Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Антимикробные свойства некоторых поверхностно-активных веществ и антисептическое действие настойки Ллмадена

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ВОРОНЕЖСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

Л\ЕЛЬНИК Игорь Юрьевич

УДК 619:615.28:636

АНТИМИКРОБНЫЕ СВОЙСТВА НЕКОТОРЫХ ПОВЕРХНОСТНО-АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ И АНТИСЕПТИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ НАСТОЙКИ ЛОМАДЕНА

16.00.03 — ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Воронеж

1992

Работа выполнена в лаборатории микробиологии Всесоюзного «аучно-исследовательского ветеринарного института патологии, фармакологии 'и терапии.

Научный руководитель — доктор ветеринарных наук, профессор А. Г. Шахов.

Официальные оппоненты: доктор ветеринар.ных наук, профессор В. П. Литвин, кандидат ветеринарных наук, доцент Л. И. Ефанова.

Ведущее предприятие — Всесоюзный государственный научно-контрольный институт ветеринарных препаратов.

Защита диссертации состоится « 1992 г.

в часов на заседании специализированного совета

К 120.54.03 Воронежского государственного аграрного университета (394087, г. Воронеж, ул. Ломоносова, 114).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВГАУ.

Автореферат разослан «./^ 1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат ветеринарных наук

Н. А. Чаплыгина

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В современных животноводческих комплексах в последние годы отмечается увеличение числа гнойных послеоперационных осложнений.

Успех борьбы с (раневой .инфекцией зависит прежде всего от эффективности профилактических мер, направленных на предупреждение попадания патогенной микрофлоры в раны при проведении диагностических исследований, лечебных процедур :и операций. Одной из таких мер является антисептика.

Лучшим препаратом для этой цели является настойка иода. Однако заявки (ветеринарии на ¡настойку йода в связи с дефицитом в ¡стране сырья постоянно .недовыполняются.

Применяемые в (настоящее .время другие .антисептики малоэффективны и не предупреждают развитие раневой инфекции у животных.

В этом плане перспективными являются препараты из группы четвертичных .аммониевых ¡соединений.

Цель и задачи исследований. Цель настоящей работы состояла в выборе ¡из .новых четвертичных аммониевых соединений одного препарата по 'следующим показателям: степень антимикробной активности, токсичность для животных, цена, возможность производства :и применения его в качестве антисептика, заменяющего настойку йода.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Изучить антимикробную активность новых препаратов четвертичных ¡аммониевых соединении — ломадена, декаме-токсина, этояия, додецония.

2. Разработать рецептуру ¡нового антисептика па основе выбранного четвертичного аммониевого соединения.

3. Изучить антимикробную и антисептическую активность нового антисептика.

4. Разработать показания к применению, провести производственную апробацию и оценить экономическую эффективность применения нового антисептика для обеззараживания кожи.

Научная новизна. Разработан новый антисептик для обработки кожных покровов на основе соли четвертичного аммония — ламадена — и изучена его антимикробная активность. Впервые проведено субмикроскопическое «исследование особенностей тонкой организации бактерий после .контакта с 11 а с то й к о й л ом а д ен а.

Практическая значимость работы. Результаты проведенных экспериментально-клинических исследований послужили обоснованием к разработке антисептика — настойки ломаде-на, предназначенного для предоперационной обработки кожи животных, и вошли в нормативно-технические документы на препарат.

Внедрение. Разработана и внедрена в промышленное производство химико-фармацевтических заводов технология изготовления настойки ломадена. Результаты 'исследований вошли во «Временное наставление по применению .настойки ломадена в .ветеринарной хирургии», утвержденное ГУВ при Государственной .комиссии Совета Министров СССР по продовольствию и закупкам 23.10.89 г.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на: отчетных конференциях и Ученом совете Всесоюзного НИВИ патологии, фармакологии и терапии в 1989—1991 гг.; на 1-й межвузовской ¡научно-практической конференции «Новые фармакологические средства в ветеринарии» (Ленинград, 1989).

Публикации. Основные положения диссертации опубликованы в 3 научных статьях.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 138 страницах машинописного текста и включает: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов исследований, выводы, предложения и список литературы. Работа иллюстрирована 29 рисунками, 22 таблицами. Список литературы включает 163 источника, в том числе 49 еарубежных авторов.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Об антимикробной активности настойки ломадена.

2. О профилактической и экономической эффективности применения .настойки ломадена для антисептической обработки кожи животных.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материал и методы

Экспериментальные ■исследования проведены в лаборатории микробиологии и 'вирусологии Всесоюзного научно-исследовательского ветеринарного ¡института патологии, фармакологии « терапии.

Лабораторные опыты проведены на белых мышах с массой тела 18—22 г, «роликах породы шиншилла с массой тела 2,5—3,0 'кг, 'содержащихся ,в условиях вивария 'института в соответствии с нормами кормления 'и содержания лабораторных животных. В опытах было использовано 250 белых мышей и 36 кроликов.

