Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Антагонистическая и адгезивная активность микроорганизмов родов LAСТОВАCTERIUM и BIFIDJBACTERIUM, используемых в качестве пробиотиков

Министерство общего и профессионального образования Российской Федерации Московский Государственный университет прикладной биотехнологии

Антагонистическая и адгезивная активность микроорганизмов родов Ьас1оЬас1епит и 1Мйс1оЬас1егшт, используемых в качестве пробиотиков

Специальность 16. 00. 03 - «Ветеринарная микробиология,

вирусология, эпизоотология, микология и иммунология»

Диссертация на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

На правах рукописи

Степанов Константин Максимович

И

V

/

Научный руководитель -Заслуженный деятель науки РФ, доктор ветеринарных наук, профессор М. А. Сидоров

Москва

-1998

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ ................................................................................................ 3-7

1. Обзор литературы ...................................................................................... 8-41

1.1. Биологические свойства молочнокислых бактерий ..................................8

1.2. Бифидобактерии и их роль в организме животных .................................17

1.3. Микрофлора желудочно-кишечного тракта животных, ее биологическая роль в защите организма-хозяина ...........................................................22

1.4. Использование бактериальных пробиотиков для коррекции микрофлоры животных ..................................................................................................33

2. Собственные исследования ......................................................................42-56

2.1. Материалы и методы ................................................................................42

2.2. Результаты исследований ................................................................57-110

2.2.1. Микрофлора фекалий здоровых поросят и поросят с признаками диареи ......................................................................................................57

2.2.2. Идентификация и основные биологические свойства бифидобактерий ...............................................................................59-78

2.2.2.1. Видовая принадлежность бифидобактерий, выделенных

от поросят .............................................................................................59

2.2.2.2. Кислотообразующие свойства бифидобактерий ...............................62

2.2.2.3. Антагонистические свойства бифидобактерий .................................64

2.2.2.4. Адгезивные свойства бифидобактерий...............................................75

2.2.3. Идентификация и основные биологические свойства лактобактерий .................................................................................79-99

2.2.3.1. Видовая принадлежность лактобактерий выделенных

от поросят ............................................................................................79

2.2.3.2. Антагонистические свойства лактобактерий .....................................86

2.2.3.3. Адгезивные свойства лактобактерий .................................................96

2.2.4. Лечебно-профилактическая эффективность бифацидобактерина

при желудочно-кишечных болезнях поросят ................................100-110

3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ .......................111-124

4. ВЫВОДЫ ..............................................................................................125 -126

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ ...........................................................127

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ .................................................................... 128 - 153

ПРИЛОЖЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

Согласно современным представлениям организм человека и животных находится в определенном экологическом равновесии с представителями нормальной микрофлоры и в тесной симбиотической связи с ней. Это позволяет рассматривать макроорганизм и микробов его населяющих как сбалансированную экологическую систему в которой стабильность микробных ассоциаций определяется как эубиоз (В. Ю. Пауликас, 1990; R. Kenworty, 1991; М. М. Интиза-ров, 1994;).

Важная роль в поддержании функций некоторых органов принадлежит нормальной микрофлоре, которая благодаря выраженным ферментативным свойствам, способности синтезировать витамины, является одним из факторов естественной защиты макроорганизма (В. М. Коршунов, 1995).

На микробную экологическую систему животных неблагоприятное влияние оказывает широкое нерациональное использование антибиотиков и антимикробных препаратов в ветеринарии; ограничение контактов животных с почвой, растениями и другими естественными факторами; широкая химизация отрасли; заболевания как инфекционного, так и не инфекционного характера; нерациональное кормление; старение организма. Изменения, происходящие в микробиоценозе животных, проявляются состоянием дисбактериоза, снижением содержания нормальных симбионтов - бифидо- и лактобактерий (Н. А. Аманов, Ф. Ю. Гариб, Я. А. Умаров, 1989; Г. И. Гончарова, В. Г. Дорофейчук, А.З. Смо-лянская с соавт., 1989; В. Н. Красноголовец, 1989, Т. Mitsuoka, 1988; F. Schulze, 1987;).

