Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Исследование противовоспалительной и анальгетической активности и изучение безвредности сабельника болотного

На правах рукописи

САПОЖНИКОВА СВЕТЛАНА КОНСТАНТИНОВНА

ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНОЙ И АНАЛЬГЕТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ И ИЗУЧЕНИЕ БЕЗВРЕДНОСТИ САБЕЛЬНИКА БОЛОТНОГО

14.00.25 - фармакология, клиническая фармакология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Томск-2005

Работа выполнена на кафедре фармакологии Алтайского государственного медицинского университета и в ЗАО "Эвалар" (г.Бийск)

Научные руководитель:

доктор медицинских наук, профессор

Брюханов Валерий Михайлович

Научный консультант:

кандидат химических наук

Виноградов Александр Клавдиевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

кандидат медицинских наук

Плотников Марк Борисович Ваизова Ольга Евгеньевна

Ведущая организация - ГОУ ВПО Новосибирская государственная медицинская академия Росздрава

Защита состоится «_»_20_г. в _час.

на заседании диссертационного совета Д 001.031.01 при ГУ НИИ фармакологии Томского научного центра СО РАМН (634028, г. Томск, пр. Ленина, 3)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ фармакологии Томского научного центра СО РАМН

Автореферат разослан «Я^ » _____ 20^7^

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Амосова Е.Н.

гет/

Актуальность темы. Воспалительные заболевания занимают одно из ведущих мест в структуре заболеваемости, временной нетрудоспособности, инвалидности и смертности населения Российской Федерации. Известно, что на протяжении жизни они встречаются хотя бы один раз не менее чем у трети населения страны. Поэтому неудивительно, что нестероидные противовоспалительные средства (НПВС) относятся к числу наиболее широко и часто применяемых лекарственных препаратов. Их высокая эффективность хорошо известна не только из клинического опыта врачей и пациентов, но и доказана в многочисленных испытаниях. НПВС выписывают более 80% врачей общей практики, а в целом эти препараты регулярно принимают более двух третей пациентов с различными воспалительными заболеваниями (Вест С., 1999). Учитывая прогнозируемое увеличение числа пациентов с хроническими воспалительными заболеваниями в течение ближайших 10-20 лет, можно предположить, что потребность в назначении НПВС в клинической практике также будет неуклонно возрастать. Однако даже кратковременный прием небольших доз НПВП может приводить к развитию побочных эффектов (поражение желудочно-кишечного тракта, нарушение функции печени, почек, и др.), которые в среднем встречаются у трети больных, а в некоторых случаях представляют серьезную угрозу здоровью и жизни пациента (Насонов Е.Л., 2002; Шостак H.A. и со-авт., 2003). Согласно официальной статистике в России общая заболеваемость воспалительными поражениями только опорпо-двигательного аппарата в настоящее время достигла 13 млн. человек, а реальная распространенность этих заболеваний, вероятно, значительно выше.

Учитывая социальную значимость проблемы, а также необходимость изыскания новых средств с максимально безопасным воздействием на организм, очевиден и оправдан интерес, проявляемый к растительным лекарственным препаратам, обладающим противовоспалительным действием.

Среди растений, широко используемых в народной медицине, известен сабельник болотный - Comarum palustre L. Отвар высушенных корневищ употребляется при различных заболеваниях. Его используют как кровоостанавливающее и потогонное средство, для лечения желудочных и гинекологических заболеваний, при ранах, при желтухе, лихорадке, при болезнях полости рта, а также при подагре, ревматизме, болезнях суставов и радикулите (Турищев С.Н., 2003; Яковлев Г.П., 2004). Учитывая это, можно было бы ожидать наличие у данного растения значительной противовоспалительной активности.

РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ

БИБЛИОТЕКА I

___ — **

Цель исследования. Целью настоящего исследования явилось выявление предполагаемой противовоспалительной и анальгетической активности и изучение безвредности при длительном применении настойки сабельника болотного.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- исследовать острую токсичность настойки сабельника болотного;

- провести исследования по выявлению возможного противовоспалительного действия настойки сабельника болотного на различных моделях экспериментального воспаления;

- провести исследования по выявлению возможных иммунотропных свойств настойки сабельника болотного;

- провести исследования по выявлению возможной анальгетической активности настойки сабельника болотного;

- изучить безвредность настойки сабельника болотного при длительном применении с оценкой возможных побочных эффектов.

Научная новизна

1. Выяснено, что водно-спиртовое извлечение из растения обладает низкой токсичностью.

2. Впервые экспериментально показано, что спиртовое извлечение из корневищ сабельника болотного обладает выраженной противовоспалительной и анальгетической активностью, не уступая по своей эффективности препаратам сравнения диклофенаку и метамизолу натрия.

3. Выявлено, что настойка сабельника обладает иммунотропными свойствами и способна ограничивать иммунное воспаление посредством влияния на гуморальное и клеточное звенья иммунитета

4. Установлено, что настойка сабельника при длительном применении не вызывает побочных эффектов со стороны основных органов и систем организма и не обладает местнораздражающим и аллергизирующим действиями.

Научно-практическая значимость Результаты экспериментальных исследований послужили основанием для разработки нового лекарственного препарата из подземной части - корневищ сабельника болотного в качестве профилактического средства у больных с ревматоидным артритом (Разрешение, выданное Федеральной службой по надзору в сфере здравоохранения и социального развития на проведение клинических исследований № 165 от 22.04 05 г) и остеоартрозом коленного сустава (гонар-трозом) (Разрешение, выданное Федеральной службой по надзору в сфере здравоохранения и социального развития на проведение клинических исследований

№ 166 от 22.04.05 г). Результаты исследований фармакологических свойств настойки сабельника болотного позволяют рекомендовать ее для дальнейшего изучения в качестве средства для профилактики и в комплексной терапии воспалительных заболеваний.

