Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему:Значение взаимодействия между рецепторами эстрогенов и белком Snail1 в развитии гормональной резистентности рака молочной железы

АНДРЕЕВА ОЛЬГА ЕВГЕНЬЕВНА

ЗНАЧЕНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ МЕЖДУ РЕЦЕПТОРАМИ ЭСТРОГЕНОВ И БЕЛКОМ вЛАПЛ В РАЗВИТИИ ГОРМОНАЛЬНОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

Специальность 14.01.12-онкология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

21 НОЯ 2013

005539362

Москва-2013

005539362

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Российский онкологический научный центр имени H.H. Блохина» Российской академии медицинских наук

(директор - д.м.н., проф., академик РАН и РАМН М. И. Давыдов) Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Красильников Михаил Александрович Официальные оппоненты:

Герштейн Елена Сергеевна — доктор биологических наук, профессор, ведущий научный сотрудник лаборатории клинической биохимии Научно-исследовательского института Клинической онкологии Федерального государственного бюджетного учреждения «Российский онкологический научный центр имени Н. Н. Блохина» Российской академии медицинских наук;

Немцова Марина Вячеславовна - доктор биологических наук, профессор, ведущий научный сотрудник лаборатории эпигенетики Федерального государственного бюджетного учреждения «Медико-генетический научный центр» Российской академии медицинских наук;

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт онкологии имени H.H. Петрова" Министерства Здравоохранения Российской Федерации

Защита диссертации состоится «г/» к&я/Гр^( 2013 года в часов на заседании диссертационного совета Д 001.017.02 Федерального государственного бюджетного учреждения «Российский онкологический научный центр имени H.H. Блохина» Российской академии медицинских наук по адресу: 115478, Москва, Каширское шоссе, 23.

С текстом диссертации можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН (115478, Москва, Каширское шоссе, 24)

Г\

Автореферат разослан «/£» 2013 года.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук, профессор ___

Барсуков Юрий Андреевич

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Рак молочной железы (РМЖ) является одним из самых распространенных онкологических заболеваний; основными характеристиками, определяющими прогноз и перспективность его лечения, являются гормональный статус опухоли и ее способность пролиферировать в отсутствие эстрадиола. Для подавления митогенных сигнальных каскадов рецепторов эстрогенов (РЭ) используются антиэстрогены, в частности, тамоксифен, однако во многих случаях при его продолжительном применении клетки опухоли теряют чувствительность к его антипролиферативному эффекту в результате развития гормональной резистентности. Изучение природы механизмов, которые приводят к снижению гормональной зависимости клеток РМЖ, относится к числу важнейших задач современной онкологии и является необходимым условием повышения эффективности гормональной терапии для лечения этого заболевания.

В ряде случаев в процессе развития резистентности неопластические клетки приобретают некоторые черты мезенхималыюй организации на фоне пониженной экспрессии эпителиальных маркеров (в частности, белка межклеточной адгезии Е-кадхерина) и повышенного содержания продуктов мезенхимальных генов (фактор транскрипции Snail 1, N-кадхерин и др.), для них также характерно увеличение подвижности и инвазивности. Развитие подобных признаков характерно для клеток, прошедших через эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМП). Этот процесс представляет собой последовательность фенотипических и морфологических изменений клеток эпителиального происхождения, которые, в итоге, утрачивают межклеточные контакты и приобретают подвижность. В норме ЭМП служит для закладки тканей и органов, участвует в заживлении ран, однако играет большую роль и в опухолевой прогрессии, в частности, при формировании метастазов.

Современные клинические исследования свидетельствуют о том, что в образцах наиболее агрессивных опухолей молочной железы достаточно часто наблюдается повышение экспрессии мезенхимальных маркеров, наряду с другими признаками эпителиально-мезенхимального перехода, причем особенно часто эти изменения касаются клеток гормон-резистентных опухолей, утративших

экспрессию РЭ. Причины этой корреляции и особенности взаимного влияния РЭ и транскрипционного фактора Snail 1, основного регулятора ЭМП, изучены недостаточно. По данным некоторых исследователей, Snail 1 может являться одним из репрессоров РЭ, при этом данные о влиянии РЭ на его активность весьма противоречивы. Некоторые исследователи предполагают, что Snail 1 находится под негативным контролем со стороны РЭ, в других публикациях приводятся сведения о РЭ-опосредованной активации Snaill. В итоге, несмотря на интерес к этой проблеме и большое количество работ, посвященных ее изучению, ключевые вопросы о роли ЭМП в канцерогенезе РМЖ и об участии Snaill в развитии гормональной резистентности РМЖ по-прежнему остаются открытыми.

Цель и задачи исследования Целью данной работы было изучение роли белка Snaill в развитии гормональной резистентности и в поддержании эстроген-независимого роста клеток рака молочной железы человека.

