Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Антигенные и иммуногенные свойства инактивированной эмульсии - вакцины против инфекционного эпидидимита баранов

РГ ь ид

; г СЕ!! «!МП.

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛКДОБАШЬСКИй ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ШТЕРШАРИИ им. Я.Р.КОВАЛЕНКО (ВИЭВ)

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК (РАСХН)

На правах рукописи

АБЮШИРОВ ГаСад Шамугович

АНТ;{ГЕНН1£ И ШМУНОПЕННЫЕ СВОЙСТВА ШАКТИВИРОВАННОЙ ЭМУЛЬСИН-ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ИНФЕКЦИОННОГО ЭЛВДВДИМЭТА БАРАНОВ

Iб.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология

А в'т ореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Москва - 1994

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии имени Я.Р.Коваленко

Научный руководитель - доктор ветеринарных наук, старший научный сотрудник В.А. Взмахов

Официальные оппоненты:

доктор ветеринарных наук, профессор К.В. Шумилов (ВГНКИ)

каадвдат ветеринарных наук C.B. Родионов (ВИЭВ)

Ведущее учреждение - Всероссийский научно-исследовательский институт бруцеллеза и туберкулеза животных (г. Омск).

Защита диссертации состоится "^ ^f^C^^iJ 1994 г. в часов на заседании специализированного совета К 020.28.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии имени Я.Р. Коваленко. Адрес: 109472, Москва, Кузьминки, ВИЭВ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИЭВ.

Автореферат разослан ËfcCfiC-i fa 1994 г.

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат ветеринарных наук

й.Г. Терешков

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Овцеводство занимает значительный удельный вес в производстве животноводческой продукции. Успешному развитию отрасли в определенной степени препятствуют инфекционные болезни, одной из которых является заболевание овец, вызываемое Brucella оvis (инфекционный эпедидимит баранов -ИЭ).

Болезнь распространена почти во всех странах мира и причиняет значительный экономический ущерб.

Широкий практический опыт показал, что методы профилактики ИЭ баранов и оздоровления неблагополучных хозяйств путем выполнения организационно-хозяйственных, ветеринарно-санитарных мер и проведения регулярных диагностических исследований требуют больших экономических затрат, длительны и, нередко, мало эффективны.

В связи с указанным весьма актуальна задача изыскана надежных и экологически безопасных средств специфической профилактики болезни.

В комплексе мер борьбы с ИЭ баранов в настоящее время рекомендовано использование профилактической иммунизации овцепого-ловья живой вакциной из штамма Рев-I, но её применение ограничено только отдельными регионами, неблагополучными по бруцеллезу овец.

Проведенные исследования по испытанию инактивированных ьакции из гомологичных или гетерологичных видов бруцелл разноречивы и нередко свидетельствуют о недостаточной иммунологической ' эффективности этих препаратов против ИЭ баранов ( B.M.Buddie , 1954, 1957, 1962; S.RensXurg et.al.;I958; S.1 Biberstein et.al. 1962; С. Tudoriu ,1965; P. Claxton ,1968; Д-Тез-t, A..Bru-

ere,1979» m.J. Alton e-t.al.,1984» Б.Н. Афанасьев, 1984; Т.К. Касымов, 1985, В.И. Ким 1991 и др.).

Снижение естественной резистентности организма, вследствие нарушения норм кормления и содержания животных, обусловливает необходимость применения наряду со средствами специфической профилактики (вакцины) и средств, способных направленно воздействовать на иммунную систему (иммуностимуляторы) при нарушении её равновесия, приводя к норме измененные иммунобиологические параметры, а также неспецифических веществ, стимулирующих и пролонгирующих иммуногенез (адъюванты).

В связи с указанным вопрос создания безопасного в экологическом отношении и высокоиммуногенного препарата для профилактики ИЭ баранов является актуальным.

Цель и задачи исследований. Целью наших исследований являлась разработка высокоэффективной инактивированной эмульсин-вакцины против инфекционного эпидедимита баранов с использованием иммуностимулятора.

Для достижения поставленной цели были решены следующие задачи:

- подобран штамм В. ovio , обладающий пониженными антигенными и высокими иммуногенными свойствами;

- отобран адьювант, обладающий умеренной реактогенностью для организма овец;

- определена оптимальная иммунизирующая доза инактивированной культуры В.ovia (антигена) для морских свинок и овец;

- отработаны оптимальные параметры изготовления эмульсин-вакцины;

- подобран итамы В, ovis с большой остаточной вирулентностью для проведения экспериментального заражения животных при проьер-

ке иммунитета;

- изучены антигенные и иммуногеннне свойства эмульсин-вгкци-ны в опытах на морских свинках и овцах. Установлена её оптимальная доза для данных видов животных;

- изучено иммуностимулирующее действие гликопина (ГВДП) при сочетанном его применении а эмульсин-вакциной.

Научная ноеизна. Отобран высокоиммуногенный штамм Р 64/2 В. от!а , пригодный для изготовления инактивированной вакцины. 'Установлена стабильность его осноеных свойств. На основе этого штамма сконструирована экологически безопасная вые о ко иммуно ге н-нал инактивированная эмульсин-вакцина против инфекционного эпи-двдимита баранов. Подобран высоковирулентный штамм 15 8406 рекомендованный для экспериментального заражения при проверке иммуногенности вакцин. Установлена его минимальная инфицирующая доза (ОДэдо) для морских свинок (лабораторная модель) и овец.

Показано, что введение в вакцину иммуностимулятора - гликопина (ГВДП) по 300 мкг на I дозу повышает иммуногенность вакцины в среднем на 31,1/5.

