Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Эпизоотология коронавирусного энтерита у уток

На правах рукописи

УДК 619 : 616.988 : 578.834.1 : 636.597

Аспирант

МУСУКАЕВА ФАТИМА БАТАЛОВНА

ЭПИЗООТОЛОГИЯ КОРОНАВИРУСНОГО ЭНТЕРИТА УТОК

16.0.3 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология

Автреферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

- и Я ¡0/1

I /

У

\

!

Г.Покров -1997

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной Еирусологии и микробиологии Россельхоз-акадешзи

Научные руководители: доктор ветеринарных наук, профессор

А.Л.Сеыешшш,

кандидат биологических наук, заслуженный Еетеринарный врач РФ А.А.Коломыцез

Официальные оппоненты: доктор ЕетеринарЕых наук, профессор Б.Г.ОРЛИНКИН (ВИЭЗ),

кандидат ветеринарных наук Т.А.ВЛАСОВА (ВЗЕП-ЗВиГЛ).

Ведушее учреждение - Всероссийский государственный научно-исследовательский институт контроля, стандартизации и сертификации ветпрепаратоЕ.

•зп

Зашита состоится 27 июня 1997 г. е 12ои часов на заседании диссертационного совета Д 120.61.01. во Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной вирусологии и микробиологии Россельхозакадемик (601120, г.Покров Владимирской области, ВНШВВаМ),

С диссертацией кокно ознакомиться е библиотеке ВНКИВВиМ.

Автореферат разослан 26 мая 1937 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Г.П.Федоров

I. ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. В промышленном утководстве при высокой концентрации птица на ограниченной территории и интенсивных методах производства увеличивается вероятность возникновения многих инфекционных болезней, особенно вирусной этиологии. Массовое заболевания утят могут бнть обусловлены вирусами чумы, гриппа и вирусного гепатита. Они достаточно изучены и описаны в научной литературе.

В 1987 году сотрудниками ВШЙВВиИ Н.А.1агуткиным, И.Ф.Вияня-ковцм, В.П.Князезш! и др. впервые в нашей стране был выделен коро-навирус при массовых заболеваниях утят с признаками диареи в одном из утководческих хозяйств. В институте были изучены некоторые морфологические, физико-химические к антигенные свойства этого возбудителя, получена гипвриммуннне антисыворотки и отработана лабораторные метода: РДП - для обнаружения антигена и И?А с протеин А-перокеидазннм конъпгатом для обнаружения специфических антител у переболевшие уток.

В последующем сообщалось о появлении сходного заболевания утят в других утководческих хозяйствах России и Украины под названием болезни "утят-ползунков", гепатонефрита и коронавирусного энтерита. Из научной литература известно, что коронавирусы являются этиологическими агентами многих массовых респираторных и желудоч-но-кшзечних болезней, а также гепатитов и энцефаломиелитов у различных видов животных.

Появление этой малоизученной болезни у уток представляло реальную угрозу для утководческих промшзленных хозяйств нашей страна.

Н.АЛагуткин (199%) в одной из первых публикаций по этой болезни писал, что утководство находится под угрозой ликвидации газа коронавирусного энтерита. Если не принять срочных мер защита.

стране может лишиться весомого резерва мяса.

Цель и задачи исследований. Целью исследований являлось изучение клинико-эпизоотологических особенностей болезни и разработк мероприятий по борьбе с коронавирусным витеритом уток.

В связи с этим были поставлена следуввде задачи:

- изучить распространение болезни в утководческих хозяйствах страны;

- изучить клинико-гпиэоотологические особенности коронавирус-ного энтерита уток при естественном течении болезни и в эксперт«! тальных условиях;

- выделить полевые изолята возбудителя коронавирусного витерита уток от больных утят и изучить их основные биологические свойства;

- изучить возможность разработки лабораторных методов исследований при коронавирусном энтерите уток;

- разработать рекомендации по борьбе с болезнью.

Научная новизна работа, йхервне изучена клинико-зпизоотологи-ческие особенности коронавирусного энтерита уток при естественном течении болезни в промышленном утководческом хозяйстве и при экспериментальном заражении утят»

Выделены и идентифицированы изолятв вируса от больных корона-вирусным энтеритом уток, изучены их основные биологические свойсп

Установлено антигенное родство возбудителя коронавирусного Э1 терита уток с вирусами трансмиссивного гастроэнтерита свиней и коронавирусного энтерита телят*

Отработаны серологические метода РГА и РЗГА для обнаружения возбудителя коронавирусного энтерита уток и его идентификации.

Практическая значимость. Сделан эпизоотологический анализ распространения коронавирусного энтерита уток в различных регионах России и отдельных странах СНГ.

- <t -

Дано клинико-эпизоотологическое описание коронавирусного энтерита уток, как новой нозологической болезни для этого вида птиц.

Разработаны "Рекомендации по предупреждении к ликвидации коронавирусного энтерита утех", утвержденные Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода РФ 1^.01.1997 г.

Предложена реакция гемагглвтинации и реакция задержки гемаг-глвтинации для заявления специфического антигена в исследуемом патологической материале и идентификации вируса при лабораторной диагностике болезни.

Ооновнае положения, выносимые на защиту:

1. Результаты изучения клинико-зпизоотологических особенностей коронавирусного энтерита уток при естественном течении болезни и в экспериментальных условиях.

2. Результата изучения основных биологических свойств возбудителя коронавирусного энтерита уток.