Основные положения, выносимые на защиту:

- Настойка сабельника, предназначенная для перорального применения, обладает низкой токсичностью, что позволяет перенести эксперименты в клинику.

- Настойка сабельника болотного в условиях как острого, так хронического воспалительных процессов проявляет высокую противовоспалительную активность в сочетании с анальгетическим действием.

- Настойка сабельника болотного обладает иммунотропной активностью, проявляя терапевтическую эффективность у животных с адъювантным артритом и экспериментальным контактным дерматитом.

- Настойка сабельника болотного при длительном применении не вызывает побочных эффектов со стороны основных органов и систем организма и не проявляет местнораздражающего и аллергизирующего действий.

Апробация материалов диссертации. Основные результаты диссертационного исследования докладывались на научно-практической конференции «Новые технологии и комплексное использование природных ресурсов Алтайского края для производства биологически активных добавок» (Бийск, 2002), на VII международном съезде «Фитофарм», 2003 (С-Петербург - Пушкин, 2003), на научной конференции, посвященной 50-летию Алтайского государственного медицинского университета «Лекарственные растения в фармакологии и фармации» (Барнаул, 2004), на научно - практической конференции АГМУ и Фармацевтической компании «Эвалар» (Барнаул - Бийск, 2004).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 127 страницах машинописного текста, иллюстрирована 30 таблицами, состоит из введения, обзора литературы, описания методов и материалов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, в котором приведено 164 источника.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты проведены на 210 беспородных мышах обоего пола с исходной массой 18-20 г, 40 мышах линии СВА, 450 белых беспородных крысах обоего пола с исходной массой 150-180 г, 10 кроликах породы «Шиншилла» массой 1,5-2,0 кг, 20 морских свинках светлого окраса с массой тела 300-350 г. Все животные содержались на стандартном рационе питания. Эвтаназию про-

изводили, соблюдая «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных», утвержденные Министерством Здравоохранения РФ, путем дислокации шейного позвонка, используя эфирный наркоз.

Объект диссертационного исследования - настойка, полученная из корневищ сабельника болотного (Comarum palustre L., сем. розоцветные - Rosaceae) при соотношении растительное сырье: экстрагент - 1:10. Настойку готовили методом мацерации (настаивания), в качестве экстрагента использовали 40% этанол Корневища сабельника болотного были заготовлены в Алтайском крае в 2000-2001 гг. Собранное сырье сушили в тени в естественных условиях (на воздухе), влажность высушенного сырья определяли по методике, представленной в ГФ XI издания (1989).

Настойку сабельника вводили перорально после деалкоголизации и разведения сухого остатка в воде очищенной и/или апплицировали местно в натив-ном виде профилактическим и/или лечебным курсом

Острую токсичность определяли по экспресс-методу Прозоровского (1978) на половозрелых беспородных мышах и крысах обоего пола.

Противовоспалительные свойства настойки сабельника исследовали согласно «Руководству по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (2002). Острую воспалительную реакцию у крыс вызывали субплантарным введением агар-агара (0,15 мл 1% раствора), каррагенина (0,1 мл 1% раствора), формалина (0,1 мл 2% раствора) в правую заднюю лапу через 1 ч после однократного перорального введения настойки или сочетанного с местной аппликацией перорального введения настойки, или через 1 ч после последнего введения испытуемой настойки, если использовали курсовое введение. Критерием эффективности считали достоверное уменьшение отека лапы не меньше, чем на 30% по сравнению с контролем. Влияние настойки сабельника на пролиферативную фазу воспаления изучали на модели «ватной гранулемы» (Тринус Ф.П. и соавт., 1987). Стерильный ватный тампон весом 15 мг имплантировали с помощью пинцета крысам под кожу спины между лопатками.

Препаратом сравнения служил классический нестероидный противовоспалительный препарат диклофенак в дозе 10 мг/кг.

Углубленное исследование противовоспалительных свойств настойки сабельника проводили на модели ревматоидного артрита у белых беспородных крыс-самцов. Хроническое иммунное воспаление моделировали субплантарным введением животным в правую заднюю лапу 0,1 мл адъюванта Фрейнда (взвесь вакцины БЦЖ в вазелиновом масле в концентрации 2,5 мг/мл) (Freund 1., 1956). Воспалительную реакцию оценивали в динамике, учитывали такие симптомы реакции организма на введение адъюванта, как отеки лап и ушей, хвоста, ограничение в подвижности, ухудшение общего состояния, в том числе

шерстного покрова, снижение массы тела, гибель в ходе эксперимента. В отдельной серии опытов оценивали влияние местных аппликаций деалкоголизи-рованной настойки сабельника на течение экспериментального аллергического контактного дерматита у морских свинок. Контактный дерматит моделировали путем трехкратного втирания в кожу 3 капли 5% спиртово-ацетоновый раствор 2,4-динитрохлорбензола (ДНХБ) на предварительно депилированный участок кожи боковой поверхности туловища экспериментальных животных. Критерием эффективности настойки служили заживление повреждений кожи и регресс толщины кожной складки.

Иммунотропные свойства настойки сабельника изучали по выраженности гуморального иммунного ответа у мышей на внутрибрюшинное введение эритроцитов барана и по характеру реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) [Руководство ..., 2000].

