Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Ассоциированное течение вирусного гепатита у утят и разработка экспресс-методов диагностики

інститут експериментальної та клінічної ВЕТЕРИНАРНОЇ медицини

На правах рукопису

ТЮТЧЕНКО Юрій Миколайович

УДК 619:616.9:636:597

АСОЦІЙОВАНИЙ ПЕРЕБІГ ВІРУСНОГО ГЕПАТИТУ КАЧЕНЯТ ! РОЗРОБКА ЕКСПРЕС МЕТОДІВ ДІАГНОСТИКИ

16.00.03 — ветеринарна мікробіологія, вірусологія, епізоотологія, мікологія і імунологія

* Автореферат

■: дисертації на здобуття вченого ступеня .

кандидата ветеринарних наук

Работа виконана в лабораторії кафедри вірусології і мікробіології Сумського сільськогосподарського інституту.

Науковий керівник: доктор ветеринарних наук, професор,

лауреат Державної премії України

І. І. Панікар.

Офіційні опоненти: доктор ветеринарних наук

Н. П. Чечеткіна кандидат ветеринарних наук, доцент В. К. Смолянінов.

Провідне підприємство: Український аграрний університет.

Захист дисертації відбудеться « О Л 199Я р.

в —2— годин на засіданні спеціалізовано'/ ради Д 020.68.81 при інституті експериментальної і клінічної ветеринарної медицини за адресою: 310023, Харків-23, вул. Пушкінська, 83.

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці ІЕКВМ.

У & /?' ^

Автореферат розісланий « 1993 р

Вчений секретар спеціалізованої Ради, доктор ветеринарних наук

К. Є. Конаржевсьний.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА.

Актуальність теми. В забезпеченні населення продуктами харчування велика роль належить птахівництву, особливо качківництву. Розвитку цієї галузі перешкоджають заразні захворювання, зокрема — вірусний гепатит каченят, що реєструється майже в усіх областях України. Економічні збитки дуже великі, тому що тільки загибель каченят від цієї інфекції в первинних очагах сягає 90%. Останні роки з’явились повідомлення про те, що вірусний гепатит перебігає в асоціації із збудниками бактеріальної, вірусної і грибкової етіології з неясними клінічними ознаками і па-тологоапатомічними змінами (Б. Ф. Бессарабов, 1967,Rafa:e EL—¡R , 1981; И. И. Паникар, 1981, 1987; .isiaüß ¡Jm jiu, , 1990). Було відзначено, що при асоційованому перебігу вірусного гепатиту каченят ускладнювалась своєчасна діагностика.

Розробці клініко-епізоотологічної, патологоанатомічної і вірусологічної'діагностики при вірусному гепатиті каченят, що перебігає у вигляді моноінфекцій, присвячено ряд робіт ( Р. D. Aspb'n,

Л D. Mc. Lauch! ir„ 1954; И. H. Дорошко с соавт., 19Б0, 1965; ; F, LT.. ¡ch, , 1971, A. Farid, , M. A. Shajabl,

Tantavi H. H., 1974; M. K. Скоробагатько, 1975;

И. И. Паникар, 1983, 1987). '

Після встановлення попереднього діагнозу за епізоотологіч- -їїими, клінічними і патологоанатомічними даними проводиться і лабораторне підтвердження його. Дослідження в облветлаборато-ріях проводились загальноприйнятим методом: ізоляція вірусу на курячих ембіонах, ідентифікація в реакції нейтралізації і 'біоп-роба на каченятах. Однак лабораторна діагностика вимагає багато часу, великої кількості ембріонів і качиного молодняка.

Велика контагіозність захворювання, гострий перебіг і наявність змішаних інфекцій вимагали швидкого встановлення діагнозу, що досягається в'основному експресс-методами діагностики.

Є багато повідомлень про метод флюоресціюючих антитіл при експрес-діагностиці різних захворювань ( Warane: P. et аі. - ,

1978; И. Сизов, Т. Игнатов, 1979; А. С. Алиев, 1983; Т. М. Бабурина, Ю. В. Пантелеев, Л. И. Бугаева, 1987; Н. П. Чечеткина,

1988; И. Ф. Вишняков, Н. Ю. Кукоров, В. В. Куринов, Л. Я. Олейник, 1990 и др.) і імуноферментний аналіз (М. Фадель, Г. А. Надточей, Л. М. Контримавичус, А. В. Суворов, 1989; Э. Д. Джа-вадов, А. С. Алиев, А. С. Кудрявцев и др., 1987; В. А. Лукина,