В качестве тест-культур были использованы референтные штаммы микроорганизмов: золотистого стафилококка (штамм 209-Р), кишечной палочки (штамм 1257), бациллы церсуса (штамм 96), полученные (из музея Всесоюзного НИИ 'Ветеринарной санитарии, а также полевые штаммы золотистого стафилококка, кишечной и синегнойной палочек, вульгарного протея, сальмонеллы и грибов родов трихофитои и кандиды.

Предварительно у этих штаммов были изучены морфологические, культуральные, тинкториальные и биохимические свойства.

Минимальную бактериостатическую концентрацию новых биологически активных ПАВ — ломадена, додецония, дека-метоксина ;и зтония — выявляли методом серийных разведений в МПБ 'и в жидкой среде Сабуро; минимальную бактерицидную концентрацию — путем высева из -пробирок с МПБ на плотные питательные среды. Результаты опытов учитывали в течение 7 дней, а со спорами и грибами — 14 дней.

Рецепт заменителя настойки йода составлен на основе ломадена.

Определение оптимальной концентрации ломадена в новом антисептике проводили на кроликах, на выстриженную и продезинфицированную кожу которых наносили взвесь суточной агаровой культуры тест-микроба (золотистый стафи-л о ко к к, эшерихии).

Для контроля исследовали смыв с кожи без предварительной дезинфекции участка .нанесения тест-микроба. В остальных случаях смывы с места аппликации микроорганизмов сделаны после предварительной обработки .их различными препаратами (70% этанол; 0,1%, 0,5%, 1%, 1,5%, 2%, 4%

¿ппртФвые растворы ломадена). Посев всех смывов проводили «а МПА и термоетати'ровал'и в течение 48 часов. Учет проводили по интенсивности роста микроорганизмов.

Опыты по определению антимикробной активности настойки ломадена проведены на 8 культурах микроорганизмов (золотистый стафилококк, эшерихии, сальмонеллы, протей, исев-домонады, грибы родов трихофнтои и кандида, 'бацилла цере-уса) общепринятым методом серийных разведений в сравнении с таковой у 5% настойки йода м компонентов этого антисептика (70° этилового спирта и 1,5% водного раствора ломадена).

Изучение влияния белка па активность настойки ломадена проводили при добавлении к микробной взвеси ииактивиро-ванной лошадиной сыворотки в количестве 5%, 10% и 20%.

Для разграничения бактерицидного действия настойки ломадена (по АДВ) от бактериостатичеокой активности использовали 'биологический метод. При постановке 'биологической пробы белым мышам интраперитонеально .вводили патогенные для них бульонные культуры: золотистого стафилококка, кишечной палочки, сальмонеллы (возбудителя паратифа телят), протея вульгарного и синегноиной палочки соответственно в количестве 2-10*; 1-Ю3; 3-Ю5; 1 - 10г'; 5-103 микробных клеток после обработки их в течение 15 минут различными концентрациями активно действующего вещества настойки ломадена. 18-часовые культуры ■смешивали с раствором антисептика в соотношении 1 : 9. В .качестве положительного ■контроля 'использовали настойку йода. В отрицательном контроле вместо раствора антисептика культуры смешивали с физиологическим раствором.

За подопытными мышами наблюдали в течение двух недель, при этом соблюдал,и условия, исключающие возможность контактного заражения. От павших и убитых через 2 недели мышей бактериологически исследовали кровь из сердца, ткани печени и селезенки. При наличии роста проводили идентификацию выделенных бактерий по морфологическим, культуралышм и биохимическим показателям.

Для электронно-микроскопического изучения действия настойки ломадена о опытах ин витро использовали культуры кишечной палочки (штамм '1257) и золотистого стафилококка (штамм 209-Р) в фазе логарифмического роста, выращенные на МПБ в условиях усиленной аэрации па качалке. К 1 мл взвеси микробов 18-часового роста, содержащей 1 • 107 клеток, прибавляли настойку ломадена .и оставляли их в контак-

те на 1, 15 -и 30 минут при 18°С. Контролем служили маточные культуры без антисептика. Опытные :и контрольные образцы центрифугировали 5 минут при 3 000 об./,мин .на центрифуге ОПн-3 УХЛ 4,2. Осадок дважды отмывали в физиологическом растворе. Затем бактериальные «летки помещали на 1 час в 2,5% глутаральдегид на в-коллидинопом 'буфере, центрифугировали в течение 10 минут при 3 000 об./мин, .отмывали осадок 10% раствором сахарозы 5 раз по 20 минут. Постфиксацшо проводили четырех-окнсыо осмия. Фиксированный .материал обезвоживали в восходящих .концентрациях этилового спирта, после чего заключали в смесь эпоновых смол. Срезы готовили на ультратоме Ы<В-380Л -и контрастировали ураннлацетатом и цитратом свинца. Просмотр производили в электронном микроскопе ТЕЗЬА-ВБ-бОО при ускоряющем напряжении 90 Квт.