Анальгетический эффект оценивали по способности уменьшать число болевых реакций - "корчей", у мышей при внутрибрюшинном введении 0,75% раствора уксусной кислоты из расчета 10 мл/кг [Руководство ..., 2000]. Деалко-голизированную настойку сабельника в дозах 3, 6, 12, 60 мг/кг вводили перо-рально за 1 ч до исследования. Оценивали количество корчей в течение 20 мин. Для более глубокого исследования анальгетической активности препарата использовали стандартный тест «tail-flick» и модель электростимуляции корня хвоста у крыс, а также изучали в условиях острого воспаления, вызванного субплантарным введением животным 0,1 мл 1 % раствора коррагенина.

Изучение безвредности настойки сабельника при длительном применении в дозах 6 мг/кг (1 группа), 30 мг/кг (2 группа), 60 мг/кг (3 группа) и 6 мг/кг и одновременно наружно (4 группа) проводили на белых половозрелых беспородных самцах и самках крыс.

В отдельных сериях опытов изучали также возможные местнораздра-жающие и аллергизирующие свойства настойки сабельника [Руководство ..., 2000]. Исходя из способов применения настойки сабельника (внутрь и местно), оценивали ее местнораздражающее действие на слизистую оболочку желудочно-кишечного тракта крыс и на кожу кроликов. Аллергизирующие свойства оценивали по результатам конъюнктивальной пробы и по ее анафилактогенно-му потенциалу.

Полученные результаты подвергали статистической обработке методом вариационных рядов с использованием критериев Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Острая токсичность

В ходе оценки острой токсичности на мышах при пероральном введении и местном применении настойка сабельника является низкотоксичной, так как ни одно из животных не погибло при пероральном введении даже максимально используемых объемов жидкости (доз настойки). В пересчете на сухой остаток максимально вводимые дозы составляли более 10 г/кг. В условиях местного применения настоек также не было выявлено токсических реакций на однократную аппликацию раствора на выстриженный участок кожи.

Таким образом, все образцы настойки сабельника (5 серий) при однократном пероральном введении и однократной накожной аппликации (способы введения, предлагаемые при использовании настойки сабельника в качестве лекарственного препарата) не проявляют токсических свойств.

Фармакологическое исследование настойки сабельника болотного проводили по методикам, позволяющим оценить влияние на развитие различных стадий воспалительного процесса, течение экспериментальных воспалительных заболеваний, а также изучить иммунотропное и анальгетическое действие препарата.

Изучение противовоспалительного действия настойки сабельника

На этапе скрининга, включающем оценку развития формалинового и агар-агарового отека лапы у крыс при однократном пероральном введении и сочетанном пероральном введении и местной аппликации, были исследованы 5 образцов настойки. По результатам скрининга из пяти серий настоек для углубленного исследования была отобрана одна, оказавшаяся наиболее активной в отношении ингибирования действия флогогенных веществ и малотоксичной. Был также определен диапазон эффективных доз от 3 до 30 мг/кг в пересчете на сухое вещество.

Для изучения антиэкссудативных свойств настойки сабельника использована модель воспалительного отека лапы у крыс на фоне субплантарного введения таких флогогенных агентов, как формалин, каррагенин и а!ар-агар.

В серии опытов, поставленных в условиях экспериментального воспаления, выяснилось, что на фоне субплантарного введения таких флогогенных агентов, как формалин, каррагенин и агар-агар происходит развитие воспалительного отека конечности, величина которого приобретала статистическую достоверность уже через 15 мин после инъекции, последовательно нарастала и достигала максимума к исходу 4-го часа наблюдения. При этом введение карра-генина обусловило более быстрое увеличение объема лапы, на 80-85% превосходившее исходный уровень, с последующим довольно быстрым возвращением к норме. При применении формалина развитие отека было более постепенным, но сам отек сохранялся значительно дольше (до 3-х суток). На лике формалинового отека объем конечности превосходил исходные величины на 60-65%.

Субплантарное введение агар-агара приводило к формированию воспалительного отека, величина и динамика развития которого занимала промежуточное положение.

Однократное профилактическое применение настойки сабельника на фоне формалинового отека оказывало значительный противоотечный эффект, выраженность которого зависела от дозы. Действие усиливалось с увеличением дозы от 3 до 12 мг/кг. При использовании дозы 30 мг/кг эффект был несколько ниже и существенно слабее - при введении настойки в дозе 60 мг/кг в пересчете на сухое вещество. При этом максимальная степень угнетения воспалительной реакции наблюдалась уже через 15 мин после введения формалина (табл. 1).

Выраженность эффектов настойки сабельника при введении в дозах 6 и 12 мг/кг и эффекта дикпофенака в дозе 10 мг/кг приблизительно одинакова. Как и препарат сравнения, испытуемая настойка не только ограничивала развитие отека, но и замедляла время его появления.