Практическая ценность. По результатам исследований разработан лабораторный регламент на изготовление и контроль инактивиро ванной эмульсин-вакцины с иммуностимулятором против инфекционного эпддидимита Саранов и наставление по её применению, которые одобрены методической комиссией ВИЭВ 27 ноября 1991 г., протокол № 18 и утверждены замдиректора В!ЭВ 28 ноября 1991 г. Внедрение вакцины в ветеринарную практику позволит значительно сократить сроки оздоровления хозяйств, неблагополучных по инфекционному эпвдедимиту баранов и снизить экономический ущерб, наносимый этой болезнью. .

Апробация работа. Материалы исследований по диссертационной работе доложены на научной конференции молодых ученых "Актуальные проблемы инфекционной патологии животных и ветеринарной биотехнологии" (Москва, ВИЭВ, 1989); на Всесоюзной научной конференции "Совершенствование методов государственного контроля ветеринарных препаратов" (Москва, ЕГНКИ, 1991); на заседании Ученого совета ВИЭВ (1391); на межлабораторном совещании научных сотрудников BI0B (1994).

Публикация результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 3 статьи и I находится.в печати.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 162 страницах машинописного текста, включает 26 таблиц и 8 рисунков •л состоит га введения, обзора литературы, собственных исследова-' ний, обсуждения полученных результатов, выводов, практических предложений, списка использованной литературы, включающего 115 отечественных и 136 иностранных источников.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы. Работа выполнена в 1988-1991гг. в лаборатории эпизоотологии, диагностики и профилактики бруцеллеза, в лаборатории молекулярной биологии и биохимии ВИЭВ и на опытной базе Вышневолоцкого отдела ВИЭВ. При проведении опытов было использовано 118 белых мышей, IB5 морских свинок, 10 кроликов и 134 баранчика.

Культурально-морфологические и биологические свойства 5 штаммов бруцелл веда ovia изучали по методикам, рекомендованным Комитетом экспертов по бруцеллезу ФА0/В03 (1971, 1986).

Нуклеотидный состав ДНК изучаемых культур проводили в лаборатории молекулярной биологии и биохимии совместно с С.К.

Артшиным и В.И. Мельниченко, руководствуясь "Методическими рекомендациями по идентификации бруцелл методом ДНК-ДНК гибридизации" (1988).

Антигенные свойства культур В. ovia изучали путем внутривенного введения 2-суточньк агаровых культур кроликам массой 2...3 кг (по 2 кролика на штамм) с последующим (через 15 дней) исследованием сыворотки крови в РДСК.

Вирулентные свойства штамма 8406 В. orla устанавливали в опытах на 30 морских свинках массой 250-300 г и 15 баранчиках 5-6 месячного возраста. Культуру вводили морским свинкам в дозах от 10 м.к. до I млн. м.к. с шагом =10, а баранчикам - от 500 тыс. до 5 млрд м.к. Серологическое исследование животных на бруцеллез (ВВП, РА, РДСК) и инфекционный эпедедимит (пластинчатая РА и РДСК) проводили на 7,15 и 30-е сутки после заражения.

Иммуно.-генные свойства инактивированных формалином (0,5$) культур штаммов 64, 211, 1840 и 1081 изучали в опыте на 25 морских свинках, путем подкожного введения I млрд.м.к. каждого штамма. Динамику антител определяли в реакциях с бруцеллезными (ЯЗП, РА, РДСК) и овисными (пл. РА, РДСК, FHTA) антигенами через 7, 15 и 30 суток. Заражение морских свинок проводили культурой вирулентного штамма 8406 в дозе 10 млн.м.к. (10 ИД100). Бактериологическое исследование биоматериала от животных осуществляли по методике, принятой в лаборатории эпизоотологии, диагностики и профилактики бруцеллеза.

Ивдекс инф и ц иро в акно с г и (ИЛ) животных в опытах определяли' по формуле: ИИ - '100, где

а - количество выделен л т культур бруцелл;

в - количество проведенных: высевов из биоматериала.

Реактогенные свойства 10 разных адъюБантов определяли в опыте на 36 морских свинках, путем подкожного введения по I мл эмульсии, содержащей I млн.м.к. шактиЕированного штамма 64/2 В. Одновременно определяли влияние адыэвантов на проявление антиген-ности и иммуногенности каждого препарата. Оптимальную концентрацию • антигена в эмульсин-вакцине устанавливали на образцах, приготовленных из смеси 84 ч минерального масла ПЭС-З, 16 ч безводного ланолина и взвеси инактивированных клеток В.от1в в концентрациях: для морских свинок - от 25 тыс. до 2,5 млрд.м.к./мл и для баранов - от I млрд. до 25 млрд- м.к./мл.

Контроль каждого из образцов эмульсин-вакцины на стерильность проводили путем высева препаратов на МШБ, МППГТА, МПБ под вазелиновым маслом, на среду Китт-Тароцци и агар Сабуро. Безвредность изучаемых серий вакцин проверяли на белых мышах, путем внутри-брюшинного введения по I мл каждого препарата ( 5 гол. на каждый).

Антигенные и иммуногенные свойства эмульсин-вакцины, содержащей оптимальную дозу антигена, а также с пониженной в 5 раз концентрацией клеток В. оу±в , но в сочетании с иммуностимулятором ПЩП, изучали в 2-х опытах на баранчиках 4-5 месячного возраста. Сыворотку крови опытных •животных исследовали в динамике серологическими методами на бруцеллез и инфекционный эпвдвдимит на протяжении всего периода опытов. Бактериологическое исследование лимфатических узлов и органов животных проводили через 30 дней после заражения. В первом опыте, дополнительно к бактериологическому анализу, каждую пробу биоматериала исследовали в реакции нейтрализации антител (РНАт).