В настоящее время одним из перспективных направлений в области профилактики болезней животных, вызываемых условно-патогенной микрофлорой, является применение пробиотиков - биологических препаратов из полезных микроорганизмов - антагонистов - представителей нормальной кишечной микрофлоры. Эти препараты при обоснованном применении обладают антибиотическим действием, улучшают обменные процессы в организме, подавляют ус-

ловно-патогенные микроорганизмы, а бактерии, входящие в их состав, продуцируют ряд витаминов, редуцируют нитраты, оказывают стимулирующее действие на местную защиту пищеварительного тракта. (A. Chesson, 1991; В. В. Смирнов, С. Р. Резник, 1992; В. Никитенко, 1993;) Механизм действия этих препаратов основан на заселении и регулировании нормальной микрофлоры микроэкологической ниши макроорганизма.(С. Stewart, A. Chesson, 1993)

Из-за актуальности вопроса о применении пробиотиков в связи с их безвредностью, возможностью применения в любом возрасте, безопасностью для окружающей среды возникает проблема конструирования и использования экологически безопасных биопрепаратов из представителей нормальной микрофлоры животных.

В качестве одних из основных действующих начал в производстве сухих препаратов и продуктов лечебного питания как у нас в стране, так и за рубежом, широко используются представители родов Lactobacterium u Bifidobacterium.

В нашей стране при отборе и характеристике штаммов - кандидатов в пробиотики учитывают прежде всего их технологичность, спектр и уровень антагонистической активности, что явно недостаточно (Е. И. Беляев, 1988).

Проблема адгезии микробов привлекает внимание исследователей как с точки зрения ее биологического значения в механизмах, обеспечивающих приживление микроорганизмов и формирования нормальной микрофлоры организма, так и участия ее в начальных этапах развития заболевания.

Существуют различные точки зрения в отношении возможности использования штаммов бактерий, выделенных от одних видов животных для коррекции кишечного микробиоценоза у других видов.

В научной литературе имеются отдельные сообщения об эффективном использовании антагонистических и адгезивных свойств отдельных микроорганизмов против различных видов микробов с целью профилактики и лечения различных болезней, но наиболее обобщенных данных исследований этих свойств сразу на несколько микроорганизмов, используемых в качестве пробио-

тиков, нет.

Все вышеуказанное определяет целесообразность комплексных исследований биологических свойств штаммов лакто- и бифидобактерий, особенно изучение степени выраженности антагонистических свойств и адгезивной активности, для конструирования пробиотиков с известным механизмом действия.

Цель и задачи исследования. Основной целью является изучение основных биологических свойств, антагонистической и адгезивной активности лакто-бактерий и бифидобактерий, выделяемых из кишечника поросят. В соответствии с этим на разрешение поставлены следующие задачи:

■ изучить кишечный микробиоценоз у клинически здоровых поросят и поросят с желудочно-кишечной патологией, сопровождающейся диареей. Установить количество лакто- и бифидобактерий, высеваемых из фецес здоровых и больных животных;

■ выделить из фецес поросят подсосного периода содержания культуры лакто- и бифидобактерий, установить их видовую принадлежность;

■ изучить основные биологические свойства, антагонистическую и адгезивную активность бифидобактерий, выделенных из фецес поросят и штамма В. adolescentis В-1, используемого при производстве пробиотического препарата лактобифадола (бифацидобактерина);

■ изучить основные биологические свойства, антагонистическую и адгезивную активность лактобактерий, выделенных из фецес поросят и штамма L. acidophilus ЛГ-1, используемого при производстве пробиотического препарата лактобифадола (бифацидобактерина);

■ изучить лечебную и профилактическую эффективность пробиотика лактобифадол (бифацидобактерин) при диарейных заболеваниях поросят.

Научная новизна: Изучена динамика становления кишечного микробиоценоза у поросят в условиях свинокомплекса промышленного типа.

Изучен состав кишечной микрофлоры клинически здоровых поросят и его качественные и количественные изменения при желудочно-кишечной патоло-

гии, сопровождающийся дисбактериозами и диареей.

Установлены количественные изменения основных антагонистов кишечного тракта (лакто- и бифидобактерий) при желудочно-кишечной патологии у поросят.

