Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.02) на тему:Активность Na-K- и Са-АТФ-аз нейтрофильных гранулоцитов крови при воздействии IN VITRO низкоинтенсивным гелий-неоновым лазером

PiS од

I 8 ИЮН 1998

на правах рукописи УДК 612. 128

ЛЯПИНА СВЕТЛАНА АНАТОЛЬЕВНА

АКТИВНОСТЬ Ыа-К- и Са-АТФ-аз НЕЙТРОФИЛЬНЫХ ГРАНУЛОЦИТОВ КРОВИ ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ IN VITRO НИЗКОИНТЕНСИВНЫМ ГЕЛИЙ-НЕОНОВЫМ ЛАЗЕРОМ

16.00.02 - патология, онкология и морфология животных

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Саранск - 1998

Работа выполнена на кафедре биохимии Мордовского государственного университета им. Н. П. Огарева

Научный руководитель - доктор биологических наук, профессор

Киселева Руфина Евгеньевна

Научный консультатнт - доктор биологических наук

Кругляков Павел Павлович

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук, профессор

Ехкова Маргарита Степановна кандидат биологических наук, доцент Вехновская Елена Георгиевна

Ведущая организация - Российский Ордена Дружбы народов

университет дружбы народов

Защита состоится 1998 г. в /О часов на засе-

дании диссертационного совета К 063.72.07 при Мордовском ордена Дружбы народов им. Н.П. Огарева (430000, г. Саранск, Большевистская, 68).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Мордовского государственного университета им. Н. П. Огарева.

Автореферат разослан иг&я 1998 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доцент

Р.' Шашанов

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1. Актуальность темы. Проблемы клеточной проницаемости и распределения веществ между клеткой и средой имеют непосредственное отношение к обмену веществ и представляют собой часть важнейшей общебиологической проблемы - взаимосвязи организма со средой. Данные, характеризующие проницаемость клеток, широко используются в различных областях биологии, медицины, ветеринарии, зоотехнии.

За последние десятилетия собран значительный материал по клеточной проницаемости, пассивному и активному транспорту ионов через плазматические мембраны, роли транспортных АТФ-аз в данных процессах (Бергельсон, 1982; Болдырев, 1982; Бреслер, Никифоров, 1983; Вишняков, 1988; Ткачук, 1990; Орлов, .1991; Halliwell et. al., 1986; Vasilets et. al., 1990).

В течение всей жизни между клеткой и средой поддерживается неравномерное распределение веществ. Как только клетка теряет способность управлять потоками продуктов питания, энергии и информации, она гибнет. Ситуация, при которой ионы калия самопроизвольно выходят из клетки, а ионы натрия, наоборот, поступают внутрь, при этом клетка теряет способность к жизнедеятельности. Кроме того клетке для обеспечения процессов обмена веществ необходимы сахара, липиды, аминокислоты, которые транспортируются в нее. за счет вторично-активного транспорта (Na - насос). Ионы Са2+, благодаря очень низкой концентрации в цитоплазме и высоких градиентов его на клеточных мембранах, играют ключевую роль в жизнедеятельности практически всех животных и растительных клеток (Левицкий, 1993).

Создание ионной' ассимметрии клетки обеспечивается активным транспортом Na+, К+, Са2+ и Н+. Этот процесс осуществляется специальными ферментными системами, а именно Na-K- и Са-АТФ-азами. Данные ферменты представляют собой весьма лабильные системы очень чувствительные к морфофункциональным изменениям клеток протекающим под воздействием внешних факторов.

В последние годы в медицине и ветеринарии применяют лазерную технику с целью патогенетического воздействия (Михайлов, 1982; Добровольский и соавт., 1996; Козлов, 1994, 1997; Киселева, 1995, 1997; Balguera et. al., 1986; Human et. al., 1990). Кроме

того, в литературе встречаются работы, в которых сообщается о неблагоприятном воздействии на организм монохроматического красного света с длиной волны 632, 8 нм даже при очень низких мощностях лазерных установок. Это вызывает необходимость решения ряда вопросов дозиметрии излучения гелий-неонового лазера.

Нейтрофильные гранулоциты интенсивно метаболизирующие клетки, поэтому для них важно поддерживать на определенном уровне электрогенный баланс. Возникающие в них реакции кратковременной адаптации представляют собой системы, для осуществления которых имеются готовые, вполне сформированные механизмы. Одними из таких механизмов являются Na-K- и Са-АТФ-азы. В связи с этим правомерна постановка вопроса о роли транспортных АТФ-аз в процессе облучения нейтрофильных гранулоцитов низкоинтенсивным гелий-неоновым лазером (НИГНЛ).

1.2. Цель и задачи исследования. Основной целью данной работы являлось изучение морфоцитохимии нейтрофильных гранулоцитов, а так же выяснение возможности влияния различных доз низкоинтенсивного лазерного излучения типа ЛГ - 78 на активность ионтранс-портирующих систем клеток.