3. Рекомендации по предупреждении и ликвидации коронавирусного энтерита уток.

¿пробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на: научной конференции ВШИВВиМ (гЛокров, 1994); Всероссийской научно-практической конференции ВНЙЙЗЖ (г.Владимир, 1995); 17 съезде паразитоценологов Украина (г.Харьков, 1995); Х-ом Международном конгрессе по вирусологии (Иерусалим, Израиль, 1996); ученом совете ВНИИВВиИ (1995 - 1996); межлабораторнои совещании сотрудников ЗНИШВиМ (1997).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на IZ7 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и практических предложений, содержит 16 таблиц, б рисунков. Огасок

использованной литературы включает 91 источник, из них 47 отечественных и зарубежных. Приложения.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материала и методы

Работа выполнена с 1994 по 1996 годы в лабораториях эпизоотологии и биохимии Всероссийского научно-исследовательского института ветеринарной вирусологии и: микробиологии, а также в АОЗТ "Мало-дубненская птицефабрика" Московской области.

В экспериментальных работах использовали:

Вируса (штамин и полевые изоляты) - коронавирусного энтерита уток (КЗУ): "Ивано-Франковский" (ИФ-87), выделенный в 1987 г. в лаборатории диагностики ВНЙИВВиМ из проб органов павших утят 5-30-дневного возраста птицефабрики "Городенковская" Ивано-Франковской области Украины; "Тарановский-91* (Т-91), выделенный в 1991 г. в лаборатории эпизоотологии ВШИВВиМ ив проб содержимого кишечника больных энтеритом утят Тарановской птицефабрики Харьковской области Украины; "Малодубненский-94" (МД-94), выделенный в 1994 г. из проб содержимого кишечника больных энтеритом утят АОЗТ °Малодуб-ненокая птицефабрика" Московской области;

- трансмиссивного гастроэнтерита свиней (ТГ©: "Риме", вакцинный, адаптированный к культуре клеток ППК-ббД, получен из ВИЭВ в 1991 г.*; "ВГНКИ", вакцинный, адаптированный к культуре клеток ПТП, подучен из ВЙЗВ в 1991 г.;

- коронавирусного энтерита телят (КЭТ): "К1-2", вакцинный,адаптированный к перевиваемой культуре клеток МДВК, получен из ВИЗВ.

Животные - утки 3-4- и 14-16-месячного возраста, кросс "Темп" пекинской порода; утята 1-40-суточного возраста этой же породи; утиные эмбрионы (УЭ) 7-9-суточкой инкубации, доставленные из АОЗТ "Малодубненокая птицефабрика" и частного сектора г.Покров Владимир-

- б -

ской области; куриные эмбрионы (КЗ) 8-10-суточной инкубации от ШФ птицы, доставленные из Онкологического центра Р.Москва; куриные эм брнонн 7-10-суточной инкубации, доставленные из Лакинской птицефаб рики Владимирской области; поросята 3-суточного возраста крупной белой породы, полученные от свиноматки, не имеицей специфических антител к возбудителям ТГС и КЗГ; мыши белые беспородные, полученные из питомника "Белый Мох" Московской области.

Культуры клеток - первично-трипсинизированные культуры клеток (фибробластов) куриных эмбрионов (ФКЗ) и утиных эмбрионов (ФЭУ); перевиваемые линии культур клеток почки - ППК-66Д, РК-15 и теоти-кул свиньи - ПТП, а также почки крупного рогатого скота - ЦШК.

Вирусологические исследования. Вирус КЗГ (изоляты ЙФ-87, Т-91 и ЯМН) пассировали в УЗ и КЗ. Вируссодержащие суспензии в объеме 0,2-0,3 с»Р вводили в аллантоисну» полость эмбрионам, которых инку бировали в течение 7-10 суток при температуре 37°С. Учет гибели и вирусологическое исследование органов эмбрионов проводили черев 48-72 часа и более после заражения. После вскрытия эмбрионов их ио следовали на наличие специфических патоморфологических изменений. Проба аллантоионой жидкости, суспензии из ХАО и печени эмбрионов исследовали на наличие вируса КЗУ методом электронной микроскопии (ЭЮ, в реакциях гемагглвтинацш (РГА) и преципитации (РДП).

Вирус ТГС (штамма "Риме" и "ВШШ"), а также виру о КЗГ (птамм "0-2") поддерживали в чувствительных культурах клеток по общепринятой методике.

Для выделения вируса КЗУ из проб содержимого кишечника и фека лий больных энтеритом утят готовили: 30-50^-ные взвеси на ЗФР, рН 7,2-7,<*. Надосадок после центрифугирования использовалия для очист ки.' Вначале проводили микрофильтрацив исходного материала через ме мбранные фильтры "Владипор" М$Аг-1ГА № 2 под давлением двух атмоофе с использованием прибора ПДК-2. Затем фильтрат подвергали очистке

и концентрированию методом центрифугирования через градиент саг харозы в течение двух часов «А центрифуге "ВесЛдаап " при II6000 g. Полученный осадок ресуспензировали в соотношении 1:10. В суспензии добавляли антибиотики и использовал» для. заражения эмбрионов.

Этот se вируссодержащий материал использовали при изучении чувствительности культур клеток ФУЗ, ФКЗ, ЩДК, ПТП и др..к вирусу КЗГ. Культуре клеток готовили по общепринятой методике в лаборатории культур клеток института.