Определена видовая принадлежность лакто- и бифидобактерий, выделенных из фецес поросят подсосного периода содержания.

Изучены основные биологические свойства, антагонистическая и адгезивная активность лакто- и бифидобактерий, выделенных из фецес поросят в сравнении с соответствующими свойствами производственных штаммов В. adoles-centis B-l u L. acidophilus ЛГ-1, используемыми при изготовлении пробиотика лактобифадол (бифацидобактерин).

Изучена лечебная и профилактическая эффективность пробиотика лактобифадол (бифацидобактерин) при желудочно-кишечной патологии у поросят.

Практическая значимость: При сравнительном изучении биологических свойств, антагонистической и адгезивной активности лактобактерий и бифидобактерий выделенных от поросят и производственных штаммов, входящих в пробиотик лактобифадол (бифацидобактерин), установлено, что последние не уступают по производственно-ценным свойствам культурам выделенным от поросят.

Установлен высокий лечебный и профилактический эффект пробиотиче-ского препарата лактобифадол (бифацидобактерин) при желудочно-кишечных болезнях поросят, сопровождающихся дисбактериозом и диареями.

Отработаны схема применения и дозы препарата при его лечебном и профилактическом назначении поросятам. Полученные данные использованы в Наставлении по применению лактобифадола (бифацидобактерина) в ветеринарии № 13-5-2/1255 от 01.06.1998 г, утвержденного департаментом ветеринарии Минсельхозпрода РФ.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на заседаниях Ученого совета ветеринарно-санитарного факультета Московского

Государственного университета прикладной биотехнологии в 1996, 1997, 1998 г.г., на второй Международной научно-практической конференции, июнь 1997г.

Автор считает своим приятным долгом выразить искреннюю благодарность заведующему кафедрой микробиологии Московского Государственного университета прикладной биотехнологии, Заслуженному деятелю науки РФ, доктору ветеринарных наук, профессору Михаилу Анисимовичу Сидорову, доценту кафедры микробиологии, кандидату ветеринарных наук Владимиру Викторовичу Субботину и всем сотрудникам кафедры микробиологии за ценные советы и помощь, оказанные в период выполнения и оформления работы.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Биологические свойства молочнокислых бактерий

Молочнокислые бактерии - это специфическая группа микроорганизмов, обуславливающих молочнокислое брожение, т. е. распад углеводов (сахаров) до молочной кислоты. Они присутствуют в почве, различных бродящих продуктах (молочнокислые продукты, силос, фрукты, фруктовые соки и др.), на растениях, в ротовой полости, пищеварительном и мочеполовом тракте различных животных и человека. Особые биологические свойства молочнокислых бактерий обуславливают их применение в медицине, в ветеринарии, (препараты-эубиотики) и в пищевой промышленности (сыроварение, виноделие, консервирование, заквашивание силоса и др.) (Е. И. Квасников и О. А. Нестеренко, 1975, Н. E.Sharpe, 1979, В. В. Смирнов, С. Р. Резник, 1995).

В соответствии с определителем Bergey (1957) молочнокислые бактерии были сгруппированы в одно семейство Lactobacillaceae, которое делилось на два триба: Streptoccaceae (сферическая или овальная форма) и Lactobacillaceae (палочковидная форма).

В последней классификации, приведенной в определителе Bergey (1984) молочнокислые бактерии отнесены к двум отдельным семействам: Streptococ-caceae u Lactobacillaceae. В соответствии с Международным стандартом по номенклатуре (1991) молочнокислые стрептококки отнесены к семейству Strepto-соссасеае , родам Lactoccus u Leuconostoc , а молочнокислые палочки - к семейству Lactobacteriacae, роду Lactobacterium (цитируется по П. П. Степаненко, 1996).

Молочнокислые стрептококки относятся к семейству Streptococcaceae, родам Lactococcus и Leuconostoc . К гомоферментативным относятся молочный (Lac. lactis) и сливочный (Lac. cremoris) стрептококки. Гетероферментативными являются ароматобразующие стрептококки, или цитроворусы, способные продуцировать ароматические вещества (диацетил, ацетоин) и усваивать соли ли-

монной кислоты - цитраты. В эту группу входят Lac. diacetylactis, Leu. cremoris, Leu. dextranicum.