Для выяснения поставленной цели были определены следующие задачи:

1. Изучить морфологию нейтрофильных гранулоцитов крупного рогатого скота на цитохимическом и электронно-микроскопическом уровне.

2. Выявить морфофункциональные показатели краткосрочной адаптации нейтрофильных гранулоцитов к воздействию низкоинтенсивного гелий-неонового лазера в опытах in vitro.

3. Изучить влияние различных экспозиций низкоинтенсивного гелий-неонового лазера на активность Na-K- и Са-АТФ-аз.

4. Исследовать влияние различных доз низкоинтенсивного гелий-неонового лазера на динамику морфофункциональных показателей нейтрофильных гранулоцитов при бронхо-пневмонии у телят.

Работа является самостоятельным разделом комплексной темы кафедры биохимии Мордовского госуниверситета им. Н.П. Огарева (номер регистрации 01870009146) и лаборатории электронной микроскопии.

1.3. Научная новизна. Впервые изучена динамика изменений электронно-микроскопических структур нейтрофильных гранулоцитов

крупного рогатого скота, фотомодифицированных излучением низкоинтенсивного гелий-неонового лазера.

Впервые показана динамика ионтранспортирующих ферментов Na-K- и Са-АТФ-аз в процессе фагоцитоза и лазерного облучения, носящая адаптивные или деструктивные изменения в зависимости от дозы облучения.

Впервые показаны морфофункциональные изменения в нейтрофиль-ных гранулоцитах при бронхо-пневмонии у телят, вызываемые воздействием излучения низкоинтенсивного гелий-неонового лазера. На основании анализа литературных материалов и собственных данных высказывается мнение, что глубина изменений, возникающих под влиянием НИГНЛ зависит от экспозиции облучения нейтрофильных гранулоцитов и их функционального состояния.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Низкоинтенсивный гелий-неоновый лазер вызывает изменения в активности Na-K- и Са-АТФ-аз, обеспечивающие поддержание гоме-остаза клеток, их ультраструктурную организацию в опытах in vitro.

2. Активность ионтранспортирующих систем зависит от стадий фагоцитоза: в стадии движения и адгезии, образования фаголизосом - увеличивается активность ионтранспортирующих АТФ-аз; в стадии килинга и деградации микроорганизмов активность Na-K-АТФ-азы и Са-АТФ-азы снижается.

3. Облучение низкоинтенсивным гелий-неоновым лазером при различных экспозициях, а так же так и в пострадиационный период неоднозначно влияет на активность Na-K- и Са-АТФ-аз. Стимулирующий эффект проявляется при экспозиции лазером 1, 5, 10 минут как в нейтрофилах полученных и облученных из крови здоровых животных, так и больных бронхо-пневмонией. 20-минутная экспозиция вызывает снижение активности Na-K- и Са-АТФ-аз, причем, в нейтрофильных 'гранулоцитах полученных из крови животных больных бронхо-пневмонией, отмечаются глубокие деструктивные изменения в ультраструктурной организации, приводящие к гибели до 30 % клеток.

4. Экспозиции лазером 1, 5, 10 минут стимулирующие активность Na-K- и Са-АТФ-аз сокращают время фагоцитоза до 60 - 90 минут. При 20-минутной экспозиции индекс незавершенности фагоци-

тоза снижается на 28 %.

1.4. Научно-практическая значимость работы. Полученные в настоящей работе электронно-микроскопические данные расширяют представления о структурных изменениях, возникающих в нейтро-фильных гранулоцитах под влиянием низкоинтенсивного гелий-неонового лазера.

Результаты исследования активности Na-K- и Са-АТФ-аз нейтро-фильных гранулоцитов необходимы'для характеристики морфофункцио-нальных изменений фагоцитарной активности для решения ряда вопросов дозиметрии излучения НИГНЛ.

Полученные данные могут использоваться в учебном процессе чтения курсов цитологии, молекулярной биологии, микробиологии, инфекционных заболеваний животных в разделах посвященных светолечению.

1.5. Реализация результатов исследования. Основные положения диссертации опубликованы в 11 научных работах, отчетах по заказ-наряду N 53/4-92 "Электромагнитные волны и регуляторные механизмы биомембран, ответственных за адаптационно-трофические реакции клеток".

Результаты исследований используются в учебном процессе со студентами ветеринарных и биологических факультетов в Мордовском государственном университете им. Н. П. Огарева, Мордовском государственном педагогическом институте им. М. Е. Евсевьева, Казанской государственной академии ветеринарной медицины, Российском Ордена Дружбы народов университете дружбы народов.

