Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Антитела, иммунные комплексы, антигены при туберкулезе крупного рогатого скота и инфицировании атипичными микобактериями

РГ6 од

2 1 ;;:01АКШ®Я АГРАРНЫХ НАУК РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ

- БЕЛОРУССКИЙ НАУЧНО-ГЗСадаВАТЕЛЬСШ ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ВЕТЕРИНАРИИ ИМ.С.Н.ВЕПШШССКОГО

. На правах рукопиои

АГЕЕВА ТАШРА<ЙИКОШВНА

АНТИТЕЛА, ИММУННЫЕ КОМПЛЕКСУ, АНТШЕНЫ ПРИ ТУБЕРКУЛЕЗЕ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА И ИНФИЦИРОВАНИИ. АТИПИЧНЫМИ ШШШСГЕРИЯМИ

16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология в иммунология

Автореферат

диссертации т соискание ученой атепени кацдвдата ветеринарных наук

Минск 1993

?а&>та выполнена з Белорусском иаучяо-ассладоза^згьском ансяиу*в стптпуриивятплмоа вемранараи ам. С .11. Высъ-десского

Научный руководитель - кандидат ветери.лраых наук, старший научный сотрудник АЛЛысекко

Официальные гашснвкты: доктор ветеринарных асу к, профессор Р.В.Тузова

. доктор медицинских наук,профессор :й.П.Титрв

Ведущее учреддеяие — Украинский научно-исследовательский институт экспериментальной а клинической ветеранарйой медицины

Защита состоится * Ц иОиЛ— 1°35г.

в часов на заседании специализированного совета

Д 020.47.01 в Белорусском ^fflyчж>-лccл8дoвaтeльcкoм институте экспериментальной ветеринарии им. С.Н.Вышелесского , по адресу: 223020, гЛааа'и/о Кунцавщана, БелНИИЭЙ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке БелШИЭВ.

Автореферат разослан 44' диш^ ' 1993г.

Ученый секретарь специализированного совета, доктор ветеринарных наук.црсфессор

В.ЯЛинник

- 3 -

• - I. ОВДАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Туберкулез крупного рогатого скота наносит значительный урон животноводству, опасен для человека, поэтому ваяно своевременно находить и удалять из стада инфицированных а больных животных.

Внутрикожная аллергическая проба с туберкулином полностью не выявляет больных животных Л1.К.Юсковец, 1963;3.II.Урбан, 1980; Ю.Я.Касоич,1982;В.Е.115 равокий,В.А.Шаров,НЛ.Овдоецко, IS82;P.B.Ty-зова,1983;А.Н.Шаров,1989/. С другой стороны на туберкулин реагируют животные,зараженные атипичными микобактериями /Г.А.Киин,1966; А.Н.Шаров, 1969,1939; А.М.Кадочкии,1983; О.В.!.1артма,К.К.Тяхнас, 1986; А.С.Донченко,1987/, что связадо с присутствием в туберкулине общеродовых антигенов /В.С.Тырина, 1974;'А.П.Лысенко, IS82, 1989; А.Н.Шаров,1989; В.М.Безгин, В.Е."озлов, В.А.Алехин,1989/. Следовательно, аллергическая проба хотя и играет ванную роль в мероприятиях по борьбе с туберкулезом, но ее результаты необходимо подтверждать проведением дополнительных исследований. Среда них выделяются доступность?), 'возможностью широкого охвата поголовья, низкой стоимостью - методы серологической диагностики/ Ю.Я .Кассич, 1979; Н .П .Овдиенко, А .И .Козин, 1979,1988; Э .Д. Лакман, 1981;

•Д.Д.Новак,1989/. Вез чаще внимание исследователей привлекает вм-- мунофершнтный анализ Л'ФА/, отличающийся от традиционных, серологических тестов высокой чуватвитальностьв. / в.Nassau et.al. , 1976; J.A. Morris et. al., 1979; V.Hitaooo et« al., 1Э83;2.В.Маолов А.А.Бойко, И.А,Хорьков,1986; Л.М.Ходун,Н.И.Цунская,1989, 1990/.

Для успешного применения серологических методов, и в особенности ИФА, необходимо решить проблему "перекрестных" реакций, а также учитывать характер иммунного ответа у крупного рогатого

- 4 - ■ ?

скота при туберкулезе и инфшдаровании атипичными микобактвриями.

На определенных стадиях инфекционное процесса при туберкулезе возможно преобладание синтеза антигенов возбудителя, из-за чего они могут свободно циркулировать в крови или в иммунных кокшлексах с антителами. Такое явление, вероятно, влияет на результативность и точность серологической диагностики туберкулеза Д1.1.1.Авербах с ооавт.,1984; Н.Н.Сареда,1984; Е.З.Герасиыова,1984; ЛЛ1.1^р]1Д11-оглы,1985;О.ВЬа»*асЬагуа о1;.а1.,1986/.