Испытания по изучению 'адаптации золотистого стафилококка и -кишечной палочки « -настойке ломадена проводили путем культивирования бактерий па мясо-пептонном бульоне, содержащем все ¡возрастающие количества суббактериостатн-ческих концентраций активно действующего вещества.

Было сделано 65 пассажей кишечной палочки и 60 пассажей золотистого стафилококка. Степень -увеличения -устойчивости микроорганизмов оценивали по коэффициенту резистентности — отношению конечной максимальной .концентрации активно действующего вещества настойки ломадена, не препятствующей .росту бактерий, к исходной,

При определении антисептической активности настойки ломадена транзитную микрофлору -кожи имитировали, используя поле-вые тест-штаммы золотистого стафилококка, кишечной палочки, сальмонеллы, вульгарного протея и палочки сине-зеленого гноя. При проведении исследова-ний суточную бульонную культуру -в количестве 0,1 мл наносили па кожу внутренней поверхности ушной раковины кроликов и равномерно распределяли на ограниченном участке. Отбор проб проводили дважды: до обработки антисептиком (при естественной контаминации) или через 5 минут после нанесения и распределения тест-культуры на коже — контрольная проба (с левого уха); вторую пробу (с правого уха) отбирали через 1, 2, 3, 4 и 5 минут после нанесения обеззараживающей жидкости -в объеме 1 мл (на участок 25 с-м2).

Пробы па обсемененность кожи микрофлорой брали стерильными марлевыми тампонами с 1 см2 кожи. Тампоны -со взятыми пробами погружали в пробирки со стерильным

0,85% раствором натрия хлорида, после чего последний разводили 1 : 10000. Эту жидкость (1 мл) высевали на 2% агар в пробирке, .содержимое ее тщательно смешивали, выливали в бактериологические чашки. Последние помещали на сутки в термостат при 37°С, после чего подсчитывали колонии, .выросшие на поверхности и в глубине агара.

Бактерицидность обеззараживающего средства определяли относительно количества микробных проб, взятых до нанесения обеззараживающей жидкости.

При определении влияния настойки ломадона на аутофло-ру кожи после однократного воздействия на .тестируемые участки кожи внутренней поверхности ушных раковин кроликов, тщательно обработанные физиолопическим раствором для устранения поверхностной микрофлоры, наносили настойку ломадена и настойку йода. Контрольные поверхности антисептиками не обрабатывали. После минутного контакта с препаратами .исследуемые участки кожи смачивали стерильным 0,25% водным .раствором аммиака с .целью увеличения секреции желез и поступления глубокой микрофлоры на поверхность кожи. Через 1 минуту после нанесения раствора брали материал при помощи дисков из фильтровальной бумаги, пропитанные стерильным физиологическим раствором. Затем диски отмывали ¡в пробирках с физраствором и осуществляли посев содержимого пробирок на чашки с МПА. Результаты учитывали по количеству выросших колоний.

Все эксперименты по определению антимикробной активности и антисептических свойств препаратов проводили в 3—5 повторностях.

Статистическую обработку полученных данных проводили при помощи критерия Стыодента.

2.2. Результаты исследовании

Результаты проведенных исследований показали, что ло-маден обладал широким спектром противомикробного действия. Наиболее высокую чувствительность к ломадену проявляли культуры золотистого стафилококка (.минимальная подавляющая концентрация К<0,9—3,9 мкг/мл). Активность ломадена в отношении грамотрицательных бактерии >в зависимости от видовой принадлежности .микроорганизмов колебалась от 3,9 до 500 мкг/мл. Фунгистатическое действие проявлялось при 15,6—31,2 мкг препарата на 1 мл среды.

Эффективным в отношении грамотрицательных бактерий

б

оказался декам етокспн. Препарат подавлял рост кишечной палочки, сальмонеллы, протея, еинегнойной палочки в концентрации соответственно 15,6; 15,6; 31,2 и 62,5 мкг/мл. Дс-каметоксин оказался эффективным фунгицидом. Он подавлял рост культуры гриба трнхофитон в дозе 1,9 мкг/мл. Однако его активность о отношении дрожжеподобных грибов была вдвое ниже активности ломадена.

Додецоний задерживал рост культур золотистого стафилококка, кишечной палочки, сальмонеллы, вульгарного протея, синегнойнои палочки, а также грибов из родов трихофитон и кандида в концентрации соответственно 7,8; 125,0; 125,0; 500,0; 1 000,0; 31,2; 62,5 мкг/мл.