Изучение полипептидного состава изолятов "ИФ-87", "T-9I" и "МД-94" вируса КЗГ проводили в электрофорезе. Очистку и концентрирование вируса проводили, как описано ваша. Электрофорез в полиак-риламидних гелях проводили на пластинах с концентрацией Ь% формирующего и 25% разделяющего гелей. Режим электрофореза автоматический. После окончания электрофореза гели фиксировали и окрашивали 0,1%-кж*. раствором кумасси бриллиантового на 30^-нои метаноле в 102-кой уксусной кислоте в течение 20 минут при температуре 50°С, а также методом блотинга с окрашиванием блотограммы моноклональня-ми антителами сыворотки крови мыши к нуклеокапсидному антигену вируса ТГС, конюгированного пероксидазой хрена.

Электронная микроскопия. Исследования проводили методами негативного контрастирования и флотационным способом. При просмотре объектов (препаратов) определяли морфологические параметры корона-вирусных частиц и их концентрацию. Подсчет вирионов проводили по общепринятой формуле.

Серологические исследования. РГк и реакцию задержки гекагглю-тинации (РЗГА) ставили по общепринятой методике, о использованием эритроцитов мыши, морской свинки, утки, петуха, кролика, барана, свиньи, теленка в концентрациях 0,4; 0,5; 0,6; 0,8 и 1,0$. Результаты РГА и РЗГА учитывали через 10, 30, 60 и 120 минут после внесения эритроцитов по четырехплюсовой системе.

Реакция диффузионной преципитации ставили по общепринятой методике. Иоследуемае материала, приготовленные из проб органов павших, больных и незаряженных коронавирусом уток, предварительно обрабатывали детергентом " N P-4Q" или "Гвин-8СГ. В качестве контроля использовали коммерческие набора для диагностики чума уток и инфекционного бронхита кур.

Гипериммуннне сыворотки против КЭУ и TTC для серологических исследований получали путем иммунизации уток 14-16-месячного возраста внутримышечно вирусом КЗ? с концентрацией 1.10^ вирионов/ciP в 0,5 ctP, инъецировали шестикратно с интервалом 1-2 суток. Поросят 3-суточного возраста заражали вирусом ТГС перорально с интервалом 7 дней в течение 45 суток. Для выявления уровня специфических антител в РДП и РЗГА ежедневно отбирали пробы сывороток крови.

ашзоотодогические исследования. Эпизоотическую ситуацию в стране по КЗУ изучали по данным отчетов Департамента ветеринарии и ветеринарного отдела Птицепрома ¡Минсельхозпрода Российской Федерации, результатам диагностических исследований экспертизних материалов, проведенных во ВНШВВиН с 1987 г., я собственных обследований хозяйств за период с 1994 по 1996 гг. Оценку эпизоотической ситуации проводили путем констатации клинических симптомов и пато-логоанатомических изменений, заболеваемости уток по разным возрастным группам и другим показателям, характерным для КЗУ.

Гистологические исследования проводили по общепринятой методике."

Статистическая обработка. При анализе и обобщении результатов исследований использовали метода статистической обработки» примени мае в биометрии (Г.Д.Дакин, 1980). Антигенное родство между штаммом КЗТ и изолятами КЗУ определяли в перекрестных РЗГА и рассчитывали ПО формуле Archetti, Horfall (1950).

2.2. Результаты исследований 2.2.1. Распространение коронавирусного энтерита уток

Элиз©отологическим анализом установлено, что коронавирусннй энтерит уток впервые установлен в 1987 г. в Ставропольском крае Росоии и Ивано-$ранковской области Украины. В дальнейшем, в результате проведенных исследований во ВКИИВВиМ и других научно-иссле довательских учреждениях России, Украины и Белоруссии, инфекция до I996 г. была обнаружена в 16 хозяйствах этих стран.

Таблица

Перечень и сроки установления неблагополучных птицехозяйств по КЗУ в период с 1987 по 1995 гг.

т

п/п

Наименование птицехозяйства

Период регистрации болезни

Р о о с и я

1. Госплемптицезавод "Зольский",Ставропольский край 1987-1990

2. Птицесовхоз "Тюкалинский" .Омская обл. 1988

3. Птицефабрика "Малодубненская",Московская обл. 1989-1995 Птицефабрика "Бэровская",Астраханская обл. 1990-1991

5. Птицефабрика 11 Березовская",Липецкая обл. 1991

6. Птицефабрика "Степная",¿страханокая обл. 1991

7. Птицефабрика им.60-летия СССР,Владимирская обл. 1991

8. Птицефабрика "Тарановская*,Липецкая обл. 1991

9. Птицефабрика "Агрин",Белгородская обл. 1994

Украина

10. Птицефабрика "Городенкозская"Ивано-£ранковская обл. 1987-1989

11. Птицефабрика № 3, с.Сахны,Сумская обл. 1988-1990

12. Птицесовхоз "Менский",Черниговская обл. 1988-1990

13. ПТОЗ им.26 съезда КПСС, Черкасская обл. 1989-1995

14. Птицефабрика им.Куйбышева., Оумакая обл. 1989-1991

15. Птицесовхоз "Пивденнобугский",Николаевская обл. 1989-1990

Белоруссия

16. Племптицезавод "Ольшевский, Брестская обл. 1991

- 10 -

Анализируя данные изучения эпизоотической ситуации по КЗГ в России, Украине и Белоруссии, следует отметить, что предрасполагав щими факторами возникновения и сохранения инфекции в отдельных хозяйствах являлись нарушение гигиена кормления уток неполноценными кормами с пониженным содержанием протеина и витаминов, а также кор мами с высоким содержанием хлопчатникового шрота и паприна. Часто в кормах была высокой бактериальная и микотоксическая обсемененное Констатировали также нарушение плотности посадки и кратности возду хообмена, резкого сокращения санитарного разрыва между партиями» наличие в обследованных хозяйствах колибактериоза и сальмонеллеза, а также высокую бактериальную обсемененность инкубационных яиц.