Цель гяботи: Изучение гуморального шатунного ответа у крупного рогатого скота при туберкулезе и инфицировании атипичными микобактерияда для разработка дифференциальной диагностики болезни и идентификации антигенов кшобактерий в ИФА.

Задачи исследования:

1. Изучить в перекрестном имлуноэлектрофоразе /¡С;05/ и \Ш х^к-.оралышй тленный ответ на индивидуальные антиге!ш яри гипвр-июлуназации, эксперекенталыюм и спонтанном заражении крупного рогатого скота М.Ъоу1о и атипичными микоблктериями.

2. Разработать тест-систеьу для дифференциальной диагностики туберкулеза в ИФА.

3. Разработать метод обнаружения антигенов шксбактерий и их дифференциацию в ИФА.

Научная новизна саботы: Впервые у крупного рогатого скота изучен аморальный иммуняый ответ на индивидуальные антигены М. Ьоу1о и атипичных шкобактерий.-Описано более 20 антигенов стицулирующих синтез антигел. Выявлено, что при туберкулезе у многих животных стпечается продукция антигенов, в особенности, • наиболее специфичных для возбудителя туберкулеза, и их циркуляция в 1'лл.лУиных комплексах. Определены оптимальные параметры постановки ИФА для дифференциальной диагностики туберкулеза. Изу-

-5 - '

чаны вадоспвцифйчэокаа антигены М.ьот1а , а также группоспециф!-чвскиа антигены атипичных микобактерий, разработана методика их

даффе^зндашпии в ИФА.......

Практическая цяняооть:

Разработана и утверадева 17В ветеривариа Минсельхозпрода Р.Б. яорштивно»тахяичеокая документацияпо изготовлению а контролю , "Тест-системы для дифференциальной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота в ищунофермектном анализе а так-

же временное наставление по ое применению. (от 21.П.90г.) и нормативно -техническая документация по изготовлению и контролю "Набора для дифференциации культур мшсо бактерий в ИФА" в временное наставление по его применению (от 7.04.92г.).

Применение наборов позволяет повысить эффективность и точность дифференциальной диагностики туберкулеза, значительно сократить время л затраты на проведение исследований. Апробация работы;

. Материала диссертации доложены на Ученом совете БелНШЭВ в 1990-1992 гг., на Всесоюзной научной конференции "Совершенство-• валив методов госконтроля ветпрепаратов" /Москва,1991/, на Республиканском семинаре ветврачей бактериологов по современным мето-' дам диагностики туберкулеза Дашек, 1992/, на ыежлабораторнбм со. вещании научных сотрудников БелШИЭВ /1993/*

Публикации: По материалам диссертации опубликовано 2 научных статьи и 3 оданы в печать.

О бьем и стдукстра диооерташа: Диссертационная работа изложена на 168 страницах машинописного текста а включает: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов, вывода . предложения для практика, спиоок литературы, приложение. Работа иллюстрирована 9 таблицами а 33 рисунками. Спиоок литературы состоит из 248 источников, аз которых 100 иностранных-

- 6 -

2. CQECTffitfiüS ИССЛЗД)ВШЯ

2.1; Материалы и методы

Работа выполнена в 1990 - 1993гг. в лаборатории туберкулеза Бел!£ШЭВ им. С.Н.Вьйелесского п хозяйствах Беларуси.

В исследованиях использованы эталонные и производственные и'лобактерий:t.bovia VaiH-o.a, bgü.m.tub.?rcuiosiu, H^RV, U»knnea3nii D4/74,D10/7-1» U.Bcrofulaceun 526, Ii.avium l603,K.int-xacaUulurae 586ß,i:, fortuitun 342, il.phloi 1909, M.amocrcatia, а также 42 культуры,выделенные от реагирующих на туберкулин животных.

Микобактерии выращивали на средах Гельберга, Павловского, Сотона. При получении антигенов восевыиа среде Сотона инактива-ровалп фенолог /2-5,"/ и после 96ч инкубирования при 37°С отделяла культуральную жидах с ть (¡¿«.¿троваааеы шш непосредственно в ней разрушали бактзриильную шссу на УЭДН - 1/20 иик,15-35кГц/. Детрит удаляли цвнтрн^угированиец при 5000^. Антигены концентрировали вентилированием в целофансвых каксчках дс 1/10 объе:/-а /10 кг/мл /. •

Концентрацию белка после удаления фенола определяли по Доурл /1956/ ила по связывании Ку:.лсси голубого а -250/РЛкоупс, 1985/.

