Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.02) на тему:Биологические основы применения биохромов в морфологических исследованиях

На правах рукописи

ЛАПШИН ЛЕВ ВАСИЛЬЕВИЧ

БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ПРИМЕНЕНИЯ БИОХРОМОВ В МОРФОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ

16.00.02 - патология, онкология и морфология животных

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Уссурийск-2004

Работа выполнена на кафедре морфологии и физиологии Приморской государственной сельскохозяйственной академии

Научный консультант:

доктор ветеринарных наук, профессор Момот Н.В.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Лоншакова К.С., доктор биологических наук, профессор Хибхенов Л.В., доктор биологических наук, профессор Шантанова Л.Н.

Ведущая организация: Иркутская государственная сельскохозяйственная академия

в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 220.006.01

при ФГОУ ВПО Бурятской государственной сельскохозяйственной

академии им. В.Р. Филиппова

Адрес академии: 670020, г. Улан - Удэ, ул. Пушкина, 8 С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Бурятской государственной сельскохозяйственной академии им. В.Р. Филиппова

Автореферат разослан "22" октября 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат ветеринарных наук, доцент Г.А Игумнов

Зашита состоится "26"_ноября 2004 г.

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Проблема посвящена получению биохромов из растительного сырья, исследованию и применению их красящих свойств на различных биологических объектах.

Интенсивное развитие одного из важнейших направлений в биологии по изучению биохромов в начале 20-го века связано с работами М.С. Цвета (1901, 1910) по созданию метода адсорбционного хроматографического анализа, который позволил дифференцировать природные пигменты, и положил начало их систематизации. Эти исследования продолжили В.Н. Любименко (1916, 1935); В.Н. Любименко, В.А. Бриллиант (1924); В.Н. Столетов (1945); К.А. Тимирязев (1948) и др.

С 30-х годов прошлого столетия развернулись исследования роли каротиноидов и флавоноидов в фотосинтетических процессах, в физиологии и биохимии живых организмов (Будницкая Е.В., Овчаров К.Е., 1950; Данжар П., 1950; Рубин Б.А., 1954; Эмме A.M., 1958; Рабинович Е., 1959; Bech R., 1965; Иванов Б.Н., 1982; Лебедев Т.С., Сытник К.М., 1986 и др.).

Актуальность исследования биохромов определяется широким их использованием как экологически чистых основных морфологических красителей для решения различных задач в биологии. В качестве красителей природные пигменты используются для выявления ядер и ядерных структур клеток животных и растений.'

Современная микроскопическая техника обладает широким арсеналом красителей, часть из которых имеет природное происхождение. Пополнение морфологического метода исследований новыми красителями растительного происхождения будет продолжаться и в дальнейшем, так как пигментов растительного происхождения известно более 2000, а используется же немногим более 100.

В настоящее время разрабатываются следующие прикладные аспекты использования биохромов: применение их в цитологии и гистологии для морфологической характеристики клеток и тканей в норме и при патологии, исследование потенциальных их свойств в растворах и в сухом виде при анализе гистоструктуры животных и растительных организмов, изучение химического состава водных и спиртовых экстрактов, приготовленных из различного сырья.

Целью настоящего исследования является изучение эколого-биологических1 особенностей флавоноидо- и каротиноидосодержащего

РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ*) БИБЛИОТЕКА I

растительного сырья флоры юга Приморского края для практического применения в морфологии.

Задачи исследования:

1. Изыскание новых природных источников для получения растительных биохромов флоры юга Дальнего Востока.

2. Получение флавоноидо- и каротиноидосодержащих пигментов, являющихся основой красителей, для выявления микроструктуры животных и растительных организмов.

3. Разработка методических подходов при работе с новыми морфологическими красителями на различных биологических объектах, исследование их свойств на клеточном уровне.

Решение этих задач осуществлялось с помощью морфологических, микрометрических методов исследования и биометрического анализа.

Теоретическое и научно-практическое значение работы. Разработанные нами методические подходы к анализу микроструктуры животных и растительных клеток с помощью предложенных эффективных основных гистологических красителей значительно расширяют морфологический метод исследования, который открывает новые возможности для изучения гистоструктуры. Предлагаемые нами способы получения отечественных красителей могут служить основой для промышленной технологии производства гистологических красителей.

На основании изучения химического состава растительного сырья флоры юга Приморского края теоретически возможно использование биохромов не только в качестве красителей, но и для . создания действенных лечебных и профилактических средств в ветеринарной медицине.

Сравнение испытуемых биохромов на фоне их биологических, химических и морфологических свойств позволяет дополнить сведения об этих природных комплексах, расширить наши знания об их взаимосвязях и систематизации.

Научная новизна. Впервые для получения устойчивых биохромов проведен поиск флавоноидосодержащих растений на юге Дальнего Востока. В региональной флоре такими растениями являются черемуха Маака из семейства розоцветных, воронец заостренный из семейства лютиковых, марена сердцелистная лесная из семейства маренных, луносемянник даурский из семейства луносемянниковых.

Для получения основных гистологических красителей использовалось растительное сырье из природных местообитаний юга

Приморского края, ранее не употреблявшееся ни в пищевой, ни в биологической промышленности.

Созданные нами красители широко можно использовать как основные гистологические для получения достоверных результатов в функциональной, возрастной и экологической морфологии.

По теме диссертационной работы имеется 41 публикация, в том числе сообщений на различных международных научно-практических конференциях и в специальных центральных журналах - 15, по материалам работы, связанным с совершенствованием техники и методики исследований, оформлено авторских свидетельств на изобретения и патентов - б, информационных листков - 3 и рационализаторских предложений - 9.

Тема научного исследования обсуждена и утверждена на ученом совете Приморской государственной сельскохозяйственной академии 24 ноября 1997 года (протокол №3) и имеет номер государственной регистрации 01.9.80 000366.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Эколого-биологические особенности перспективных растений юга Приморского края и способы получения из них устойчивых биохромов.

2. Получение основных эффективных отечественных красителей для выявления клеточных структур растительных и животных тканей..

3. Методические подходы при работе с основными морфологическими красителями.

Апробация работы. Материалы исследований доложены и одобрены на всесоюзной научной конференции морфологов «Экологические аспекты эволюционной, функциональной и возрастной морфологии человека и домашних животных», посвященной 100-летию со дня рождения профессора А.Е.Ефимова (Омск, 1987); на республиканской научной конференции ветеринарных морфологов, посвященной 100-летию со дня рождения заслуженного деятеля науки РСФСР, профессора А.И.Акаевского (Омск, 1993); на научной конференции «Арсеньевские чтения» (Уссурийск, 1993); -на международной научно-производственной конференции «Наука в образовательном процессе вуза» (Уссурийск, 1997); на научно-методических конференциях Приморской государственной сельскохозяйственной академии (Уссурийск, 1992, 1994, 1998, 2000); на международной конференции ветеринарных морфологов (Улан-Удэ, 1998, 2001); на международной конференции «Леса и лесообразовательный процесс на Дальнем Востоке», посвященной 90-

летию со дня рождения член-корреспондента РАН Б.П.Колесникова (Владивосток, 1999); на международной региональной научной конференции «Перспективы сотрудничества российских аграрных учебных заведений со странами Азиатско-Тихоокеанского региона» (Уссурийск, 1999); на международной научно-практической, конференции морфологов «Достижения эволюционной, возрастной и экологической морфологии - практике медицины и ветеринарии», посвященной памяти академика Ю.Ф. Юдичева (Омск, 2001).

Реализация результатов исследования:

1. Результаты работы используются в учебном процессе при проведении лабораторно-практических занятий по теме «Техника приготовления гистологических препаратов» по цитологии, эмбриологии и гистологии, анатомии в Омском агроуниверситете и Омском институте ветеринарной медицины, в Уссурийском педагогическом институте, в Бурятской и Приморской сельскохозяйственных академиях.

2. Издано три информационных листка по способам получения красителя из растительного сырья:

а) Момот Н.В., Лапшин Л.В., Мешков Н.Н. Способ получения красителя из растительного сырья / Йнформ. листок №283-89.-Приморский межотраслевой ЦНТИ. Владивосток, 1989.

б) Момот Н.В., Лапшин Л.В. Способ получения красителя из растительного сырья / Информ. листок №52-89. Приморский межотраслевой ЦНТИ. Владивосток, 1989.

в) Момот Н.В., Лапшин Л.В., Мешков Н.Н. Способ окраски политенных хромосом насекомых / Информ. листок №79-92. Приморский межотраслевой ЦНТИ. Владивосток, 1992.

3. Получено девять удостоверений на рационализаторские предложения:

а) Лапшин Л.В. Способ получения красителя из черемухи Маака и его использование для гистологических целей / Удостоверение на рационализаторское предложение, №252-150. Приморская государственная с.-х. академия, 1990.

б) Лапшин Л.В. Способ выявления хромосом в животных клетках на лабораторно-практических занятиях по биологическим дисциплинам / Удостоверение на рационализаторское предложение, №253-151. Приморская государственная с.-х. академия, 1990.

в) Лапшин Л.В. Методика выделения хромосом в растительных клетках / Удостоверение на рационализаторское предложение, №1-98. Приморская государственная с.-х. академия, 1998.

г) Лапшин Л.В. Использование свойств луносемянника даурского как основного красителя / Удостоверение на рационализаторское предложение, №2-98. Приморская государственная с.-х. академия, 1998.

д) Лапшин Л.В. Использование свойств луносемянника даурского в гистологической технике / Удостоверение на рационализаторское предложение, №3-98. Приморская государственная с.-х. академия, 1998.

е) Лапшин Л.В. Изыскание в природе и разведение биологических объектов с гигантскими хромосомами / Удостоверение на рационализаторское предложение, №6-98. Приморская государственная с.-х. академия, 1998.

ж) Лапшин Л.В. Методический подход по выявлению ядерных структур красителем из покровных чешуи лука репчатого / Удостоверение на рационализаторское предложение, №7-98. Приморская государственная с.-х. академия, 1998.