По результатам изучения данных хозяйственно-экономических отношений установлены тесны» производственные овязи между неблагополучными по КЭУ хозяйствами. Так, АОЗТ "Малодубненская птицефабрика! до 1989 г. (дата постановки диагноза КЗУ) имела постоянные контакты по обмену (продаже) продукции, в том числе утиными эмбрионами и живой птицей с 18 предприятиями.

Аналогичная, или близкая к этому, ситуация складывалась на других птицефабриках и племптицезаводах» что способствовало быстро му распространению возбудителя КЭУ по стране. Отсутствие лаборатор ных методов диагностики и средств специфической профилактики также затрудняло борьбу с этой болезнью.

2.2.2. Клинике-эпизоотологйческие особенности болезни

Нами при эпиз©отологическом обследовании неблагополучного по КЗУ хозяйства АОЗТ "Малодубненская птицефабрика" были обнаружена клинически больные КЗУ утята в разных группах от 7- до 58-суточно-го возраста в острой и подострой формах болезни. При клиническом осмотре утят в помещениях с напольным содержанием наблюдали их ско пление группами вокруг неподвижно сидящих или лежащих особей. Весь

- и -

пол в помещении загрязнен жидкими фекалиями. При вспугивании набя дали бегущих утят с нарушенной координацией движений, которке пер] одически пахали, садились, а затем продолжали движение ползком на плюснах. Эти симптомы сопровождались посинением клюва утят, учаде-нием сердцебиения и дыхания.

Больные утята были малоподвижными, отказывались от корма, с признаками сильной диареи, чаще лежали, а перед гибелью у них часто отмечали признаки опивтотонуса. В случае выздоровления после п] менения медикаментозных средств, они сильно отставали в росте: и рг витии от здоровых утят.

Подострая ферма болезни характеризовалась более продолжительным сроком и сглаженным характером развития клинических симптомов до 30-45 дней. Видимое клиническое улучшение, уменьшение диареи у таких утят и появление аппетита после применения симптоматических медикаментозных средств через 2-3 дня вновь сменялись сильной диареей и расстройством координации движений.

Минимальная продолжительность болезни утят в группах ограничу валась 4-10-ю днями, а макоимальная - до 45 дней. В первом случае летальность составляла 10-20?, а во втором - до 70-30$. В отдельна группах массовое заболевание и гибель утят продолжались 3-5 суток, а затем с интервалом 4-7 дней падеж вновь возобновлялзя. Переболи тая птица отставала в росте и развитии в сравнении с утятами здорс вых групп.

Среди взрослого (маточного и ремонтного молодняка) поголовья уток клинически больных мы не обнаруживали.

При вскрытии и патологоанатомических исследованиях павших утя обнаруживали катаральный айнусит, конъюнктивит, гепатит (печень в 80-90$ случаев темно-бордового цвета., увеличена и при надавливании легко разрушалась), нейрит (почки также темно-бордового иди вишневого цвета, увеличены), катаральный гастроэнтероколит, иногда о нг

личием точечных и реле полосчатых кровоизлияний. В железистом желудке обнаруживали катаральное воспаление и обильное содержание слизи. Селезенка чаще йез видимых изменений или была уменьшена в размерах, кровенаполнена, пульпа дегенерирована. В сердце несвернувпа-яся кровь темно-зипневого цвета. Перечисленные патологоанатомичес-кис изменения прослеживались в 60-100$ случаев, но были различны в отдельных группах утят по степени проявления. Они наиболее ярко и интенсивно были выражены у птицы при подострой форме болезни.

Было установлено, что на птицефабрике от КЗУ пало в 1990 г. 18,9/5 утят до 2-месячного возраста, в 1991 - 14,0%, в 1992 - 22,0/1 и в 1993 г. - 27,7$.

Анализ показал постоянное, снижение среднесуточных привесов утят в 1,56 раза с 1989 по 1993 гг. в группах, неблагополучных по КЭУ.

!

При зпизоотологическом анализе в указанном хозяйстве было установлено, что на первом этапе развития эпизоотического процесса при КЭУ отмечали зимне-весеннюю сезонность регистрации болезни птицы. Гибель молодняка в летний период 1990-1992 гг. составляла от 5 -до 12/1. Осенью заболеваемость и падеж утят увеличились. В последующий период с декабря 1992 г. по ноябрь 1994 г. заболевание и гибель птицы от КЭУ в возрасте 7-55 суток возросли и составляли от б до 31%.