Цри изучении гуморального вгэдиного ьтв-.та на У. bovis к смесь ьтиш'.чнйХ кикибагл ерп2 7 ъидов аош.льзовгли- сыворотки крови 6 голов крупного рогатого скота подколно гиперш^низирсван-нсго указанные антигенам в дозе 2DQ-25Q ккг/кг в смеси с неполны!.: адмзвантом фрейнда. 7-П раз с интервале« 14-15 дней, взятые после 2, 5, 7, 9, II иньекши.

В работе также использованы сыворотки крови от 6 голов крупного рогатого скота,перорально зараженного Ы. bovis 8 и

M. acrofulaceun , получйнние чараз 75, 120 и 180 дней после зара-zemuif 06 сывороток крови коров, больных ту барку лвзок,' из которых 19 били паСззво предоставлены кандидатом биологических наук Я.М.Ходуком (ВЕ1ИБТЯ). 35 сывороток коров, реагировавшие на туберкулин,из неблагополучных по туберкулезу стад, 350 сывороток крови коров, реагировавших на туберкулин,из благополучных стад. Контролем служили 25 сывороток здоровых на реагирующих на туберкулин коров.

^моральный иммунный ответ изучали в перекрестном имыуно-электрофорезе ЛШЭФ/ по Amelsen /1977/, используя рвференс-првг параты и номенклатуру антигенов М.bovis А.П.Лнсенко ДЭ91/. ' ШЭФ ставили в I/» агарозе (Signa type 33) в веронал-мединаловом буфере pH 8,6, ионной силой 0,02.

При постановке иммуноферыеятного анализа (ИФА) применяли: ППД. туберкулин для ылекопитовдих, культурольный фильтрат, ультразвуковой дезинтеграт М.bovis , фракции культусалыюго фильтрата, преципитировалную фенолом и выделенный из нее гель-ф1льтращ;ей антиген с молекулярной массой ц 24кДа, сг/есь дезинтегратов 7 видов атипичных микобакгерий (антиген 1-1У).

Антигены /I-Змкг/ вносили в лунки панелей " nynatech" в карбонатко-бикарбонатном буфере (КББ) pli 9,1-9,4 и инкубировали 10-12 часов при +6 ...+8°С. Панели блокировали 0,5;' куриной сывороткой в 0.D1 КББ в течение 20-60 мин. После каждого зтала проводили отмывку панелей 0,5L! раствором щи pH 8,6 с 0,2& твана 20 /Perraïe, /. ■

В качестве коньагата использовали кроличьи xgo против Igo крупного рогатого скота,мзчешше персксидазой хрена /Щ) "Инициатива"/. Проявляющим субстратом слуакл орт о фе *дие (3igna ) а парекись водорода. Реакцию останаышвзде f $ евг-тей х - опыт но тршишш выполнен аспирантов А .А .Холода.?,

' . " •'••■•• - 6 - ; ' , кислотой и оценивали в единицах оптической плотноотк на спектрофотометре {.{R-680 " Bynateeh при длине водны 492 нк."

Для изучения состава шаднных комплексов их осаждали поли-этвленгдикодем ЛЮР-115/ из сывороток крови коров, больных туберкулезом, диссоциировали в 0,1 М уксусной кислоте и фракщони-ровали на удьтрогеле А-4 ó использованием хроматографаческого оборудования ЬКВ. Антигенную и антительную активность элюатов определяла о помощьй ИФА, используя антивидовые igo - igu конъю-«ггы о пероксадазой хрена.

Антигены М. bovis определяла непосредственно, фиксируя их на панелях, "сэндвич-методом", а также методом истощения известной аятисыворотки. Для atoro использовали бычьи и кроличьи антисыворотки к М. bovis, а также очищенныеарфинной хроматографией lg о х видоспеда$ичесхим антигенам U. bovis , полученным канд. вет.наук А.П.Лысенко и груплоспедафаческую антисыворотку для-атипичных микобактерий, истощенную антигенами u.bovis.

Бактериологическое исследование патматериала выполняли согласно наставления по диагностике туберкулеза животных Alocksa, 1986/. '

Статистически данные обрабатывали по Е.В.Монцевичюте-Эран-гене /1964/.