А. А. Бойко, И. К. Авдосьева, 1989). Було відмічено, що обробка

і

мазків-відбитків флюоресціюючими антитілами дозволяє виявити вірусні антигени і проводити таким чином лабораторну діагностику вірусних захворювань. '

Є окремі повідомлення про розробку і лабораторні випробування експрес-методів діагностики при вірусному гбпатиті каченят — РДП, МФА, РИГА (А. И. Куриленко, 1968; С. И. Кот, 1969; Г. П. Демаков, В. Н. Огородникова, 1980, Г. В. Малиновская, 1981). Дослідники вказали на можливість використання цих методів для експрес-діагностики вірусного гепатиту каченят. Слід відмітити, що розробки МФА торкались непрямого методу (А. И. Куриленко, 1968; Г. П. Демаков, 1975; Ж. Т. Султанян, 1975; A.A. Маловастая, П. П. Шилкин, 1986). Повідомлень про прямий метод флюоресціюючих антитіл/і імуноферментний аналіз для діагностики вірусного гепатиту каченят, крім первинних розробок на кафедрі вірусології і мікробіології Сумського СГІ, в доступній нам літературі ми не знайшли. ‘ -

Таким чином, вірусний гепатит каченят при асоційованому перебігу проявляється неясними ознаками і патологоанатомічними змінами і діагностика захворювання загальноприйнятими методами у виробничих ветлабораторіях утруднена, а експрес-методи не використовуються. Із-за несвоєчасної діагностики знижується ефективність профілактики і заходів боротьби.

Мета і завдання досліджень. Метою нашої роботи було: вивчити особливості асоційованого перебігу вірусного гепатиту каченят, дати оцінку загальноприйнятим методам діагностики, одержати специфічний препарат для експрес-діагностики МФА і ІФА. Мали намір вивчити їх в лабораторних умовах, а більш легкий у виконанні МФА запропонувати для широкої виробничої перевірки в умовах ветлабораторій ряду областей України:

Для досягнення мети були поставлені такі завдання:

1.. Вивчити ті методи, що застосовуються для діагностики вірусного гепатиту каченят при моно- і асоційованому перебігу з іншими захворюваннями, встановити ефективність, застосовуваних методів діагностики і дати їм оцінку.

2. Одержати діагностикуми для МФА і ІФА, вивчити їх в лабораторних умовах з встановленням специфічності і придатності для експрес-діагностики вірусного гепатиту каченят.

3. Випробувати у виробничих умовах МФА і підготувати ма-

теріали для його впровадження в науково-виробничих облветла-бораторіях. , ■

. Наукова новизна. Вперше одержані діагностпкуми для прямого МФА і ІФА при вірусному гепатиті каченят, дали їм епізоотологічну оцінку при асоційованому перебігу вірусного гепатиту каченят з іншими захворюваннями. Вперше показана можливість використання для експрес-діагностики цієї хвороби прямого методу ІФА без контрастування фону. Показана специфічність діагностикумів МФА і ІФА. Встановлено, що типова клініко-епізоотологічна ознака вірусного гепатиту каченят — характерна динаміка загибелі молодняка — може використовуватися для діагностики захворювання при асоційованому .перебігу. Для лабораторного підтвердження вірусного гепатиту каченят в умовах науково-виробничих лабораторій запропонований прямий метод флюоресціюючші антитіл як експрес-мегод. .

Практична цінність. Дані, що були одержані, доповнюють відомості про клініко-епізоотологічні особливості вірусного гепатиту каченят при асоційованому перебігу і можуть бути тестами при діагностиці і диференціальній діагностиці вірусного гепатиту каченят. Проведене порівняльне вивчення ефективності методів діагностики і рекомендується для експрес-діагностики вірусного гепатиту каченят МФА. Результати дослідження можуть бути використані в науково-виробничих облветлабораторіях, науковій роботі і при вивченні відповідних розділів «Ветеринарної вірусології» і «Епізоотології». ,

Апробація роботи. Основні матеріали дисертаційної роботи доповідались на річних, наукових конференціях Сумського СГІ (1991-1993 p.p.), опубліковані в матеріалах 9-го Міжнародного симпозіуму по водоплавній птиці (Італія, м. Піза, 1992 p.). Викладені на семінарі-нараді ветлікарів Сумської області (1993 p.). Стенд про застосування МФА в діагностиці вірусного гепатиту каченят демонструвався на «Виставці-продажу завершених наукових розробок» в м. Києві (1992 p.).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 4 роботи.