Таблица 1

Влияние однократного перорального введения настойки сабельника на формирование формалинового отека конечности у крыс в сравнении с диклофенаком (среднее из двух серий опытов)

Препа- Доза, Степень угнетения воспаления, %

рат мг/кг 15 мин 1 час 2 часа 3 часа 4 часа 8 часов

Нас- 3 52,5±8,1 68,2±9,4 59,3±8,2 64,7±4,4 63,6±5,7 48,9±6,2

тойка 6 87,5±6,7 70,7±5,2 68,6±6,5 69,3±8,9 71,6±4,3 68,3±6,4

сабе- 12 89,5±10,5 85,1±7,9 75,6±9,6 72,9±7,3 75,2±8,2 71,7±5,2

льника 30 75,7±6,9 72,1 ±8,0 62,8±6,7 66,3±6,9 65,9±6,8 51,3±4,9

60 46,7±8,0 48,1±6,6 41,6±3,1 41,3±8,1 43,8±6,4 48,2±6,8

Дикло- 10 90,2±6,9 83,1 ±8,1 72,3*6,7 70,8±8,7 73,9±4,2 63,6±9,1

фенак

Примечание: здесь и далее дозы приведены в пересчете на сухое вещество. Здесь и в таблицах 2, 3 все приведенные цифры достоверно отличаются от показателя контрольных животных (р<0,05)

На втором этапе исследования настойку использовали для накожных аппликаций на лапу за 1 ч до введения формалина, а также комбинированно: наружно и внутрь в дозах 6 и 12 мг/кг за 1 ч до инъекции того же флогистика. Полученные через 4 ч после введения формалина результаты представлены в таблице 2. Они свидетельствуют о том, что настойка сабельника достаточно эффективно ослабляет формирование отека при местном использовании, а при комбинированном применении настойки происходит усиление антиэкссудатив-ного эффекта. При этом результаты, полученные при введении настойки сабельника в дозах 6 и 12 мг/кг, различаются несущественно. Обращает на себя и

тот факт, что местное использование настойки одновременно с введением дик-лофенака усиливает эффект последнего.

Таблица 2

Влияние однократного накожного и комбинированного применения н стойки сабельника на формирование формалинового отека конечности у крыс в сравнении с диклофенаком (среднее из трех серий опытов)

Способ применения настойки сабельника Степень угнетения воспаления, %

Накожный Внутрь

+ - 65,7±8,9

+ 6 мг/кг 76,2±4,8

+ 12 мг/кг 75,1 ±6,5

+ 10 мг/кг диклофенака 77,8±7,2

Примечание: здесь и в таблице 3 приведены результаты измерений через 4 ч после введения формалина.

На третьем этапе исследования были проведены опыты по изучению зависимости антиэкссудативного эффекта настойки сабельника от длительности ее профилактического использования. Соответствующие результаты приведены в таблице 3.

Таблица 3

Влияние курсового накожного и комбинированного применения настойки сабельника на формирование формалинового отека конечности у крыс (среднее из двух серий опытов)

Способ применения настойки Длительность введения Степень угнетения воспаления, %

Накожный Внутрь

+ Однократно 65,7±8,9

2 недели 68,5±7,9

4 недели 72,5±10,2

+ 6 мг/кг Однократно 76,2±4,8

2 недели 82,5±5,5

4 недели 86,5±7,6

+ 10 мг/кг диклофенака Однократно 77,8±7,2

2 недели 86,0±9,4

4 недели 88,9±8,2

Полученные в этой серии экспериментов данные свидетельствуют о целесообразности курсового комбинированного применения настойки сабельника

с целью усиления терапевтического эффекта (наблюдается тенденция к увеличению расчетного показателя по мере увеличения продолжительности курса). Заслуживает внимания и тот факт, что многократные накожные аппликации настойки на фоне курсовой терапии диклофенаком несколько усиливают эффект последнего по сравнению с однократным применением

Общие закономерности, полученные на модели формалинового отека лапы, в целом подтвердились и при изучении возможности настойки сабельника угнетать развитие отека, индуцированного субплантарным введением агар-агара и каррагенина.

Суммируя данные, полученные на моделях острого воспалительного отека, можно заключить, что водно-спиртовое извлечение из корневищ сабельника оказывает выраженное противовоспалительное действие.

Для изучения действия настойки сабельника болотного на течение проли-феративной фазы воспаления была использована модель «ватной гранулемы». Установлено, что исследуемый препарат при пероральном лечебном введении в дозах 6-12 мг/кг замедлял пролиферативные процессы в очаге воспаления примерно в той же степени, что и диклофенак в дозе 10 мг/кг. Кроме того, настойка сабельника достоверно снижала массу экссудата в очаге хронического воспаления. Причем при сочетанном введении диклофенака (10 мг/кг) и настойки (6 мг/кг) прослеживалась тенденция к усилению антипролиферативного эффекта последнего.

Таким образом, на модели ватной гранулемы у крыс изучаемое средство оказывает антипролиферативный эффект, сравнимый с эффектом диклофенака, а при сочетанном введении с диклофенаком проявляет тенденцию к усилению противовоспалительного эффекта НПВС.

Суммируя приведенные данные, можно заключить, что настойка сабельника болотного обладает выраженным дозо-зависимым противовоспалительным эффектом, обусловленным подавлением экссудативного и пролиферативного компонентов воспалительной реакции. Возможно, настойка сабельника особенно эффективна в ранний период пролиферативной фазы воспаления, когда метаболизм сульфатированных гликозоаминогликанов играет ведущую роль в формировании гранулемы [Чернух A.M., 1979; Дыгай A.M., Клименко H.A., 1992]. На основании литературных данных можно предположить, что противовоспалительное действие настойки обусловлено, главным образом, ингиби-рующим влиянием на высвобождение медиаторов воспаления, таких как гиста-мин, кинины и простагландины. Выяснено, что флавоноиды могут ослаблять нарушения кровообращения и микроциркуляции в воспаленной ткани, уменьшать сосудистую проницаемость за счет своего мембраностабилизирующего и антиоксидантного действия. Наличие такого эффекта можно предполагать и у сабельника, содержащего, как установлено, флавоноиды. Мембраностабилизи-

рующее действие флавоноидов препятствует повреждению митохондрий и ли-зосом, что способствует поддержанию энергетического гомеостаза и снижению процессов протеолиза, гликолиза и липолиза в очаге воспаления. Антипроли-феративное действие настойки сабельника вероятно связано с высоким содержанием дубильных веществ, которые уменьшают воспалительный процесс за счет связывания ферментов, вызывающих воспалительные реакции [Максюти-на Н.П. и др., 1985].