1.6. Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на: Первой Всероссийской научно-технической конференции с международным участием "Светоизлучающие системы. Эффективность' и применение" (г.Саранск, 1994); III конгрессе Международной ассоциации морфологов (г.Тверь, 1996); конференции молодых ученых и студентов МГУ (г.Саранск, 1997); ежегодных научно-практических конференциях Мордовского госуниверситета "Огаревские чтения" (г.Саранск, 1995, 1996, 1997).

1.7. Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 165 страницах машинописного текста и состоит из разделов: общая характеристика работы, обзор литературы, материал и методы исследования, результаты и обсуждения собственных исследований, выводы, практические предложения, библиографический

список, который включает 182 источника, в том числе 40 зарубежных. Работа иллюстрирована 8 таблицами, 62 рисунками.

2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Материалом исследования служила кровь крупного рогатого скота (к.p.c.), забранная в момент убоя из яремной вены животных на Саранском мясокомбинате ( порода - симментальская; возраст 2-3 года); кровь телят больных бронхо-пневмонией, полученная из яремной вены животных в учебном хозяйстве МГУ г. Саранска (возраст телят до 6 месяцев). В качестве антикоагулянта использовали 5 % раствор ЭДТА в соотношении 9:1. Всего обследована кровь от 20 здоровых животных и 10 телят больных бронхо-пневмонией.

Количество жизнеспособных клеток определяли при окраске три-пановым синим.

В зависимости от поставленных задач облучали лазером in vitro кровь крупного рогатого скота или суспензию лейкоцитов низкоинтенсивным гелий-неоновым лазером ,ЛГ - 78 (клиническая модификация - аппарат "Узор", мощностью 0,02 Вт), дающим монохроматический когерентный красный свет с длиной волны 632, 8 нм. Время облучения НИГНЛ составило 1, 5, 10, 20 минут. Период последействия длился 3 часа с интенвалом в 30 минут.

Контролем служила кровь или суспензия лейкоцитов, не подвергавшаяся воздействию лазерного излучения. В качестве активатора фагоцитов и дозированной бактериальной нагрузки использовали бактериальную взвесь золотистого стафилококка (Staphilococcus aureus) в концентрации 109 микробов/мл. Фагоцитарные показатели определяли на светооптическом уровне в мазках, окрашенных азур-эозином. Эксперименты по изучению влияния НИГНЛ проводили в 4-х сериях опытов: 1) облучение крови здоровых животных НИГНЛ; 2) облучение крови здоровых животных НИГНЛ с последующим засевом ее микроорганизмами; 3) облучение крови здоровых животных НИГНЛ с предварительным засевом микроорганизмами; 4) облучение крови животных НИГНЛ больных бронхо-пневмонией.

При помощи световой микроскопии определяли: жизнеспособность лейкоцитов по поглощению трипанового синего; активность Na-K- и Са-АТФ-азы определяли цитохимически по Wachstein и Me:i-

sel (1956) и по Padikula и Herman (1955). Количественное определение активности изучаемых ферментов проводили на микроденситометре "М-100". Результаты выражали в относительных единицах плотности. Биохимически активность ферментов определяли по М.Р. Прохоровой (1982), результаты выражали в нМоль Pi/1 мл/мин.

Фагоцитраную активность определяли с тест-культурой стафилококка по общепринятой методике. При анализе данных учитывался процент фагоцитирующих нейтрофилов - фагоцитарное число (ФЧ) по Гамбургеру; фагоцитарный индекс (ФИ) по Райту, которое вычисляли как общее количество захваченных микробов, деленное на число фагоцитирующих клеток, и индекс завершенности фагоцитоза по М. А. Фроловой (1972).

Для электронно-микроскопических исследований материал фиксировали в 3 % глутаровом альдегиде на 0,1 М фосфатном буфере в течение 12 часов. После дофиксации в 1 % осмиевой кислоте и обезвоживании в спиртах и ацетоне проводили заливку в эпон-арал-дит по общепринятым методикам. Ультратонкие срезы получали на ультрамикротоме Ultracut и контрастировали цитратом свинца и уранилацетатом. Полученный материал просматривали в электронный микроскоп ЭМ - 125.

Статистическая обработка результатов проведена на ЭВМ - 486. Достоверность оценивалась с использованием t-критерия Стьюдента.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ ДАННЫХ

3.1. Морфофункциональные показатели адаптации нейтрофильных гранулоцитов к воздействию НИГНЛ

Проведенные нами гистологические, гистохимические, электронно-микроскопические и биохимические исследования нейтрофильных гранулоцитов крупного рогатого скота на мазках и клетках крови, позволили дать комплексную морфофункциональную оценку влияния НИГНЛ на их ионтранспортирующую систему и ее роли в поддержании электролитного баланса клеток.

На гистологических препаратах, окрашенных азур-эозином лейкоциты по отношению к красителю делятся на 3 вида (нейтрофиль-ные, эозинофильные и базофильные).