Структура і обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, власних досліджень, обговорення результатів, висновків, практичних пропозицій, сииска літератури і додатку. Робота викладена па 108 сторінках машинописного тексту, ілюстрована 16 таблицями, 7 графіками. Список літератури складається із 167 джерел, із них 66 іноземних. . -

В додатку наведено 7 документів, що підтверджують окремі етапи роботи, їх наукову і практичну цінність. '

З

2. ВЛАСНІ ДОСЛІДЖЕННЯ.

2.1. Матеріали і методи.

Вивчення епізоотології вірусного гепатиту каченят. Дослідження проводились в умовах неблагополучних господарств, обл-ветлабораторій і вірусологічної лабораторії кафедри вірусології і мікробіології Сумського СГІ. Епізоотологія вірусного гепатиту каченят була вивчена в п’яти областях України: Сумській, До-

нецькій, Чернігівській, Кримській і Дніпропетровській. Використовувався метод епізоотологічного обстеження і експерименту (Бакулов И. А., Юрков Г. Г., Песковацков А. П., Ведерников В. А., 1982). Вивчались і реєструвались клініко-епізоотологічні, патоло-гоанатомічні з'мінн, виділялись збудники хвороб і вивчались їх властивості. Для аналізу матеріалів використовувались дані ветеринарної статистики, експертизи ветлабораторій і дані безпосереднього обстеження птахогосподарств з проведенням відповідних вірусологічних^ бактеріологічних, мікологічних і ін. досліджень.

Об’єкти досліджень. При виїздах обстежено по два качиних господарства вказаних областей України. Клініко-епізоотологічно обстежено 48000 каченят .і качок, та піддані розтину більше 400 голів. При лабораторній діагностиці і підтриманні вірусних штамів'використано понад 800 курячих ембріонів. При лабораторних дослідженнях МФА і'ІФА було використано понад 100 проб печінок різних видів тварин і птиці.

Одержання специфічної сироватки. Гіперімунну сироватку проти вірусного гепатиту каченят одержували в умовах віварію (па 28 головах качок) Сумського СГІ і в лабораторіях кафедри вірусології і мікробіології. Титр антитіл (ІЕД50) визначали в реакції нейтралізації, при цьому використовували постійну дозу вірусу (ЕДД50) і дворазове розведення сироватки. ЕЛД50 і ІЕД50 розраховували за методом Ріда і Менча.

Виготовлення діагностикумів складалось з кількох етапів:

1) одержання гіперімунної сироватки; . •

2) виділення гама-глобулінів із гіперімунних сироваток;

3) мічення гама-глобулінів, флюорохромом за І. Ф. Михайло-вим (1968) або пероксидазою" (за методом ^та1?апе Р. X,

. Ка\уаоі А. ', 1974);

4) очищення кон’югату від вільного барвника;

5) ,.контроль якості кон’югату; .

6) консервування і ліофілізація кои’югованих гама-глобулінів.

Виготовляли діагностикуми в умовах центральної заводської лабораторії Покровського заводу біопрепаратів Володнмирської області. Діагностикуи з «Інструкцією» по застосуванню були розіслані в .облветлабораторії України. Проводилась і спільна пе-. ревірка діагиостикума при виїздах до облветлабораторін. Діаг-ностикум для МФА після комісійних випробувань був перевірений в виробничих умовах!

2.2. Епізоотологія вірусного гепатиту каченят і ефективність методів лабораторної діагностики.

Вірусний гепатит каченят реєструвався протягом останніх 10 -років в цілому ряді областей України. Аналіз даних облветлабо-раторій свідчить про те, що підтвердження діагнозу на вірусний гепатит не завжди здійснювалось. Так, із 11737 відправлених за 10 років проб, позитивних було тільки 468, або 3,99%. Направлення великої кількості проб патматеріалу для дослідження на вірусний гепатит каченят пов’язане з тим, що захворювання перебігало з неясними ознаками і в асоціації з іншими захворюваннями,. . а діагноз за клініко-епізоотологічшши і патологоанатомічними ознаками па вірусний гепатит каченят іноді ставився помилково. Кількість позитивних па вірусний гепатит каченят результатів за 1982- 1992 роки коливалось від 0,64 до 13%.

Епізоотологічні особливості і ефективність діагностики вірусного гепатиту каченят вивчена нами в окремих господарствах областей України. Березпянська птахофабрика Менського району Чернігівської області неблагополучна по вірусному гепатиту каченят з 1986 року. Захворювання каченят з неясними клінічнії-' ми ознаками і патологоанатомічними змінами і підвищеною загибеллю відмічені в пташниках наприкінці квітня—на початку травня 1990 року. Максимальна загибель каченят становила в пташнику № 14 — 272 голови, № 19 — 336 голів, № 18 — 750 голів,'. № 16— 1030 голів. ■

Для лабораторних досліджень багато разів направлялись трупи каченят в Менську районну, Чернігівську обласну і Київську міжобласну ветеринарні лабораторії.