Определение'количества эритроцитов, лейкоцитов и Еыведе-

ние лейкофорыулы проводили по общепринятым методикам (A.A. Кудрявцев, Л.А. Кудрявцева, 1974). Количество Т-лимфоцитов (Е-РОЮ определяли по методике ^o.ohiet.al., (1969), B-лимфоцитов (E-AC-FOK) - по методике Е.Ф. Чернушенко, Л.С. Когосовой (1981). При выделении лимфоцитов кровь стабилизировали гепарином (30 ед/мл), в качестве градиента плотности использовали смесь фикола-урографина (1.077,). Содержание иммуноглобулиноз в сыворотке крови устанавливали в РВД по Манчини в модификации Ю.Н. Федорова (1981) с использованием моноспецифических анти-сыюроток и стандартов, интенсивность фагоцитоза лейкоцитов -методом опсоно-фагоцигарной реакции.

Статистическую обработку полученных данных проводили на

программируемом микрокалькуляторе МК-56. Достоверность различия

средних при сравнительном изучении ДНК по показателю нуклеотвд-

ного состава вычисляли по критерию Стьццента (Л.З. румишинский, 1971).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛБДОВАНИЙ

Выбор штамма В. ovia для изготовления инактиви-рованной эмульсин-вакцины.

Изучение культурально-морфологических, тинкториальных и агглютинабельных свойств 5-ти отобранных штаммов В.ovio (211, 8406, 1081, 1840, 64) показало, что все они обладают типичными для данного вида бруцэлл свойствами и соответствуют референтному штамму 63/290. Средние значения нуклеотидного состава у всех изучаемых штаммов были близки (интервал колебаний ГЦ-сос-тава 57,1+0,2 - 57,9чЮ,4 Мол^ГЦ) и достоверно не различались (В-0,05).

_ i

В опыте на кроликах установлено, что наименьшую антиген-

ность проявлял штамм 64 В.ovia (средний титр комплементевязы-

ващих антител через 15 дней после введения культуры - 1:160), а наиболее антигенным был штамм 8406 (средний титр комплеменг-связывашцих антител 1:480 или в 3 раза выше).

Подбор штамма В. qyíb , обладающего высокой остаточной вирулентностью.

Для облегчения работы е культурами В. ovia штаммов 64 и 8406 мы предварительно провели их селекцию с целью адаптации к росту без повышенного содержания СО^ в атмосфере и без добавления сыворотки крови в питательную среду. Селекциониро ванным штаммам присвоили номера 64/2 и' 8406/2.

Изучение вирулентных свойств штамма 8406/2 (как наиболее антигенного в предыдущем'опыте) в опытах на 30 морских свинках и 15 баранчиках показало, что минимальная инфицирующая доза, вызывающая заражение всех опытных животных (ВДюо^ составила: для морских свинок - I ылн.м.к. и для баранчиков - 500 млн.м.к. Для проверки иммунитета у животных в последующих опытах культуру этого штамма вводили подкожно в дозах 10-20 ВДдоо»

Подбор культуры В. ovia с высокими иммуногенными свойствами в опыте на морских свинках.

Для проведения указанной работы были отобраны 4 штамма бруцелл вида овис: М 211, 64/2, 1840 и 1081. Суспензию 2-су-точной агаровой культуры калдого штамма, после инактивации формалином (0,5$), разводили стерильным физиологическим раствором до концентрации I млрд.ы.к./мл.

Взвесь культуры каждого штамма вводили 5-ти морским свинкам подкожно в объеме I мл. Животным пятой группы (контроль) ввели по I мл стерильного физиологического раствора. Наблюдение за опытными животными вели в течение 30 сут.

Установлено, что наиболее выраженный антигенный ответ был

отмечен через 30 дней после инъекции культур у животных, иммунизированных взвесьо клеток штаммов В. ovia № 211 (положительная РДСК в среднем по группа в титре 1:20), № 1081 (1:25) и № 1840 (1:40). Показатели пластинчатой РА с антигеном В. ovia у всех животных этих груш были положительными. В группе животных, иммунизированных культурой штамма № 64/2, к этому сроку реагировало положительно в РДСК с сывороткой крови 60% животных (средний титр 1:8), а пластинчатая РА сохранилась только у 2-х морских свинок (40$).

Для проверки напряженности иммунитета через 30 дней после иммунизации всех морских свинок опытных и контрольной групп заразили 10 ВДэдо живой вирулентной культуры штамма 8406/2 В. ovia . По результатам бактериологического исследования материала от животных установлено, что наиболее иммуногенной является инактивированная культура штамма 64/2. У морских свинок этой группы при самых низких показателях индекса инфицироданности и индекса веса селезенки (соответственно 8,0 и 0,7) процент иммунных был наиболее высоким (60$). В других группах противостояло заражению от 20 до 40% морских свинок, а показатели индекса инфицированности и индекса веса селезенки были значительно вше (от 18,0 до 22,0 и от 1,4 до 1,8). Все животные контрольной (неиммунизированной) группы № 5 заразились, выделена 21 культура из лимфатических узлов и органов (индекс инфицированности 42%).

По результатам показателей антигенных и иымуногенных свойств, полученных в данном опыте, для дальнейших исследований был отобран селекционированный в ВИЭВ штамм № 64/2 В. ovia.