При испытании антимикробной активности этония было установлено, что исследуемый препарат в разведении 7,8 мкг/мл ннпгбировал рост .полевого штамма золотистого стафилококка и в большей 'или меньшей степени подавлял репродукцию грамотрицателыюй микрофлоры (в среднем в разведениях 125—1 000 мкг/мл) и оказывал фунгистатическое действие на патогенные и условно-патогенные виды грибов в концентрации 62,5—250 мкг/мл.

Все названные препараты обладают бактерицидной активностью при определенных концентрациях. Минимальная бактерицидная концентрация, при которой гибнут все виды взятых в опыт микроорганизмов, для декаметокоина была равна 125 мкг/мл, для ломадена — 1 000 мкг/мл, а для додецония и этония она 'была выше 1 000 мкг/мл. Споровые формы бациллы цереуса были устойчивы ко всем четырем препаратам даже при повышении их концентрации до 5%.

Таким образом, из испытанных препаратов группы четвер- , тпчных аммониевых соединений 'Наиболее эффективным (по / минимальной подавляющей концентрации в отношении ¡испытанных культур) оказался декаметокоин. Наименее активными были додецоний и этоннй, а ломаден занимал промежуточное место.

Однако в связи с тем, что производство декаметоксшга ограничено и от; имеет большую стоимость, ¡нами для дальнейшего ¡изучения и использования в качестве активно действующего вещества для разработки кожного антисептика был выбран более доступный и дешевый по цене препарат «ломаден». производство которого налажено ОП ИОХ УДИ.

С целью изучения возможности использования в качестве антисептического средства ломадена при обработке операционного поля животных нами была ¡исследована антисептичс-

екая активность его спиртовых растворов с различной 'концентрацией препарата.

Что ¡касается содержания спирта, то взята .наиболее бактерицидная и технологичная концентрация — 70%.

Установлено, что с увеличением содержания ломадена в спиртовых растворах возрастает 'бактерицидность этих растворов. Та.к, при добавлении к 70° этиловому спирту 0,1% ломадена степень деконтамииацин .кожи, обсемененной золотистым стафилококком, увеличилась с 97,8 до 98,3%, количество колониеобразующих клеток кишечной палочки уменьшилось на 0,9% (с 3,2% до 2,3%)- При применении 0,5% спиртового раствора ло.маде,на обеззараживающий эффект 'был 'более .высоким: в отношен,ни стафилококка — 99,2%; в отношении кишечной палочки — 98,7%. 1% спирто-ной раствор ломадена вызывал '100% гибель стафилококка; участки кожи, контаминированные кишечной -палочкой, -в этом случае обеззараживались на 99,4%. Полное обеззараживание кожи, обсемененной кишечной палочкой, обеспечивалось 1,5% спиртовым 'раствором ломадена через 1 минуту.

Таким образом, .в ходе исследований установлено, что оптимальной является концентрация ломадена в настойке, равная -1,5%.

Антимикробная активность настойки- ломадена в сравнении с активностью настойки йода и 1,5%' водного раствора ломадена испытана на восьми видах микроорганизмов.

Настойку ломадена готовили па 70° этиловом спирте. Параллельно ставили контрольный -опыт — этиловый спирт соответствующего разведения.

Настойка йода оказывала бактериостатическое действие иа грамположительную и грамотрнцательпую микрофлору. У сальмонеллы и кишечной палочки не выявлено существенной -разницы в чувствительности -к настойке йода (250— 500 мкг/мл). Синегнойная палочка и вульгарный протей были чувствительны в равной степени (1000 мкг/мл). Значительной чувствительностью к настойке йода обладал стафилококк (7,8—62,5 мкг/мл). На грибы рода кандида настойка йода действовала в дозе 1 000 1мкг/,мл, трихофптон подавляла при концентрации 125 мкг/.мл.

Было отмечено, -что сальмонелла и кишечная палочка примерно одинаково 'чувствительны к 1,5% водному раствору ломадена (125 и 62,5 мкг/.мл). Водный раствор ломадена действовал на синегнойную палочку бактерностатическн в дозе 500 мкг/мл. Препарат подавлял рост протея вульгарного в

дозе 250 мкг/мл. Он задерживал 'рост разных штаммов золотистого стафилококка в разведении К 0,9—3,9 мкг/мл. Фунги-статическое действие проявлялось прежде всего в отношении трихофитона (15,6 мкг/мл). Ингибирование кандиды отмечалось при более высокой (концентрации (62,5 мкг/мл). Водный раствор ломадена не оказывал бактериостатичеекого действия .на спорообразующие (микроорганизмы.