2.2. Гуморальный юаунный ответ у крупного рогатого скота при гидериммунизацаи антигенами М. bovis и атшшчяши шсо бактериями

При изучении гуморального ищу иного ответа на индивидуальные антигены Н. bovis и смеси атипичных микобактерий у крупного рогатого скота в ШЭФ, за основу был взят референс-спектр М.ьо-vie Valle« , состоявший из 25 пронумероваяных преципитатов (АЛ.Дноещсо, 1991). Применяя ШЭФ и ШЭФ с промежуточным гелем

(ПГ) удалось установить, что при гаперам^уназапаа как М.bovis так и смесью атипичных шкс бактерии синтез антител-начинается на ан-тигени 1,2,4,6. Поотоьу после 2-х инъекций и в 15SA с культураль-ным фильтратом Н. bovia сыворотки ¡Д. bovis a I-U кз давала достоверно различающихся показателей оптической плотности /СП/. При дальнейшей иммунизации L!. bovis нарастал синтез антител к более специфичным антигенам 13,15,16,17,21,24 и повышалась специфичность антисывороток в KSA.

Индивидуальные спектры епеотш.'х,5-кратно клмуш'.зироганных, в ПИЗЗ отличались как по количеству прздапитатов, так и по их Еысоте, однако сопоставление набора антител в ШШ ПГ а И2Д в сравнении о раференс-сывороткой показало, что к этиф времена з крови всех еивотнкх уке была антитела ко вези основным'антаге-ншл n es набор сад вденткченг дладовате;1Ьио, разл51Ч11я, выявленные в ПИЗ-5, определялись дра вднцеадрадще.й $ .адефизнсстьи ачтител.

■ Применение ige к видосдеинфическщл ЗЮДОЯЗД.^ волало определить в 1ШЭ5рантигекы несущие дадорпецифацрэдэ топы, которые были обнаружены в адтигецах 5,6,7,14,15,16,П., ZJI, 19.

После 5-кратной гаперадаунизациа антигенами атипичных -ми-кобактерий в сыворотках крови также присутствовал полный набор антител, -однако наиболее чеидю ии7нопрецй|щтздаоннуы картину удалось получить после 9-И, инъекций. В дальнейших исследованиях использовала смесь сывороток от 3 животных разных еррков взятия (антисыворотка 1-Е'). С помощью антисыворотки 1-1У в ЩРй <5кл изучен спектр из 20 антигенов атипичных какобактерай, .различаема aiasywiofi системой крупного рогатого скота. Антигены, идентичные антигенам М. bovis, получила одинаковые номера,, а тем которые

Ks удалось четко идентифицировать, присвоены номера от AI0I и далее /рис. I/.

С пм.тощыо включения в промежуточный гель-антигенов и анти-

t

сывороток'Ы. bovis удалось выявить, что антигены AIII, AI08 и предположительно AIIO и АЮЗ отсутствовали у возбудителя туберкулеза и были группоспецвфичны для атипичных мшшбактерий.

Антисыворотки М.bovis и 1-1У были использованы для характеристики антигенов М. bovis в ИФА. Исследования показали, что наиболее активным, но наименее специфичным оказался ультразвуковой дезантеграт, дававший перекрестные,реакции с антисывороткой 1-1У, разведенной 1:12800.

Меньшая активность, ко больыая специфичность была характерна для продуктов лизиса М. bovis - культурального фильтрата и ШД туберкулина. В особенности это касалось фракции,преципитирован-ноё из культурального фильтрата и выделенного из нее антигена с молекулярной массой 24кДа. Последний реагировал в ИФА как вадо-специфический вмт.нгвн, дававший с антисывороткой 1-1У превышение 011 в 1,2 ± 0,06 раза, а с антисывороткой М.bovis в 3,4 ± 0,57 раза.

При изучении возможности повышения специфичности показаний ИФА о неочищенными антигенами провели опыты по включению в буферный раствор /буфер Б/ для разведения сывороток 100-200мкг/кл антигенов атипичных мак с бактерий /буфер А/.

Установлено, что в буфера А антнсыворотки 1-1У снилали показания ОП на 35-40$, а антисыворотки М. bovis достоверно не изменяли интенсивность реакции /снижение 1,3-7$/. Данный способ,наряду с применением очищенного антигена (м.ы.24кДа ), позволил четко дифференцировать антисыворотки iL bovia и 1-1У.

рпс.1 ОйляЗ спектр антигенов атипичных микобактерий, полученный в ПИЭФ.

- 12 - .