Изучение реактогенных свойств адъювантных препаратов в опыте на морских свинках

Основной задачей данного опыта был выбор наименее реак-тогенного адьюванта, обеспечивающего наиболее высокий по напряженности и продолжительный иммунитет при использовании его для изготовления эмульсин-вакцины из инактивированных бруцелл штамма № 64/2.

Для сравнительного изучения было взято 9 опытных адъшван-тов, любезно предоставленных БНИШй и адъювант, приготовленный из кремнийорганнческой жидкости ГфС-З (ГОСТ 13004-77) и безводного ланолина в соотношении 84 ч.+ 16 ч. На основе каждого из адъювантов было изготовлено 10 микросерий препаратов, содержащих I млрд/мл. инактивированных клеток штамма 64/2. Соотношение адоованта и взвеси микробных клеток в физиологическом растворе составляло по объему в изучаемых препаратах 1:1. Для получения гомогенной суспензии к 2,5 мл адъюванта добавляли 2,5 мл взвеси бруцелл (концентрация 2 млрд.м.к./мл) и эмульгировали до получения однородной сливкообразной стойкой суспензии белого цвета.

Реактогенные и иммуногенные свойства препаратов определяли в опыте на 30 морских свинках (по 3 свинки на препарат^. В качестве контролем служили -3 морские свинки, которым ввели только антиген в дозе I млрд.м.к. и 3 морские свинки, которым подкожно инъецировали I мл стерильного физиологического раствора.

По результатам исследования установлено, что наименьшей реактогенностью обладали препараты, изготовленные на основе гдаовантов № 3210н, 5606(э)6 и 7404. У животных, привитых этими препаратами отмечен и наиболее низкий уровень комплемент-

связывающих антител в сыворотке крови (1:60...1:160). Показатель шмуногенности также был очень низким - 33,3$.

Высокая реактогенность, ентигешость (титр РДСК 1:640) и иммуногенность (66,6-100%),отмечена у животных,привитых вакцинами, изготовленными на основе адъювантов №№ 3606® и 5508®.

При средней выраженности очага на месте введения препаратов, отмеченной при использовании в качестве адъювантов опытных образцов серий №№ 3310, 3508(щ), 5210, 53106 и стандартного адъю-ванта, уровень комплементе вяз ыващих антител в сыворотке крови составил от 1:160 до 1:640. Показатель иммуногенности также варьировал в широких пределах - от 33,3% до 100%.

На основании анализа результатов денного опыта мы пришли к заключению,что наиболее приемлемым для изготовления эмульсин-вакцины из штамма 64/2 является препарат, полученный на основе стандартного ыасляно-ланолинового адьюванта, на введение которого у морских свинок отмечены средние показатели реактогеньости и антигенности и наиболее высокая иммуногенность. В связи с указанным все последующие эксперименты проводили с использованием этого адиованта.

Определение оптимальной дозы антигена в эмульсин-вакцине в опыте на морских свинках

Для решения поставленной задачи изготовили 7 микросерий инактивированной эмульсин-вакцины с содержанием в I мл 25 тыс., 250 тыс., 2,5 млн., 25 млн, 250 млн, 500 млн. и.2,5 млрд.м.к. штамма 64/2. Морским свинкам (по 10 голов) вводили подкожно по I мл каждого из перечисленных выше образцов вакцины (группы I- ' 7). Животным 8-10-й груш (контрольные) вводили соответственно только по I мл адъюванта, только I мл взвеси инактивированньк

клеток В. о^-в в дозе 5 млрд.м.к. и только физиологический раствор в объеме I мл. Наблюдение за животными вели в течение 4-х месяцев, на протяжении которых от них периодически брали кровь для исследования в РДСК с овисным антигеном.

Через 4 месяца после иммунизации морских свинок опытных и контрольных групп заразили культурой вирулентного штамма 8406/2 в дозе 10 млн.живых и.к. (10 ОДщ}) и через 30 дней всех нивот-ных опытных и контрольных групп убили для бактериологического исследования.

По результатам серологических исследований установлено,что наиболее выраженный антигенный ответ (по числу реагирующих в РДСК) получен с сыворотками крови морских свинок, привитых эмульсин-вакциной, содержащей в I мл от 2,5 млн. до 2,5 млрд.м.к. штамма 64/2.

Результаты проверки иммунитета у морских свинок через 4 месяца после введения вакцинных препаратов показали, что при концентрации антигена в эмульсин-вакцине, составляющей 250 млн.м.к^ мл и вше все животные противостояли экспериментальному заражение. При меньших концентрациях антигена (2,5 млн. ... 25 тыс. м.к./мл) количество иммунных животных колебалось от 30$ до 0. При введении антигена без адью ванта (5 млрд.м.к.) противостояло заражению только 20$ морских свинок. Все животные контрольных групп, которым вместо эмульсин-вакцины вводили только адыовант или только физиологический раствор, заразились с развитием генерализованного инфекционного процесса (ИИ - 39,0 и 47,0, а индекс веса селезенки соответственно 1,9 и 2,0).

Таким образом, оптимальной дозой антигена в вакцине для морских свинок следует считать 250 млн. инактивированных клеток ктамма 64/2 В.оу1в,

Определение оптимальной дозы кн&ктивированных клеток

В. оу1з в эмульсин-вакцине в опыте на баранчиках

Опыт бьш проведен на 24 баранчиках 4-5 месячного возраста,-которых разделили по принципу аналогов на 6 групп (по 4 гол. в группе). Баранчикам 1-3 групп вводили по I мл эмульсин-вакцины с содержанием антигена в концентрациях I млрд., 5 млрд. и 25 ■ млрд. инактивированных м.к./мл соответственно. Баранчикам 4-й группы вводили по I мл антигена'в дозе 25 млрд.м.к. без адъю-ванта, животным 5-й группы - по I мл адъюванта без антигена и баранчикам 6-й группы - по I мл стерильного физиологического раствора.