При зпизоотологаческом анализе КЗУ в других неблагополучных хозяйствах было установлено, что болезнь проявлялась в любое врет года и поражала уток разного возраста пекинской и мускусной пород. У уток родительского стада (максимально 5-15$ от общего поголовья) болезнь протекала чаще в хронической форме и была выражена клоаци-том, редукцией яичников и яйцевода, снижением яйценоскости от 10 до 25/1 и длительным вирусоносительством0- Острую и подострую формы течения инфекции отмечали только при прогрессирующем развитии бо-

- 13 -

лезни у молодняка в 3-45-дневном возрасте.

В отдельных хозяйствах КЗУ поражались не больше 2-3 партий молодняка уток, в других - от 50# до 100$. В том случае, если инфекция принимала прогрессирующий характер, то поражаемый возраст расширялся от 3-суточного до 1,5-2-летнего. Заболевание утят в 3-дневном возрасте указывало на отсутствие трансовариального иммунитета.

Было установлено, что источником возбудителя инфекции являлась больная и переболевшая птица. Во внешнюю среду возбудитель КЗУ выделялся через кишечный тракт.

2.2.3. Выделение и изучение некоторых биологических свойств возбудителя коронавирусного энтерита уток

Электронной микроскопией было установлено, что наибольшее содержание вируса КЗУ при естественном течении болезни обнаруживается в пробах: фекалия (1«10® вирионов/см^), содержимого кишечника (1*10® вирионов/см^), кишечника (1*10^ вирионов/см"*), печени (1« 10**"^ вирионов/см^), легких вирионов/см^), селезенки (I»

ГО5""** вирионов/см^), почек (1*10^ вирионов/смЪ.

Для выделения вируса использовали объединенные пробы внутренних органов (печень, почки, легкие), содержимого кишечника и фекалий больных утят. Очищенным и концентрированным вирусом заражали утят, УЗ и КЗ, а также культуры клеток §УЗ и ФКЭ. Каждый опыт повторяли не менее трех раз.

В результате было установлено, что вирус выделяется только на утятах и УЗ. Титр вируса составлял 1,5+0,5 ЭД^о/см"* и ^»5+0,5 ЭИДздДуЗ соответственно.

'Выделенный изолят коронавируса уток обозначили как "Малодуб-ненский-94" (ВД-94).

Опыты по выявлению вируса КЗУ, изолят "МД-94", на культурах

¡слеток проводили в сравнении с изолятами КЗУ "ИФ-87" и "Т-91", а также со штаммами вирусов ТГС и КЭТ. В результате было установлено, что наиболее чувствительной культурой клеток к вирусу КЗУ (все изо-ляты) является ППК-ббД, где ЭМ вирус обнаруживали в титре 1,5+0,5 ЭИД50/СМ3; к вирусу ТГС - РК-15 и ПТП, к вирусу КЗГ - ВДВК. В трех последних культурах клеток вирус КЗУ обнаружен не был.

ЭМ было установлено, что коронавирус у павших УЗ обнаруживается в хорионаллантоисной оболочке, печени, почках, а также в аллан-тоисиой жидкости.

Злектронномикроскопическое исследование, возбудителя КЗУ. При ЗМ исследовании негативно окрашенных препаратов наблюдали вирусные частицы различной полиморфной формы: сферической, вытянутой и изогнутой.' Размеры вирионов сферической форма составляли от 80 до 200 нм, вытянутой и изогнутой - от 70 до 300 нм. На поверхности оболочки частиц обнаруживали булавовидные пепломеры длиной от 7 до 12 нм, образующие корону. В центре всех вирусных частиц находили уплотненную (затемненную) сердцевину.

Полипептидный состав и антигенные свойства вируса. В результате злектрофоретического анализа обнаружили наличие у очищенного"« концентрированного коронавируса уток 14 структурных полипептидов с молекулярной массой 16, 31, 33, 51, 80 и 100 КД, являющихся мажорными. |

На основе моноклональных антител к нуклеокапсидному антигену вируса ТГС в иммуноблотинге обнаружили в трех повторностях связывание их с двумя пептидами молекулярной массы 39 и 65 КД коронавируса уток. Антигенное родство между возбудителями КЗУ и ТГС было дополнительно показано в РДП.

Опыты, проведенные нами совместно с доктором биологических наук Н.Д.Соколовой (ВЙЗВ), показали антигенное родство между вирусами КЗУ и КЭТ в РЗГА. Специфические сыворотки к обоим коронавиру-

сам в равной степени были активны к антигену вирусного энтерита уток, тогда как специфическая сыворотка к КЗУ задерживала агглютинацию вируса КЗТ с эритроцитами мыши только на 30%.

Было показано, что иммунопероксидазный конъюгат на основе мо-ноклональных антител к нуклеопротеину вируса ТГС реагировал с белковыми структурами возбудителя КЗУ, репродуцируемого в клетках §72

Гемагглютинирующая активность вируса. Для выявления гемагглю-тинирувщих свойств использовали коронавирус (изолят "ВД-94") различного происхождения: культуральный (первого и второго пассажей на культурах клеток), органный, выделенный из внутренних органов (печень, почки, селезенка) павших и убитых больных утят, эмбриональный (из ХАО, аллантоисной жидкости, печени и кишечника зараженных УЗ), а также очищенный и концентрированный из содержимого кишечника и фекалий павших и больных уток.

Установлено, что гемагглютинирующими свойствами обладает коронавирус, изолированный и концентрированный из проб содержимого кишечника и фекалий павших и больных уток с эритроцитами мыши. Титр гемагглютинирувщей активности составил 1:1024-1:2048. Однако коронавирус уток обладал слабыми агглютинирующими свойствами с эритроцитами других видов животных. Титр не превышал 1:16.