з) Лапшин Л.В. Методика окрашивания ядерных структур мареной сердцелистной / Удостоверение на рационализаторское предложение, №01-99. Приморская государственная с.-х. академия, 1999.

и) Лапшин Л.В. Воронец заостренный и его красящие свойства по выявлению ядерных структур живбтных / Удостоверение на рационализаторское предложение, №02-99. Приморская государственная с.-х. академия, 1999.

4.* Получено шесть авторских свидетельств и патентов на изобретения:

а) Ах. № 1597376 СССР. «Способ получения красителя из растительного сырья», 1990.

б) А.с. № 1688163 СССР. «Способ окраски политенных хромосом насекомых», 1991.

в) А.с. № 1781259 СССР. «Способ получения красителя для гистологических целей», 1992.

г) Патент № 2078105 РФ (Роспатент) «Способ получения красителя из растительного сырья», 1997.

д) Патент № 2092018 РФ (Роспатент) «Способ идентификации хромосом растительных клеток», 1997.

е) Патент № 2098440 РФ (Роспатент) «Способ получения красителя для гистологических целей», 1997.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 215 страницах машинописного текста, иллюстрирована 43 графиками и микрофотографиями, 18 таблицами. Диссертация включает следующие разделы: введение, обзор литературы, собственные исследования, .обсуждение результатов, выводы и список литературы, содержащий 249 работ отечественных и 35 зарубежных авторов.

2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

Морфологическому исследованию подвергались ткани животных и растительных организмов из разных систематических групп: типов, классов, отрядов, семейств, родов, видов (табл.).

При этом из класса млекопитающих исследовались всеядные животные (домашняя свинья, дикий кабан), плотоядные (собака домашняя, лисица обыкновенная, выдра обыкновенная, норка американская, амурская кошка или дальневосточный лесной кот, кошка домашняя, рысь), травоядные (косуля дальневосточная или маньчжурская, пятнистый олень); из класса амфибий из отряда хвостатых (углозуб сибирский), из отряда бесхвостых (лягушка дальневосточная); членистоногие в исследованиях представлены ракообразными из отряда десятиногих (речной рак даурский), классом насекомых и различными представителями его отрядов и семейств (стрекоза четырехпятнистая, комары-звонцы, мухи-дрозофилы фруктовые, слепни); представители типа простейших из класса инфузорий (стилонихия митилюс).

Систематическое положение и число экземпляров исследуемых животных

№ Систематические категории Число экземпляров

Тип Хордовые - Chordata Подтип Позвоночные - Vertebrata Класс Млекопитающие - Mammalia Отряд Хищных - Carnivora •

Семейство Волчьи — Canidae

Вид Собака домашняя - Canis familiaris L.

Вид Лисица обыкновенная - Vulpes vulpes L.

Семейство Куньи - Mustelidae

Вид Выдра обыкновенная — Lutra lutra L.

Вид Норка американская — Mustela vison Schreber

Семейство Кошачьи,- Felidae

Вид Амурская кошка, дальневосточный лесной

кот - Felis euptilura Elliot Вид Кошка домашняя - F.catus Вид Рысь - F.lynxL. Отряд Парнокопытные - Artiodactyla Подотряд Нежвачные - Suiformes Семейство Свиные - Suidae

Вид Дикая свинья, кабан уссурийский - Sus scrofa ussuriensis Heude

Свинья домашняя • 1 Подотряд Жвачные - Ruminantia Семейство Оленьи - Cervidae Вид Косуля дальневосточная или маньчжурская -

Capreolus capreolus bedfordi Thomas Вид Олень пятнистый - Cervus nippon Temminck

Класс Земноводные - Amphibia Отряд Хвостатые - Caudata, Urodela Семейство Углозубов — Hynobiidae Вид Углозуб сибирский - Hynobius keyserlyngi

Dybowski et Godewski Отряд Бесхвостые - Anura Семейство Настоящие лягушки - Ranidae Вид Лягушка дальневосточная — Rana semiplicata Nikolsky

Тип Членистоногие - Arthropoda Класс Ракообразные - Crustacea Отряд Десятиногие раки - Decapoda Семейство Речные раки — Astacidae Вид Речной рак даурский - Cambaroides dahuricus

Класс Насекомые - Insecta Отряд Стрекозы - Odonata Семейство Настоящие стрекозы - Lubellulídae Вид Стрекоза четырехпятнистая - Lubellula quadrimaculata orientalis Be lys he v

16

17

18

19

(Личинка) Отряд Двукрылые - Díptera

Семейство Комары-звонцы - Tendipedidae (Chironomidae)

Вид Комар-звонец - Tendipes sp.

(Личинка) Семейство Дрозофилы - Drosophilidae Вид Дрозофила фруктовая - Drosophila melanogaster L. (Личинка) Семейство Слепни — Tabanidae Вид Слепень - Tabanus sp. (Личинка)

Тип Простейшие - Protozoa Класс Инфузории - Infusoria Отряд Спиральноресничные - Spirotricha Подотряд Брюхоресничные - Hypotricha Род Стилонихия - Stylonychia . Вид Стилонихия митилюс — Stylonychia mytilus

Итого:

626

Материал для морфологических исследований от животных тканей фиксировали в 10 и 12%-ном растворе нейтрального формалина, сулемовой смеси Максимова; от растительных тканей - в жидкости Буэна, в 70-ном этиловом спирте, уплотняли в парафине. Срезы получали на санном микротоме, их толщина с парафиновых блоков 5-7 мкм. В зависимости от методов окраски срезы в одних случаях наклеивали на предметные стекла, в других - расправляли на стекле без фиксации. В качестве объектов для морфологического анализа служили слюнные железы, мальпигиевы сосуды, эпидермис растительных тканей и корешки проращенных семян. Срезы окрашивали гематоксилином, а также основными красителями, приготовленными из покровных чешуи луковицы лука (авт.св. СССР № 1413931, 1986), из плодов черемухи Маака (авт.св. СССР № 1597376, 1990; авт.св. СССР № 1688163, 1991), из плодов воронца заостренного и луносемянника даурского (авт.св. СССР № 1781259, 1992; № 2092018 РФ (Роспатент), 1997; № 2098440 РФ (Роспатент), 1997), из плодов марены сердцелистной лесной (№ 2078105 РФ (Роспатент), 1997) по разработанной нами методике (информационные листки: № 52-89, 1989, Владивосток; № 283-89, 1989, Владивосток; № 79-92, Л992, Владивосток, также рационализаторские предложения: № 252-150, 1990, ПСХИ, Уссурийск; № 253-151, 1990,

ПСХИ, Уссурийск; № 1-98, 1998, ПГСХА, Уссурийск; № 2-98, 1998, ПГСХА, Уссурийск; № 3-98, 1998, ПГСХА, Уссурийск; № 6-98, 1998, ПГСХА, Уссурийск; № 7-98, 1998, ПГСХА, Уссурийск).

Для получения достоверных данных, касающихся морфофункциональной дифференциации больших слюнных желез, мы проводили . карио- и цитометрию эпителиоцитов вставочных, исчерченных, междольковых протоков и концевых отделов, а также микрометрию ацинусов, внутридольковых и междольковых протоков. Данные микрометрии основных органотипических структур и кариометрии клеток слюнных желез обрабатывали методом вариационной статистики (по Стьюденту) с использованием ЭВМ «Минск-32». При этом учитывались показатели не только среднестатистической величины, данные минимальной и максимальной вариант, но и среднестатистические коэффициенты отклонений и степень достоверности изменений с учетом величины ошибок. Протоплазменно-ядерное и ядерно-протоплазменное отношение вычисляли с помощью среднестатистических показателей площадей ядер и клеток круглых, округло-овальных и многоотросчатых (неправильной формы) с использованием рекомендации К. Ташкэ (1980).

Для выявления действующих начал в разработанных нами красителях экстракты хроматографировали на хроматографической бумаге №16 в системе бутанол-уксусная кислота - вода (4:1:3). Хроматограммы проявляли в хлористом алюминии в этаноле и рассматривали в видимом и ультрафиолетовом свете на приборе «Спекорд-М-40». Проводили тонкослойную хроматографию на силуфоле в присутствии стандартов. Для всех стандартов были сняты ультрафиолетовые спектры.

3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Биологическая промышленность при своем развитии нуждается в постоянном пополнении, обновлении и усовершенствовании методов исследования, а также в апробированных и уточненных методиках изучения объектов; при этом использование и выбор красителей, природная принадлежность которых определяется биохромами, является основой любой методики исследования.

Впервые нами обращено внимание на природный источник получения биохромов и их практическое применение. Из флоры Дальневосточного региона были выделены и исследованы виды

растений, являющихся основой для производства морфологических красителей, которые возможно использовать в биологической промышленности.

Проведение этих исследований в этом регионе мы объясняем богатством, видовым разнообразием и своеобразием флоры Приморского края, которое обусловлено его географическим положением, сложным и разнообразным рельефом, соседством с другими регионами со специфическими и своеобразными физико-географическими условиями, с которыми имеет много общих видов.

Как известно, территория Приморья преимущественно представлена горной системой Сихотэ-Алинь и Приханкайской низменностью; господствующее' положение, занимают смешанные широколиственные леса, в состав которых входит черемуха Маака, актинидии, разнообразные лианы, к которым относится луносемянник даурский. Б.П. Колесников (1956) насчитывает более 800 видов цветковых и папоротниковых растений.

Впервые нами' обозначен круг растений одного из регионов Дальнего Востока, в частности южного Приморья, который может служить устойчивым источником поступления технического сырья для нужд биологической промышленности.

3.1. Луносемянник даурский и его практическое использование

Луносемянник даурский (Meшspermum dahuricum DC.), относящийся к семейству луносемянниковых (Menispermaceae Juss, род Menispermum Ь), является единственным в России дикорастущим видом этого семейства, в естественных условиях встречающийся в Приморском и Хабаровском краях.