Ультраструктуру клеток, ведущих к образованию нейтрофильных лейкоцитов, их дифференцировку и различные стадии развития подробно изучали как отечественные так и зарубежные ученые (Покровский, Тутельян, 1976; Киселева, Мельникова, Федотова, 1994; Bainton et al., 1975 -1981; Baggiolini, Dewal, 1984; Kobayashi et al., 1991) На ультраструктурном уровне выявлены новые критерии для четкого определения степени зрелости нейтрофильного лейкоцита и, в известной степени его функциональной активности.

Поступившие в кровоток зрелые нейтрофильные лейкоциты при анализе электронограмм содержат значительное число гранул (50 -200) различного вида и размеров. Ферментативный состав гранул имеет строго определенный спектр действия и достаточен для деградации многих поглощенных веществ и частиц (Пигаревский, 1982; Федотова, 1995).

Общие запасы гликогена, который может быть использован в гликолизе, дает возможность нейтрофилам функционировать в аэробных и анаэробных условиях. На электронограммах гранулы гликогена локализуются около скоплений митохондрий и в участках активных цитоплазматических выростов - псевдоподий. И как показали наши исследования, по интенсивности отложения продуктов гистохимической реакции на Na-K- и Са-АТФ-азы нейтрофильные гранулоциты также делятся на 3 пула: клетки с высокой, средней и низкой активностью ферментов.

Активность Ма-К-АТФ-азы, являющаяся маркерным ферментом плазматических мембран, под влиянием НИГНЛ возрастает при экспозиции 1, 5, 10 минут от 150 ± 0,20 до 161 ± 0,03 отн. ед. пл. При 20-минутной экспозиции НИГНЛ активность фермента снижается до 98 % к уровню контроля. Следует отметить, что активность гистохимической реакции в нейтрофильных лейкоцитах вариабельна. Гранулы окрашиваются от бледно-золотисто-желтого до темно-коричневого цвета, поэтому более точную информацию о суммарной активности изучаемых ферментов мы получили в результате биохимического анализа суспензии клеток. Наибольшую активность нейтрофилы проявляют через 30, 60 и 120 минут после 1, 5 и 10 минутных экспозициях. Несмотря на то что фагоцитирующая клетка непрерывно "поедает" свою мембрану с одного конца и наращивает ее с другого, и одновременное функционирование экзо- и эндоцитоза, позволяющее обновлять плазматическую мембрану нейтрофильного грануло-

цита (Глебов, 1987). Происходит это за счет усиления синтеза Na-K-АТФ-азы в мембранах зпр, олигомер фермента формируется в аппарате Гольджи, ' от цистерн которого отделяются везикулы, содержащие Na-K-АТФ-азу. Эти везикулы сливаются с плазмалеммой, в которую они встраиваются (Болдырев, 1985; Вишняков, 1988), на все эти процессы необходима энергия. При 20-минутной экспозиции активность Na-K-АТФ-азы растет до 60 минут, а затем резко снижается. Это объясняется изменением микровязкости биомембран при 20-минутной экспозиции, обводнением цитоплазмы, накоплением в ней ионов Na+ и выходом ионов К+ из клетки во внеклеточную среду.

Повышение активности Na-K-АТФ-азы в первые 30 - 60 минут после облучения связаны с тем, что НИГНЛ обладая мембранотропным эффектом вызывает изменение микровязкости липидного бислоя в сторону его уменьшения, что способствует повышению активности мембраносвязанных ферментов. Регуляцию мембранной проницаемости следует рассматривать как центральный фактор обеспечивающий сохранение ионного баланса. Чтобы избежать набухания и разрыва мембран, Na-K-Hacoc откачивает ионы путем активного транспорта. В этом случае именно Na-K-, Ca-, Mg-АТФ-азы поддерживают сбалансирование ионных токов (Сох, Comte, Stein, 1982). Метаболическая энергия для работы насосов генерируется в нейтрофильных'Грануло-цитах, получаемая аэробным и анаэробным путем, и ее затраты могут достигать значительных размеров (до 40 %). Кроме того, особенно следует отметить, что Na+ и К+ участвуют в генерации биопотенциалов, а это важно при начальной стадии (хемотаксиса), поддержании водного баланса и распределении воды в клетке, обеспечении нормального осмотического давления, в регуляции кислотно-щелочного равновесия (Трошин, 1985; Вишняков, 1988). Существенным моментом является участие Na+ и во вторично-активном транспорте (Ма-зависимом) Сахаров и аминокислот.

В процессе исследований было выявлено изменение в морфофунк-циональных показателях нейтрофильных гранулоцитов под влиянием различных экспозиций НИГНЛ, а также в период последействия.