Одним из методов углубленного изучения противовоспалительных средств является модель «адъювантного артрита», представляющая собой адекватную модель иммунного поражения суставов у человека (Саратиков A.C. и соавт., 1983). В экспериментах с адъювантным артритом введение адъюванта Фрейнда вызывало развитие тяжелой патологии, сопровождавшейся высокой смертностью животных. Клиническая картина характеризовалась развитием отеков ушей, хвоста, обеих задних конечностей, болезненностью и резким ограничением подвижности суставов как на стороне введения адьюванта, так и контра-латеральной конечности.

В этих условиях применение настойки сабельника зависимо от дозы существенно облегчало течение заболевания. Причем терапевтическая эффективность была сопоставима с таковой при использовании такого мощного противовоспалительного препарата как диклофенак. Результаты представлены в таблице 4.

Таблица 4

Эффективность перорального введения настойки сабельника при лечении крыс с иммунным артритом (п=10 в группе)

Препарат Доза, мг/кг Угнетения отека, % Выживаемость к окончанию курса, %

на правой лапе на левой лапе

Настойка сабельника 6 64,3±9,5 п=10 58,9±7,7 п=5 50

12 73,6±10,5 п=10 76,4±9,0* п=5 60

Диклофенак 10 70,5±8,2 п=10 67,8±7,8 п=6 70

Примечание: * - у двух из выживших животных в группе отек на левой лапе не развился вообще.

Было обнаружено, что животные из подопытных групп на протяжении всего периода наблюдения легче переносили симптомы иммунного хронического воспаления: у них меньше отекали конечности, уши и хвосты, в большей степе-

ни сохранялась подвижность пораженных конечностей. Если к концу эксперимента в контрольной группе из 10 крыс выжили только 2, то в опытных - от 5 (6 мг/кг изучаемого препарата) до 7 (диклофенак). У двух животных из подопытных групп отек левой лапы не развился вообще, что можно отнести на счет эффективности лечения.

Кроме того, углубленное исследование противовоспалительных свойств настойки сабельника было проведено на модели «контактного дерматита» у морских свинок. В результате серии экспериментов выяснилось, что у всех животных (п=12) уже в первые сутки после нанесения 2,4-динитрохлорбензола (ДНХБ) обнаруживалась умеренная гиперемия, а у 4 животных из 12 - отек близлежащей области. Каждая последующая аппликация 5%-ного спиртово-ацетонового раствора ДНХБ усугубляла тяжесть проявлений дерматита. На третьи сутки у 6 животных из 12 обнаруживались эрозии, а у двух - обширные кровоточащие язвы. У всех морских свинок обнаруживалось увеличение толщины кожной складки в районе поражения в среднем в 1,5 раза по сравнению с исходным показателем. На этой стадии эксперимента животные были распределены на 2 группы (контрольную и опытную) так, чтобы в каждую из них попали морские свинки с разной степенью поражения кожи в равном соотношении. На четвертые сутки начинали лечение животных из опытной группы, за контрольными животными вели наблюдение, оставив их без лечения. Полученные результаты представлены в таблице 5.

Таблица 5

Результаты лечения аллергического контактного дерматита при помощи накожных аппликаций настойки сабельника (п=6 в группе)

Показатель Группа Дни наблюдения

Исходно 4 сутки 6 сутки 8 сутки 10 сутки

Тяжесть Контроль 0 4,4±0,28 3,9±0,16 3,7±0,22 3,4±0,25

дерматита, Опыт 0 4,3±0,24 3,6±0,29 2,4±0,12* 1,0±0,14*

балл

Толщина Контроль 4,2±0,21 7,9±0,34 8,2±0,25 8,1±0,21 7,6±0,41

кожной Опыт 4,4±0,30 7,8±0,32 6,3±0,37* 5,2±0,16* 4,9±0,23*

складки,

мм

* - отличия от контроля статистически значимы, р<0,05.

Как видно из таблицы, лечение животных подопытной группы дало положительный результат по обоим используемым критериям: происходило более раннее заживление повреждений кожи и более быстрый регресс толщины кожной складки. В опытной группе отторжение корочки произошло у 2 животных из 6 на восьмые сутки эксперимента, а полностью закончился этот

процесс на 12 сутки В контрольной группе животных он отставал в среднем на 3-4 дня. О восстановлении полноценного кожного покрова у всех морских свинок в опытной группе можно было говорить через 2 недели, а в контроле -через 18 дней. Таким образом, настойка сабельника не только не оказывала местнораздражающего действия, но и проявила десенсибилизирующий и противовоспалительный эффекты при использовании агента, вызывающего контактный аллергический дерматит.

