного загрязнения воды различными ксенобиотиками, уровень которых не превышал ЦДК; определить взаимосвязь степени токсичности почвы и характера ее антропогенного загрязнения; выявить токсическое действие некоторых полимерных и строительных материалов.

12. Расчет экономической эффективности применения ускоренных методов биологической оценки на тетрахименах показывает, что они позволяют получать необходимую информацию в 5,5 раз дешевле и в 7-10 и более раз быстрее, чем при использовании для этих целей

< высших животных (белчх крыс).

13. Результаты проведенных исследований свидетельствуют о целесообразности широкого внедрения ускоренных методов биологической оценки в практику ветеринарно-санитарного и экологического контроля качества кормов, продуктов животноводства и объектов окружающей среды, а также о перспективности дальнейшей разработки теоретических и практических аспектов данной проблемы.

практические лредлошия

I. Методические рекомендации по биологической оценке продуктов животноводства и кормов с использованием тест-организма Тетрахимена пириформас. (Утверждены ВАСХНИЛ. М., 1977).

2» Применение реснитчатой инфузории для качественной экспресс-оценки технологий пищевых и кормовых продуктов в условиях Крайнего Севера (рекомендации). ( Утверждены НИИСХ Северного Зауралья. Тюмень, 1979).

3. Методические рекомендации по определению биологической ценности сельскохозяйственных продуктов. (Утверждены ВАСХНИЛ. Пкное отделение. Киев, 1981).

4. Методические рекомендации по биологической оценке кормов и продуктов с использованием в качестве тест-организма цыплят. (Утверждены ЙАСХНИЛ. йшо'е отделение. Киев, 1983),

б. Методические рекомендации по использованию инфузорий Тетрахимена пирифорыис для токсико-биологической оценки.сельскохозяйственных продуктов. (Утверждены ВАСХНИЛ. Ккное отделение. Киев, 1983).' ;

6. Методические рекомендации по повышению качества продуктов убоя свиней, выращенных по промышленной технологии. (Утверждены ВАСХНИЛ. Шнов отдаление. Киев, 1985).

7. Методические-рекомендации по использованию инфузорий Тетрахимена пиряформис для биологической оценки продуктов и кормов. (Утверждены ВАСХНИЛ. М., 1987). '

8. Методические- рекомендации для использования экспресс-метода биологической оценки продуктов и кормов. (Утверждены ВАСХНИЛ. М., 1990).

• 9. Методические рекомендации по ускоренной токсикологической оценке кормов с использованием прибора "Биотестер-2". (Утверждены ВАСХНИЛ, М., 1991).

10. Методические рекомендации по ускоренной токсико-биологической оценке продуктов и кормов. (Утверждены ВАСШИЛ. М., 1991).

II. Методические рекомендации "Использование инфузорий (Тет-рахимена дориформис) в качестве тест-культуры в приборе "Биотес-тер-2" (экспресс-метод). (Утвермены Государственным лечебно-оздоровительным объединением. М., 1991).

12. Результаты исследований использованы при разработке "Методических рекомендаций по ускоренному способу определения токсичности кормов". (Утверждены ГУВ при Госкомиссии СМ СССР по продо-

вольствию и закупкам. М., 1990).

13* Разработанный нами метод биологической оценки о использованием инфузорий Тетрахимена пиряформис включен в ГОСТ 28178-89 "Дрожжи кормовые. Методы испытаний". (Госкомитет СССР, по'стандартам. И., 1989).

14. Результаты исследований явились основанием для внесения изменений в "Правила ветеринарного осмотра убойннх животных и ве-теринарно-санитарной экспертизы мяса и мясных продуктов", раздел 10. "Лабораторное исследование мяса и мясных продуктов". (Утверждены ГУВ МСХ СССР 27.12.83 г. Ейесены измененйя и дополнения от 17.06.88 г.).

15. Биотестовый прибор с расширенными функциональными возможностями "Биотестер-Н" , разработанный нами совместно с сотрудниками ЛЭТИ, может применяться в практических целях при выполнении массовых анализов жидких сред (природных и сточных вод, экстрактов кормов, продуктов питания, почвы, полимерных и строительных материалов, и др.). Подготовлена документация для его патентования.