Облучение суспензии лейкоцитов НИГНЛ при экспозиции 1 минуты не вызывало существенных изменений в их ультраструктурной организации. Однако специфические признаки, присущие процессу активации нейтрофилов.были обнаружены. ' Это, прежде всего, изменение плазматической мембраны, характеризующееся увеличением микровы-

- И -

ростов. Изменения в составе хроматина: гетерохроматин десперги-руется, эухроматин занимает всю центральную часть ядра и в отдельных участках прилежит к кариолемме. Азурофильные и специфические гранулы, которые хорошо выявляются при электронно-микроскопических исследования, занимают большую часть цитоплазмы. Гранулы гликогена располагаются отдельными группами. Отмечается частичное набухание митохондрий.

С функциональной точки зрения фагоциты могут находиться в двух состояниях - покоя и активном (Адо, Маянский, 1993). Если до облучения в активном состоянии фагоциты составляли - 14,0 %, то после облучения их количество резко возрастает.

Нами показана различная чувствительность Na-K- и Са-АТФ-аз ко времени воздействия лазерного излучения. В контроле активность Na-K- и Са-АТФ-аз составила 17,13 ± 0,12 и 18,45 + 0,41 нМоль Pi мл/мин, но уже при 1-минутном воздействии активность ферментов возрастала и составила 119 % и 125 % к уровню контроля соответственно. Далее с увеличением времени экспозиции до 5 минут наблюдалось возрастание активности до 128 % для Na-K-АТФ-азы и до 141 % для Са-АТФ-азы (р < 0,05).

При изучении времени последействия активность мембраносвя-занных ферментов продолжает расти и максимум ее составляет к 60 минутам 5-минутного облучения для Na-K-АТФ-азы 143 % , 156 % для Са-АТФ-азы к уровню контроля. Большая доза облучения, такая как 20 минут приводит' к подавлению активности ферментов и к третьему часу после облучения она составляет для Na-K-АТФ-азы -59 %, а для Са- АТФ-азы - 68 % от уровня контроля (р < 0,05).

3. 2. Влияние НИГНЛ на функциональную активность нейтрофильных гранулоцитов "

Функциональную активность нейтрофильных гранулоцитов изучали в опытах in vitro. В качестве активатора нейтрофилов и дозированной бактериальной нагрузки использовали бактериальную взвесь стафилококка (Staphilococcus aureus). Проведенные нами исследо-. вания показали, что около 44,0 % нейтрофилов крови здоровых животных при подсчете их фагоцитарной способности (ФЧ 48,0 ± 0,21) остаются функционально инертными несмотря на воздействие бактериальных клеток.

У функционально инертных нейтрофильных гранулоцитов на электронограммах мы не обнаружили морфологических признаков мембранной активности. Цитоплазма их насыщена равномерно распределенными органеллами, хорошо дифференцирующимися между собой азурофильными и специфическими гранулами. Ядро окружено четко прослеживающейся двухконтурной мембраной. Такие клетки не содержат бакатериальных тел. Подобные клетки встречаются в основном у здоровых животных. Активность Na-K- и Са-АТФ-аз у них колеблется на уровне 17,13 ± 0,12 и 18,45 ± 0,41 нМоль Pi мл/мин (р < 0,05). Во вторую группу, которая включала от 32 до 38 %, были отнесены клетки с умеренно выраженной мембранной активностью.

В третью группу, составляющую 13 - 20 % отнесли клетки, у которых ярко выражены морфологические признаки реактивных изменений со стороны плазматической мембраны, т. е. клетки которые имеют большое число тонких, длинных, часто ветвящихся выростов, проявляющих наибольшую ферментативную активность при постановке реакции на Na-K- и Са-АТФ-азы.

Цитохимически установлено, что в начальной фазе фагоцитоза происходит повышение активности Na-K- и Са-АТФ-аз. Na-K-АТФ-аза увеличивается на 20 % , Са-АТФ-аза на 32 % (р < 0,05). По мере усиления фрагментации бактерий, усиления обводнения цитоплазмы происходит снижение активности изучаемых АТФ-аз. При активации комплемента по альтернативному пути после расщепления СЗ образуется С5а и мембраноатакующий комплекс (МАК), формирующий трансмембранный канал, полностью проницаемый для электролитов и воды (Петров, 1982; Ройт, 1991). За счет высокого коллоидно-осмотического' давления внутри клетки в нее поступают ионы Na+ и воды, что и приводит к лизису. Однако, система комплемента малоэффективна в отношении лизиса мембран аутологичных клеток. Скорее всего это происходит из-за изменения текучести мембран, ионы Na+ и молекулы воды проникают в цитоплазму, а ионы К+ выходят из цитоплазмы; это и приводит к лизису клеток.

Обнаруженные сдвиги активности исследуемых ферментов представляются целенаправленными с общебиологических позиций, так как более согласованный и высокий уровень активности отдельных ферментов энергообеспечения повышает общую жизнеспособность клеток. Снижение активности Na-K-АТФ-эзы связано со снижением энергоресурсов в клетке, с ее обводнением, в связи с чем наблюдали сни-

жение количества жизнеспособных клеток в конце фагоцитоза.