Обнадеживающие результаты, полученные при лечении вышеописанной экспериментальной патологии иммунного генеза, побудили нас исследовать иммунотропные свойства настойки сабельника болотного. При изучении влияния препарата на гуморальный иммунный ответ в реакции Ерне-Нордин, несмотря на то, что статистически значимых различий между контрольным и опытными показателями в условиях однократного введения препаратов обнаружить не удалось, все же прослеживалась четкая тенденция к снижению уровня антителообразования при использовании настойки сабельника, равно как и диклофенака, особенно при их введении в индуктивную фазу

Таблица 6

Влияние настойки сабельника на процесс антителообразования в селезенке мышей при пероральном введении (п=15 в группе)

Группа, препарат Доза, мг/кг Число АОК в селезенке х 10'

Индуктивная фаза Продуктивная фаза

Контроль - 12,7 ± 1,9 12,9 ± 2,1

Настойка сабельника 6 10,3 ±2,8 12,3 ± 2,2

Настойка сабельника 60 11,9 ±2,5 11,6 ±2,4

Диклофенак 10 10,5 ± 1,3 11,5 ±2,3

Примечание: АОК - антителообразующие клетки

Результаты, полученные при изучении влияния настойки сабельника на реакцию гиперчувствительности замедленного типа у беспородных белых мышей, свидетельствуют, что введение животным диклофенака в дозе 10 мг/кг обеспечивало статистически значимое ограничение развития гиперчувствительности замедленного типа.

Введение мышам настойки сабельника в дозах б и 60 мг/кг также сдерживало реакцию, хотя и в меньшей степени (отличия от контроля оказались статистически недостоверны при данном доверительном интервале). Тем не менее, результаты эксперимент свидетельствуют о том, что насюйка сабельника об-

ладает способностью ограничивать иммунное воспаление посредством влияния на клеточное звено иммунитета.

Как известно, большинство флоголитиков сочетает антиэкссудативную активность с болеутоляющим эффектом Выявленное на различных моделях противовоспалительное действие настойки сабельника побудило нас исследовать ее анальгетическую активность.

На модели «уксусные корчи» назначение настойки сабельника мышам оказывало выраженный анальгетический эффект, зависимый от дозы. Так, при введении препарата в дозе 3 мг/кг латентный период наступления судорог не изменялся по отношению к контролю, но количество судорожных движений составляло всего 62% от контрольных значений (р<0,05). По мере повышения дозы происходило постепенное увеличение продолжительности латентного периода наступления корчей и уменьшение их количества. Максимальный эффект, превосходивший эффективность метамизола натрия по степени уменьшения количества судорожных движений, наблюдался при использовании настойки в дозе 60 мг/кг.

Таблица 7

Влияние настойки сабельника на развитие уксуснокислых корчей у крыс (п=10 в группе)

Препарат, доза, мг/кг Латентный период Корчи

Мин % от контроля Количество %от контроля

Контроль 4,9±0,3 100 70,5±9,8 100

Настойка сабельника, 3 5,2±0,8 Различия несущественны 43,7±5,7* 62,0

Настойка сабельника, 6 6,9±1,1 140,8 38,4±11,4* 54,5

Настойка сабельника, 12 7,4±1,0* 151,0 31,2±3,5* 44,3

Настойка сабельника, 60 8,2±0,9* 167,3 20,5±5,4* 29,1

Метамизол натрия, 50 12,6±0,75* 257,1 29,8±2,6* 42,3

Метамизол натрия, 125 16,5±2,1* 336,7 28,2±4,8* 40,0

Примечание: * - отличия от контрольной группы статистически значимы.

Анальгетическое действие исследуемого препарата подтвердилась на модели «tail-flick» и в условиях электростимуляции корня хвоста крыс. Деалкого-лизированную настойку вводили однократно в дозах 3, 6, 12, 60 мг/кг до нанесения болевого воздействия или курсом 2 недели (последний раз за 1 час до помещения в домик).

В серии экспериментов на модели «tail-flick» было обнаружено, что введение настойки сабельника (независимо от дозы) практически не оказывало влияния на эмоциональную окраску боли. В то же время, по мере роста дозы латентный период отдергивания хвоста постепенно возрастал - от 5,1% при однократном введении настойки в дозе 3 мг/кг до 30,6% при увеличении дозы до 60 мг/кг и времени введения до 2 недель.

Определенный анальгетический эффект был продемонстрирован и в серии экспериментов с использованием электростимуляции корня хвоста крыс. Применение настойки, начиная с дозы 6 мг/кг, существенно удлиняло латентный период болевой реакции. При этом максимальный эффект достигался на фоне использовании дозы 12 мг/кг. Полученный эффект превышал действие метамизола натрия в дозе 50 мг/кг и несколько уступал эффективности этого анальгетика, взятого в дозе 125 мг/кг. Интересно, что увеличение дозы настойки сабельника до 60 мг/кг не только не удлиняло латентный период, а напротив, укорачивало его в сравнении с дозами 6 и 12 мг/кг. Существенного влияния на порог вокализации у различных доз настойки сабельника, равно как и у метамизола натрия выявлено не было. Не зафиксировано и влияния длительности профилактического введения настойки на выраженность обезболивающего эффекта. Комбинированное введение препарата (внутрь и в виде накожной аппликации на хвост) также не изменяло сущес!венно реакцию животных на боль по сравнению с тем, что наблюдалось при пероральном введении настойки.

Дальнейшее изучение анальгетической активности настойки проводилось в условиях острой воспалительной реакции, вызванной субплантарным введением раствора каррагенина. В этих условиях однократное введение препарата вызывало достоверное увеличение латентного периода появления болевой реакции.

Таблица 8

Влияние однократного введения настойки сабельника на переносимость боли крысами-самцами с гиперальгезией (п^Ю в группе)

Препарат, Латентный период

доза, мг/кг отдергивания хвоста

Время, сек % к контролю

Контроль 6,2±1,1 100

Настойка сабельника, 6 10,9±0,8* 175,8

Настойка сабельника, 12 12,3±1,5* 198,4

Примечание: * - отличия от контроля статистически значимы.