Па основании .полученных результатов установлено, что у представителей одного и того же рода кишечной палочки 'и золотистого стафилококка были штаммы с неодинаковой резистентностью к настойке ломадена, которая варьировала в достаточно широких пределах (1,9—31,2 ликг/мл и К<0,9— 1,9 мкг/мл соответственно). Наибольшую устойчивость к настойке ломадена проявлял штамм синегиойпой палочки, сохраняющий жизнеспособность до .концентрации 250 мкг/мл. Наименьшей устойчивостью обладал стафилококк, который погибал при воздействии препарата в дозе 1,9 мкг/мл.

Сравнивая средние показатели гибели 'изученных штам.мов при воздействии 'настойки ломадена, их можно распределить в следующей последовательности по степени увеличения устойчивости: золотистый стафилококк (1,9 мкг/мл), трихофитии (7,8 мкг/мл), кишечная палочка (31,2 мкг/мл), кандида (31,2 .мкг/мл), сальмонелла (62,5 мкг/мл), протеи (125 мкг/мл). сннег.нонная палочка (250 мкг/мл).

Спирт в концентрациях, соответствующих его разведениям в настойке ломадена, бактериостатической активности в отношении всех испытанных микроорганизмов не проявил. "* При определении истинной бактерицидной .активности настойки ломадена в сравнении с таковой у настойки пода методом биологической пробы установлено, что при (воздействии настойки пода ига культуру золотистого стафилококка .в концентрации 125 мкг/мл наступала полная гибель бактерий. В результате этого микроорганизм, иноку .тированный белым мышам, не вызывал их гибели. Мыши не погибали при заражении их суспензией кишечной палочки после ее обработки настойкой йода в дозе 1 ООО .мкг/мл. Сальмонелла не сказывала патогенного действия на подопытных жизот.ных после контакта с антисептиком, содержащим 1 ООО .мкг в 1 мл раствора. Летальные дозы протея становились безвредными для мышеи в результате бактерицидного действия на них настойки пода в разведении 2 000 мкг/мл. Синегнонная палочка инактнвнровалась такой же концентрацией препарата, после чего не ¡вызывала заболевания у мышей.

Результаты проведенных исследований показывают, что настойка ломадена обладает бактерицидной активностью в концентрации 15,6— 1 000,0 .мкг/мл и зависимости от вида культуры. Так, золотистый стафилококк, введенный белым мышам внутрнбрюшинно, не высевался из внутренних органов животных после их убоя >в результате его инактивации настойкой ломадена в концентрации 15,6 <м:кг/мл. В этом случае'бактерицидная ¡активность настойки ломадена в 8 раз превышала активность настойки йода. Кишечная палочка в 16 раз чувствительнее :к настойке ломадена, чем к настойке йода. Она утрачивала свою 'активность при воздействии на нее дозы 62,5 мкг ломадена в 1 ,мл антисептика :и при этом становилась непатогенной для мышей. У подопытных животных, которым инокулировали летальную дозу сальмонеллы после предварительной обработки настойкой ломадена в концентрации 250 мкг/мл, заболевания ¡не наблюдалось. Здесь бактерицидный эффект антисептика превышал эффективность настойки йода в 4 раза. Более устойчивым к препарату был вульгарный протеи. Он не вызывал гибели мышей лишь после ¡контакта с настойкой ломадена ¡в концентрации 500 мкг/мл. Настойка йода в данном случае ¡была ¡менее активной в 4 раза. Оинегнойная палочка оказалась наиболее устойчивой к ■настойке .ломадена. Она погибала после обработки антисептиком в концентрации 1 000 мкг/мл и была безвредной при биопробе. Бактерицидные дозы настойки йода для этой бактерии были в 4 раза выше.

Таким образом, результаты изучения 'бактерицидного действия 'антисептиков, полученные при помощи биологической пробы, полностью коррелируют с да,иными культурального метода и подтверждают большую активность настойки ломадена по сравнению с настойкой иода в отношении испытанных культур микроорганизмов в опытах ин внтро.

Активность антисептического средства определяется не только его концентрацией и видам микроорганизма, но и таким фактором, как наличие органических веществ, играющих защитную роль для ¡микроорганизмов.

Бактериостатнческое и бактерицидное действие настойки ломадена ¡в отношении кишечной палочки и золотистого стафилококка 'Изучали в присутствии сыворотки крови.

Так, при внесении в среду 5% сыворотки крови бактерио-статическая активность настойки ломадена ¡в отношении стафилококка снижалась ¡в 2 раза (от 1,9 до 3,9 мкг/мл), а в отношении кишечной палочки — в 4 раза (от 31,2 до

125,0 мкг/мл). Бактерицидные концентрации антисептика при этом в обоих ¡случаях становились в 4 раза большими и ■изменялись от 3,9 до 15,6 мкг/мл в отношении стафилококка и от 62,5 до 250,0 мкг/мл в отношении кишечной палочки.