Изыскание биосистем для культивирования коронавируса уток. Опыты по культивированию коронавируса проводили в течение 6 пассажей в УЗ и КЗ, а также в культурах клеток ФУЭ, ППК-66Д и ПТП.

Методом негативного контрастирования ЭМ изоляты "МД-94" и "И$-87" выявляли постоянно в печени, кишечнике и ХАО УЗ с первого по шестой пассаж.

На шестом пассаже инфекционная активность вируса (НД-94) составила 3,0-3,5 1е ИЭДздДуЗ, а в КЗ вирус не обнаруживали; активность изолята "Т-91" - 3,5-4,0 ИЭД50/СМ3, в КЗ вирус не обнаруживали; активность изолята иИФ-87" - 4,5 1е » КЗ вирус

обнаруживали до третьего пассажа с активностью 2,25 ig H3&5o/CK3.

Методом ЭМ вирус КЗУ обнаруживали в печени, кишечнике и ХАО УЭ в концентрации до вирионов/си?.

При культивировании в культурах клеток изолятв "M5-9V и "ИФ-87" индуцировали 1ЩД в ФУЭ на первом пассаже, в ППК-66Д - до 3-го пассааа. В осветлениях концентратах детрита клеток методом негатив ного контрастирования ЭМ ввявлени вирусное частица в концентрации I'^O^ вирионов/cir*.

2.2.^. Изучение вопросов эпизоотологии хоронавирусного энтерита уток

Моделирование эпизоотического очага болезни провели в условиях визария института. С этой цель» в неблагополучной по КЗУ хозяйстве било отобрано 20 утят 7-дневного возраста без клинических признаков болезни. В течение 30 дней наблюдения заболело и пало от КЗУ 17 утят, что составляет 85£ летальности. Результаты исследований по обнаружению возбудителя КЗУ методами ЭМ, в РГА и РДП были положительными. Клинические признаки болезни у больных утят и пато морфологические изменения у павших утят били аналогичными при естественном течении болезни в неблагополучном хозяйстве.

Для изучения путей распространения и передачи возбудителя КЗУ из эпизоотического очага болезни провели две серии опытов.

В первом из них провели эпизоотологическое обследование маточ ного поголовья уток на "Малодубненской птицефабрике*. Клинически больных среди них не отмечали. Однако анализ показал, что среди ни наблюдается повышенный отход. При патоморфологическом исследовании уток отмечали: катаральную или крупозно-некротическую пневмонию, серозно-фибрииозннй аэросаккулит, плеврит, перикардит и хронически гастроэнтерит. Вирусологически в пробах фекалий и содержимого кишечника убитых или павших уток обнаруживали наличие возбудителя КЗ

Таким образом, в результате исследований было установлено, что ут кк маточного поголовья переболевают КЗУ в хронической форме.

Яйца от обследованного маточного стада регулярно поступали н инкубатор птицефабрики. Нами для проведения опята были взята УЭ 15-, 17- и 22-суточной инкубации. Предварительно 73 были продезин фицированы. Вирусологические исследования на наличие вируса КЗУ в УЭ били отрицательными. Выводимость утят составила от 50 до 70$, что было ниже показателей выводимости в благополучном по КЗУ хозя стве. В период наблюдения в течение 17 суток у выведенных утят не отмечали клинических симптомов КЗУ. Вирусологические и серологиче кие исследования на КЗУ были отрицательными. Опыт показал, что с продезинфицированными УЭ возбудитель КЗУ из неблагополучного хозя ства не распространяется.

Во второй серии опытов провели изучение передачи вируса КЗУ при совместном содержании больных и здоровых утят. Заболеваемость среди интактных утят составила 33%, летальность - 55/5. Методом ЭН И РГА вирус КЗУ был выявлен в печени и кишечнике всех больных и павших утят.

Изучение патогенности вируса КЗУ для новорожденных поросят. Ранее было установлено антигенное родство между вирусами КЗУ и ТГ В связи с этим трех новорожденных поросят заразили изолятом "ЙФ-8 а двух - изолятом пМД-9%". На вторые сутки у них наблюдали диарею рвоту, угнетенное состояние и ограниченный прием молока. Через тр суток один поросенок, зараженный изолятом "й£-87", был убит. Пато морфологические исследования показали гиперемию сосудов слизистой оболочки желудка и кишечника, десквамативняй энтерит двенадцатиперстной кишки, вакуольную дистрофию бокаловидных клеток желудка н тонкого отдела кишечника.

Отобранные проба фекалия всех инфицированных поросят содержа ли коронавируо и преципитирувщий антиген.

Таким образом, результаты исследований показали выраженную пат тогенность изолятов "ЙФ-87" и ЯКД-94П вируса КЗУ для новорожденных поросят.

2.2.6. Разработка методов лабораторних исследований при коронавирусном энтерите уток

Отработка режимов постановки РЖ. Результаты исследований показали, что для постановки РДЗ необходимо использовать 0,9% агар, антигена после, добавления 0,25-0,5$ детергента "НР-.40" или "Твин-8 в течение 30-60 минут и сывороток крови уток в разведении 1:2 или 1:4. Учет результатов РДП для выявления коронавирусного антигена в пробах фекалий и печени павших уток проводили через 12-14 часов, в содержимом кишечника - черев 24 часа после инкубации. Полозштель ные результаты по выявлении специфических антител были получена пр исследовании сывороток крови гшериммуншированннх уток-доаоров и отдельных переболевших уток.