Как видно из приведенных в таблице результатов, порог болевой чувствительности у контрольных животных при введении каррагенина (по сути дела, негативный контроль) существенно снижался по сравнению с таковым для животных, которым не вводили каррагенин. Однако его удавалось повысить почти в 2 раза введением настойки сабельника в эффективных дозах, чго подтверждает наличие у изучаемого средства анальгетической активности.

Выявленное нами анальгетическое действие настойки сабельника может иметь важное значение в терапевтической эффективности препарата. Наличие выраженной анальгетической активности является важным компонентом в спектре фармакологических эффектов препаратов, используемых в комплексной терапии воспалительных заболеваний. Болеутоляющее действие обычно связывают с периферическими и центральными эффектами фармакологических средств. Ингибицию синтеза медиаторов воспаления с последующим противо-экссудативным, антипролиферативным действием относят к периферическим эффектам препаратов. Центральный же эффект в основном реализуется посредством трех типов рецепторов простагландинов Е через передний мозг и регуляцию тонуса вегетативной нервной системы. Можно предполагать, что в реализацию обезболивающего эффекта изученного нами препарата вовлечено влияние как на периферическую, так и на центральную регуляцию.

Изучение безвредности при длительном применении и возможных побочных действий настойки сабельника

Проведенные исследования по изучению длительного применения на белых половозрелых беспородных крысах показали, что настойка сабельника в дозах 6, 30, 60 мг/кг и в дозе 6 мг/кг с одновременной накожной аппликацией не вызывала каких-либо изменений со стороны желудочно-кишечного тракта, печени, сердечно-сосудистой, нервной, мочевыделительной систем, а также не влияла на морфологические и биохимические показатели крови. В результате изучения безвредности можно сделать вывод о возможности длительного применения настойки сабельника в терапевтических дозах без развития побочных эффектов со стороны основных органов и систем организма

Как показали проведенные эксперименты, ни у одной из взятых в опыт по оценке местнораздражающего действия изучаемого препарата на желудочно-кишечный тракт крыс (как самцов, так и самок) при изучении морфологии желудка и разных отделов тонкого и толстого кишечника патологических изменений слизистой оболочки и подслизистого слоя обнаружено не было.

При локальном нанесении на кожу настойки на кожу кроликов в течение 4-х недель также не было обнаружено местнораздражающих свойств.

Таким образом, можно заключить, что настойка сабельника даже при длительном введении не обладает ульцерогенным эффектом, что выгодно отли-

чает потенциальное новое противовоспалительное средство от классических НПВС. Не выявлено также местнораздражающего действия препарата при длительном нанесении на кожу.

Аллергизирующее действие В таблице 9 представлены результаты изучения аллергенности настойки сабельника в конъюнктивальной пробе.

Таблица 9

Влияние настойки сабельника на конъюнктиву у морских свинок

№ группы Сенсибилизация Разрешение Эффект

1 6 мг/кг препарата в пересчете на сухое вещество перорально 1 капля деалкоголиз. настойки без патологии

2 60 мг/кг препарата в пересчете на сухое вещество перорально 1 капля деалкоголиз. настойки без патологии

Приведенные данные свидетельствуют об отсутствии проявлений у животных аллергического отека конъюнктивы при использовании настойки сабельника болотного.

Результаты, полученные при изучении анафилактогенных свойств настойки сабельника, приведены в таблице 10. Ежедневно перед введением препаратов сенсибилизированым сывороткой кролика животным оценивали их общее состояние и поведение. Существенных отклонений от нормы не наблюдалось ни в одной из групп После проведения разрешающей инъекции I ибели морских свинок в опытных группах не зарегистрировано, в то время как в контроле погибло 1 животное.

Таблица 10

Влияние настойки сабельника на выраженность реакции гиперчувствительности немедленного типа на модели анафилактического шока у морских свинок

Группа, препарат Выраженность Число

шока (балл) животных

1 4

Контроль 2 3

(вода) 3 2

4 1

1 7

Опыт 1 (настойка сабельника, 6 2 2

мг/кг в пересчете на сухое 3 1

вещество) 4 0

1 5

Опыт 2 (настойка сабельника, 60 2 1

мг/кг в пересчете на сухое 3 3

вещество) 4 0

1 3

Опыт 3 (диклофенак, 10 мг/кг) 2 5

3 1

4 0

Время наблюдения за развитием реакции составило 20 минут. Как видно из материалов таблицы 10, в опытных группах не погибло ни одно животное. В то же время у морских свинок, получавших диклофенак, выраженность реакции была несколько выше по сравнению с животными, получавшими настойку сабельника. Следует отметить, что латентный период также был больше - реакция у животных развивалась медленнее, в пределах 2 мин. В контрольной группе и у животных, получавших диклофенак, признаки анафилаксии появлялись уже через 1 минуту после введения разрешающей дозы антигена. Полное отсутствие каких-либо проявлений аллергической реакции наблюдали в 10% случаев в каждой из опытных групп (по 1 животному). Таким образом, обнаружено, что длительное введение животным настойки сабельника несколько смягчает развитие у морских свинок реакции гиперчувствигельности немедленного типа в ответ на введение чужеродного белка.