Характерна для вірусного гепатиту каченят динаміка загибелі каченят дозволила припустити, що провідна роль в асоціації збудників захворювання каченят належала вірусному гепатиту. Лабораторні дослідження, що були проведені вказаними вище лабораторіями, підтвердили діагноз тільки на сальмонельоз і аспергільоз. '

Нами для підтвердження діагнозу на вірусний гепатит каченят

В

були виготовлені мазки-відбитки із кусочків печінки від каченят, що загинули з характерними ознаками вірусного гепатиту із пташників № 16 і № 18. В лабораторії вірусології Сумського СІ 1 було проведене дослідження МФА, мазки були оброблені ФІТЦ-глобуліном. При вивченні мазків під люмінесцентним мікроскопод виявили характерне зеленкувате свічення. В контрольних мазках із печінки каченят благополучного господарства свічення не спостерігали.

Таким чином, при асоціації вірусного гепатиту каченят з сальмонельозом і аспергільозом діагноз на вірусний гепатит каченят був поставлений на підставі характерної для вірусного гепатиту каченят динаміки загибелі і підтверджений МФА.

В неблагополучному по вірусному гепатиту каченят птахорад-госпі «Менський» Менського району Чернігівської області вірусний .гепатит каченят перебігав в асоціації. В цьому господарстві, крім збудника вірусного гепатиту, була виділена сальмонела і аспергіла. В колгоспі 1-е Мая Лебединського району Сумської області зареєстрований один випадок аспергільозу в асоціації з вірусним гепатитом і іпшии — з сальмонельозом і аспергільозом. Діагноз підтверджений мікологічними і бактеріологічними дослідженнями. Однак діагноз на вірусний гепатит каченят початково був поставлений за характерною динамікою загибелі каченят і ефективності -специфічної профілактики (застосування з метою зниження загибелі протигепатнтної сироватки).

Асоціації збудників захворювань качок в 1990-1991 p.p. були вивчені в господарствах Сумської, Чернігівської, Черкаської, Харківської, Кримської областей. Зроблений аналіз матеріалу спалахів інфекційних захворювань качок з визначенням збудників, які викликають асоціативні захворювання. Встановлені такі асоціації збудників інфекційних захворювань качок: вірусного гепатиту, сальмонельозу,' разом з грипом, іноді з колібактеріозом (36,5%); сальмонельозу, аспергільозу і колібактеріозу (27,3%); вірусного гепатиту колібактеріозу, іноді аспергільозу (18,2%); коронавірусної інфекції з сальмонельозом (9%) і вірусного гепатиту з грипом (9%).- -

В 1993 році нами були зареєстровані спалахи вірусного гепатиту каченят в Дніпропетровській області. При вивченні епізоотологічної ситуації по птахорадгоспу. «П’ятихатський» П’ятихат-ського району Дніпропетровської області встановлено, що він не-благополучний по вірусному гепатиту каченят з 1970 року.

З 1975 року в птахорадгоспі «П’ятихатський» для специфічної

профілактики застосовують дворазову імунізацію качок маточпііл стад з метою .одержання каченят несприйнятливих до вірусного гепатиту. В березні 1993■року нами проведено вивчення спалаху вірусного гепатиту каченят в птахорадгоспі «П’ятнхатський». Встановлено, що випадки підвищеного відходу молодняка почастішали на початку цього року. У зв’язку з цим було проведене комісійне обстеження птахорадгоспу з участю співробітників ка* федри вірусології Сумського СГІ, зооветеринарної служби Пта-хопрому і радгоспу.

При патологоапатомічному розтині 100 трупів каченят із пташників № 1 (партія № 12), № 9 (партія № 10), Аг° 14 (партія №11), основні зміни виявляли в печінці: збільшення органу, неоднорідність забарвлення від охряно-жовтого до жовто-коричневого, дряблість, крапкові і плямисті крововиливи.

Із патматеріалу, що був відібраний від трупів партії № 5, рай-ветлаборагорією виділений збудник сальмонельозу і колібактеріозу, а із трупів каченят партії № 6 — збудник колібактеріозу.