Отработка методов постановки РГА и РЗГА. В процессе исследова ний установили, что более приемлемый вариант постановки РГА возможен при использовании следующих компонентов: вирусных антигенов о преципитирувщей активностью не менее 1:2-1:4. Происхождение антиге нов (гемагглютининов) органное (из печени павших утят и УЭ) или по лучениве из проб содержимого кишечника и фекалий больших и павших от КЗУ утят; 1%-ная взвесь эритроцитов мышей.

Для контроля РГА разработали РЗГА о использованием специфичео кой и нормальной сывороток крови в разведенияя 1:10. Через I час контакта испытуемого материала с гютериммунной сывороткой во все лунки вносили взвесь эритроцитов. Учет результатов проводили через 60-90 минут. Реакции считали положительной, если специфическая са-воротка задерживает гемагглотинацию исследуемого материала не мен» ше чем на 16 ГАЕ.

При отработке РГА было установлено, что титр агглютиногенной активности достигал 1:2048 с пробами содержимого кишечника и фекалий больных КЭУ уток и 1:128 с пробами печени павших утят и УЗ.

Результаты сравнительных исследований показали, что в РГА бил выявлено положительных проб на 12-19$ больше, чем в РДП и на 19-41 больше, чем методом ЗМ.

2.2.7. Разработка противоэпизоотических мероприятий при КЗУ

Испытание вируовакцикы против ТГС для профилактики КЗУ. Группу утят 1-2-суточного возраста в количестве 1300 голов, принадлежа щуп "Малодубненской птицефабрике", привили вирусвахциной из штамма "ВГНШГ ТГС в дозе 100-800 Шед/^ производства ВЙЗВ. Способ вве дения - интраназальный, однократный в объеме 0,15-0,2 ом^. Контролем служили 2400 утят этой же, партии. В день производственного убо (55 суток) сохранность в группе привитых утят составила 36$, тогда как в контрольной - 9,5%.

Полученные результаты свидетельствуют о возможности разработки средств специфической профилактики и показана пригодность существующей вакцины против ТГС для частичного купирования очага во время эпизоотии КЗУ.

Разработка мероприятий по профилактике и ликвидации КЗУ. Резу льтаты проведенных нами исследований и анализ научной литературе позволили разработать необходимый оптимальный минимум противоэпизоотических мероприятий при КЗУ, который учитывает клинихо-эпизоо-тологичеокие особенности болезни, биологические свойства возбудите ля и возможные пути его передачи, а также направленность общих ве-теринарно-санитарних мероприятий при других вирусных болезнях утек

В разработанных с нашим участием рекомендациях по предупрежде нию и ликвидации КЭУ содержится несколько разделов. Первый раздел

"Общие положения", в котором дано описание КЗУ. Во втором разделе "Мероприятия по профилактике болезни" отражена правила для птицеводческих хозяйств и технология выращивания и содержания утят, а также пункт о том, что ввозимое в благополучные хозяйства маточное поголовье уток подвергает месячному профилактическому карантиниро-ванию, в период которого проводят лабораторные исследования от них проб фекалий для обнаружения коронавируса.

Третий раздел "Мероприятия по ликвидации коронавирусного онте рита уток" содержит следующие пункты: - при подозрении на КЗУ принимают мера, исключающие возможность распространения болезни; - пр подтверждении диагноза на КЗУ на хозяйство (ферму) в установленном порядке накладывают ограничения; - в неблагополучном хозяйстве про водят: убой больной и подозрительной по заболевании птицы я утилизация трупов; оставшееся клинически здоровое поголовье мадовозраот ных утят подвергают симптоматическому лечению; с письменного paspe шения Департамента ветеринарии Минсельхозпрода РФ в неблагополучно хозяйстве для профилактики КЗУ используют вирусвакцину против ТГС; проводят тщательную механическую очистку и двукратную дезинфекцию помещений, где содержались больные утята; инкубационное яйцо перед закладкой обязательно дезинфицируют. Ограничения с неблагополучног хозяйства (фермы) снимают через две недели после последнего случая заболевания и убоя больных уток, проведения заключительных ветери-нарно-санитарных мероприятий и получения отрицательных лабораторнн исследований на КЗУ.

В У В О Д У

I. Коронавирусннй энтерит уток впервые зарегистрирован в России в 1987 году. В течение 1987-1995 гг. болезнь диагностировали в 9 утководческих хозяйствах различных климато-географических зон страны: на Северном Кавказе, юге Поволжья, в Центральном районе и

- 21 -

Западной Сибири, а также, на Украине и в Белоруссии.

2. Болезнь возникала только в хозяйствах промышленного типа и характеризовалась массовым заболеванием утят 5-55-суточного воз раста с признаками поражения желудочно-кишечного тракта и сильной диареи, снижением или отсутствием аппетита, угнетением и нарушен» ем координации движений ("утята-ползунки").

3. Заболеваемость утят 5-55-суточного возраста при КЗУ дости гает 60-100$, а летальность - до 70$. Болезнь протекает остро и подостро. Утки старвего возраста переболевают бессимптомно в скры той форме.,

4. Возбудитель КЗУ обнаруживается в организме больных утят в печени, почках, легких и кишечнике. Он выделяется из организма ут с фекалиями до 1*10® вирионов/см"3, распространяется алиментарным путей и при совместном содержании больной и здоровой птицы.