16. Результаты исследований использованы при проведении Секционных занятий на экологических курсах ЖУ (Экоцентр ИГУ), а также учебных сборах начальников ветеринарных лабораторий округов и флотов при военно-ветеринарном факультете MBA им. К.И.Скрябина.

17. Полученные экспериментальные данные использованы при решении ряда практических вопросов, связанных с • зетеринарно-санитар-ной оценкой и технологией обработки кормов и* продуктов животноводства, а также экологическим мониторингом объектов окружающей среды.

СПИСОК основных работ, опубликованных • по теме диссертации •

1. Игнатьев А.Д., Исаев М.К., Долгов В.А., Шаблий В.Я., Не-любин В.П. Модификация метода биологической оценки шпцевых продуктов с помощью реснитчатой инфузории Тетрахимена пириформис. Вопросы питания. 1980, * 1, с. 70-71.

2. Куликова В.З., Долгов В.А., Калинина Л.А. Качество рубленых полуфабрикатов с концентратами животного и растительного про-исхокдснич. Тезисы докладов конференции "Пути рационального ис-пользтопая мясных ресурсов с целью повышения эффективности производства и качества продукции". М., 1980, с. 11.

3. Журавская Н.К., Рогов И.А., Куликова В.В., Ростроса Н.К., Долгов В.А. Исследование изменений свойств мясных систем с различным содержанием молочных и растительных белков в процессе замораживания, сублимационной сушки и последующего хранения. Тезисы докладов Всесоюзного совещания "Новые источники пищевого белка и их применение". Тбилиси, 1980, с. 54-56.

4. Долгов З.А., Иоффе М.Л. Биологическая ценность творога, подвергнутого консервированию и хранению. Молочная промышленность. 1981, № 4, с. 30-31.

5. Иоффе М.Л., Долгов В.А., Нелюбин В.П. Влияние сублимационной сушки творога на его биологическую ценность. Молочная промышленность. 1981, № 7, с. 17-18.

6. Шаблий В.Я., Исаев М.К., Долгов В.А. Биологическая оценка импортного мяса как важнейшее условие его качественной характеристики. Тезисы докладов конференции "Пути повышения качества продуктов животноводства и их ветеринарно-санитарная оценка". Киев, 1981, с. 50-53.

7. Долгов В.А., Иоффе М.Л. Биологическая оценка консервированного творога. Тезисы докладов конференции "Пути повышения качества продуктов животноводства и их ветеринарно-санитарная оценка". Киев, 1981, с. 103-105.

8. Долгов В.А. Улучшение качества'кормовой микробной биомассы путем деструкции. Тезисы докладов конференции "Пути повышения качества продуктов животноводства и их ветеринарно-санитарная оценка". Киев, 1981, с. 166-168.

9. Долгов В.А. Повышение биологической ценности хлореллы. Тезисы докладов конференции "Пути повышения качества продуктов животноводства и их ветеринарно-санитарная оценка". Киев, 1981, с. i71-172.

10. Шаблий В.Я., Долгов В.А., Лихачева Г.Н., Исаев М.К. Биологическая оценка пищевых отходов. Тезисы докладов конференции "Пути повышения качества продуктов животноводства и их ветеринар-но-санитарная оценка". Киев, 1981, с. 176-178.

11. Шаблий З.Я., Долгов В.А., Исаев М.К. Применение cow в колбасном производстве. Пищевая промышленность. Киев, 1981, # 3, с. 30-31.

12. Долгов В.А., Нелюбин З.П. Определение биологической ценности продуктов животноводства и кормов на цыплятах. В кн.: Гигиена содержания сельскохозяйственных животных и получение продуктов животноводства высокого санитарного качества. Труды ЕНШВС. М.,

1981, с. 105-110.

13. Радаева И.А., Высоцкий В.Г., Иоффе М.Л., Долгов В.А., Турянский Э.Г. Биологическая ценность консервированного творога. Hl Международный молочный конгресс. Краткие сообщения. М., 1982, т. 1, кн. 2, с. 10.