Серологическое исследование (пл. РА, РДСК,.РНГА, Шк и РДП с овисными антигенами и 1БП, РА и РДСК с бруцеллезными антиге- . нами) проводили через 5, 10, 15, 30 дней после вакцинации и в дальнейшем ежемесячно, а после заражения - через 15 и 30 дней. В течение всего опыта у животных групп №№ I, 2, 3 и 5 периодически учитывали местнуи реакцию на. введение препаратов.

Местная реакция на введение вакцинных препаратов и только адъюванта (группы К? I, 2, 3 и 5) проявлялась у баранчиков в области введения в виде инкапсулированных, ограниченных соединительно-тканных очагов размерами от 0,5x0,75 см ДО 1,5x2,0 см, которые наблюдали в течение всего опыта. Более выраженными эти очаги были у животных, которым вводили высокие дозы антигена (5 млрд.м.к., 25 млрд.м.к.). Очаги наименьших размеров отмечали у баранчиков, которым инъецировали только адьювант (груша ;> 5).

При изучении динамики серологических реакций с овисными антигенами установлено, что у всех животных групп I, 2, 3 и 4 наблцяалась иммунологическая перестройка организма, выражащая-

ся в появлении в сыворотке крови специфических антител, выявляемых в пластинчатой РА, РДСК, РДП, ША и НТА.

В количественном отношении наиболее выраженными бьши показания в ШГА (титры от 1:50 до 1:1600), несколько ниже в ША (1:400-1:800) и еще ниже в РДСК (1:5-1:160). При этом уровень антител был выше в сыворотке крови животных, привитых большими дозами антигена.

Через 6 месяцев после иммунизации всех животных опытных и контрольных груш с целью проверки напряженности иммунитета заразили культурой вирулентного штамма 8406/2 в дозе 5 млрд.м.к. (10 ВД];оо)- Результаты проверки иммунитета приведены в табл.1.

Таблица I

Ьоказатели бактериологического исследования и состояния иммунитета у баранчиков в зависимости от дозы антигена В. от!з в эмульсин-вакцине

1 Кол-во ¡Зара-'^ВД^0 Ж*0}^" групп! П р е п а р а т'жив-х ¡зи- П»х

! 'пЛгм)1?™л),Г0 ,из ор-!ваннос!гол!Я

I. Адыовант+антиген (I млрд. м.к.) 4 I 2 0 2,5 3 . 75,0

2. Адъювант +■ антиген (5 млрд.м.к.) • 4 0 0 0 0 4 100,0

3. Адъювант + антиген (25 млрд.м.к.) 4 0 0 0 0 4 100,0

контроли:

4. Антиген (25 млрд.м.к. )4 3 12 4 15,0 I 25,0

5. Адъювант 4. 4 23 6 28,8 0 0,0

6. Физиологический р-р 4 4 27 9 33,8 0 0,0

По результатам бактериологического исследования (табл.1) видно, что все животные в группах № 2 и № 3, привитые адъювант-вакцинами с содержанием соответственно 5 млрд. м.к. и 25 млрд.

м.к. культуры штамма 64/2 Б. от±з , противостояли экспериментальному заражению 10 ВД^д вирулентной культуры штамма 8406/2. Среди животных группы № I (I млрд.м.к.) количество иммунных было также высоким - заразился только I баран из 4-х, причем от него выделено всего 2 культуры из регионарных месту заражения лимфатических узлов (ИИ = 2,5$).

В группе животных Л5 4, иммунизированных взвесью инактиви-рованной культуры в дозе 25 млрд.м.к. без адыованта, заразились 3 баранчика с развитием у них генерализованного инфекционного процесса.

Также следует отметить, что у животных контрольных.групп !? 5 и № 6 во всех случаях установлена генерализованная форма с множественными поражениями лимфатических узлов и паренхиматозных органов. Индекс инфицированности - . составил соответст-

венно 28,8 и 33,

Таким образом, по результатам данного опыта установлено, что оптимальной концентрацией инактивированных формалином микробных клеток штамма 64/2 в адъювант-вакцине, обеспечивающей надежную защиту всех опытных животных от заражения, следует считать 5 млрд.м.к.

Учитывая, что с повышением дозы культуры в вакцине возрастает и продолжительность серопозитивности у иммунизированных животных, нами была предпринята попытка изучить возможность повышения напряженности иммунитета у животных на дозу I млрд.м.к. за счет введения в состав вакцины компонента, стимулирующего неспецифические факторы защиты организма, повышающие его устойчивость к инфицированию.

Изучение иммуностимулирующего действия гликопина

(ГМДШ в сочетании с адью вант-вакциной

Учитывая литературные данные (Р.В. Петров, Хаитов, 1988), а также результаты исследований, полученные в лаборатории молекул лярной биологии и биохимии ВИЭВ Г.Ф. Коромысловым и Г.И. Устиновой (1969-1992 гг.), для изучения в качестве средства, восстанавливающего функции иммунной системы, нами был взят препарат ГВДП (гликопин-глюкозшиншшурамилдипептид), синтезированный в Институте биорганической химии им. М.М. Шемякина АН F®.

Опыт № I. В данном опыте, наряду с определением иммуностимулирующего действия гликопина, мы также устанавливали оптимальную дозу инактивированных клеток штамма 64/2 в эмульсин-вакцине при её применении в комплексе с иммуностимулятором.