По нашим наблюдениям луносемянник даурский растет и весьма обычен в приречных зарослях, по опушкам, на кустарниково-разнотравных лугах, по канавам, в полынниках, оврагах. Растение поднимается в горы до 300-400 метров над уровнем моря. Оно1 представляет собой небольшую (до 25 метров) травянистую многолетнюю лиану, обычно обмерзающую до корня. У растения длинное, сильно разветвленное горизонтальное корневище с многочисленными мелкими корнями и боковыми почками.

Листья очередные, темно-зеленые, щитовидной формы, 3-7-лопастные, реже цельные, с длинными черешками 6-12 см длины,

Заостренные к верхушке. Двудомное растение, цветет в конце мая -июне.

Цветки очень мелкие, зеленовато-белые. Они собраны в малоцветковые кистевидные соцветия на сравнительно коротких цветоносах.

Плоды черные, сочные (ягодовидные) костянки до одного сантиметра в диаметре,, с крупным лунообразным семенем и фиолетовым красящим соком. Плоды (особенно семена) ядовиты, созревают в сентябре. На юге Приморья плоды держатся на стебле до заморозков (до 2-й декады октября), что облегчает и делает возможным их сбор в течение продолжительного периода. Так как низкая зимостойкость и ядовитость плодов ограничивают использование луносемянника в озеленительно-декоративных и медицинских целях, мы решили, учитывая сильно красящие свойства плодов, употребить их в качестве растительного сырья для приготовления основного красителя в морфологических исследованиях.

Целесообразность применения. Научные исследования луносемянника в качестве естественного красителя для выявления морфологических структур клеток и тканей животных и растительных объектов показали перспективность его применения для морфологических целей. Краситель из луносемянника дает устойчивое фиолетовое окрашивание клеточных мембран, ядер, ядрышек как на временных, так и на постоянных гистологических препаратах, которое в стандартных условиях хранения не подвергается заметным изменениям. Такие свойства красителя позволяют рекомендовать его для научных исследований и широкого использования для учебных целей.

Довольно - обширный ареал произрастания луносемянника даурского и частая встречаемость его в природных сообществах (например, в пойменных лесах, кустарниково-разнотравных лугах, канавах с рудеральной растительностью, полынниках), а также высокая плодовитость этого растения, позволяют сделать вывод о том, что запасы этого растительного сырья достаточно велики, доступны для сбора, хранения и получения экстракта. Масса свежих плодов с одной лианы луносемянника в наших сборах на юге Приморья составляет: М ± ш = 13,06 ± 0,9 г; о ± те = 6,30 ± 0,64; СУ ± то, = 48,24 ± 4,87%; п = 49.

Масса высушенных плодов в расчете на одну лиану (побег) луносемянника составляет:

М ± ш = 4,66 ± 0,32 г; о ± та = 2,21 ± 0,22; СУ ± тсу = 47,42 ± 4,84%; п = 48.

Масса 1000 зрелых сочных костянок составляет 0,561 кг. Выход красящего экстракта (пигменты), полученного из сухих плодов луносемянника даурского составляет 43,1%.

Возможности получения растительного сырья в необходимых количествах расширяются в связи с тем, что имеет место опыт размножения луносемянника не только семенным, но и вегетативным способом корневыми отпрысками, отводками, черенками. Таким образом, перспективно его разведение на плантациях.

Длительная работа с луносемянником даурским показала отсутствие неблагоприятных воздействий мякоти, сока и полученных из плодов 70°-х спиртовых вытяжек на кожные покровы при непосредственном контакте.

Проведенный химический анализ спиртового экстракта указанной концентрации показал следующее: экстракт из луносемянника не проявляется в системах, используемых и на бумаге, и на силуфоле; не светится экстракт в УФ-свете. В экстракте содержатся алкалоиды, возможно гликозиды кверцетина, может быть рутин, а также гиперозид.

Для повышения химической устойчивости красителя, усиления интенсивности окраски в полученный спиртовой экстракт добавляют соляную кислоту и двууглекислый натрий.

Способ получения красителя из луносемянника даурского предусматривает настаивание растительного сырья и отличается от" известных тем, что в целях расширения базы красителей растительного происхождения, упрощения технологии производства красителя, пригодного для гистологических целей, используются несъедобные плоды луносемянника даурского с добавлением '8-10 мл соляной кислоты и 1-1,5 г натрия двууглекислого на 100 мл 70°-го спиртового экстракта (авт.св. №2098440).

На постоянных гистологических препаратах, приготовленных нами из растительных объектов и окрашенных по нашей методике, четко просматриваются интерфазные ядра, а также хромосомы на разных стадиях митотического деления.

Полученный основной краситель темно-вишневого цвета может быть использован для проведения морфологических исследований в цитологии, гистологии, морфологии, ботанике, генетике.

Гистологические препараты, окрашенные по данной методике с использованием красителя из плодов луносемянника даурского, не выцветают в течение длительного срока (свыше 20 лет) и при этом не теряют первоначального вида в обычных условиях хранения.

Использование красителя для приготовления временных препаратов

В процессе исследования действия красителя использовались классические объекты растений и животных, употребляемых широко в генетических, цитологических, морфологических, ботанических исследованиях, а также объекты оригинальные из местной фауны и флоры, позволяющие быстро проверить действие красителя на клеточные структуры. Объекты эти достаточно доступны для сбора и отлова в разное время года. В весенний период хорошим объектом являются личинки комаров-звонцов. В это время у личинок старшего возраста после зимовки хорошо развиты в слюнных железах политенные хромосомы. Возможно круглогодичное содержание этих насекомых в аквариумах.

В летнее время мы широко использовали для исследования личинок и взрослых насекомых из отрядов двукрылых (слепней, мух-дрозофил), стрекоз.

Для приготовления временных препаратов, не требующих проведения работ на микротоме, удобными для окрашивания являются органы насекомых, представленные одним - двумя слоями клеток и прозрачных: слюнные железы, трахеи, мальпигиевы сосуды, половые железы, просветленные отделы кишечника. В некоторых случаях нами использовались типовые методики приготовления давленых препаратов различных органов и тканей.

Из растений чаще использовали эпидермис сочных чешуи луковицы лука, а также корешки лука и конских бобов. Перспективным представляется применение наших красителей для изучения микроспорогенеза и макроспорогенеза у растений как на давленых препаратах, так и на морфологических срезах.

Окрашивание слюнных желез домашних и диких животных показало высокую степень дифференциации клеточных элементов желез. В наших опытах краситель из луносемянника даурского хорошо проявил себя при изготовлении постоянных препаратов, что позволяет говорить о перспективности его практического применения в научных исследованиях и в учебных целях.

Вариационные кривые ЯПО мукоцитов нижнечелюстной слюнной железы домашней свиньи при окраске гематоксилином и красителем из луносемянника даурского проявляют сходство в наличии двух модальных классов больших (р=15 и р=12) и малых (р=3 и р=2) соответственно. При общем характере движения размах вариант кривой

красителя из луносемянника даурского все же больше, чем у кривой при окраске гематоксилином, и наблюдается сдвиг ее вправо по пути ее движения на 0,02-0,03 единицы. Общий размах вариант составляет от 0,050 до 0,160 единиц при окраске гематоксилином и от 0,042 до 0,187 единиц при окраске луносемянником даурским.

Выявленные особенности основного красителя приготовленного на основе растительного сырья, состоящего из зрелых плодов луносемянника даурского по нашей технологии, обладают позитивными свойствами по отношению к фиксированным в различных смесях и нефиксированным объектам, которые изучены нами на примере нижнечелюстной слюнной железы, а также эпидермиса сочных чешуи луковицы лука репчатого.

' 3.2. Черемуха Маака и ее практическое использование

Черемуха Маака (Padus maackii ^^г.) ^т.) распространена в Приморском и Хабаровском краях, в юго-восточных районах Амурской области, вниз по Амуру доходит до Мариинска (Булавы), а на запад до Буреинских гор.

По нашим наблюдениям, она растет одиночно и группами в смешанных лесах, в долинах горных рек и ручьев, преимущественно в их среднем и верхнем течении, часто у каменистых россыпей и скал. В горы поднимается до 800 м над уровнем моря.

Черемуха Маака - прямоствольное стройное дерево 15-17 метров высоты и до 40-45 см в диаметре ствола. Кора гладкая оранжево-желтая или коричнево-красная, золотисто-бурая, блестящая, на старых деревьях отслаивающаяся тонкими пластинками.

Плоды черёмухи маака- черные мелкие костянки 3-5 мм диаметре, имеют сильно красящую тёмно-фиолетовую мякоть. Плоды несъедобные, горькие на вкус, созревающие в конце июля-августе.

По нашим наблюдениям плоды черёмухи Маака охотно поедаются птицами и медведями вероятно, поэтому в народе это растение называют «медвежьей черемухой».

Исследования показали, что из плодов черемухи Маака был получен основной гистологический краситель с высокими красящими свойствами. Получение красителя технически осуществляется в лабораторных условиях просто; доступно для сбора растительное сырье, произрастающее на большой территории нашей страны. Краситель можно получить как из жидкого, так и из сухого экстракта.

Выход пигмента красителя из растительного сырья достаточно велик и составляет 31%.

Масса одной свежей костянки черемухи Маака равна: М ± ш = 0,111 ± 0,003 г; о ± та = 0,022 ± 0,002; СУ±тсу= 19,815± 1,981; п = 50.

Масса 1000 свежих костянок равна 0,111 кг. С одного обильно

плодоносящего молодого дерева можно собрать свыше 5 кг костянок.

Окрашивание гистологических срезов и биологических объектов с целью обнаружения ядер, ядрышек, хромосом яркое и наглядное, по насыщенности цвета, не уступающее окрашиванию классическими, широко используемыми основными красителями.

Краситель, приготовленный из растительного сырья черемухи Маака, перспективен для дальнейшего его изучения и совершенствования методических подходов при работе с ним для проведения не только цитологических, гистологических, но и гистохимических исследований, так как возможно проявление специфического воздействия нашего красителя на определенные группы белков.