Для выяснения влияния НИГНЛ на фаготарную активность лейкоциты в начале облучали НИГНЛ, а затем засевали стафилококком. Фагоцитарную способность лейкоцитов оценивали по Гамбургеру и Райту.

Отмечено, что стимулирующие эффекты лазерного излучения проявляются в узком интервале падающих доз, которые затем, при дальнейшем увеличении дозы облучения, исчезают и даже сменяются фазой угнетения, заканчивающейся в ряде случаев гибелью клетки. При облучении лейкоцитов лазером в течении 1 минуты фагоцитарная активность составила 136 % (ФЧ) и 119 % (ФИ). При 5 мин. экспозиции фагоцитарная активность достигает максимальных значений и составляет 171 % (ФЧ) и 145 % (ФИ) при р < 0,05 к уровню контроля, в пострадиационный период через 60 мин. после облучения эти показатели достигли 188 % (ФЧ) и 161 % (ФИ) при р < 0,05.

На электронно-микроскопическом уровне особенно четко заметно стимулирующее действие НИГНЛ на процесс фагоцитоза. В зависимости от дозы облучения усиливается процесс образования первичных фагосом. Нейтрофильные гранулоциты выбрасывают цитоплазматичес-кие отростки. Особенностью контакта между фагоцитом и бактерией является наличие зоны повышенной цитоплазматической плотности. Растет активность мембраносвязанных ферментов, ответственных за содержание электролитного баланса, активный транспорт Сахаров и аминокислот. При 5-минутной экспозиции активность Иа-К-АТФ-азы достигает 142 %, а Са-АТФ-азы - 151 % к уровню контроля, а через 60 минут возрастает до 160 % и 167 % (р < 0,05) соответственно. В отдельных клетках имеются вакуоли различных размеров. При 10 минутном облучении у нейтрофилов отчетливо видно изменение плазматической мембраны. Микровыросты образуют тонкие, вытянутые, часто разветвляющиеся структуры, характерные для активированных клеток. При этом активность Са-АТФ-азы достигает максимума к 60 минутам и составляет 153 % от уровня контроля. Со стороны ядерных структур особых изменений не наблюдается. В цитоплазме отчетливо видна частичная дегрануляция азурофильных и специфических гарнул. Часть таких гранул концентрируется около плазмалеммы или небольших вакуолей, заполненных хлопьевидным содержимым. Гранулы гликогена выявляются в меньшей степени и расположены они диффузно. Митохондрии увеличены в размерах. 20-минутная экспози-

ция характеризуется деструкцией крист, появлением большого числа фагосом содержащих большое количество воды и хлопьевидного материала. Активность Na-K- и Са-АТФ-аз падает.

В серии опытов по изучению влияния различных доз НИГНЛ на уже фагоцитирующие клетки возбуждение фагоцитов происходило по типу субактивации, т. к. золотистый стафилококк уже вызвал у ряда клеток процесс активации. Поэтому стимулирование НИГНЛ фагоцитирующих клеток сходно с феноменом "праймирования" (Маянский, 1995), и привлекает внимание в связи с фагоцитотропным потенции-рующим действием НИГНЛ.

■ После облучения крови in vitro в течении 1 минуты происходит увеличение процента фагоцитоза на 147 % (р < 0,05) по сравнению с необлученными нейтрофильными гранулоцитами. Фагоцитарный индекс достигает 4,9 ± 0,20 бактерий на каждую клетку. Рост фагоцитарной активности особенно характерен для 5- и 10-минутного облучения и составляет 180 % и 167 % к уровню контроля (р < 0,05). Максимум фагоцитарной активности приходится к 60 минутам 5-минутного облучения, которая достигает 196 % по отношению к контролю (р < 0,05).

Также наблюдается и .рост активности мембраносвязанных ферментов. Наибольшая активность регистрируется при 5-минутном облучении. Для Иа-К-АТФ-азы активность составляет 159 %, а для Са-АТФ-азы - 164 %. Что касается времени последействия, то максимум активности приходится на 60 минут после 5-минутного облучения и сотавляет для Иа-К-АТФ-азы 176 %, для Са-АТФ-азы 181 % при р < 0,05. 20-минутное облучение вызывает снижение активности Иа-К-АТФ-азы и Са-АТФ-азы - цитоплазма обводняется, и, как следствие, снижается концентрация лизосомальных ферментов в фа-голизосомах. Поэтому снижается переваривающая способность нейт-рофильных гранулоцитов, о чем свидетельствует уменьшение индекса переваривания на 28 %.