Так как в предыдущем опыте оптимальная доза антигена в эмульсин-вакцине для баранчиков составила 5 млрд.м.к., мы взяли этот показатель за отправной и при изготовлении двух последующих серий концентрацию антигена в вакцине сокращали с "шагом" = 5, т.е. соответственно до I млрд.м.к. и до 200 млн.м.к. на дозу.

В опыте использовали 25 баранчиков 4-5 месячного возраста живо# массой от 20 до 25 кг, которых разделили по принципу аналогов на 5 групп по 5 голов.

Животным 1-й группы вводили эмульсин-вакцину с концентрацией антигена В. ovie штамма 64/2 5 млрд.м.к./мл в сочетании с гликопином (доза 0,3 мг на голову), баранчикам второй группы -с содержанием антигена в концентрации I млрд.м.к./мл и гликопина - 0,3 ыг на голову и 3-й группы - соответственно 200 млн.м.к. и 0, 3 мг. Контрольным животным 4-й группы вводили только гли-копин в дозе 0, 3 мг . .и 5-й группы - физиологический

раствор в дозе I мл.

Местная реакция на введение эмульсин-вакцины в данном опыте была менее Еыражена, чем в предьдущем и характеризовалась формированием под кожей в области инзекции препаратов ограниченных соединительно-тканных очажков размерами от 0,5x0,6 см до 0,8x1,0 см. У отдельных животных очаги рассасывались полностью в течение 3-4-х месяцев, но у большинства баранчиков I, 2 и 3-ей групп они сохранялись в течение всего срока наблюдения (7 месяцев).

Динамика антител в сыворотке крови баранчиков, иммунизированных эмульсин-вакциной с иммуностимулятором (ГМДП), соответствовала аналогичным группам , в предьщущем опыте-.

Иммунитет, и его напряженность кроме состояния защитных барьеров организма определяется специфическим кооперированием фагоцитов, Т- и В-лимфоцитов.

Результаты исследований в данном опыте показали, что фагоцитарная активность лейкоцитов к антигену В. возрастала в 1-ой и 2-ой группах животных с 1,06+0,01.в среднем до 5,82+0,25 и 5,75+0,34, в 3-ей до 4,05+0,55 и 4-ой до 3,62±0,34.

Количество Т-лимфоцитов в крови существенно изменялось начиная с 3-5 дней после иммунизацииКдо 7?,0+2,5% (I гр.), 71,% 1,4 (2 гр.), 70,0+1,5 (3 гр.), 71,6+2,4% и этот процесс продол» жался до 21 дня (78,6+1,8$ в среднем). Содержание В-лимфоцитов изменялось у животных в опытных группах, но на-значительно. После заражения уровень Т- и В-клеток а животных, иммунизированных различными дозами антигенов, существенно не различался..

Содержание иммуноглобулинов класса б возрастало у овец всех спытных груш, начиная со второй неделй^йёцинации до 5-6 недель с 19,2+0,85 в среднем до 22,8+1,95 в первой, 22,0+1,02-го

2-ой, 21,4+1,44 в 3-ей и 20,8+2,05 мг/>/*, в 4-ой. Концентрация иммуноглобулинов М в сыворотке крови опытных овец аналогична,начиная с первого дня иммунизации ( с 1,85+0,22 в среднем до 2,01+ 0,3; 2,0+0,2; 1,8+0,05; 1,69+0,2.мг/лЛ;).

Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о способности ГМДП, одновременно введенного с вакциной и без нее, повышать сопротивляемость организма овец в период формирования иммунитета. Это подтвердили результатами бактериологического исследования после заражения.

Для проверки напряженности иммунитета и выяснения иммуностимулирующего значения ГВДП через 180 дней после вакцинации животных опытных и контрольных групп заразили подкожно культурой вирулентного лтамма'8406/2 в дозе Ь млрд.ы.к. (10 ВДэдд).

Через 30 дней после заражения животных всех групп убили и провели бактериологическое исследование лимфоузлов и органов. Одновременно с бактериологическим исследованием этот же материал исследовали в реакции нейтрализации антител (FHAt) с эритроцитар-ным диагносгикумом ВИЭВ с целью выявления антигена В. ovis.

По результатам бакисследования и FHAt установлено, что все животные первой и второй групп противостояли экспериментальному заражению культурой вирулентного штамма 8406/2. Снижение дозы антигена в вакцине до 200 млн. инактивированных клеток штамма 64/2 ( группа ДО 3), даже при наличии иммуностимулятора, создает у опытных баранчиков менее напряженный иммунитет ( 60% иммунных), но и в данном случае можно считать, что инфекционный процесс у заразившихся баранчиков протекал доброкачественно, так культура В.ovis была выделена, в основном, только из регионарных месту введения лимфатических узлов.

Необходимо особо подчеркнуть, что из животных группы № 4, которым был введен только иммуностимулятор, 2 баранчика противостояли заражению, а количество выделенных культур от заразившихся 3-х голов было незначительным (ИИ = 10,44). Эти данные свидетельствуют о повышении резистентности организма за счет »ведения животным иммуностимулятора ГМДП.

В контрольной группе баранчиков, которым вместо испытуемых препаратов вводили физиологический раствор, все животные заразились с развитием генерализованной формы инфекционного процесса (ИИ. 40,7%).

Таким образом, по результатам данного опыта считаем, что для создания напряженного и продолжительного иммунитета у баранчиков против инфицирования В.оу1в оптимальной концентрацией м.к. штамма 64/2 в инактивированной эмульсин-вакцине при применении её в комплексе с ГМДП является I млрд. на доэу (I мл).