2.3, Исследования сывороток крови крупного рогатого скота реагирующего на туберкулин в ИФА

Результаты раздела 2.2 показали, что в ИФА конно четко дифференцировать онтисыворотки. Однако, естественное заражение шко-бактерияыи не сопровоздается таким интенсивным антителообразова-нием как при типериммунизании, поэтому были проведаны исследова- • ния,направленные на обнаружение различий мевду сыворотками здоровых и больных- животных, отработку оптимальных параметров поста-нот ч ИФА и методов оценки реакции

Установлено, что' прд обычном учете реакции путем сопоставления ОП исследуемой сыворотка с ОН отрицательных сывороток в разведении 1:50, среднее превышение ОД сывороток крови коров с парааллергическйми реакциями на туберкулой в ИФА с культуральным фильтратом H.bovie было 1,7 /0,24 ± 0,40/. Примерно такие ае показатели отмечены и у сывороток коров,больных туберкулезом /1,6 и 0,224±0,01б/. Несколько лучшими были результаты ИФА в буфере А, Среднее снижение ОП по гру;ше когов с парааллергическими реакциями составляло 14$, причем в 57£ сывороток оно было более 20$. Показатели ОП сывороток крова больных коров в среднем уменьшались только на 6,4$, однако в 36,5/i сывороток оно было более 12$. В целом применение традиционный подходов постановки и учета КФА при дифференциальной диагностике туберкулеза показало невысокую чувствительнее?-*, и специфичность реакции.

Мы предполкккли, что на результаты реакции может влиять индивидуальная неспвцифичзская адсорбция. Было установлено, <'?о даже у отрицательных сывороток в ИФА с антигеном 1.1.bovis ОП ко- ' лебалась от 0,137 до 0,200 и в среднем составляла О,144±0,О17. С целью устранения такого влияния для каддей сыворотки был введен отрицательный контроль - показатель ОП сыворотки в лунке блокированной инертным белком /0,5;® куриная сыворотка/-, что' ока-

залось оправданным. Так, если при обычном способе учета сыворотки крови коров, инфицированные атипичными микобактериями давали превышение СП в 1,6 - 2,3 раза, то при учете по предлагаемы® способу оно было Х,0 - 1,6. Одновременно возросла выявляемость сывороток крови коров, больных туберкулезом, при чем в буфере Д она была значительно выше при небольших разведениях сывороток /1:10 -1:40/. Кроме того,было установлено, что для повышения четкости реакции а снижения неспецифи^еской адсорбции целесообразно блокировать панели 0,5% сывороткой крови кур и добавлять з хсоньюгат 0,03-0,04;? очищенного гель-фильтрацией на ультрогелв Ас 54 БСА и сыворотку крови кур.

При выяснении возможности включения а тест-систему для ША антигена 1-W установлено, что он не дифференцировал ни антисыворотку м. boviaii 1-1У, пи сыворотку крови больных туберкулезом коров от инфицированных атшшчйыма шкобактериями.

В целом на основании проведенных исследований разработан набор /тест-сксте:.'л/ в котором сыворотки исследовали в лунке с куриной сывороткой на. неспецифачесиую адсорбции, в лунках с белковой фракцией культурального фильтрата, в том числа и с буфером А, а также с очищенным антигеном, с код.кассой 24кДа.

В таблице Г приведены результаты комиссионного испытания предложенной тест-системы на сыворотках крови коров с различным статусом. Положительно реагируюгдаи счглали сыворотка, дающие превышение СП над контроле!.-, с антигеном М .bovis в 1,7 раза и более при одновременном превышении СП в буфере А в 1,4 раза и более или при превышении 011 в 1,4 раза о очищенным антигеном П. bovis

Установлено, что все 25 сывороток здоровых.животных не реагировали по полной тест-системе и только по очищенному антигену, специфичность 100%. ' .'■■•.•

Таблица I

Характеристика тест-системы по результатам комиссионного испытания

Сыворотки крови! Всего Шолокительные рв-1Спецай,ичность'У.

vnnrm ! иссле-11 зультати:_jчувствительностью

••U1U" 1 ловано !по иол- то очи- ino пол-1по очищен ! 1ной тест1щенноц? 1ной те-!ноед ан! ¡системе !антигену!ст сас-1тигеяу ■_!_!_|_I теме 1_

Здоровых коров 25 0 0 100 1Ш

Гип ернммунизирован-н;;:<. антигенами I.U"'Вко ■ 4. 4 4 "ТОП ШГ

Гипариммунизирован. атипичными микобак-териями ■ 4 3 0 ML

реагирующих на-туберкулин благополучного стада 46 5 1 2 ' 90 96

Больных туберкулезом 37 33 12 ~32~

Сыворотки гпшотннх гипepm.i.ryнлзированшх ангигенами 1.1.bovis были выявлены в 100$ случаях, а-сыворотки животных, иммунизиро-

PlOLÜ tiUU

ванных антигенами атипичных шкобактерий дава;ЩгВ~тест-системе, но в 100$! случаев не реагировали с очищенным антигеном.

Иэ 48 сывороток крови коров, реагирующие на туберкулин благополучного стада реагировали положительно в полной тест-системе-5 /спаи.фпчность - 90/5/, но только с очищенным антигеном иэ них реагировало-2 /специфичность - 96%/.