Для производства красителя из плодов черемухи Маака плоды собирают в конце летнего сезона, когда зрелость мякоти достигнет своего максимума. Более предпочтителен сентябрьский сбор. Ранние сроки (июль - начало августа) заготовки плодов не целесообразны, так как приводят к низкой красящей способности красителя и, как правило, цели своей такие красители не достигают. Чтобы избежать изначальной погрешности при производстве красителя необходимо сырье собирать в указанные сроки.

Предварительно промытые плоды подвергают измельчению для быстрого выхода биохромов, а затем проводят экстракцию, настаивают и фильтруют. К полученному фильтрату добавляют 30-50 мл соляной кислоты и 2-3 г алюмокалиевых квасцов на 100 мл фильтрата. Меньшие количества алюмокалиевых квасцов (1 г) и соляной кислоты (25, 20, 15 мл) обнаруживают ядра клеток при большом увеличении микроскопа. При использовании еще меньших доз реактивов должного эффекта не наблюдается. Большие количества ингредиентов красителя (60 мл и более концентрированной соляной кислоты и 4 г и более алюмокалиевых квасцов) выявляют ядра клеток, но положительного эффекта не оказывают.

При хроматографии на бумаге в системе бутанол-уксусная кислота-вода (4:1:3) экстракт, приготовленный из черемухи Маака, показывает наличие пигментов, окрашенных в видимом и в ультрафиолетовом свете в розовый (красный) цвет. При снятии УФ-

спектров при рН=7 происходит частичное обесцвечивание раствора и УФ имеет шах при X =280 нм, в кислых значениях рН - при А.=560 нм, а при рН>7 появляется голубое окрашивание. Такой цветовой переход

характерен для антоцианидинов, которые в кислых растворах существуют в виде флавилиевых солей.

На силуфольных пластинках анализ показал сложный состав экстракта, наличие большого числа компонент, среди которых предположительно имеются изофлавононы, например, типа софорола. Вероятно, в результате химических реакций образуется комплексное соединение, обладающее свойствами основного красителя.

В нашей работе для определения политенных хромосом мы получали краситель путем настаивания целых ягод черемухи Маака в 70°-ном растворе этилового спирта, равным по объемному соотношению растительному сырью. В течение суток проводили настаивание. Биохромы диффундируют через оболочки плодов, со временем экстракт становится очень насыщенным и готов для дальнейшего использования.

Описанный выше краситель из черемухи Маака в ходе дальнейших исследований был нами модифицирован для выявления хромосом. Данная разработка относится к цитогенетике, в частности к окраске политенных хромосом насекомых.

Одной из задач разработки является повышение информативности цитогенетических препаратов.

Для этого на изолированные клетки насекомых наносят по 1-2 капли 45%-ной ледяной уксусной кислоты и 2-3 капли основного красителя из плодов черемухи Маака на 15-20 мин. Излишки красителя удаляют фильтровальной бумагой под контролем микроскопа, окончательно препарат отмывают от красителя дистиллированной водой.

Таким образом, можно сделать вывод о больших возможностях использования красителя, полученного как из жидкого, так и из сухого экстракта, для морфологических исследований. Способы получения и большие запасы сырья черемухи Маака дают возможность говорить об экономической оценке красителя, его низкой себестоимости.

При анализе вариационных кривых ядерно-протоплазменных отношений мукоцитов нижнечелюстной слюнной железы пятнистого оленя необходимо отметить сходство при окраске гематоксилином и красителем из черемухи Маака. Общий характер их движения выявляет два модальных класса: основного максимального и дополнительного минимального по величине частот, причем наблюдается совпадение мод как в первом, так и во втором классах; по частоте вариант максимальные классы разнятся - пик максимального модального класса при окраске

черемухой Маака на 1/3 выше пика максимального модального класса при окраске гематоксилином. Оба пика ассиметричны, ассиметрия отрицательная со значительным смещением вариант вправо, особенно у кривой ядерно-протоплазменных отношений при окраске гематоксилином. Общий размах вариант в сторону минимума составляет 0,05 в сторону максимума - 0,33.

Исходя из изложенного материала, необходимо сделать следующее заключение:

- действие красителя из плодов черемухи Маака специфично как ядерного красителя, тонко выделяющего его структуры, в частности кариоплазму, ядрышки, хроматин;

- большой контраст ядра с цитоплазмой дает яркую картину, что важно для исследования гистологических препаратов, а также дает возможность получать четкие фотоматериалы;

- краситель выявляет детали в строении политенных хромосом, в этом проявляется универсальность действия предложенного красителя;

- доступность и простота изготовления морфологического красителя, широкий спектр действия позволяют утверждать о возможности успешного его использования наряду с другими красителями в научно-исследовательской работе и в учебном процессе.

3.3. Воронец заостренный и его практическое применение

Воронец заостренный - Actaea acuminata Wall. - семейства лютиковых распространен в Приморье и южном Амуре. Растение обитает в горных лесах маньчжурского типа в кедровниках. Стебель 5070 см высотой, листочки 5-10 см длины, 2-6 см ширины. Конечные листочки в основании обычно клиновидные или глубокотрехраздельные с клиновидной средней лопастью. Дольки листьев зубчатые. Соцветие -кисть 3-5 см, цветоножки при основании более или менее утолщенные, темно-красные. Плоды черные ягодообразные, обладают сильнокрасящими свойствами, цвет окрашенных объектов темно-фиолетовый, насыщенный; окраска стойкая, не выцветает при длительном хранении. Растение в типичных таежных местообитаниях является обычным, для научных и учебных целей возможен сбор в

природе, но возможно и культивирование при создании условий, близких к таежным, в затенении. С одного растения воронца заостренного можно собрать:

М ± m = 22,7 ± 1,58 костянок; а ± то = 8,68 ± 1,12;

CV ± tncv = 38,24 ± 4,94%; п = 30.

Масса сочных плодов в расчете на одно растение составляет:

М ± m = 4,86 ± 0,47 г; о ± то = 2,55 ± 0,33;

CV ± то, = 52,47 ± 6,78%; п = 30.

Масса одной сочной костянки составляет 0,231 г = 231 мг.

Масса 1000 сочных костянок составляет 0,231 кг.

Краситель из воронца заостренного перспективен для работы с гистологическими, цитологическими, зоологическими и ботаническими объектами.

Данный вид растения при практическом его применении расширяет сырьевую базу растительного происхождения и упрощает технологию производства основного красителя в сравнении с имеющимися. В качестве растительного сырья используют плоды воронца заостренного (A. acuminata Wall.), в качестве органического растворителя - 70"-ный спирт, экстрагирование ведут путем настаивания в течение 24-48 ч, а фильтрат обрабатывают ледяной уксусной кислотой, алюмокалиевыми квасцами и мочевиной из расчета 8-10 мл уксусной кислоты, 1-1,6 г алюмокалиевых квасцов и 1,6-2,4 г мочевины на 100 мл фильтрата.

Предложенный краситель фиолетового цвета можно использовать в гистологии и цитологии для выявления ядерных структур животных клеток после фиксации материала по Максимову и уплотнения в парафине.

Достоинством данного красителя является выявление хромосом в растительных клетках на разных стадиях митотического деления.

Поставленная задача достигается тем, что на депарафинированные срезы растительных тканей помещают 2-3 капли основного красителя из плодов воронца заостренного на 20-30 мин, отмывают в водопроводной воде 5-10 мин, проводят по спиртам возрастающей концентрации и заключают в бальзам.

Основной краситель готовят из плодов воронца заостренного, которые настаивают на 70°-м этиловом спирте. К 100 мл полученного раствора фиолетового цвета добавляют 10-15 мл пропионовой кислоты, 1-1,6 г алюмокалиевых квасцов и 1,6-2,4 г мочевины.

Для достоверности полученных данных по действию красителя из воронца заостренного мы провели сравнение с классическим красителем гематоксилином и проанализировали количественные

данные размеров протоплазмы, ядерно-дротоплазменных

отношений мукоцитов в слюнны железа растительных клетках.

При анализе вариационных кривых размеров протоплазмы мукоцитов нижнечелюстной слюнной железы пятнистого оленя, окрашенной гематоксилином, выделяется один класс; при окрашивании воронцом заостренным - два класса. Разброс от минимальных до максимальных вариант при обоих способах окрашивания достаточно большой и соответственно составляет 68,68 мкм2 - 235,50 мкм2 и 147,19 мкм2 - 223,23 мкм2-. Высота пика кривой воронца заостренного по величине частот модального класса превышает высоту пика кривой гематоксилина в 1,3 раза (р=16 в диапазоне 147,19 мкм2 - 162,398 мкм2 и р=12 в диапазоне 68,88 мкм2 - 102,04 мкм2 соответственно). Второй малый пик в диапазоне (92,81 мкм2 при окрашивании воронцом заостренным составляет р=6; на вариационной кривой гематоксилина второй пик отсутствует.

Ядерно-протоплазменные отношения мукоцитов при окраске гематоксилином в графическом изображении имеют два класса, причем пик доминантного класса (р=14), как и пики двувершинного модального класса (р=10) вариационной кривой при окрашивании испытуемым нами красителем, смещены влево, и находятся в близких диапазонах, что говорит о сходстве их показателей ЯПО. Другой, крайне малочисленный по количеству вариант класс при окрашивании гематоксилином располагается на кривой в диапазоне 0,275-0,330 резко вправо от основных вариационных величин (р=2); на вариационной кривой ЯПО при окрашивании воронцом заостренным аналогичный малый класс находится в диапазоне 0,100-0,117» и.р=4.

Обобщая характер хода вариационных кривых, мы отмечаем значительное совпадение особенностей классов вариант по площадям

3.4. Марена сердцелистная лесная и ее практическое использование

Марена (Rubia cordifolia f. silvatica Maxim.) относится к семейству маренных и распространена в Приморье, на западном и южном Амуре. Растет марена в дубовых и смешанных лесах. Наши многолетние наблюдения показывают, что в Уссурийском районе она чаще встречается в пойменных лесах вдоль оврагов, по краю опушек, в полынниках, в местах произрастания сорной растительности.