&. 3. Влияние НИГНЛ на функциональную активность нейтрофильных гранулоцитов крови телят при бронхо-пневмонии

Широкое распространение получило применение низкоинтенсивного лазерного излучения, которое в зависимости от спектрального состава, дозы, мощности и других условий используется в медицине

и ветеринарии при лечении ряда воспалительных заболеваний в связи с явно выраженным положительным эффектом (Михайлов, 1985; Вишняков 1987; Панько и соавт. ,1987; Добровольский и со-авт.,1996).

Нами были проведены модельные опыты на крови телят по изучению биологического действия НИГНЛ на активность Na-K- и Са-АТФ-азы нейтрофильных гранулоцитов при развитии бронхо-пнев-монии. Показатели функциональной активности фагоцитирующих клеток изучали в режиме различных экспозиций облучения in vitro НИГНЛ в течении 1, 5, 10 и 20 минут, с последующим изучением активности ионтранспортирующих ферментов в течении 3-х часов с интервалом 30 минут.

Фагоцитарную способность клеток изучали в тесте с золотистым стафилококком. Расчитывали фагоцитарное число, а так же фагоцитарный индекс. У контрольной группы практически здоровых телят эти показатели составляли: ФЧ - 47 %, ФИ - 3, 7 микробных тел. У телят наблюдалось пониженное содержание лейкоцитов в крови.

При электронно-микроскопических исследованиях в начале развития бронхо-пневмонии лейкоциты находились в различных функциональных состояниях, связанных с процессом фагоцитоза и имели различные стадии активации.

Наибольшей фагоцитарной активностью обладали нейтрофилы при 5- и 10-минутной экспозиции, с максимумом на 60 минут после облучения ФЧ достигает 81 % прироста, а ФИ - 78 % при 5-минутной экспозиции. При 10-минутной экспозиции в этот же промежуток времени ФЧ увеличивается на 92 %, а ФИ на 83 % к уровню контроля (р < 0,05). После 20-минутной экспозиции резко снижаются эти показатели, и, к 3 часам они ниже уровня контроля ФЧ - на 17 % , а ФИ - на 25 % (р < 0,05).

У больных животных после облучения НИГНЛ в течении 5 минут индекс фагоцитарной активности вырос на 90 %, а при 10-минутной экспозиции на 99 %, по отношению к контролю, а ФЧ, соответственно, увеличилось на 84 % и 95 %. При 20-минутной экспозиции наблюдается некоторый рост фагоцитарной активности, однако к 3 часу он так же ниже уровня контроля ФЧ на 28 % и 31 % (р < 0,05), кроме того отмечается снижение индекса переваривания до 67 %.

Активность Na-K-АТФ-азы при 5- и 10-минутной экспозиции растет почти в 2 раза до 60 минут, а затем снижается от 5 % до

18 %. 20-минутная экспозиция вызывает снижение Иа-К-АТФ-азной активности на 30 % и Са-АТФ-азы на 39 % (р < 0,05).

Таким образом, НИГНЛ облучение с экспозицией в 1, 5, 10 минут оказало положительный эффект на активность ионтранспортирую-щие ферменты, обеспечивающие ускорение процессов фагоцитоза, что особенно важно в начальный период заболевания.

ВЫВОДЫ

1. Гистохимическими и электронно-микроскопическими исследованиями крови крупного рогатого скота выявлено три типа клеток нейтрофильных гранулоцитов: высокоактивные, среднеактивные, неактивные.

2. Активность ионтранспортирующих ферментов Ма-К- и Са-АТФ-аз отражает морфофункциональное состояние фагоцитирующих нейтрофилов и зависит от стадии фагоцитоза.

3. Активность Ма-К- и Са-АТФ-аз носит дозозависимый характер. Экспозиции облучения лазером 1, 5, 10 минут увеличивают активность и Са-АТФ-аз, 20-минутная экспозиция снижает активность.

4. Под влиянием низкоинтенсивного гелий-неонового лазера происходит изменение морфоцитохимических показателей нейтрофилов, с усилением процесса фагоцитоза в отдельных его стадиях, особенно в стадии образования фаголизосом и деградации. При экспозиции облучения лазером 5, 10 минут процесс переваривания микроорганизмов длится от 60 до 90 минут, при этом индекс переваривания возрастает на 53 % и 33 % соответственно (р< 0,05). 20-минутная экспозиция низкоинтенсивного гелий-неонового лазера приводит к снижению активности Ма-К- и Са-АТФ-аз и понижению индекса переваривания на 28 %.

5. При бронхо-пневмонии у телят активность фагоцитоза возрастает после облучения НИГНЛ и носит бифазный характер. Дозы экспозиций облучения лазером 5, 10 мин. повышают активность фагоцитоза ФЧ - 84 % и 95 %, ФИ - 90 % и 99 % соответственно (р < 0,05). 20-минутная экспозиция низкоинтенсивного гелий-неонового лазера снижает фагоцитарную активность до 46 %. Ионтранспор-тирующие ферменты отражают функциональную напряженность нейтрофильных гранулоцитов.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Материалы исследования Na-K- и Са-АТФ-аз нейтрофильных гранулоцитов необходимы для характеристики морфофункциональных изменений фагоцитарной активности для решения ряда вопросов дозиметрии излучения низкоинтенсивного гелий-неонового лазера.