Для достижения цели был сформулирован ряд задач:

1. Исследование активности Snaill-сигнального пути в клетках РМЖ при развитии гормональной резистентности:

• сравнительный анализ экспрессии Snaill, Е-кадхерина и N-кадхерина в клетках гормон-чувствительных и резистентных линий РМЖ;

• определение транс-репрессорной активности Snaill и исследование предполагаемой корреляции между активностью Snaill-сигнального пути и гормональной зависимостью клеток.

2. Изучение участия Snaill в негативной регуляции рецепторов эстрогенов:

• определение влияния Snaill на транскрипционную активность и экспрессию РЭ в клетках РМЖ;

• определение уровня гормональной чувствительности клеток РМЖ при гиперэкспрессии /подавлении Snaill;

3. Исследование механизма регуляции Snaill при развитии гормональной резистентности:

• изучение влияния РЭ на активность Snail 1 в клетках РМЖ;

• определение роли NF-kB в позитивной регуляции Snaill;

• исследование влияния NF-kB на активность РЭ и уровень гормональной чувствительности клеток РМЖ. 4. Изучение возможных подходов к подавлению ЭМП и увеличению гормональной зависимости клеток резистентного рака молочной железы.

Научная новизна и практическая значимость исследования В работе впервые был проведен сравнительный анализ изменений экспрессии Snaill и некоторых из эффекторов/регуляторов Snail 1 (Е-кадхерина, РЭ, NF-kB) при развитии гормональной резистентности в клетках РМЖ; исследован механизм взаимодействия между компонентами Snaill-сигнального пути и гормональным аппаратом клетки. Продемонстрировано повышение экспрессии и активности Snaill по мере снижения экспрессии и функциональной активности рецептора эстрогенов в клетках рака молочной железы. Установлено, что активность рецептора эстрогенов находится под негативным контролем со стороны Snaill. Полученные нами данные показали, что подавление Snaill с помощью РНК-интерференции приводит к заметному усилению гормональной зависимости клеток, что позволяет рассматривать Snaill как один из факторов, определяющих развитие гормональной резистентности клеток. Получены доказательства участия NF-kB-сигнального пути в поддержании высокого уровня Snaill в резистентных клетках, а также в негативной регуляции аппарата рецептора эстрогенов.

В целом, полученные данные позволяют рассматривать NF-kB и Snaill в качестве перспективных объектов таргетной терапии резистентных форм рака молочной железы, подавление активности которых может как частично восстановить чувствительность опухолевых клеток к гормонам, так и увеличить чувствительность опухолей к химиопрепаратам.

Публикации и апробация работы Диссертация апробирована и рекомендована к защите 25 октября 2012 года на совместной научной конференции лабораторий молекулярной эндокринологии, механизмов прогрессии эпителиальных опухолей, механизмов химического канцерогенеза, цитогенетики, регуляции клеточных и вирусных онкогенов НИИ Канцерогенеза ФГБУ «РОНЦ им. H.H. Блохина» РАМН. Материалы работы докладывались на конференциях; по результатам диссертационной работы

опубликовано 5 научных статей; также они представлены в трех сборниках тезисов докладов.

Структура и объём диссертации

Диссертация изложена на 149 страницах машинописного текста, содержит 31 рисунок. Состоит из глав: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение результатов», «Заключение», «Выводы», «Список литературы». Список литературы содержит 196 источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Обзор литературы.

Первая часть обзора литературы посвящена современным представлениям об организации эстрогенового сигналинга и основных причинах снижения гормональной зависимости рака молочной железы; во второй части рассматриваются причины, следствия и этапы эпителиально-мезенхимального перехода, принципы его регуляции в эмбриогенезе и в опухолевой прогрессии, а также свойства и функции основного регулятора ЭМП - белка Snail 1. В третьей части представлен обзор работ, связанных с изучением возможного влияния Snail 1 на функциональную активность рецептора эстрогенов, и современные представления о вероятных механизмах взаимной регуляции этих сигнальных каскадов.

Материалы и методы

В работе использованы следующие методы исследования: работа с клеточными культурами, получение эстроген-резистентной линии MCF-7/LS посредством длительного культивирования MCF-7 в бесстероидной среде, трансформация и выделение плазмидной ДНК, гибридизация и транзиторная трансфекция коротких интерферирующих РНК, экспрессионных и репортерных плазмид, определение транскрипционной активности методом репортерного анализа, определение эффективности трансфекции методом измерения активности Р-галактозидазы, определение скорости роста клеток с помощью стандартного МТТ-теста, оценка изменения выживаемости клеток методом проточной цитофлуориметрии после окраски йодистым пропидием, электрофорез нуклеиновых кислот, SDS-электрофорез белков в полиакриламидном геле,

определение уровня белков методом иммуноблотгинга, а также статистическая обработка полученных данных.

Результаты исследования и их обсуждение

В основных экспериментах были использованы следующие культуры клеток рака молочной железы:

- РЭ-негативная эстроген-резистентная линия HBL-100;

- РЭ-позитивная эстроген-зависимая линия MCF-7;

- РЭ-позитивная эстроген-независимая сублиния MCF-7/LS, полученная из клеток родительской линии MCF-7.