Плоды марены сердцелистной лесной несъедобные, сочные, костянковидные. Отрицательного воздействия на кожу сок плодов не оказывает, что было выявлено постановкой кожной пробы на лабораторных животных.

Использование плодов этого растения для окрашивания биологических объектов объясняется активными красящими свойствами марены сердцелистной лесной клеточных структур кислой природы, доступность растительного сырья, широкий ареал растения и частая встречаемость в местах обитания. Сбор плодов не вызывает затруднения: растение невысокое, костянки легко отделяющиеся; масса плодов на одном растении колеблется в зависимости от условий произрастания в различных биотопах и срока сбора, так как часть костянок на метельчатом соцветии по мере созревания опадает или подсыхает.

Масса свежих плодов на одном растении марены сердцелистной лесной составляет:

M ± га = 7,15 ± 0,85 г; сг ± та = 4,9 ± 0,6;

CV ± тсу = 69,5 ± 8,58%; п = 34.

Масса высушенных плодов, собранных с одного растения равна:

M ± m = 2,7 ± 0,35 г; о ± та = 1,7 ±0,25;

CV ± mcv = 62,04 ± 9,15%; п = 23.

Масса одной сочной костянки равна:

M ± m = 63,043 мг; ст ± то = 10,407 ± 1,08;

CV ± mcv = 16,50 ± 1,72%; п = 46.

Масса 1000 сочных костянок равна 0,063 кг.

Выход сухого пигмента из свежих плодов марены сердцелистной лесной составляет 10,699%; выход сухого пигмента, полученного из высушенных ранее плодов для хранения, составляет 27,956%.

Краситель получали из зрелых черных плодов марены сердцелистной лесной. Сбор ягод осуществляли в конце сентября -начале октября.

Данная научная разработка относится к области естественных органических красителей, а именно к способу получения красителя из растительного сырья, который может быть использован для морфологических целей.

Указанная цель достигается тем, что в качестве исходного сырья используются несъедобные плоды марены сердцелистной лесной (Rubia cordifolia silvatica Maxim.), которые настаивают на 70-ном этиловом спирте. К 100 мл полученного раствора темно-вишневого цвета добавляют 8-10 мл соляной кислоты и 1-1,4 г медного купороса.

Анализ экстракта из плодов марены сердцелистной лесной на силуфольных пластинах выявил наличие пигментов антрахиноновой природы и алкалоидов. Антрахиноны совместно с металлами, например, с ионами меди в присутствии соляной кислоты образуют комплексные соли, которые обладают красящими свойствами, ионы меди в этих соединениях являются комплексообразователем.

На гистологических постоянных препаратах ядра клеток животных тканей окрашены в коричневый цвет, хорошо просматривается кариолемма, хроматин, ядрышки.

При анализе вариационных кривых размеров площадей протоплазмы мукоцитов нижнечелюстной слюнной железы пятнистого оленя при окрашивании гематоксилином и красителем из марены сердцелистной лесной наблюдается их графическое сходство при выраженной одновершинности в пределах 68,68 мкм2 — 122,66 мкм2; они характеризуются постепенным снижением значений вариант и наличием ступеней в обеих кривых со значением 135,20 мкм2 - 168,77 мкм2 при окраске гематоксилином и 282,3U мкм2 - 335,51 мкм2 при окраске мареной сердцелистной лесной. Вершина кривой при окраске красителем из марены сердцелистной лесной сдвинута вправо относительно вершины кривой при окраске гематоксилином. Вершины модальных классов находятся на одном уровне (р=12). Минимальные варианты . в обеих кривых варьируют в меньшей степени, чем максимальные. Особенно ярко это проявляется при окраске предложенным нами красителем: при окраске гематоксилином вариации находятся в пределах 68,68 мкм2 - 235,50 мкм2, при окраске красителем из марены сердцелистной лесной - 122,66 мкм2 - 388,73 мкм2.

3.5. Покровные чешуи луковицы лука репчатого и их практическое использование

С целью отбора перспективных сортов луковичных растений для получения морфологического красителя был изучен качественный состав покровных чешу луковиц лука разных географических популяций из различных климатических зон нашей страны: Приморского, Хабаровского и Краснодарского краев и Амурской области.

Лук репчатый - многолетнее растение (А11шт сера Ь.), относящееся к семейству лилейных (ЬШасеае), имеет крупную до 15 см в диаметре приплюснуто-шаровидную или продолговатую луковицу. Наружные чешуи в зависимости От сорта желтые, реже - фиолетовые или белые; внутренние - мясистые, белые, зеленоватые или фиолетовые, расположенные на укороченном стебле.

Исследовались следующие сорта этого растения: «Бессоновский», «Каба» с окраской наружных чешуи от светло-коричневой до коричневой, «Краснодарский Г-35» с наружными чешуями от желтых до желто-коричневых цветов, «Стригуновский» с окраской наружных чешуи от светло-желтого до розового оттенка.

Изучение лука репчатого из разных эколого-географических условий показало, что по качественному содержанию красящих веществ перспективными оказались все сорта этого растения. Не уступает луку репчатому по содержанию пигментов в наружных чешуях и лук-шалот или кущевка, сорта которого широко распространены в нашей стране, на Украине, на Северном Кавказе, в Грузии, в Средиземноморье.

Исследование по изучению биохромов из покровных чешуи луковицы лука для получения морфологического красителя проводилось в двух направлениях; а) получение гистологического красителя в жидком состоянии; б) получение мелкодиспергированного красителя.

При проведении морфологического метода окрашивания как экстрагированным (жидким) гистологическим красителем, так и мелкодиспергированным (порошкообразным), мы получали качественные постоянные и временные гистологические препараты.

Предложенная научная разработка относится к биологической промышленности, а именно к способам получения красителя, который может быть использован для широкого применения в гистологических целях.

Одной из задач проведенного исследования является снижение себестоимости красителя и упрощение способа его производства,

который осуществляется следующим образом: покровные чешуи луковицы лука измельчают до 3-5 мм,, кипятят в течение 15 минут, охлаждают до комнатной температуры, отделяют от осадка и проводят дополнительное экстрагирование осадка водой при температуре кипения в течение 15 минут с последующим охлаждением до температуры 18-20°С. Полученный экстракт фильтруют.

По данным тонкослойной хроматографии в экстракте из покровных чешуи луковицы лука содержится сумма флавонолов, среди которых идентифицированы при . сравнении со стандартными веществами кверцетин, кемпферол и мирицетин.

В исследованном растворе в значительной степени преобладает кверцетин. На наличие этих флавонолов указывают также максимумы поглощения, обнаруженные в УФ-спектре (Х=250, 263, 298, 394 нм - в метаноле). Возможно, что есть в водном растворе незначительные примеси гликозидов.

К полученному фильтрату добавляют 5-10 г калийных .квасцов и 4-8 мл ледяной уксусной кислоты на 100 мл фильтрата. Дополнительная экстракция водой при температуре кипения позволяет провести более полное извлечение красящих веществ и снизить себестоимость красителя за счет использования более дешевого растворителя. Настаивание раствора в течение 22-24 часов необходимо для насыщения раствора пигментом.

Для проведения химической реакции с целью получения красителя мы использовали как комплексообразователь,

который в кислой среде более устойчив. Можно предположить, что соль, образованная в результате реакции и обладающая красящим эффектом, является комплексной, в которой комплексообразователем являются ионы алюминия. В кислой среде эти соединения представлены пирилиевыми солями.

Полученный краситель коричневого цвета пригоден для окрашивания парафиновых срезов после фиксации материала в жидкости Максимова.

При анализе характера распределения вариационных кривых ядер мукоцитов нижнечелюстной слюнной железы пятнистого оленя при окраске гематоксилином и красителем из покровных чешуи луковицы лука репчатого нами установлено, что имеется значительное сходство в распределении кривых, характеризующих оба красителя; оно проявляется в наличии одного модального класса с наибольшим количеством вариант(р=19 и 12 соответственно) сразмерами площадей ядер от 8,83 мкм2 до 17,85 мкм2; вторые классы с большими размерами площадей равнозначны и немногочисленны в своем представительстве.

Особенности действия нашего красителя, относящегося к прогрессивному типу, особенно ярко проявляется при изготовлении временных препаратов. Он оказывает на тканевые и органные структуры более щадящее действие, накапливая постепенно количество пигмента, при этом перекрашивания морфологических объектов не происходит. Следовательно, специфичность предложенного нами красителя обусловлена и временем окрашивания, и количеством осаждающихся на клеточных структурах биохромов.

Анализируя цито- и кариометрические данные, а также величину ядерно-протоплазменных отношений клеток при окраске постоянных и временных гистологических препаратов, мы указываем на некоторую специфику красителя и значительное сходство биометрических показателей при окраске гематоксилином и красителем из покровных чешуи луковицы лука.

Таким образом, морфологические красители, впервые представленные нами к технологическому использованию, по сравнению со стандартными красителями имеют ряд преимуществ, в которые входят низкая себестоимость производства красителя, простота технологического процесса и наличие стандартного оборудования, что позволяет получить качественный конечный результат.

Биологическая промышленность нуждается в научных разработках по внедрению биохромов для изучения биологических объектов на органном, тканевом и клеточном уровне. Открытое нами направление научных исследований дает перспективы использования и внедрения в практическую морфологию новых основных красителей из натурального растительного сырья, которое не оказывает негативного влияния на здоровье человека.

В своих морфологических исследованиях мы использовали экологически чистое сырье, при этом растительный организм не получал каких-либо повреждений при сборе, что особенно ярко характеризует экологическую направленность наших технических решений.

Ценным, на наш взгляд, является и то, что мы используем растительное сырье для приготовления основного красителя в качестве исходного, которое не имеет применения в пищевой промышленности, так как плоды этих растений являются несъедобными для человека.