2. Полученные электронно-микроскопические .данные расширяют представления о структурных изменениях, возникающих в нейтрофильных гранулоцитах под влиянием низкоинтенсивного гелий-неонового лазера.

3. Материалы могут использоваться в учебном процессе чтения куросов цитологии, молекулярной биологии, микробиологии, инфекционных заболеваний животных в разделах посвященных светолечению.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Киселева Р. Е., Федотова Г.Г., Ляпина С.А., Шубина 0.С., Дубасова С. В., Кулясова Л. М. Гистохимические исследования фото-модифицированных лейкоцитов //Светоизлучающие системы. Эффективность и применение: Тез. I Всерос. научно-техн. конф. с междун. участием,- Саранск, 1994.- С. 66-67.

2. Киселева P.E.,- Ляпина С. А., Федотова Г. Г., Мельникова Н.А., Дубасова С. В., Степаненко И. А. Динамика активности мембра-носвязанных ферментов в фотомодифицированных клетках крови //Светоизлучающие системы. Эффективность и применение: Тез. I Всерос. научно-техн. конф. с междун. участием. - Саранск, 1994,-С. 68 - 69.

3. Ляпина С. А., Русакова Н. В. Влияние различных доз низкоэнергетического гелий-неонового лазера на активность N-K- и Са-АТФ-аз //XXIV Огаревские чтения: Тез. докл. науч. конференции. Ч. 2,- Саранск, 1995,- С. 27 - 28.

. 4. Киселева Р.Е., Кузьмичева Л. В., Ляпина С. А., Шубина 0. С., Мельникова H.A., .Федотова Г.Г. Использование низкоэнергетического гелий-неонового лазера для селективного облучения форменных элементов крови //III Конгресс Международной ассоциации морфологов: Тез. докл.- Санкт-Петербург, 1996.-С. 59.

5. Киселева Р.Е.. Федотова Г.Г.. Ляпина С. А., Шубина 0. С. ,

Юдина 0. М. Изменение ферментативных реакций нейтрофилов под влиянием гелий-неонового лазера //Актуальные вопросы комбустиоло-гии, реаниматологии и экстремальной медицины: Тез. докл. рес-публ. научно-практ. конф. - Саранск, 1996,- С. 265 - 266.

6. Киселева Р.Е., Кузьмичева Л. В., Федотова Г. Г., Шубина 0.С., Ляпина С.А., Юдина 0. М. Изменение морфофункционального состояния форменных элементов крови под воздействием гелий-неонового лазера //Новые направления лазерной медицины: Мат. Меж-дунар. конф,- Москва, 1996,- С. 311 - 312.

7. Федотова Г. Г., Киселева P.E., Юдина 0.М., Ляпина С.А., Шубина. Особенности метаболизма форменных элементов крови после облучения низкоэнергетическим гелий-неоновым лазером //Вопросы медико-биологических наук: Сб. статей по мат. науной конф. "XXXII Евсевьевские чтения".- Саранск, 1996,- С. 60 - 64.

8. Ляпина С. А., Шубина М. А., Патякина Н. А. Функциональные изменения мембраносвязанных ферментов при стимуляции различными дозами облучения низкоэнергетическим гелий-неоновым лазером: Тез. докл. Второй конф. молодых ученых МГУ им. Н. П. Огарева.-Саранск, 1997,- С. 234.

9. Ляпина С.А., Киселева Р. Е., Федотова Г. Г., Шашанов И. Р., Шубина М.А. Изменение активности Na-K-АТФ-азы в фагоцитах стимулированных НИГНЛ //Светоизлучающие системы. Эффективность и применение: Сб. науч. трудов Второй Всерос. научно-техн. конф. "Человек и свет",- Саранск, 1997,- С. 101.

10. Федотова Г. Г., Ляпина С.А., Юдина 0. М. Взаимодействие между•процессом фагоцитоза и стимуляцией низкоэнергетическим гелий-неоновым лазером (НЭГНЛ) //Светоизлучающие системы. Эффективность и применение: Сб. науч. трудов Второй Всерос. научно-техн. конф. "Человек и свет".- Саранск, 1997.-С. 105.

11. Киселева Р. Е., Ляпина С. А., Патякина H.A. Влияние низкоинтенсивного гелий-неонового лазера на активность Са-АТФ-азы в нейтрофильных гранулоцитах //Светоизлучающие системы. Эффектив-.ность и применение: Сб. науч. трудов Второй Всерос. научно-техн. конф. "Человек и свет".- Саранск, 1997,- С. 106.