При добавлении к мясо-пептоннаму бульону 10% сыворотки крови минимальные подавляющие концентрации настойки ломадена при воздействии и а кишечную палочку и золотистый 'стафилококк увеличились в 4 раза (с 31,2 до 125,0 мкг/мл и 1,9 до 7,8 мкг/мл 'соответственно). Минимальные бактерицидные концентрации были вдвое больше бактерио-статических — 250 мкг/мл и 15,6 мкг/мл.

При добавлении к бактериальной взвеси 20% сыворотки крови устойчивость к настойке ломадена как у гра.мположи-тельиых, так и у грамотрицательных микроорганизмов повышалась в 8 раз. Гибель стафилококка наступала при концентрации настойки ломадена 31,2 мкг/мл. Кишечная палочка погибала при действии антисептика в дозе 500 мкг/мл.

Та кпм образом, бактср.ностатнчсская и бактерицидная активность настойки ломадена .в отношении грамположнтель-ных и грамотрицательных бактерий в зависимости от количества сыворотки снижается в 2—8 раз. Однако при такой степени инактивации активность настойки ломадена сохраняется на уровне, обеспечивающем гибель микроорганизмов.

Для определения возможности повышения устойчивости кишечной палочки и золотистого стафилококка к настойке 'ломадена было проведено их культивирование на питательном бульоне, содержащем все возрастающие количества суббак-тсриостатических концентраций антисептика.

Установлено, что 'минимальная подавляющая концентрация активно действующего вещества настойки ломадена в отношении культур золотистого стафилококка в процессе их серийных пассажей на МП Б с настойкой ломадена повысилась в 32 раза (с 1,9 до 62,5 мкг/мл). При культивировании кишечной палочки на средах, содержащих возрастающие концентрации активно действующего вещества настойки ломадена, ее чувствительность к препарату .снизилась в 8 раз. Минимальная подавляющая концентрация в данном случае увеличилась с 31,2 до 250 мкг/м.

Для решения вопроса о стойкости произошедших в культурах изменений под действием настойки ломадена был проведен последовательный пассаж полученных вариантов на свежий питательный бульон, не содержащий ингибитора.

При этом установлено, что к 20-му пересеву приобретенная устойчивость .постепенно снижалась до исходной.

При проведении субмикроскопического изучения особенностей тонкой организации бактерий — кишечной палочки и золотистого стафилококка — после контакта с настойкой лома-дена предполагалось установить зависимость характера происходящих структурно-морфологических изменений бактериальных клеток от длительности воздействия препарата.

В норме поверхность клеточной стенки у кишечной палочки представлена 3-слойной мембраной. Под наружной мембраной располагался слой, также относящийся к клеточной стенке, который соединяет трехслойную цптоплазматическую мембрану в единую структуру. Цитоплазматичеокая мембрана образовывала кольцевидные нива пшаты в сторону цитоплазмы. Основная часть цитоплазмы была заполнена гранулярным 'Компонентом, представленным полирибосомами. Нук-леонд был отчетливо ограничен от остальной части цитоплазмы и заполнен фибриллами ДНК.

Клетки стафилококка до воздействия настойки ломадена имели ¡клеточную стенку с четко выраженным внутренним электронно-плотным слоем. Цитоилазматичеокая мембрана обычно выявлялась как одноконтурная. Цитоплазма была заполнена гранулярным компонентом, .равномерно распределенным в клетке. В ней можно было наблюдать мембранные структуры, различающиеся положением в клетке. Ядерный материал был четко дифференцирован и занимал значительную часть ¡цитоплазмы.

На срезах 'бактерий кишечной палочки, находившихся в контакте с антисептиком в течение 1 минуты, клеточная стенка в некоторых местах ¡имела трехконтурное строение, па остальном протяжении она выглядела в виде осмиофильного слоя неравно,мерной толщины, а местами вовсе не прослеживалась. Цитоплазма имела несколько повышенную осмио-фильность. В зоне ядерного вещества были видны агрегаты нитей.

У стафилококка после 1-минутного действия настойки ломадена внутренний электронно-плотный слой клеточной стенки разрыхлялся 'И терял четкие очертания. Цитоплазматиче-скан мембрана не обнаруживалась. Впутрицптоплазматиче-окое содержимое было представлено дисперсным веществом средней электронно-оптической плотности. Нуклесид и мембранные структуры не дифференцировались.

Йрн увеличении времени действия настойки ломадена дб 15 минут у кишечной палочки клеточная стенка и внутренняя мембрана были фрагмеитированы. В комковатом, неравномерно проницаемом для электронов матриксе содержались оомиофильные гранулы с нечеткими ■расплывчатым« краями. На полюсах многих клеток наблюдался лизис цитоплазмы. Внутри и на поверхности клеток имелись шарообразные формирования.