5. От больных утят неблагополучного хозяйства выделен возбудитель КЗУ, изолят "НД-94", и изучена его основные биологические свойства. Установлено, что возбудитель КЗУ культивируется в уткни вибрионах, титр вируса достигает 4,5+0,5 1« ®%q/0,<3 и вызывает заболевание здоровых утят при их заражении per ое и подкожно в дозе 1,0-2,0x10' вирионов. Возбудитель КЗУ не пассируется без ада птацик в куриных эмбрионах, перевиваемых линиях культур клеток МДВК. ПК-15, Ш и ППК-ббД.

6. Полевые изоляты вируса КЗУ обладают гемагглатинирующими свойствами в отношении эритроцитов мышей и не агглютинируют зритр« цитв морских свинок, барана, кур и уток в диагностических титрах. Отработан метод лабораторных исследований патологического материала при КЗГ в РГА и идентификации возбудителя в РЗГА.

7. Установлено антигенное родство вируса КЗУ с возбудителем трансмиссивного гастроэнтерита свиней в РДД и методом иммуноблотш га, а также с возбудителем коронавирусного энтерита телят в РЗГА.

- 22 -

8. Разработана схема иммунизации и получения высокоактивных гипериммунных антиснвороток к возбудители КЗУ для постановки РДП

и РЗГА при лабораторных исследованиях патматериала с титром преци-питинов до 1:32 и антигемагглютининов до 1:2048, соответственно.

9. Комплекс профилактических и противозпизоотических мероприятий при КЗУ включает:

- проведение своевременной диагностики болезни на основании клинико-эпизоотологических особенностей болезни, результатов пато-логоанатомических вскрытий и обязательных лабораторных исследований патологического материала (ЗМ, РГА. РДП и др.);

- оптимизацию и строгое выполнение ветеринарно-санитарных и гигиенических правил содержания и кормления уток всех технологических групп;

- проведение убоя и утилизации больной птица при ликвидации болезни, применение химиотерапевтических медикаментозных средств для профилактики осложнений или использование вирусвакцина против ТГС для оставшейся условно здоровой птица;.

- проведение тщательной санации и дезинфекции помещений и выгульных площадок.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРШОЖНЙЯ

1. Разработаны "Рекомендации по предупреждению и ликвидации коронавирусного энтерита уток", утвержденные Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода РФ 14.01.1997 г.

2. Предложена реакция гемагглвтинации и реакция задержки гем-агглютинации для выявления специфического антигена в исследуемом патологическом материале и идентификации вируса при лабораторной диагностике болезни.

СПИСОК НАУЧНЫХ ТРУДОВ ПО ТШ ДИССЕРТАЦИЙ

1. Коронавярусная болезнь уток: антигенная и физико-химичес кал характеристика возбудителя / Н.АЛагуткин, В.П.Князев, АД» Середа, В.Н.Смирнов, А.Ф.Стрижаков, О.М.Огрижакова, Ф.Б.Цусукаев // Материалы республиканской научно-практической конф. по животн водсгву и ветеринарной медицине. - г.Витебск, 1994. - с. 71.

2. Сравнительное клинико-эпизоотологическое изучение корона вирусной болезни уток и трансмиссивного гастроэнтерита свиней/ А.И.Бузун, Ф.Б.Мусу клева, А.А.Коломыцев, АЛ.Семенихин, В .П ,'Княз О.М.Огрижакова // Актуальные вопросы ветеринарной вирусологии. Материала научно-практической юонф. ВНИИВВиМ. - г,Покров, 1995. с. 163.

3. Электронно-микроскопическая диагностика коронавирусной б лез ни уток / Ф.Б.Мусукаева, А.И.Бузун, А.А.Коломыцев, А Д. Се йен» хин // Там же, - с. 164.

4. Экспериментальное воспроизведение коронавирусной болезни уток / А.И.Бузун, Ф.Б.Мусукаева, А.А.Коломыцев, АЛ.Семенихин // Вирусные болезни с.-х. животных. Тез. докл. Всеросе. научно-прак конф. - г.Владимир, 1995. - с. 275.

5. К вопросу защиты утят от коронавирусной болезни вакциной против трансмиссивного гастроэнтерита свиней / А.И.Бузун, Ф.Б.Му-сук&ева, А.А.Колоияцев, АЛ.Семенихин, О.М.Огрижакова, А.А.Курно-сов // Там же. - о. 276.

6. К изучению корон&вирусного энтерита уток, выделенного на Тарановской птицефабрике Харьковской области / А.И.Бузун, A.A.Ко: мыцев, Ф.Б.Мусукаева, О.М.Огрижакова, АЛ.Семенихин,В. А.Зеленцов // Съезд паразитоценологов Украины. - г.Харьков, I9S5. - о. 28-2Í

7. Разработка мероприятий по борьбе и профилактике корокави-руоного энтерита уток / АЛ.Семенихин, А.А.Коломыцев, А.И.Бузун, Ф.Б.Мусукаева // Отчет. - Инв. » I9ÛÛ294. - 19%. - 60 С.

8* Semenikhine A., Buzun Д., Kolomitcev A., Sokolova, Musu-kaeva P. Duck coronaviral enteritis // Xth Intern. Congr. of Virology. - Jerusalem, Israel, 11-16 august, 1996. - p. 41.