Методом тонкослойной хроматографии на силуфольных пластинах нами были выявлены флавоноиды, относящиеся к группе О-гетероциклических соединений. Как известно, гематоксилин как основной морфологический краситель имеет также гетероциклическую структуру строения. Таким образом, изученные нами флавоноидные пигменты и гематоксилин относятся к одной группе безазотистых

ароматических соединений, чем мы и объясняем сходство воздействия на животные и растительные ткани этих красителей при имеющихся своеобразии и специфичности каждого из них.

Впервые на территории нашей страны определена сырьевая база растительного происхождения для получения стойких высококачественных естественных красящих веществ - юг Приморского края. Количество флавоноидо- и антоцианосодержащих растений увеличивается с севера на юг, в горных системах с повышением над уровнем моря в соответствии с поясностью растительности. Дальневосточный регион географически простирается в широтном направлении на тысячи километров, представляет бесконечную совокупность природных сообществ различных уровней, где высшие цветковые растения определяют их экологический характер, и поэтому представляется возможным дальнейшая перспектива поиска новых источников природных красящих веществ как на юге Приморского края, так и на Дальнем Востоке в целом.

ВЫВОДЫ

1. Впервые в результате таксономического и биологического анализа растительности Приморского края нами были выделены антоцианосодержащие растения, перспективные для получения морфологических красителей природного происхождения. Наиболее богаты биохромами представители семейств: лютиковых (Rhanunculaceae), луносемянниковых (Menispermaceae Iuss.), и розоцветных (Rosaceae). Сырьем для получения пигментов являются зрелые плоды.

2. Помимо дикорастущих растений изучено и внедрено в морфологическую практику обладающее красящими свойствами и широко культивируемое на территории всей нашей страны растение -лук репчатый (Allium сера L.) разных сортов. В качестве сырья для получения биохромов используются сухие покровные чешуи луковицы лука репчатого.

3. С помощью метода тонкослойной хроматографии на силуфольных пластинках, а также цветных реакций водных экстрактов из покровных чешуи луковицы лука репчатого и спиртовых растворов из зрелых плодов воронца заостренного (Actaea acuminata Wall.), луносемянника даурского (Menispermum dahuricum DC.), черемухи

Маака (Padus maackii (Rupr.) Кот.), марены сердцелистной лесной (Rubia cordifolia f. silvatica Maxim.) изучен химический состав пигментов, определяющих окраску основных тканевых и клеточных структур.

4. С целью совершенствования гистологической техники и расширения морфологического метода исследования нами получены гистологические красители высокого качества для нефиксированных тканей и органов животного и растительного происхождения.

5. Биохромы представителей флоры Приморского края позволяют выявлять клеточные и тканевые структуры кислой природы, весьма действенны в технологии производства основных морфологических красителей для выявления ядер и ядерных структур.

6. Основной краситель, изготовленный на основе пигментов из зрелых плодов черемухи Маака, позволяет выявлять политенные хромосомы на классических опытных объектах с тонкой дифференциацией структур.

7. Новые основные морфологические красители отличаются высокой информативной достоверностью, выражающейся в четкой и тонкой характеристике основных структур как животных, так и растительных тканей.

8. Проведенный цито- и кариометрический сравнительный анализ каждого из полученных нами красителей с классическим, широко используемым красителем - гематоксилином, показывает индивидуальность и своеобразие каждого из них, и в то же время, имеется тождественность в конечном результате.

9. Широкий диапазон исследуемых таксономических объектов растительного и животного происхождения, в частности диких и домашних млекопитающих, ткани которых использовались в опытах позволяют сделать вывод о перспективности использования предлагаемых нами красителей для морфологического анализа в научных исследованиях и учебном процессе.

10. Предлагаемые нами способы получения биохромов, а также методика работы с ними, рекомендованы для внедрения в гистологическую технику в качестве основных красителей. Впервые на территории нашей страны определена сырьевая база растительного происхождения для получения стойких высококачественных естественных красящих веществ.

Практические предложения

Результаты собственных исследований мы рекомендуем для использования:

- при написании соответствующих разделов и справочных руководств по пигментам растительного происхождения;

- в научно-исследовательских лабораториях, занимающихся изучением вопросов по общей и частной гистологии домашних и диких животных;

- на лабораторно-практических занятиях по цитологии, связанных с техникой приготовления постоянных и временных гистологических препаратов, а также гистологии и генетике с целью выявления ядерных структур и хромосом с использованием основных гистологических красителей, приготовленных из растительного сырья южной флоры Приморского края.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Лапшин Л.В., Момот Н.В. Модифицированный способ получения гистологических красителей из растительного сырья // Сообщение на межвуз. Науч. конф. «Достижения эволюционной возрастной и экологической морфологии - практике медицины и ветеринарии (12-13 июня 1987 г.).

2. Момот Н.В. Способ окраски политенных хромосом насекомых / Н.В. Момот, Л.В. Лапшин, Н.Н. Мешков // Открытия, изобретения: Офиц. госуд. бюлл. комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР. - М.: Всесоюзный НИИ патентной информации, 1991. - № 40. - С. 172.

3. Момот Н.В., Лапшин Л.В. Способ получения красителя для гистологических целей // Изобретения: Офиц. патентный бюлл. -М.: НПО Поиск, 1992. - № 46. - С.105.

4. Лапшин Л.В., Момот Н.В. Способ окраски политенных хромосом насекомых / VII Арсеньевские чтения // Сб. науч. тр. / Уссурийский госуд. пед. ин-т. - Уссурийск, 1993. - С.62-64.

5. Момот Н.В., Лапшин Л.В. Сравнительная морфология подчелюстной слюнной железы дикого кабана и домашней свиньи // Проблемы эволюционной сравнительной и функциональной морфологии домашних животных клеточного содержания: Сб. материалов республ. науч. конф., посвященной 100-летию проф. А.И. Акаевского / ОмСХИ. - Омск, 1993. - С.64-65.

6. Момот Н.В., Лапшин Л.В. Структурно-функциональные особенности строения подчелюстной слюнной железы пятнистого оленя // Физиология и патология животных: Сб. науч. тр. / Приморский СХИ. - Уссурийск, 1993. - С.41-43.

7. Момот Н.В., Лапшин Л.В. Методика выявления ядерных структур гистокрасителем из воронца заостренного // VII Арсеньевские чтения // Сб. науч. тр. / Уссурийский госуд. пед. ин-т. -Уссурийск, 1993.-С. 135-136.

8. Момот Н.В., Лапшин Л.В. Методика выявления ядерных структур гистокрасителем из черемухи Маака // Проблемы ветеринарии Приморского края: Сб. науч. тр. / Приморская ГСХА. -Уссурийск, 1996. - С.27-29.

9. Лапшин Л.В., Момот Н.В. Красящие вещества из покровных чешуи луковицы лука // Проблемы ветеринарии Приморского края: Сб. науч. тр. / Приморская ГСХА. - Уссурийск, 1996. -С.25-27.

10. Момот Н.В. Выявление ядерных структур гистокрасителем из луносемянника даурского / Н.В. Момот, Л.В. Лапшин, Л.В. Жилякова // Наука в образовательном процессе ВУЗа: Материалы междунар. научно-метод. конф. / Приморская ГСХА. -Уссурийск, 1997.-Ч.2.-С.154-156.

11. Момот Н.В., Лапшин Л.В. Красители растительного происхождения в морфологии // Материалы междунар. конф. ветеринарных морфологов / Бурятская ГСХА. — Улан-Удэ, 1998. -С.178-180.

12. Лапшин Л.В., Момот Ю.А. Практическое применение биохромов в биологии // Материалы междунар. койф. ветеринарных морфологов / Бурятская ГСХА. - Улан-Удэ, 1998. - С. 143-145.

13. Использование технических свойств растений / Н.В. Момот, Л.В. Лапшин, Л.В. Жилякова, Г.В. Иванчук // Леса и лесообразовательный процесс на Дальнем Востоке: Материалы междунар. конф. / Бислого-почвенный ин-т ДВО РАН. -Владивосток, 1999.-С.243-244.

14. Лапшин Л.В. Использование антоцианов в биологических исследованиях // Перспективы сотрудничества Российских аграрных учебных заведений со странами АТР: Материалы междунар. региональной науч. конф. / Приморская ГСХА. -Уссурийск, 1999.-С.113-115.

15. Лапшин Л.В. Мелкодиспергированные красители для морфологических исследований // Морфология, физиология и патология животных: Сб. науч. тр. / Приморская ГСХА. -Уссурийск, 2000. - С.34-37.

16. Мешков Н.Н. Индикаторные свойства пигментов некоторых растений / Н.Н. Мешков, Н.В. Момот, Л.В. Лапшин // Морфология, физиология и патология животных: Сб. науч. тр. / Приморская ГСХА. - Уссурийск, 2000. - С.26-29.

17. Момот Н.В., Лапшин Л.В. Приготовление временного препарата эпидермиса сочных чешуи луковицы лука репчатого // Морфология, физиология и патология животных: Сб. науч. тр. / Приморская ГСХА. - Уссурийск, 20QQ. - С.41-42.

18. Лапшин Л.В., Момот Н.В. Сравнительный цито- и кариометрический анализ двух основных красителей: черемухи Маака (Padus maackii (Rupr.) Kom.) и гематоксилина // Достижения эволюционной, возрастной и- экологической морфологии - практике медицины и ветеринарии: Материалы междунар. науч.-практ. конф. морфологов, посвящ. Памяти Ю.Ф. Юдичева (12-14 сент. 2001 г.): Сб. науч. тр. - Омск: ОГМА, 2001. -С.187-189.

19. К морфологии подчелюстной слюнной железы млекопитающих / Н.В. Момот, Л.В. Лапшин, Ю.А. Момот,, Л.В. Жилякова, СВ. Теребова // Незаразные болезни сельскохозяйственных животных: Материалы междунар. науч. конф. / Бурятская ГСХА. - Улан-Удэ, 2001.-С.180-181.