Промежуточное положение между гомо и гетероферментативными стрептококками занимает термофильный стрептококк Str. termophilus, потому его иногда называют среднегетерогенным видом.

Температурные границы жизнедеятельности этих микроорганизмов довольно широки. Для мезофильных видов оптимальная температура 25 - 30°С, но имеются и термофилы, растущие при 38 - 40°С. Минимальной температурой развития для мезофильных молочнокислых бактерий является 10°С, для термофилов - 20 - 22°С. Имеются данные, что некоторые молочнокислые бактерии способны расти при очень низких плюсовых температурах (до 3°С).

К настоящему времени опубликовано много работ, посвященных энтерококкам, в которых показано, что данные бактерии, являясь одними из представителей нормофлоры человека и животных, играют важную роль в создании оптимальных условий для жизнедеятельности организма хозяина (А. П. Крупина, 1967: G. Bellomo, 1980; R. Borgetta, 1981; А. Hevenstein et. al., 1979; К. G. Schümm et. al., 1982; N. Suegaraet. al., 1981).

Энтерококки в «Руководстве по систематике бактерий Берги» (1984) входят в 12 группу и включены в род Streptococcus в составе видов S. faecalis, S. faecium, S. durans, S. equinus, S. bovis.

По антигенному составу энтерококки объединены в серогруппу Д. Род Streptococcus включает 20 видов бактерий, близких по морфологии, ряду биологических признаков, а также связанных гомологией ДНК и РЕПС. Биохимически и экологически энтерококки значительно отличаются от других стрептококков. Эти признаки, наряду с антигенным своеобразием, являются основанием для предложения о выделении энтерококков в самостоятельный род (А. П. Калина, 1965; К. Н. Schleifer et. al., 1986).

В ряде работ показано, что по фенотипическим признакам и нуклеотид-ному составу энтерококки являются гетерогенной группой бактерий, в которой

четко выделяются представители вида S. faecalis, типичные штаммы S. faecium и подвижные энтерококки. Представители вида S. faecalis однородны, генетически близки и представляют собой обособленный, четко очерченный вид, а S. faecium является гетерогенным видом. Антигенная неоднородность энтерококков не зависела от видовой принадлежности штаммов. В белковом комплексе S. faecalis, S. faecium, группы подвижных энтерококков, выявлено 12 антигенов, которые были общими для всех изучаемых штаммов энтерококков и не обнаружены у других представителей рода Streptococcus (А. В. Драбкина, 1950; В. И. Вершинина, О. Б. Исхаково, 1982; JI. Д. Гуторова, 1989).

По биохимическим свойствам в современной номенклатуре энтерококки делятся на следующие основные группы: 1. S. faecalis с разновидностями Var. Zymogenes, разжижает желатину; 2. S. faecium; 3. S. durans - биохимически малоактивный вид. К промежуточным разновидностям, атипичным формам относятся S. innominatus (В. И. Седов, 1977).

При сбраживании фекальными стрептококками галактозы образуется, кроме молочной кислоты, уксусная, муравьиная и яблочная кислоты, этанол и углекислоты. Предшественником молочной кислоты, этонола и уксусной кислоты является пируват. В присутствии кислорода энтерококки образуют перекись водорода, которая оказывает быстрое бактерицидное действие (S. Treznnetis et. al., 1970).

Подавляющее число энтерококков свертывает молоко через 12-16 часов (при температуре 37°С), редуцирует метиленовый синий, восстанавливает лакмусовое молоко (А. П. Крупина, 1967).

Энтерококки сбраживают самые различные углеводы и спирты. Но ферментативные свойства у различных штаммов не могут служить их безусловным диагностическим признаком, так как колеблются и не постоянны.

Характерной особенностью энтерококков является их устойчивость к желчи. Этот важный дифференциальный признак представляет интерес и с точки зрения проблемы значения нормальной микрофлоры для организма. Парази-

тические микробы менее устойчивы к желчи, чем сапрофитные. Совершенно естественно, что энтерококки не могли бы быть основными микробами кишечника, если бы они не обладали этим свойством.

Для обнаружения и количественного учета энтерококков предложено около 100 вариантов селективны