Итак, результаты, полученные при изучении противовоспалительных, иммунотропных и анальгетических свойств настойки сабельника, подтверждают возможность ее использования в качестве противовоспалительного средства, в том числе при воспалениях иммунного генеза. При этом сам препарат уль-церогенным и аллергизирующими свойствами не обладает. При этом главным, на наш взгляд, является противовоспалительный эффект, не уступающий по своей эффективности диклофенаку. Известно, что поливалентность действия синтетических антифлогистиков объясняет неспецифичность клинического эффекта и лежит в основе побочных явлений при их применении (ульцерогенное действие на желудочно-кишечный тракт, нарушение функции печени, почек, гематотоксичность, развитие аллергических реакций и многие другие) [Зиган-шина Л.Е., Султанова А.Ф., Хазиахметова В.Н. и др., 2002]. В отличие от синтетических средств противовоспалительной направленности изученный нами препарат сабельника выгодно отличается от последних тем, что наряду с выра-

женными противовоспалительными свойствами, не является токсичным, имеет достаточную широту фармакотерапевтического действия и не вызывает побочных эффектов.

ВЫВОДЫ

1. Настойка сабельника обладает низкой токсичностью. При ее введении в максимально допустимой для перорального применения дозе (10 г/кг в пересчете на сухое вещество) гибели животных не наблюдалось.

2. Настойка сабельника болотного в условиях как острого, так и хронического воспалительных процессов проявляет высокую противовоспалительную активность, не уступая по эффективности диклофенаку.

3. Настойка сабельника болотного обладает иммунотропной активностью, проявляя терапевтическую эффективность у животных с адъювантным артритом и экспериментальным контактным дерматитом.

4. На различных экспериментальных моделях настойка сабельника болотного проявляет выраженные анальгетические свойства.

5 Настойка сабельника болотного не обладает местнораздражающим и ал-лергизирующим действиями и при длительном применении в терапевтических дозах не оказывает побочных эффектов со стороны основных органов и систем организма.

г

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Прокопьева Л.А., Виноградов А.К., Калачикова Л.Г., Трубников Г.В., Козлов Б.И., Сапожникова С.К. Перспектива использования БАД «Сабельник-Эвалар» в лечении заболеваний опорно-двигательного аппарата // Научно-практическая конференция «Новые технологии и комплексное использование природных ресурсов Алтайского края для производства биологически активных добавок». - Бийск, 2003. - С.85-89.

2. Прокопьева Л.А., Виноградов А.К., Калачикова Л.Г., Трубников В.Г., Козлов Б.И., Сапожникова С.К Об исследовании влияния БАД «Сабельник -Эвалар» в комплексном лечении воспалительных и обменно-дистрофических заболеваний опорно-двигательного аппарата // Материалы VII междунар. съезда «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения». - Пушкин, 2003. - С.455-457.

3. Прокопьева Л.А., Виноградов А.К., Калачикова Л.Г., Трубников В.Г., Козлов Б.И., Сапожникова С.К. «Артрозанет» как средство в комплексной терапии воспалительных, обменно-дистрофических заболеваний суставов, спон-дилоартроза и остеохондроза // Приволжская научно-практическая конференция «Эндоэкологическая медицина. Новые направления в лечении, оздоровлении, профилактике». - Н. Новгород - Москва, 2003. - С.76-78.

4. Сапожникова С К., Прокопьева Л.А., Виноградов А.К., Калачикова Л.Г., Козлов Б.И. Фитопрепарат «Артрозанет» в комплексной терапии заболеваний опорно-двигательного аппарата // Материалы VIII междунар. съезда «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения». - Миккели, 2004. - С.581-582.

5. Прокопьева Л.А., Виноградов А.К., Калачикова Л.Г., Сапожникова С.К., Лесиовская Е.Е. Анатомическое исследование корневищ Comarum palustre L. // Тез. докл. научн. конф , посвященной 50-летию Алт. гос. мед ун-та «Лекарственные растения в фармакологии и фармации». - Барнаул, 2004. - С.204-207.

6. Прокопьева Л.А., Виноградов А.К., Калачикова Л.Г., Сапожникова С.К., Лесиовская Е.Е., Фролова Н.Ю. Доклинические исследования фитопрепарата «Сабельник-Эвалар» // Тез. докл научн конф., посвященной 50-летию Алт. гос. мед. ун-та «Лекарственные растения в фармакологии и фармации». - Барнаул, 2004. - С.207-212

7. Сапожникова С.К., Виноградов А.К , Прокопьева Л.А., Брюханов В.М. О противовоспалительной активности и анальгезирующих свойствах сабельника болотного Comarum palustre L. // Материалы научно-практической конференции АГМУ и Фармацевтической компании «Эвалар»». - Барнаул, 2004. -С.97-112.

8. Сапожникова С.К., Виноградов А.К. Острая и хроническая токсичность настойки сабельника болотного // Материалы VI междунар. конгресса молодых ученых « Наука о человеке», Томск, 2005. - С. 87-89.

9. Чижиков Д.В., Одуладжа Д О., Чемесов И.И., Прокопьева Л.А., Калачи-кова Л.Г., Сапожникова С.К Забытые лекарственные растения. Сабельник болотный // Всерос. Научн.-практич. Конференция «Современные проблемы фармакологии». - Новосибирск, 2005. - С.388-389.

»23231

РНБ Русский фонд

2006-4 26151

Подписано в печать 17.11.2005 Печать ризо графическая Бумага офсетная _Тираж 100 экз._

Отпечатано: РА «ПАРАГРАФ» г Барнаул, пр. Ленина 40, каб 334, тел (385-2)366-143 Лицензия на полиграфическую деятельность ПД 12-061 от 04 01 2002 г