Во втором опыте на 50 баранчиках изучали иммунологическую эффективность инактивированной эмульсин-вакцины в сравнении с живой вакциной из штамма Рев-1 В.де1ЛЪепз1а.

Животных разделили на 5 групп и в возрасте 4-5-ти месяцев ввели испытуемые и контрольные препараты по схеме, представленной в табл.2.

После введения препаратов у животных изучали местную реакцию в области введения вакцин и в течение 5-ти дней измеряли температуру тела. Сыворотку крови исследовали в динамике с антигенами бруцелла овис (РДСК и РИГА) и бруцеллезными антигенами (Ш1, РА и РДСК) через 10, 15, 30 дней и в последующем через каядые 30 дней до окончания опыта.

Ьри серологическом исследовании ливотных из групп !"} 1,2,

Схема опыта № 2

Таблица 2

» Наименование I lgggn0

<й d

1. 10 Эыульскн-вакцша + ГВДП 1,0 0,3 о

2. 10 Эмульсин-вакцина 1,0 - §§§

3. 10 ГВДП - 0,3 ggg •4. 10 Кивая вакцина из шт.Рев-1 2,0 - |0§ 5. 10 Контроль, не вакцинированные __а ^

3 и 5 на бруцеллез во Есе сроки получили отрицательные результаты по НШ, РА и РДСК. В группе №4 (иммунизированы живой вакциной из ¿таима Рев-I), при исследовании сыворотки крови на бруцеллез через 20 дней положительные результаты в НШ и в РА получены в 100% случаев (средний титр 150 МЕУмл), а в РДСК - в 80% (средний титр 1:8). Положительные реакции сохранялись до SO дней после вакцинации, а при исследовании с бруцеллезными антигенами через 150 дней после иммунизации по всем реакциям получен групповой отрицательный результат.

При исследовании сывороток крови от животных из групп ШЗ,

4. 5 по РДСК и гаГА с антигенами из бруцелл> , овис во все сроки до экспериментального заражения получали отрицательные результаты.

В группе № 2 из животных, иммунизированных эмульсин-вакциной без иммуностимулятора^при исследовании сыворотки крови через 20 дней реагировали положительно в РДСК 40% (средний титр 1:120) и в RiTA - 75% ( средний титр 1:325), через 30 дней соответственно 100% ( 1:360) и 100% (®:412), через 60 дней - 100% (1:670) и 100% (1:710), через 3 мес.- 100% (1:670) и 100% (I:

При исследовании сывороток крови от животных из группы №1, привитых эмульсин-вакциной в сочетании с иммуностимулятором, процент реагирующих положительно и средние титры в РДСК и РИГА составили соответственно: через 20 дней - 60% (1:60) и 80% (I: 160), через I мес. - 80% (1:112) и 100% (1:400), через 2 мес. -80% (1:144) и 100% (1:370) и через 3 мес. - 100% (1:209) и 100% (1:400).

До иммунизации и во все сроки после введения препаратов определяли количество лейкоцитов, лимфоцитов, лейкоцитарную формулу, концентрацию гемоглобина. При иммунологическом исследовании крови определяли активность фагоцитоза лейкоцитов, количество Т- и В-л^юцитов, величину классов иммуноглобулинов ( в,М ).

Применение ГМДП на фоне иммунизации способствовало повышен™ эритроцитов, лейкоцитов и лимфоцитов в крови, а также привело к увеличению фагоцитарной активности в 1,3-1,6 раза (в течение 60 дней после вакцинации), количества Т-лимфоцитов в среднем на 1855 (1-3 гр.). Это повышение продолжалось до 1520 дней, к 60 дню отмечали снижение их уровня.

Содержание В-лимфоцитов повышалось у вакцинированных животных начиная с 15 по 40 день (2-4 гр.), ( в I гр. на 20,4%, в 3-ей на 19,5%).

Следует отметить, что более выраженная напряженность иммунитета у овец опытных групп согласуется с*содержанием иммуноглобулинов м) в их крови, колипосяю которых было аналогично данным первого опыта.

Проверку иммунитета у животных просели через 7 мес. после

иммунизации путем подкожного заражения культурой вирулентного штамма 84J5/2 в дозе 10 млрд.м.к. (20 ЦЦэдц). Убой баранчиков , и бактериологическое исследование лимфатических узлов и органов проводили через 30-33 дня.

Установлено, что в данном опыте, кьос и б опыте № I, введение баранчикам эмульсин-вакцины в комплексе с ГТДП (группа № I) создает у привитых животных шраженный по напряженности и продолжительный иммунитет. Из- 10 животных этой группы иммунными были 9 или 90% (ИИ = 1,3%).

Количество иммунных животных, привитых живой вакциной против бруцеллеза из штамма Рев-1^было несколько ниже (70%), а среди привитых только эмульсин-вакциной без иммуностимулятора не заразились 5 голов из 9 или 55,6%.

В данном опыте также показано, что введение иммуностимулятора ГМДЦ (группа W 3) предохраняло от заражения 22,2% баранов за счет повышения обцей резистентности организма животных. Все контрольные (не>-вакцкниро ванные) кивотные заразились. От них Еыделено 97 культур бруцелл ( в том числе 31 из органов), при ИИ = 42,17%.

Таким образом, по результатам опытов на баранах можно сделать заключение, что разработанная нами эмульсин-вакцина обладает выраженными гашуногенными свойствами против инфицирования В. ovia, Эзедение в состав вакцины дополнительного компонен-та-стимулягора ГМДП - позволяет за счет коррекции естественной резистентности организма животных снизить дозу антигена в вакцине ь 5 раз (с 5 млрд.м.к./мл до I млрд.м.к./мл).