. В графіку І показані порівняльні дані динаміки загибелі каченят при моно- і асоційованому перебігові вірусного гепатиту. Ці дані свідчать про те, що динаміка загибелі каченят по виводам, де вірусний гепатит перебігав у вигляді, моноінфекції (1), і виводам, де це захворювання перебігало в асоціації з сальмонельозом, аспергільозом і колібактеріозом (2 і 3), зберігалась при кожному спалаху захворювання. Так, наростання кількості загиблих відбувалось на 4-5 день, а поступове зниження кількості загиблих— на 7—8-й день. При асоційованому перебігові вірусного гепатиту кількість загиблих знову збільшувалась на 10—11-й день.

Графік 1

Дни гибели

Примітка: 1 — вірусний гепатит каченят — моноінфекція; ' 2 — вірусний гепатит в асоціації;

З—вірусний гепатит в асоціації.

І

■ и

Діагноз — вірусний гепатит каченят в птахорадгоспі ' «П’ятн-<атський» був поставлений нами на підставі клініко-епізоотологіч-іих даних з характерною динамікою загибелі каченят, патолого-інатомічною картиною для цього захворювання. Для вірусологіч-іих досліджень були відправлені трупи каченят в Дніпропетровську облветлабораторію, де і було проведене повне вірусологічне ;осліджения. Там же діагноз на вірусний гепатит каченят був під-'верджений за допомогою нашого діагпостикума методом флю-»ресціюючих антитіл. Таким чином, лабораторні дослідження, що іроведені в Дніпропетровській ветлабораторії з використанням іетоду флюоресціюючих антитіл підтвердили клініко-епізоотоло-ічний і патологоанатомічний діагноз.

Підсумовуючи дані, що викладені в ц,ьому розділі нашої ро-'Оти, можна коротко відзначити такі положення: вірусний гепатит :аченят в останні роки перебігав, у більшості випадків, в асоціа-иї з захворюваннями іншої етіології: сальмонельоз, колісептице-іія, аспергільоз і ін. Діагностика його була трудною із-за неяс-¡ої клінічної картини і патологоанатомічних змін, часто вимагала іагаторазових досліджень патматеріалу для лабораторного під-пердження діагнозу. -

Встановлено, що характерна для вірусного гепатиту динаміка агибелі каченят, яка виявляється при моноінфекції, може бути икорнстана і при асоційованому перебігові захворювання: паро-тання кількості загиблих в перші 2-3 дні, пік загибелі — на 4-5-й ень і зниження кількості загиблих до 8-12-го дня ензоотії.

Метод флюоресціюючих антитіл дозволяв протягом одного дня оботи лабораторії підтвердити діагноз на вірусний гепатит ка-енят.

2.3. Вивчення патогенності і імуногенності штамів вірусу гепа-иту каченят. На кафедрі вірусології і мікробіології Сумського П з 1986 року є аттенуйований штам вірусу гепатиту каченят М, який використовується для різних досліджень, зокрема, гіпе-імуиізації качок, постановки діагностичних досліджень по іден-тфікації вірусу і постановці перехресної реакції нейтралізації з етою встановлення серологічної спорідненості штамів, що виділяться. Використання цього штаму обумовлене тим, що біофаб-іки готують вакцину із цього аттепуйовапого штаму ЗМ. За 1990 ік було проведено 17 пасажів, за 1991 рік — 4 пасажи і в 1992 )ці — 4 пасажи, в 1993 році — два пасажи. При пасажуванні, у і’язку з необхідністю одержання великої кількості матеріалу,

о містить вірус, проводились повторні пасажи. 1

Слід відмітити, що в перших 20-ти пасажах на курячих ембріон; патогенність вірусу штам ЗМ хоч і була постійною, але загибел інфікованих ембріонів коливалась від 50-66 до 80-100%. Почі наючи з 20-го пасажу вірус штам ЗЛІ викликав загибель курячи ембріонів. .

. .Нами також вивчені біологічні властивості епізоотичного шт; му вірусу гепатиту каченят, що був виділений в радгоспі «Кролі вецький» Сумської області. В 1991-1992 роках на кафедрі вірусі логії і мікробіології Сумського СГІ з метою підтримання штам «С» тривали пасажи вірусу на 9-денних курячих ембріонах. І\< жний рік робили 4-5 пасажів. Для нас було цікавим у відпошеї ні штаму «С» з точки зору його серологічної спорідненості із шт; мом ЗМ і для зараження курячих ембріонів при випробувап одержаних нами діагностикумів. Вірус гепатиту штам «С» ви: вився серологічно спорідненим до штаму ЗМ. На заключній ст; дії роботи нами виділений ще один штам вірусу гепатиту качеіи при епізоотії цієї хвороби в итахорадгоспі «П’ятихатський» П’: тихатського району Дніпропетровської області. Штам виділені: і підтримується пасажувашіям на 9-денних курячих ембріонах, перехресній реакції нейтралізації він виявився спорідненим вірус штам ЗМ. Ізольований штам вірусу гепатиту каченят одержг назву штам «П».