20. Момот Н.В., Лапшин Л.В. Сравнительный биометрический анализ при окрашивании гистопрепаратов луносемянником даурским (Menispermum dahuricum DC.) и гематоксилином // Достижения эволюционной возрастной и экологической морфологии - практике медицины и ветеринарии: Материалы междунар. науч.-практ. конф. морфологов, посвящ. памяти Ю.Ф. Юдичева (12-14 сент. 2001 г.) / Сб. науч. тр. - Омск: ОГМА, 2001. -С.191-192.

21. Качественный анализ секрета подчелюстной слюнной железы млекопитающих / Н.В. Момот, Л.В. Лапшин, Л.В. Жилякова, СВ. Теребова // Достижения эволюционной возрастной и

экологической морфологии - практике медицины и ветеринарии: Материалы междунар. науч.-практ. конф. морфологов, посвящ. памяти Ю.Ф. Юдичева (12-14 сент. 2001 г.) / Сб. науч. тр. - Омск: ОГМА, 2001.-С. 194-195.

22. Лапшин Л.В. Сравнительная вариационная оценка гистоструктур при окрашивании воронцом заостренным (Actaea acuminata Wall.) и гематоксилин-эозином // Аграрная политика и технология производства сельскохозяйственной продукции в странах АТР: Материалы междунар. науч.-практ. конф. / Лесное хозяйство, ветеринария, животноводство, механизация, филология / Приморская ГСХА. - Уссурийск, 2002. - Т.З. - С. 244-246.

23. Момот Н.В., Лапшин Л.В. Сравнительный биометрический анализ при окрашивании гистопрепаратов мареной сердцелистной лесной (Rubia cordifolia f. silvatica Maxim.) и гематоксилин-эозином // Аграрная политика и технология производства сельскохозяйственной продукции в странах АТР: Материалы междунар. науч.-практ. конф. / Лесное хозяйство, ветеринария, животноводство, механизация, филология / Приморская ГСХА. - Уссурийск, 2002. - Т.З. - С.242-244.

24. А. с. 1597376. Способ получения красителя из растительного сырья / Н.В. Момот, Л.В. Лапшин, Н.Н. Мешков. - Опубл. 1990.

25. А. с. 1688163. Способ окраски политенных хромосом насекомых / Н.В. Момот, Л.В. Лапшин, Н.Н. Мешков. - Опубл. 1991.

26. А. с. 1781259. Способ получения красителя для гистологических целей / Н.В. Момот, Л.В. Лапшин. - Опубл. 1992.

27. Патент 2092018 РФ (Роспатент) на изобретение: Способ идентификации хромосом растительных клеток / Н.В. Момот, Л.В. Лапшин. - Опубл. 1997.

28. Патент 2078105 РФ (Роспатент) на изобретение: Способ получения красителя из растительного сырья / Н.В. Момот, Л.В. Лапшин. - Опубл. 1997.

29. Патент 2098440 РФ (Роспатент) на изобретение: Способ получения красителя для гистологических целей / Н.В. Момот, Л.В. Лапшин. - Опубл. 1997.

30. Момот Н.В., Лапшин Л.В., Мешков Н.Н. Способ получения красителя из растительного сырья / Н.В. Момот, Л.В. Лапшин, Н.Н. Мешков // Информационный листок 283-89. Приморский межотраслевой ЦНТИ. - Владивосток, 1989.

31. Момот Н.В., Лапшин Л.В. Способ получения красителя из растительного сырья // Информационный листок 52-89. Приморский межотраслевой ЦНТИ. - Владивосток, 1989.

32. Момот Н.В., Лапшин Л.В., Мешков Н.Н. Способ окраски политенных хромосом насекомых / Н.В. Момот, Л.В. Лапшин, Н.Н. Мешков // Информационный листок 79-92. Приморский, межотраслевой ЦНТИ. - Владивосток, 1992.

33. Лапшин Л.В. Способ выявления хромосом в животных клетках на лабораторно-практических занятиях по биологическим дисциплинам / Рац. предлож. № 253-151. Приморская ГСХА. -Уссурийск, 1990.

34. Лапшин Л.В. Способ получения красителя из черемухи Маака и его использование для гистологических целей / Рац. предлож. № 252-150. Приморская ГСХА. - Уссурийск, 1990.

35. Лапшин Л.В. Методика выделения хромосом в растительных клетках / Рац. предлож. № 1-98. Приморская ГСХА. - Уссурийск, 1998.

36. Лапшин Л.В. Использование свойств луносемянника даурского как основного красителя / Рац. предлож. № 2-98. Приморская ГСХА. - Уссурийск, 1998.

37. Лапшин Л.В. Использование луносемянника даурского в гистологической технике / Рац. предлож. № 3-98. Приморская ГСХА. - Уссурийск, 1998.

38. Лапшин Л.В. Изыскание в природе и разведение биологических объектов с гигантскими хромосомами / Рац. предлож. № 6-98. Приморская ГСХА. - Уссурийск, 1998.

39. Лапшин Л.В. Методический подход по выявлению ядерных структур красителем из покровных чешуи лука репчатого / Рац. предлож. № 7-98. Приморская ГСХА. - Уссурийск, 1998. *

40. Лапшин Л.В. Методика окрашивания ядерных структур мареной сердцелистной лесной / Рац. предлож. .№ 01-99. Приморская ГСХА. - Уссурийск, 1999.

4 К Лапшин Л.В. Воронец заостренный и его красящие свойства по выявлению ядерных структур животных / Рац. предлож. № 02-99. Приморская ГСХА. - Уссурийск, 1999.

| »ОС НАЦИОНАЛЬНАЯ) 1 ВМКДИОТЕКА 1 I СЯмсИЯК 3

1 Л

На правах рукописи

ЛАПШИН ЛЕВ ВАСИЛЬЕВИЧ

БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ПРИМЕНЕНИЯ БИОХРОМОВ В МОРФОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ

16.00.02 - патология, онкология и морфология животных

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Лицензия № 020572 от 16,09,97 г. Подписано в печать 22.09.2004 Формат 60X84 1/16. Бумага офсетная Печать ЯКООЯАРИ ТЯ 1510. уч.-изд. л. Тираж 100 экз. заказ № 385

Приморская государственная сельскохозяйственная академия _692510 г. Уссурийск, пр. Блюхера, 44_

Участок оперативной полиграфии Приморской гос. с.-х. академии 692500 г/Уссурийск, ул. Раздольная, 8

»20 3 2 1

РЖ Русский фонд

2005-4 22516

Актуальность темы. Проблема посвящена получению биохромов из растительного сырья, исследованию и применению их красящих свойств на различных биологических объектах.

Интенсивное развитие одного из важнейших направлений в биологии по изучению биохромов в начале 20-го века связано с работами М.С. Цвета (1910) по созданию метода адсорбционного хроматографического анализа, который позволил дифференцировать природные пигменты, и положил начало их систематизации. Эти исследования продолжили В.Н. Любименко (1916, 1935); В.Н. Любименко, В.А. Бриллиант (1924); В.Н. Столетов (1945); К.А. Тимирязев (1948) и др.

С 30-х годов прошлого столетия развернулись исследования роли каротиноидов и флавоноидов в фотосинтетических процессах, в физиологии и биохимии живых организмов (Будницкая Е.В., Овчаров К.Е., 1950; Данжар П., 1950; Рубин Б.А., 1954; Эмме A.M., 1958; Рабинович Е., 1959; Генкель П.А., Сенченкова Е.М., 1975; Иванов Б.П., 1982; Лебедев Т.С., Сытник К.М., 1986 и др.; Bech R., 1965).

Актуальность исследования биохромов определяется широким их использованием как экологически чистых основных морфологических красителей для решения различных задач в биологии. В качестве красителей природные пигменты используются для выявления ядер и ядерных структур клеток животных и растений.

Современная микроскопическая техника обладает широким арсеналом красителей, часть из которых имеет природное происхождение. Пополнение морфологического метода исследований новыми красителями растительного происхождения будет продолжаться и в дальнейшем, так как пигментов растительного происхождения известно более 2000, а используется же немногим более 100.

В настоящее время разрабатываются следующие прикладные аспекты использования биохромов: применение их в цитологии и гистологии для морфологической характеристики клеток и тканей в норме и при патологии, исследование потенциальных их свойств в растворах и в сухом виде при анализе гистоструктуры животных и растительных организмов, изучение химического состава водных и спиртовых экстрактов, приготовленных из различного сырья.

Целью настоящего исследования является изучение эколого-биологических особенностей флавоноидо- и каротиноидосодержащего растительного сырья флоры юга Приморского края для практического применения в морфологии.

Задачи исследования:

1. Изыскание новых природных источников для получения растительных биохромов флоры юга Дальнего Востока.

2. Получение флавоноидо- и каротиноидосодержащих пигментов, являющихся основой красителей, для выявления микроструктуры животных и растительных организмов.

3. Разработка методических подходов при работе с новыми морфологическими красителями на различных биологических объектах, исследование их свойств на клеточном уровне.

Решение этих задач осуществлялось с помощью морфологических, микрометрических методов исследования и биометрического анализа.

Теоретическое и научно-практическое значение работы. Разработанные нами методические подходы к анализу микроструктуры животных и растительных клеток с помощью предложенных эффективных основных гистологических красителей значительно расширяют морфологический метод исследования, который открывает новые возможности для изучения гистоструктуры. Предлагаемые нами способы получения отечественных красителей могут служить основой для промышленной технологии производства гистологических красителей.

На основании изучения химического состава растительного сырья флоры юга Приморского края теоретически возможно использование биохромов не только в качестве красителей, но и для создания действенных лечебных и профилактических средств в ветеринарной медицине.

Сравнение испытуемых биохромов на фоне их биологических, химических и морфологических свойств позволит дополнить сведения об этих природных комплексах, расширить наши знания об их взаимосвязях и систематизации.