Из 37 сывороток крови больных туберкулезом коров по полной тест-системе реагировало - 33 (чувствительность 89%) и на очищенный антиген - 12 сывороток "(чувствительность 32;?).

2.4. Исследование сывороток крови здоровых . ; коров, больных туберкулезом и инфициро-

ванных атипичными шкобахстзрияш в ПИЭ5 ПГ

Результаты ИФА показали низкое содеряание антител к видоспе-цифическим антигенам в сыворотках крови больных туберкулезом коров /раздел 2.3/. Для более подробного изучения этого явления в ПИЭф ПГ изучила иммунные спектры сывороток крови не .реагирующих на туберкулин коров /п = 10/, 9 коров экспериментально и спонтанно инфицированных атипичными микобактериями а 15 коров перораль-но и спонтанно зараженных 1Л. boviо.

Установлено, что в сыворотках крови здоровых животных находились антитела реагирующие,с 4-10 антигенами М. bovis . Особенно часто это была антитела к антигенам 3,5,6,7 /встречаемость 7080$/, до 70$ сывороток содержали антитела к антигену 21. В некоторых сыворотках были найдены имцунные комплексы к антигену 4 и И,

При инфицировании атипичными микобактерияма иммунный спектр принципиально не отличался от выявленного у здоровых животных, - но титры антител была выше a несколько шаре за счет появления антител к антигенам 8,14,16,17. Кроме того, в сыворотках обнаружены антигены 7,18,19 ила их-комплексы с антителами.

Спектр антител.выявленный у больных туберкулезом коров,был несколько шире, но в основных чертах напоминал спектр инфицдро-ванных атипичными микобактериями. Однако самой отличительной чертой явилось обнаружение в сыворотках свободных антигенов 4,7,13,

i

14,15,16,17,20,21,23 Ели их комплексов о антителами. Их встречаемость колебалась от 17 до 75%, но особенно часто это были наиболее специфичные антигены 15,16,17. Необходимо отметить, что только сыворотки крови больных туберкулезом коров образовывала в ШЭФ ПГ характерные "базовые" линии, связанные с преципитатами рафа-ренс-спектра, свидетельствующие о значительном содержании "сво- .

-16-

бодннх" антигенов или их комплексов с антителами»

2.5. Выделение вщгнных комплексов из сывороток крови коров, Сольных туберкулезом а определение в них антител а антигенов м. bovio.

Для подтверждения наличия специфических именных комплексов проведены исследования по выделении, дкссоцкатцц; и определении их состава из 3 сывороток крови коров,экспериментально зараженных М. bovis . Иконные комплексы осаздали ПЗГ - 115 /3,25$/,диссоциировали в 0,2.1 уксусной кислота ß фракционировали на ультро-геле А-4. Антительную активность определяла в ИФА на паколкхс сенсибилизированных дезинтегратом !Л.bovis , а антигены детектировали в USA путем сенсибидиэавди злюрами иммунных комплексов с последующей реакцией с кроличьей антисывороткой Н. бовиес Контролем, при проведении всех исследований, служила нормальная си-воротка крови для ТСК.

На рисунке 2 представлен профиль элюцаи диссоциированного иммунного комплекса. Как видно, с помощью И<ЗА в эл&ах выявили 2 пака антигенной активности, связанные с высокомолекулярной п низкомолекулярной фракциями' и лежавший мезду ним: пик антительной активности, совпадавший с пиком оптической вдлноегк.

Необходимо отметить, что некоторые фракции, обладавшие антительной активностью давали более интенсивные реакции з ИОА.чеь' исходные сыворотки, что подтвердило мнение о значительном содержании антител в иммунных комплексах, nps. щ.' 'мзкно класса ig а а не М, которые мохут осаждаться использованной концентрацией ПЭГ.

2.6. Определенно антигенов какобактерий с помощью ЩА

Присутствие в крови больных туберкулезом коров антигенов возбудителя вызывает необходимость разработки методов их определения с использованием Н£А. Разработка такого метода полезна а

-tfy-

пэ сыворотки крови коровы больной туберкулезом /ультрогель А-4, О.Ш уксусная кислота/.

1 - антигенная активность гагатов в ИОД

с кроличьей антисывороткой М. borle. .

2 - антитепшая активность элштов в ОДА с антигеном

М. bovls.

для обнаружения и дифференфафи. шхобактервй в других субстратах, в том числе в диагностических посевах патыатериала.