З метою одержання гіперімунної сироватки випробовували а тенуйованіїй штам ЗМ вірусу гепатиту каченят. Нами проведе чотири досліди одержання гіперімунних сироваток. В кожний д< слід брали по 7 качок: п’ять голів використовували для гіперімуі зацїї, а дві голови залишали для контролю. Гіперімунізацію зді. снювали двічі в теплу і двічі в холодну пору. Було встановлеп що титр антитіл був вищий у качок, що імунізовані в холоді пору року. Так, титр сироваток, що одержані в березні, був 1:П і вище, а в червні—1:64. Встановлено, що чим вищий титр гінер мунної сироватки, тим більшу кількість діагностикуму одерж вали. '

2.4. Одержання і випробування діагностикумів при вірусно? гепатиті каченят. ФІТЦ-глобулін готували в умовах виробничо: цеху Покровського біозаводу Володимирської області Росії одержаної нами протигепатитної гіперімунної сироватки качо Нами виготовлено 8 серій ФІТЦ-глобуліну. Всі серії готувалиі однотипно, відповідно до вшценаведеної методики. .

З метою вивчення можливості діагностики вірусного гепати-каченят імуноферментним методом був виготовлений кон’юг; антитіл з пероксидазою. Нами було виготовлено 4 серії кон’юг

гу. Всі воші готувались однотипно. Потім визначали робоче роз-)едешія, розфасовували діагностикум в ампули і ліофільно вису-иували. Визначення робочого титру ФІТЦ-глобуліпу проводилось

і метою підібрати таке максимальне розведення діапюстикуму, ікє давало б свічення не менше два хрести. Готували мазки-від-іитки із печінки курячих ембріонів, що загинули після інфікуван-я вірусом гепатиту каченят штам ЗМ, і мазкп-відбитки із печінки езаражених курячих ембріонів. Фарбування мазків проводили рямим методом без контрастування фону. Мазки продивлялись ід імерсійним об’єктивом 90 люмінесцентного мікроскопу МЛ-2.

Розведення діапюстикуму, при якому виявляли в мазку не іенше 10-12 очажків свічення різної величини і конфігурації, риймали за робоче. За специфічне свічення приймали яскраво-елене або жовтувато-зелене свічення з оцінкою не нижче три рести за 4-бальною системою оцінки. Специфічний антиген роз-ашовувався в цитоплазмі і ядрі у вигляді глибок, шнурів ' або лям довільної конфігурації. В мазках-відбитках із печінки пе-аражених курячих ембріонів специфічного свічення не виявили.

Титри одержаних серій діапюстикуму коливались від 1:16 до :32 і самий високий титр 1:32 був одержаний в 3,4 і 8-й серії.

Для визначення робочого титру кон’югату антитіл з гіерокснда-)Ю готували мазки-відбитки із печінки курячих ембріонів, що ігинули після інфікування вірусом гепатиту штам ЗМ, і мазки-дбитки із печінки неінфікованих курячих ембріонів. Висушений іспарат покривали відповідним розведенням коп’югату антитіл на години при кімнатній температурі. .

При прогляданні препаратів із печінки курячих ембріонів, що ігішули від вірусу гепатиту каченят, в цитоплазмі клітин виявити дрібні гранули коричневого кольору і округлої форми. В од->му полі зору знаходили звичайно 100 і більше гранул різного ізміру. В контрольній групі мазків подібних гранул не виявля-

і. Титр діагностикума коливався' в межах від 1:16 до 1:28.

Вивчення специфічності ФІТЦ-глобуліну перевірено багато зів; використовували гомологічці і гетерологічні проби матері-у. Готувались мазки-відбитки із печінки різних видів птиці і арин. ‘

Встановлено, що було специфічне свічення в мазках, де при-тиій вірусний антиген. ФІТЦ-глобулін також не реагував як з анинами гомологічними, так і з гетерологічними. Таким чином, [ТЦ-глобулін виявився високоспецифічним, що ілюструється ними таблиці. і

і»мпямв№дджшахдаіад^:-»и-іі»іі» її чиїм »,) і їм м,, г, ,м , «^■■«г-1-тПі—„|Г^.-.-*^.- „, „

Номер мазка

4 | 5 6 7 8 9. | 1(

1. Печінка каченят,

інфікованих штамом «С» + + + + + + + + + +

2. Печінка каченят, '<

інфікованих штамом Ож + + + + + + + + + +

3. Печінка неінфі- "