У стафилококков, обработанных настойкой ломадена при той же экспозиции, наружный и внутренний слои клеточной стенки истончались. Нередко 'нарушалась целостность стенки, или она совсем отсутствовала. По периферии клеток выявлялись скопления масс, 'нередко обнаруживающих связь с клеточной стенкой. По своей электронно-оптической плотности они были идентичны содержимому ¡клеток.

Воздействие настойки ломадена на клетки кишечной палочки в течение 30 минут вызывало появление деструктивных процессов в цитоплазме. Наблюдалось появление электронно-прозрачных зон. У отдельных «леток происходил разрыв клеточной стенки и наблюдался выход содержимого клетки, представленного сферическими конгломератами различных размеров, за ее пределы.

У стафилококка после 30-минутного воздействия настойки ломадена содержимое цитоплазмы сгущалось, в результате чего по краям клеток появлялись обширные электронно-прозрачные участки, по всей поверхности клетки появлялись электронно-плотные округлые образования. У отдельных клеток происходил разрыв клеточной стенки или отделение ее фрагментов. ,

Таким образом, настойка ломадена способна лпзпровать клеточные мембраны, дезинтегрировать цитоплазму и ДНК.

Эффективность -антисептического действия настойки ломадена при естественной контаминации кожных покровов кроликов изучали сравнительно с настойкой йода и 70° этиловым спиртом.

Наибольшее бактерицидное действие у всех средств наблюдали через 1—2 минуты после их применения, затем бак-терицидность уменьшалась, особенно у спирта. Полного бактерицидного эффекта не обнаружено ни у одного -из испытанных препаратов. Максимальную бактерицидную активность . наблюдали через 1 минуту: у настойки ломадена — 98,6%. несколько ниже у 70% спирта — 97,5%, 5% спиртовой раствор йода обеззараживал 93,7% микробов.

'Через 3 минуты действие 70% спирта снижалось на 14— 16% по «сравнению с 1—2-минутной экспозицией, бактерицид-ность настойки йода уменьшалась на 6%. В то же время эффективность настойки ломадена почти не изменялась и составляла 97,4%.

Спустя 5 минут бактерицидное действие настойки ломадена снижалось не более чем на 5%, в то время как степень обеззараживающего действия настойки йода составляла лишь 81,9%, что на 12% ниже исходной. 70% этиловый спирт при тех же условиях обеспечил деконтаминацию поверхности кожи всего на 69,2%, т. е. количество .микроорганизмов на исследуемом участке через 5 минут после действия препарата стало на 28% больше, чем после 1-минутной экспозиции, в результате выхода микроорганизмов из глубоких слоев кожи.

Следовательно, настойка ломадена по степени и времени антисептического действия при обеззараживании кожи операционного поля была эффективнее настойки йода и 70° спирта и обеспечивала бактерицидное действие до 98,6%.

Способность настойки ломадена подавлять микрофлору глубоких слоев кожи определяли в сравнении с настойкой йода.

Результаты исследований представлены в таблице 1.

.Таблица 1

Действие настойки ломадена на микрофлору глубоких слоев кожи

Количество колэниеобразующих единиц, снимаемых с 1 кв. см кожи

Антисептик до обработки нашатырным спиртом (поверхностная микрофлора) после обработки нашатырным спиртом (глубокая микрофлора)

количество % к контролю количество % к контролю

Контроль 57,4± 1,21 100,0 168,8±2,87 100,0

Настойка йода 4,2±0,37 7,3 140,(5±4,61 83,3

Настойка ломадена 1,6±0,41 2,7 33,8± 1,06 20,0

Из данных таблицы 1 видно, что при действии настойки йода па тестируемые участки кожи остаются жизнеспособными 7,3% микробных клеток относительно количества бактерий, отобранных до обработки антисептиком (контроль). После антисептического действия настойки ломадена число микроорганизмов, способных проявлять рост на питательных средах, снижается с 57,4 до 1,6, т. е. до 2,7%.

После обработки тестируемых участков кожи 0,25% раствором нашатырного спирта уже через 1 минуту происходит усиление выхода микрофлоры из глубоких слоев кожи и ,на •контрольном участке количество бактерий увеличивается почти втрое (от 57,4 до 168,8). На участке кожи, обработанном настойкой йода, происходит резкое увеличение количества микробных клеток (от 4,2 до 140,6) за счет выхода из глубоких слоев кожи. Это составляет 83,3% относительно количества бактерий на контрольном участке после обработки нашатырным спиртом (168,8). Следовательно, под действием настойки йода жизнеспособными остаются 83,3% клеток, находящихся в глубоких слоях кожи, а под действием настойки ломаде-на — только 20,0%.

Все это свидетельствует о том, что настойка лом а дел а оказывает бактерицидный эффект на кожную аутофлору.