С этой целью испытали метод изменения известной активности антисыворотки М. bovls известным количеством антигенов М. bovia Установлено, что внесение в антисыворотку Ы. bovie/1:6400/ ан-

- 18 - -

тигснов И.ЬоVIо свысокой степенью достоверности енляало ее активность до концентрации последних - 300нг/мл. С удовлетворительной степенью достоверности снижение активности отмечалось даже при концентрации антигенов 19нг/мл. Такая чувствительность была достаточной для определения антигенов в сыворотках крови у кроликов, зараженных патматериалом от коров, больных туберкулезом. В опыте на 2 больных кроликах и I кролике, которому были подкожно введены антигены 1Л.ьоу1в в неполном адыэванте Фрейнда, установили, что их сыворотка снижала активность антисыворотки М.ьо-ла соответстванно яа 98%, ' 13% и 42$. Это снижение активности соответствовало концентрации антигенов 200-600 мкг/мл.

При испытании "сзндвич-ыетода" использовали 1еО,очищенные

Ч, 1 ■ »

афинной хроматографией из кроличьих в'бычьих антисывороток М.Ьоу1а, которые фиксировали первым слоем на панелях. Второй слой образовывали связыванием с'антителами первого слоя антигенов ультразвукового дезинтограта М.ЪотЛв в различных разведениях и после необходимых блокировок и отмывания вносили соответствующе антисыворотки пконьюгаты, В такой модификации наблюдалась сильная неспецифичеокая адсорбпзих, поэтому удалось достоверно определить концентрацию антигенов лишь 700 нг/мл. Используя вариант МА, когда на панели фиксировали . Зсб из бычьей антисыворотки !.:.Ъоу1о , а второй антпсквороткой 1.1.ьоVIв служила кроличья антисыворотка, провали исследование 2 нормальных /отрицательных/ сывороток^ 2 сывороток крови, реагировавших аа туберкулин коров из благополучных стад, 4 сывороток крови коров, больных туберкулезом. Установлено, что 3 сыворотки из 4-х здоровых и реагирующих на туберкулин коров давали довольно высокие показатели. 011,. / ' - •

которые были примерно такими же; как и у 2 сывороток из 4 боль-пых и'.вотиых, однако у . 2 больных коров такие показатели СП были на/25-65;? выше,,

Нолучешше данные с одной сторона показали возможность определения в ИФА циркуляции антигенов Ы.бовас, а с другой стороны^ достаточно высокий уровень ОП, полученный с сыворотками фактически здоровых коров. Это подтверждает данные ШЭф ИГ, свидетельствующие о возмоэтоста циркуляции в крови антигенов ыд-унох'.и.тчес-ка родственных антигенам М. bovin.

Таким образом, при диагностике тубер^леза, основанной на обнаружении антигенов, также''надо учитывать их перекрестную активность.

2.7 Разработка способа дафференцдацш шкобактерий в ИФА по видо-и-груплоспепафичным антигенам

В опытах по изучению антигенного состава микобактерий в ШЭф было установлено, что некоторые антигены возбудителя туберкулеза не встречаются у атипичных шжобактерий и наоборот, а в ИФА несмотря на перекрестную активность более интенсивная реакция наблюдается с гомологичными антисыворотка!®. Тем неменее, гнуты показали, что по неистощенный антиснвороткам весьма трудно различить принадлежность мпкобактерай. Для максимального исключения перекрестных реакций при разработке способа дифференциации микобактерий мы применили бычыиео к видоспецифаческим антигенам М. bovis , а также пригоговида группоспецифическую антисыворотку, путем истощения антисыворотки 1-1У антигенами М. bovin.

В предварительных опытах было установлено, что указанные препараты позволяют достоверно выявлять антигены в концентрации 32-CI нг в 0,1мл. Следовательно, они пригодны для исследования очень небольшого количества баккассы. Иседе; вания показали, что 0,00-0,1 кг культуры,су опендированноЗ в 1мл 0,Ш карбо-натно-бпг.арбонатного буфера pH 9,1-9,6. и инактивирЬванной' 20мин.

прогреванием в кипящей водяной бане достаточно для проведения их дифференциации. :. ..

На основе полученных результатов сконструирован набор для дифференциации микобактерай, включавший tgG к видоспецифическим . антигенам M.bovie , антисыворотку, груплоспецвфачную дляатипич-' ных микобактерай, соответствующие контрольные антигены и реактивы для учета реакции. \ / .

. Испытание набора в комиссионном а .производственном опыте на 49 культурах показало, что во всех случаях штаммы M.bovib /п»1б/ а М. tuberouioaia (п-I) показала коэффициент (отношение СП с кОП группоспецифеческой антисыворотки) - 1,3-3,0,а культуры атипичных мико бактерий (п > 32) - 0,2-0,8. Такав различия позво-. дяютчетко дифференцировать возбудителей -губеркулеза млекопитающих от мико бактерий, при минимальных затратах, ана выполнение работы по исследованию 22-45 штаммов уходит 2-3 дня.