Научная новизна. Впервые для получения устойчивых биохромов проведен поиск флавоноидосодержащих растений на юге Дальнего Востока. В региональной флоре такими растениями являются черемуха Маака из семейства розоцветных, воронец заостренный из семейства лютиковых, марена сердцелистная лесная из семейства маренных, луносемянник даурский из семейства луносемянниковых.

Для получения основных гистологических красителей использовалось растительное сырье из природных местообитаний юга Приморского края, ранее не употреблявшееся ни в пищевой, ни в биологической промышленности.

Созданные нами красители широко можно использовать как основные гистологические для получения достоверных результатов в функциональной, возрастной и экологической морфологии.

По теме диссертационной работы имеется 41 публикация, в том числе сообщений на различных международных научно-практических конференциях и в специальных центральных журналах - 15, по материалам работы, связанным с совершенствованием техники и методики исследований, оформлено авторских свидетельств на изобретения и патентов - 6, информационных листков - 3 и рационализаторских предложений -9.

Тема научного исследования обсуждена и утверждена на ученом совете Приморской государственной сельскохозяйственной академии 24 ноября 1997 года (протокол №3) и имеет номер государственной регистрации 01.9.80 000366.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Эколого-биологические особенности перспективных растений юга Приморского края и способы получения из них устойчивых биохромов.

2. Получение основных эффективных отечественных красителей для выявления клеточных структур растительных и животных тканей.

3. Методические подходы при работе с основными морфологическими красителями.

Апробация работы. Материалы исследований доложены и одобрены на всесоюзной научной конференции морфологов «Экологические аспекты эволюционной, функциональной и возрастной морфологии человека и домашних животных», посвященной 100-летию со дня рождения профессора А.Е.Ефимова (Омск, 1987); на республиканской научной конференции ветеринарных морфологов, посвященной 100-летию со дня рождения заслуженного деятеля науки РСФСР, профессора А.И.Акаевского (Омск, 1993); на научной конференции «Арсеньевские чтения» (Уссурийск, 1993); на международной научно-производственной конференции «Наука в образовательном процессе вуза» (Уссурийск, 1997); на научно-методических конференциях Приморской государственной сельскохозяйственной академии (Уссурийск, 1992, 1994, 1998, 2000); на международной конференции ветеринарных морфологов (Улан-Удэ, 1998, 2001); на международной конференции «Леса и лесообразовательный процесс на Дальнем Востоке», посвященной 90-летию со дня рождения член-корреспондента РАН Б.П.Колесникова (Владивосток, 1999); на международной региональной научной конференции «Перспективы сотрудничества российских аграрных учебных заведений со странами Азиатско-Тихоокеанского региона» (Уссурийск, 1999); на международной научно-практической конференции морфологов «Достижения эволюционной, возрастной и экологической морфологии — практике медицины и ветеринарии», посвященной памяти академика Ю.Ф. Юдичева (Омск, 2001).

Реализация результатов исследования:

1. Результаты работы используются в учебном процессе при проведении лабораторно-практических занятий по теме «Техника приготовления гистологических препаратов» по цитологии, эмбриологии и гистологии, анатомии в Омском агроуниверситете и Омском институте ветеринарной медицины, в Уссурийском педагогическом институте, в Бурятской и Приморской сельскохозяйственных академиях.

2. Издано три информационных листка по способам получения красителя из растительного сырья: а) Момот Н.В., Лапшин J1.B., Мешков Н.Н. Способ получения красителя из растительного сырья / Информ. листок №283-89. Приморский межотраслевой ЦНТИ. Владивосток, 1989. б) Момот Н.В., Лапшин Л.В. Способ получения красителя из растительного сырья / Информ. листок №52-89. Приморский межотраслевой ЦНТИ. Владивосток, 1989. в) Момот Н.В., Лапшин Л.В., Мешков Н.Н. Способ окраски политенных хромосом насекомых / Информ. листок №79-92. Приморский межотраслевой ЦНТИ. Владивосток, 1992.

3. Получено девять удостоверений на рационализаторские предложения: а) Лапшин Л.В. Способ получения красителя из черемухи Маака и его использование для гистологических целей / Удостоверение на рационализаторское предложение, №252-150. Приморский государственный с.-х. институт, 1990. б) Лапшин JI.B. Способ выявления хромосом в животных клетках на лабораторно-практических занятиях по биологическим дисциплинам / Удостоверение на рационализаторское предложение, №253-151. Приморский государственный с.-х. институт, 1990. в) Лапшин Л.В. Методика выделения хромосом в растительных клетках / Удостоверение на рационализаторское предложение, №1-98. Приморская государственная с.-х. академия, 1998. г) Лапшин Л.В. Использование свойств луносемянника даурского как основного красителя / Удостоверение на рационализаторское предложение, №2-98. Приморская государственная с.-х. академия, 1998. д) Лапшин Л.В. Использование свойств луносемянника даурского в гистологической технике / Удостоверение на рационализаторское предложение, №3-98. Приморская государственная с.-х. академия, 1998. е) Лапшин Л.В. Изыскание в природе и разведение биологических объектов с гигантскими хромосомами / Удостоверение на рационализаторское предложение, №6-98. Приморская государственная с.-х. академия, 1998. ж) Лапшин Л.В. Методический подход по выявлению ядерных структур красителем из покровных чешуй лука репчатого / Удостоверение на рационализаторское предложение, №7-98. Приморская государственная с.-х. академия, 1998. з) Лапшин Л.В. Методика окрашивания ядерных структур мареной сердцелистной / Удостоверение на рационализаторское предложение, №01-99. Приморская государственная с.-х. академия, 1999. и) Лапшин Л.В. Воронец заостренный и его красящие свойства по выявлению ядерных структур животных / Удостоверение на рационализаторское предложение, №02-99. Приморская государственная с.-х. академия, 1999.

4. Получено шесть авторских свидетельств и патентов на изобретения: а) А.с. № 1597376 СССР. «Способ получения красителя из растительного сырья», 1990. б) А.с. № 1688163 СССР. «Способ окраски политенных хромосом насекомых», 1991. в) А.с. № 1781259 СССР. «Способ получения красителя для гистологических целей», 1992. г) Патент № 2078105 РФ (Роспатент) «Способ получения красителя из растительного сырья», 1997. д) Патент № 2092018 РФ (Роспатент) «Способ идентификации хромосом растительных клеток», 1997. е) Патент № 2098440 РФ (Роспатент) «Способ получения красителя для гистологических целей», 1997.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 215 страницах машинописного текста, иллюстрирована 43 графиками и микрофотографиями, 18 таблицами. Диссертация включает следующие разделы: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов, выводы и список литературы, содержащий 249 работ отечественных и 35 зарубежных авторов.

Выводы

1. Впервые в результате таксономического и биологического анализа растительности Приморского края нами были выделены антоцианосодержащие растения, перспективные для получения морфологических красителей природного происхождения. Наиболее богаты биохромами представители семейств: лютиковых (Rhanunculaceae), луносемянниковых (Menispermaceae Iuss.), и розоцветных (Rosaceae). Сырьем для получения пигментов являются зрелые плоды.

2. Помимо дикорастущих растений изучено и внедрено в морфологическую практику обладающее красящими свойствами и широко культивируемое на территории всей нашей страны растение - лук репчатый (Allium сера L.) разных сортов. В качестве сырья для получения биохромов используются сухие покровные чешуи луковицы лука репчатого.

3. С помощью метода тонкослойной хроматографии на си-луфольных пластинках, а также цветных реакций водных экстрактов из покровных чешуй луковицы лука репчатого и спиртовых растворов из зрелых плодов воронца заостренного (Actaea acuminata Wall.), луносемянника даурского (Menispermum dahuricum DC.), черемухи Маака (Padus maackii (Rupr.) Кот.), марены серд-целистной лесной (Rubia cordifolia f. silvatica Maxim.) изучен химический состав пигментов, определяющих окраску основных тканевых и клеточных структур.

4. С целью совершенствования гистологической техники и расширения морфологического метода исследования нами получены гистологические красители высокого качества для нефиксированных тканей и органов животного и растительного происхождения.

5. Биохромы представителей флоры Приморского края позволяют выявлять клеточные и тканевые структуры кислой природы, весьма действенны в технологии производства основных морфологических красителей для выявления ядер и ядерных структур.

6. Основной краситель, изготовленный на основе пигментов из зрелых плодов черемухи Маака, позволяет выявлять поли-тенные хромосомы на классических опытных объектах с тонкой дифференциацией структур.

7. Новые основные морфологические красители отличаются высокой информативной достоверностью, выражающейся в четкой и тонкой характеристике основных структур как животных, так и растительных тканей.

8. Проведенный цито- и кариометрический сравнительный анализ каждого из полученных нами красителей с классическим, широко используемым красителем — гематоксилином, показывает индивидуальность и своеобразие каждого из них, и в то же время, имеется тождественность в конечном результате.

9. Широкий диапазон исследуемых таксономических объектов растительного и животного происхождения, в частности диких и домашних млекопитающих, ткани которых использовались в опытах, позволяют сделать вывод о перспективности использования предлагаемых нами красителей для морфологического анализа в научных исследованиях и учебном процессе.

10. Предлагаемые нами способы получения биохромов, а также методика работы с ними, рекомендованы для внедрения в гистологическую технику в качестве основных красителей. Впервые на территории нашей страны определена сырьевая база растительного происхождения для получения стойких высококачественных естественных красящих веществ.

Практические предложения

Результаты собственных исследований мы рекомендуем для использования:

- при написании соответствующих разделов и справочных руководств по пигментам растительного происхождения;

- в научно-исследовательских лабораториях, занимающихся изучением вопросов по общей и частной гистологии домашних и диких животных;

- на лабораторно-практических занятиях по цитологии, связанных с техникой приготовления постоянных и временных гистологических препаратов, а также гистологии и генетике с целью выявления ядерных структур и хромосом с использованием основных гистологических красителей, приготовленных из растительного сырья южной флоры Приморского края.