кованих каченят — — — — — . — — — — —

4. Печінка каченят з ма- '

теринськими антитілами — — — — — — — — — —

5. Печінка курей — — — — — — — — — —

6. Печінка великої

рогатої худоби — — — — — — — — — —

7. Печінка свиней — — — — — — — — — —

Примітка « + »— свічення не менше 3 хрести; 15-30 плям свічек «—» — відсутність специфічного свічення

Вивчення специфічності кон’югсіту антитіл з пєроксидазо

Проведено два досліди з використанням гомологічного і гетеро./ гічного матеріалу. При наявності в мазках-відбитках специфічне вірусного антигену гепатиту каченят спостерігались характе] гранули коричневого кольору. В мазках-відбитках, що були обрс лені тим самим кон’югатом антитіл з пероксидазою, виготовлег із печінки неінфікованих ембріонів каченят, а також печінки кур1 таких коричневих гранул не виявляли.

Комісійні випробування діагностикума для МФА. На підст наказу ректора Сумського СГІ було проведене комісійне випро вання ФІТЦ-кон’югату антитіл до вірусу гепатиту каченят з мет визначення його активності, специфічності і можливості викор ташія його у виробничих умовах. ,

Комісія проаналізувала дані досліду і зробила висновок, .виготовлений ФІТЦ-кон’югат антитіл специфічний до вірусу ге титу каченят і може бути використаний в умовах виробничих вї ринарних лабораторій.

Виробнича перевірка діагностикума методом флюоресціюю антитіл. Діагностикум був розісланий у вірусологічні відділи ласних науково-виробничих веглабораторій таких областей: и

Мазки-відбитки група №

'¡вської, Херсонської, Сумської, Харківської, Кримської, Київсь-ї, Дніпропетровської і Донецької, а також у-ветлабораторії за жі України: в Литовську Республіканську лабораторію і міжоб-сні ветлабораторії хвороб птиці м. Казань і м. Бєлгород. Нами гржані повідомлення про позитивні результати випробувань на-іго діагиостикума із цих ветлабораторіп. Найдетальніше вітровали діапюстикум і надіслали письмове підтвердження із Цеит-льної Литовської лабораторії. Все це дозволяє констатувати, що готовлений нами ФІТЦ-кон’югат антитіл вірусу гепатиту каченят :пецнфічпнм і дає позитивні результати при дослідженні, прос-"і у застосуванні, прискорює підтвердження діагнозу. Все це доз-тяло швидко приймати відповідні профілактичні заходи в господствах. Нами проведене випробування методу флюоресціюючих гитіл при спалаху вірусного гепатиту каченят в птахорадгоспі ’ятихатськнй» Дніпропетровської області. Діагноз па вірусний іатит каченят був поставлений комісійно за’ епізоотологічними, нічними і патологоанатомічними даними. Забарвлення мазків-битків проводили ФІТЦ-глобуліпом проти вірусного гепатиту ка-іят, виготовленого 05.06. 1991 р., серія № 4 в розведенні 1:4. В жах із печінки каченят, що загинули, виявлені очаги свічення мої конфігурації в кількості 10-15 в полі зору, інтенсивністю сві-:пя до 3-х хрестів. В контролі — в' мазках із печінки неінфікова-; свічення не було. В лабораторії кафедри вірусології Сумсько-СГІ нами були повторені дослідження мазків-відбитків із пеки 7-денппх каченят із нтахорадгоспу «П’ятихатський». .У всіх іках-відбитках із печінки каченят, що мали характерні макро-пп після обробок ФІТЦ-глобуліном, виявляли характерне зелене їси а я. В контролі в мазках-відбитках із печінки неінфіковапих енят і курячих ембріонів ¡свічення не було.

Таким чином, ФІТЦ-кон’югат антитіл до вірусу гепатиту каче-; розробленшї нами, виявився високоспецифічішм і придатним впровадження в практику облветлабораторій України і інших жав СНД. На підставі узагальнених даних лабораторних і ви-ннчих випробувань методу флюоресціюючих антитіл нами підго-ана- «Інструкція» по діагностиці вірусного гепатиту каченят, нд з експрес-методом діагностики вірусного гепатиту каченят онструвався на «Виставці-продажу закінчених наукових роз-ок» — на території центра виставок та ярмарок України, м. Ки-•1992 р. .