Г. При введении крупному рогатому окоту здк м.bovia так и - атипичных мико бактерий синтез, антител начинаете ' наобщеродсвые антигены 1,2,4,6. Далее возрастает образование ¡..нтител к более специфичным антигенам. -

-, ' 2. Иммунная система крупного-рогатого окота распознает а дает различимый в ПИ ЭФ ^ гуморальный иммунный ответ на 20-25 индивидуальных антигенов Ц.bovie и атипичных микобактерай.

3. В качестве антигенов ддя ИФА целесообразно применять про. дукты лизаоа'шкобяктерай - культу ралышй фильтрат а. его фракцию,

прзципитирсванкую фенолом, а такае не дававший перекрестных реак~ дай антиген из указанной фракции о мол. массой около 24 кДа.

4. В сыворотках крева животш»х,не реагирующих на туберкулин,

- 21 - >

и коров, инфицированных атипичными микобактериями обнаружены антитела, взаимодействующие с 4-14 антигена!.® 11. Ьотг1о.

В сыворотках крови коров, больных туберкулезом, найдет антитела к 16 антигенам и 21 разновидность иммунных комплексов или "свободных" антигенов.

5. Только сыворотки крови коров, больных туберкулезом, образовывали в ШЭФ ИГ "базовые" линии, с преципитатами референс-спектра. с

6. Для повышения чувствительности и специфичности МА целесообразно с целью устранения индивидуальной неспецифической адсор бции сывороток при учете реакции за ноль принимать адсорбцию исследуемой сыворотки в лунке блокированной инертным белком; исследовать снворотки в разведениях 1:10 - 1:50, в том числе в буфере, содержащем антигены атипичных микобактерий.

7. Изученные культуры возбудителя туберкулеза имели одинаковые видоспецифаческие антигены, обнаруживаемые в ИФА. Атипичные микобактерии, кроме общерсдовых, обладали и группоспецифи-ческкми антигенами, не встречающимися у возбудителей туберкулеза млекопитающих.

8. ИмцуноферментннЛ анализ, с разработанными к нему наборами, позволяет проводить дифференциальную диагностику туберкулеза о чувствительностью 89^, специфичностью 90/5 и дифференцировать культуры возбудителя туберкулеза от атипичных микобактерий со 1005? специфичностью.

4. црЕДшггшя дая практики

1)"Тест-система для дифференциальной диагностики туберкулеза крупнот рогатого скота в тиуно^зр.'ентном анализе Дкл/"Утвер здена ГУЗ Минсельхозпрода РБ 2I.II.SC/.

2) ";5абор для дифференцаацпи культур мдкобактерий в ИМ" /Утвержден Г/3 ЬиНсельхозпрода РБ 7.04.92/-.

СПИСОК НАУЧШХ РАБОТ, ОПУШЖОВАИШХ ПО ТШЕ Д1ССВРГАЩИ

1. Лысенко А.И., Карпова Г.А., Агеева Т.Н. ИммунохпшческлЁ метод оценки специфичности препаратов для диагностики туберкулеза у крупного рогатого скота// Те^докл.Всес.науч.конф. "Совершенствование методов госконтроля ветпрепаратов". -Москва.-IS9I. -С. 148-149.

2. Лысенко А.П., Карпова Г.А., Агеева Т.Н. Специфичность антигенов Mycobacterium'bovis при диагностике туберкулеза крупного рогатого скота в \Ш// Bsтеринария.-1992.-»'»3.-С. 22-24.

3. Лысенко А.П., Карпова Г,А., Агеева Т.Н., Глинникова З.А.. Кузнецов H.A. Оценка аллергических проб для диагностики туберкулеза// Ветеринарная наука - производству, -{Линек. -1993./впечати/

4. Лысенко А.П., Карпова Г.А., Агеева Т.Н. Особенности серологической диагностики туберкулеза у крупного.рогатого скота// Теадокл.науч.конф. -Харьков. -1993 /в печати/.

5. Лысенко А.П.,'Агеева Т.Н., Карпова Г.А. Исследование сывороток коров, инфицированных атипичными микоб. нтериями и больных туберкулезом в перекрестном имму но электрофора je// Becqí Ака-дзш/. навук РБ /в печати/.

Подписано к печати Лв.05'.93г; Печать о|сетная Формат 60%в4*1/16 Усл;гг^ 1,0' Заказ 53"Гираж 100 Бесплатно БелНИЖП АПК Минск, Казанца, 88