При сравнительном изучении опытной чнактивированной эмульсин-вакцины и жирой вакцины из штамма Рев-I показало, что опытный препарат, вводимый в комплексе с иммуностимулятором,

-за-

является более эффективным, так как через 7 мес. после.вакцинации (срок наблюдения), противостояло экспериментальному заражению соответственно 90$ и 70$ животных.

Преимуществом данной вакцины является также и то, что она может быть рекомендована для иммунизации оьцепоголовья против инфекционного эпидидимита в зонах, благополучных по бруцеллезу овец.

ВЫВОДЫ:

1. Разработана эффективная, экологически безопасная инак-тивированная эмульсин-вакцина с иммуностимулятором против инфекционной болезни овец, вызываемой бруцеллами видао-yia (инфекционный эпедидимит баранов).

2. Штамм № 64 по культурально-морфологическим, тинкториа-льным и агглютинабельным свойствам является типичным для бру-целл вида ovis , обладает пониженной антигенностья, высокой имыуногенностью. По этим показателям он является наиболее пригодным для изготовления вакцинных препаратов против инфекционного эпвдвдимита баранов.

3. В целях унификации и получения достоверных результатов при проведении экспериментальных работ подобран штамм 8406 В. ovia , обладающий высокой остаточной вирулентностью и рекомендован нами для проверки иммунитета^животных при определении имыуногеншсс свойств вакцин против инфекционного эпвдидимита. Минимальная инфицирущая доза данного штамма составляет для баранов 500 млн.м.к.

4.Путем селекции исходных культур штампов i* 64 и 9 8406 В. о, получены штаммы № 64/2 и I? 8406/2, адаптированные к росту в условиях термостата без повышенного (до 10$) содержания

п атмосфере и без добавления сыворотки кроги жиготн1« или

аминопепгцца {10%) в питательную среду. При этом основные свойства штаммов остается стабильными.

5. Б опыте на морских свинках установлено, что из изученных 5-ти инактивированных культур В. ovis наибольшей иммуногенностью обладает штамм 64/2 В. ovis.

6. Опытным путем подобран адъювант для изготовления эмульсин-вакцины, включающий 84% кремнийорганической жадности ПЭС-З и 16% безводного ланолина в качестве эмульгатора.

7. Эмульсин-вакцина типа "вода в масле", изготовленная на основе этого адъюванга, при средней реактогенности и антигенности (титр в РДСК 1:320) создает иммунитет у 100% морских свинок через 30 дней после вакцинации.

8. Оптимальное количество микробных клеток инактивированной культуры в эмульсин-вакцине составляет для морских свинок 250 млн. на дозу, а для баранов - 5 млрд.

9. Синтетический препарат из группы мурамилдипептидов - ГМДП (гликопин) обладает выраженным иммуностимулирующим действием, вызывая увелвдение">^орменньи элементов крови, Т- и В-лимфоцитов. При этом повышается уровень естественной резистентности организма баранов против инфицирования В.oris.

10. Введение в состав эмульсин-вакцины иммуностимулятора ГМДП из расчета 0,3 мг на одну прививаемую дозу позволяет снизить количество антигена в 5 раз (до I млрд.м.к.). При этом показатель иммуногенности вакцины повышается с 75,0% до 100%.

11. Инактивироваяная эмульсин-вакцина из В. ovis с иммуностимулятором ГМДП по иммунологической эффективности превосходит живую вакцину из итамма Рев-I (соответственно 90% и 70% иммунных через 7 мес. после приЕивки) и имеет преимущества в том, что вследствие экологической безвреднссти может быть использована для

иммунизации овцепоголовья в хозяЯстйах, благополучных по бруцеллезу овец.

ПРАКТИЧЕСКИЕ пщщотж И Р&ОМЗДАЦИИ.

1. Рекомендована для производственного испытания экологически безопасная инактивированная эмульсин-вакцина с иммуностимулятором для профилактики инфекционного эпвдццимита баранов.

2. "Лабораторный регламент на изготовление и контроль эмульсин-вакцины инактивироданной против инфекционного эпидидкмита баранов". (Утв.звм.директора ВИЭВ 2В.II.91г.).

3. "Временное наставление по применении эмульсин-вакцины инак-тивированной против инфекционного эпидедимита бараков (Утв.зал:, директора ВИЭВ 28.11.91 г.).

По теме диссертации опубликованы следующие работы:

I» Абулхаиров Г. III. Вирулентные свойства штамма Brucalla ovia в опытах на морских свинках и баранах// Бш.ин-та/ Всерос.н.-и. ин-^Ннщшёнт.яет. им. Я.Р.Коваленко. Вьш. 73-74.-М. 1990.-

с.

2. Абулхаиров Г.III., Ромахов В.А. Антигеннце и иммуногенные свойства вакцинных препаратов бруцелл овечьего типа // Материалы Всесоюзной научной конференции "Совериенствование методов государственного контроля ветеринарных препаратов" (тезисы докладов). М., 1991. - С. II6-II8.

3. Ромахов В.А., Тягунина Е.А., Мельниченко В.И., Абулхаиров Г.Ш., Ниязов У.д., Мельниченко J1.П. Ишуноферментный анализ при диагностике инфекционного эпидвдимита баранов// Материалы Всесоюзной научной.конференции по сельскохозяйственной биотехнологии (те-' зисы выступлений). Целиноград. - 1991. С. I3I-I32.