Производственные испытания эффективности применения настойки ломадена в качестве антисептика проведены .в хозяйствах Воронежской, Липецкой, Житомирской и Крымской областей при взятии крови у коров, каудотомии у быков, кастрации у ягнят и поросят, номерации телят, обрыве пуповины, внутриаортальном введении лекарственных средств и т. д.

Животные всех видов были разделены на две аналогичные группы (по 60—120 голов). У животных контрольной группы операционное или инъекционное поля обрабатывали настойкой йода (5% спиртовой раствор пода). У животных опытной группы обеззараживание кожных покровов производили настойкой ломадена.

В течение 5 дней за животными обеих групп проводили клиническое наблюдение, учитывая наличие признаков воспаления на месте рассечения покровных тканей (гиперемия, отек, болезненность, повышение местной температуры).

Установлено, что эффективность применения настойки ломадена для обработки операционного поля у всех видов животных равна эффективности использования настойки пода.

Таким образом, опыты на сельскохозяйственных животных подтвердили высокую эффективность применения настойки ломадена для деконтаминации кожных покровов при проведении хирургических операций. Оказывая 'выраженное бактерицидное действие, препарат профилактирует развитие гнойных осложнений и способствует более быстрому заживлению ран.

3. выводы

1. Препараты из группы четвертичных аммониевых /соединений (декаметоксин, ломаден, этоний :и додецоний) обладают высокой антимикробной активностью. Для разработки ¡нового кожного антисептика по ряду экономических и технологических показателей был выбран ломаден.

2. 1,5% ¡раствор ломадена в 70° этиловом спирте (настойка ломадена) является эффективным бактерицидом и предложен для использования в качестве антисептика.

3. Установлено, что настойка ломадена обладает широким спектром антимикробного действия при концентрации активно действующего вещества от 3,9 .мкг/мл до 1 ООО мкг/мл.

Активность препарата в опытах ин витро значительно превосходит действие известных антисептиков: 70° этилового спирта, настойки йода, а также антимикробную активность 1,5% водного раствора ломадена.

4. Антимикробная активность настойки ломадена в присутствии в среде 20% сыворотки крови снижается о 8 раз, однако остается на уровне, обеспечивающем гибель грамотрица-тельных и грамположительных микроорганизмов.

5. При культивировании грамположительных и грамотри-цательных бактерий на средах, содержащих суббактериоста-тичсскне концентрации настойки ломадена, нарастание их устойчивости к препарату не достигает высокого уровня. Коэффициент резистентности в процессе 60-ссрийпых пассажей в отношении культуры золотистого стафилококка составил 32. Чувствительность кишечной палочки к препарату через 65 пассажей снизилась ¡в 8 ¡раз. Степонь устойчивости к настойке ломадена у ¡вариантов микроорганизмов с повышенной резистентностью восстанавливается в течение 20 дней при ежедневных пересевах на среды, не содержащие препарата.

6. При ультрамикрэскопичееком ¡исследовании установлены морфологические ¡изменения бактериальной клетки после действия настойки ломадена, характеризующиеся разрушением клеточной стенки ¡и цитоплаз.матпческой мембраны, грануляцией цитоплазмы, дсструкцисн нуклеотнда.

7. Настойка ломадена подавляет 80,1% аутофлоры кожи. Эффективность антисептического действия настойки ломадена на поверхностную ¡микрофлору кожи составляет 98,6%.

8. Настойка ломадена по эффективности профилактики раневой инфекции у сельскохозяйственных животных не уступает настойке йода.

9. Внедрение препарата в ветеринарную практику даст экономический эффект 14,3 рубля на 1 рубль затрат.

4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Для предупреждения развития раневой инфекции при .проведении хирургических операций у сельскохозяйственных животных предлагаем применять в качестве накожного антисептика настойку ломадена наружно с помощью ватно-'марлевого тампона пли механического распылителя. Материалы данных предложений вошли во Временное наставление по применению настойки ломадена в ветеринарной хирургии.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Шабунин С. В., Агеева Т. И., Мельник И. 10., Паршин П. А. Новый накожный антисептик // Тезисы докладов к 1-й межвузовской научно-практической конференции «Новые фармакологические средства в ветеринарии».— Ленинград, 1989, —С. 36—37.

2. Мельник И. 10. Применение настойки ломадена в качестве антисептика // Информ. листок № 27—90. — Воронеж, ЦНТИ, — 1990, — 4 с.

3. Бузлама В. С., Паршин П. А., Мельник И. Ю., Агеева Т. И., Шабунип С. В., Кузнецова И. И. Фармакологическая характеристика аледапа // Ветеринария.— 1991. — № 7. — С. 62—64.

4. Временное наставление по применению настойки ломадена в ветеринарной хирургии, утвержденное ГУУ пр.и Государственной комиссии Совета Министров СССР по продовольствию и закупкам 23 октября 1989 года.

Тип. ВГАУ, зак. 349-92 г., тир. 120. Объем Í п. .%