14. Фоломеева О.Г., Ростроса Н.К. , Долгов В.А., Головня Р.В., Журавлева И.Л. Влияние очистки хранившегося казеина на его питательную ценность.. Тезисы докладов У1 научно-технической конференции "Повышение эффективности производства и качества молочных продуктов". Каунас, 1982, ч. 1, с. 259.

15. Долгов В.А. Биологическая ценность кормовой биомассы одноклеточных. В кн.; Зоогигиена и ветеринарная санитария в промышленном аивотноводстве. Труды БНИКВС. М., 1982, с. 82-89.

16. Долгов В.А. Ветеринарно-санитарные аспекты применения антистрессовых препаратов в.животноводстве. Тезисы конференции "Ветеринарные проблемы промышленного свиноводства". Киев, 1983, с^ 147-148. %

17. Долгов В.А., Шаблий В.Я. Биологическая ценность искусственных молочных смесей. В кн.: Зоогигиена и ветеринарно-санитарные мероприятия в промышленном животноводстве. Труды ВНИИВС. М., 1984, с. 98-102.

18. Долгов В.А. ' Изменение показателей жизнедеятельности инфузорий Тетрахимена пириформис в зависимости от качества-белковых продуктов и кормов. В кн.: Зоогигиена и ветеринарно-санитарные мероприятия в промышленном животноводстве. Труды ВНИИВС. М., 1984, с. 118-127.

19. Долгов В.А. Повышение биологической ценности кормов микробного происхождения. В кн.: Повышение качества продуктов птицеводства. Сборник научных трудов ВАСХНИЛ. М., "лолос", 1983.

20. Митасева Л.Ф., Ясырева В.А., Куликова В.З., Кожевникова В.В., Долгов В.А. Биологическая ценность свежезамороженных комбинированных полуфабрикатов в связи с характером автолиза мясного сырья. Материалы Второй Всесоюзной научно-технической конференции "Разработка процессов получения комбинированных продуктов питания (технология, аппаратурное оформление, оптимизация)". М., 1984

с. 164-165.

21. Куравлева И.Л., Головня Р.В., Светлова Н.И., Фоломеева О.Г., Ростроса Н.К., Дьяченко П.Ф., Долгов В.А. Влияние очистки хранившегося казеина на состав летучих азотсодержащих оснований. Прикладная биохимия и микробиология. 1987, т. XXII1, вып. 5, с.

679-685.

22. -Беленски Н.Г., Долгов В.А., Нелюбин B.II., Бойков ¡D.M. Биологичен контрол въерху качествата на продуктите от животнсвъд-ството в системата на ветеринарносанитарната експертиза. Ветери-нарна сбирка (София). 1987, № 5, с. 24-26.

23. Долгов В.А. Влияние послеубойных изменений pH мяса на его биологическую ценность. Тезисы докладов Всесоюзной научно-технической конференции "Совершенствование ветеринарного обслужи-

.вания животноводства в условиях интенсификации". Махачкала, 1987.

24. Долгов В.А., ЕаГапгвшш Л.З. 1и?неподдерхивающие свойства кормовой добавки, полученной с применением продуцента Endcrayccpsia sp. Тезисы республиканской конференции "Биотрансформация вторичного растительного сырья в белковые кормовые продукты". Тбилиси, 1987, с. 110.

25. Долгов В.А. Чувствительность инфузорий Тетрахимена пири-формис к антибиотикзм. В кн.: Вопросы ветеринарной токсикологии, энтомологии и дератизации. Труды ВНИИВС. М., 1987(881, с. 18-24.

26. Долгов Б.А. .Методичоские аспекты совершенствования зетв-ринарно-санитарной экспертизы мяса и мясопродуктов. Тезисы докладов Всесоюзной научной конференции "Совершенствование ветеринарно-санитарной экспертизы продуктов животноводства и повышение уровня гигиены производства в перерабатывающей промышленности АПК". Казань, 1988, с. 5-6.

ВИЖВСГЭ, 1992 г. Москва, Звенигородское шоссе, 5, зак. тир. 100 экз.