В середньому на Україні за рік в одну облветлабораторію надить 3.2 проби для досліджень на вірусний гепатит каченят. Під-эвано, що 32 дослідження МФА дадуть економічну ефективність

697,6' тис. крб. у порівнянії! з загальноприйнятим методом діап тики. '

В И С Н О }В к и

1. Вірусний гепатит каченят в обстежених господарствах і

являвся неясними клінічними ознаками і патологоанатомічш змінами із-за асоційованого перебігу з захворюваннями. іншої > ології, що утруднювало діагностику і збільшувало строки лабс горних досліджень. '

2. Випадки підтвердження діагнозу на вірусііий гепатит к нят загальноприйнятими методами, як показав аналіз даних р< ти облветлабо.раторій України за 10 років, коливались в знач межах — від 0,64% до 13%.

3. При асоційованому перебігові вірусного гепатиту каче у всіх ензоотіях спостерігалась характерна динаміка загибелі ченят: наростання кількості загиблих в перші два-три дні, пік гибелі на 4-5-деиь і поступове зниження кількості загиблих д 12-го дня ензоотії, що ! може слугувати діагностичним тес'

4. З метою прискорення лабораторного підтвердження діап на вірусний гепатит каченят при асоційованому перебігу з за; рюваннями іншої етіології доцільно ■ використовувати експрес тоди діагностики, що дозволяють своєчасно і ефективно'профі. тувати захворювання.

5. Аттенуйований штам ЗМ вірусу гепатиту каченят мав пос ну патогенність для курячих ембріонів і був достатньо імуногеп: Він використовувався для виготовлення діагностикумів при і рімунізації качок. Титр антитіл (ІЕД50) в сироватці крові к; був достатньо високим від— 1:64 до 1:323.

6. Одержані нами препарати для діагностики вірусного г

титу методом флюоресціючих антитіл і і муно ферменти им ан зом випробувані в лабораторних дослідах і виявились високо ливими і специфічними. . .

7. Метод флюоресціюючих антитіл після комісійної перев в вірусологічній лабораторії. Сумського СГІ випробуваний з її тивним результатом у виробничих умовах дозволяв виявити а геп вірусу гепатиту каченят у ,100% .випадків.

8. Експрес-діагностика вірусного гепатиту каченят мете флюоресціюючих антитіл може бути використана при різній е отичній ситуації, потребує мало часу і легко виконується в ум науково-виробничих обласних ветлабораторіц.

1. Для діагностики вірусного гепатиту каченят, .що перебігає ;оціації з хворобами бактеріальної, грибкової і іншої етіології понується тест ■— характерна динаміка загибелі каченят: наросня кількості загиблих в перші 2-3 дні, пік загибелі па 4-5-й ь, зниження кількості загиблих до 8-12-го дня (кінець ензоотії).

2. Експрес-діагностнка вірусного гепатиту каченят розробле-! нами методом флюоресціюючих антитіл дозволяє в короткий эк підтвердити діагноз і своєчасно прийняти заходи профілак-и вірусного гепатиту каченят.

3. Обидва діагностичних теста — характерна динаміка загибе-сачеият і метод флюоресціюючих антитіл — можуть бути вико-говані як для діагностики, так і для дифереііційної діагностики ,'сного гепатиту каченят. :

Список робіт, що опубліковано за темою дисертації:

1. Паникар И. И., Решетило А. И., Тютченко Ю. Н. Особен ти диагностики вирусного гепатита утят, протекающего в ассої ции с бактериальными и вирусными болезнями. Интенсификг птицеводства: Межвузовский сб. научн. тр. Харьковский Г< аграрный университет. Харьков, 1991, с. 83-87.

2. Панікар І. I., Решетило О. І., Гаркава В. В., Тютченко Ю. Збудники хвороб качок — віруси, бактерії, грибки та їх асоці; Шляхи підвищення продуктивності і якості с.-г. продукції: М ріали наукової конференції. Сумський сільсьгосподарський іп тут, 1*993, с. 96-98.

3. Тютченко Ю.' М. Одержання та застосування гіперіму сироватки крові з метою діагностики вірусного гепатиту качє Шляхи підвищення продуктивності і якості с.-г. продукції: Ма' али наукової конференції Сумський с.-г. інститут, Суми, 199!

4. Паникар И., Решетило А., Тютченко Ю., Паникар Иг. Г нейшие ассоциации возбудителей инфекционных болезней } Матер. 9 Междунар. симпозиума по водоплавающей птице. Ита г. Пиза, 199.2, с. 204-205.

Здано до набору 15 04,93. Підписано до друку 21.04.93. Формат 60x84 1 Папір друкарський № 2. Друк високий.

Умов. друк. арк. 1,0. Облік — вид. арк. 1. Тираж 100 екз. Буринська друкарня.

94-96,