Как известно, длительное отсутствие эстрадиола является одним из факторов, стимулирующих развитие эстроген-независимого фенотипа клеток рака молочной железы. В условиях in vitro эффект отсутствия эстрогенов достигается культивированием клеток в специальной бесстероидной среде, приготовленной без красителя фенолового красного (соединения, обладающего эстрогеноподобной активностью) и содержащей вместо стандартной эмбриональной сыворотки сыворотку, очищенную от стероидных соединений путем обработки покрытым декстраном активированным углем. По сравнению с MCF-7, клетки MCF-7/LS отличались низкой чувствительностью к пролиферативному действию эстрадиола и относительно более высокой скоростью роста в бесстероидной среде.

1. Экспрессия и активность Snaill в клетках эстроген-зависимых и резистентных линий РМЖ

Целью первой части работы было исследование экспрессии Snaill, основного белка эпителиально-мезенхимального перехода, в клеточных линиях с различным уровнем гормональной зависимости методом иммуноблоттинга. Полученные результаты (рис. 1) показали, что в клетках линий MCF-7 и MCF-7/LS экспрессия как Snaill, так и Е-кадхерина поддерживается на умеренном уровне. Стоит отметить, что в клетках РЭ-позитивной эстроген-независимой сублинии MCF-7/LS уровень Snaill был несколько выше, а содержание Е-кадхерина, соответственно, ниже, по сравнению с клетками родительской линии. При этом экспрессия мезенхимапьного маркера N-кадхерина в РЭ-позитивных клеточных линиях РМЖ практически отсутствовала (см. рис. 16), однако в клетках гормон-

независимой линии HBL-100 при фактическом отсутствии синтеза РЭ и Е-кадхерина был зафиксирован высокий уровень экспрессии N-кадхерина и Snail 1.

а

б

-Snaill

Е-кадхерин

РЭ

N-кадхерин

актин

Рисунок 1. Содержание белков Snaill, РЭ (а), Е-кадхерина и N-кадхерина (б) в клетках MCF-7, MCF-7/LS и HBL-100. Результаты иммуноблоттинга. "

По литературным данным, повышение содержания N-кадхерина (в эпителиальных клетках этот белок отсутствует) наблюдается в 87,8% инвазивных карцином, утративших экспрессию Е-кадхерина. Подобное «переключение» кадхеринов («Cadherin switch») считается классическим проявлением ЭМП, а потеря функционального Е-кадхерина является его начальным этапом.

Для определения трансрепрессорной активности Snaill (т.е. его активности в качестве транскрипционного репрессора) в клетки MCF-7, MCF-7/LS и HBL-100 трансфицировали репортерную плазмиду, содержавшую ген люциферазы светлячка под контролем Snaill-чувствительного промотора Е-кадхерина; активность люциферазы в клеточных лизатах определяли по стандартному протоколу. Результаты этих экспериментов, представленные на рис. 2, показали, что подавление Е-кадхерина непосредственно связано с гиперэкспрессией Snaill: так, в клетках РЭ-негативной линии HBL-100, помимо повышенного количества белка Snaill, наблюдалось значительное увеличение его функциональной активности. На этом фоне трансрепрессорная активность Snaill в клетках РЭ-позитивных линий была заметно понижена.

Здесь и далее представлены результаты одного из трех независимых

экспериментов.

0J16DO

Рисунок 2. Трансрепрессорная активность Snail 1 в клетках MCF-7, MCF-7/LS и HBL-100. Репортериый анализ.

Подавление Е-кадхерина в РЭ-негативных клетках может быть как следствием гиперэкспрессии Snail 1, так и проявлением трансрепрессорной функции Snail 1 на дополнительном, эпигенетическом уровне . Известно, что Snail 1 не только напрямую подавляет транскрипцию CDH-1, но и активирует синтез транскрипционных репрессоров Е-кадхерина - Zebl и Zeb2. Более того, Snail 1 ингибирует синтез активаторов транскрипции Е-кадхерина, в частности, рецептора витамина D. Мы предположили, что потеря функционального Е-кадхерина вследствие активации Snail 1 не только способствует развитию локомоторного фенотипа, но и может быть одним из проявлений гормональной резистентности, а обратная зависимость между уровнем Snail 1 и РЭ, возможно, является следствием существования системы взаимной негативной регуляции со стороны этих сигнальных путей.

2. Snaill и активность РЭ

Предположение об участии Snaill в регуляции активности аппарата рецептора эстрогенов подтвердилось при исследовании непосредственного влияния Snaill на РЭ в клетках MCF-7 и MCF-7/LS. Для этого в клетки РЭ-позитивных линий MCF-7 и MCF-7/LS трансфицировали плазмиду для экспрессии Snaill дикого типа, после чего определяли уровень белка посредством иммуноблоттинга. Было обнаружено, что трансфекция Snail не меняет содержания РЭ в клетках (рис.За), но вызывает резкое снижение его транскрипционной активности, которую измеряли методом репортерного анализа с использованием РЭ-чувствительной плазмиды ERE-TK-LUC (рис. Зв).

Sua ill---->

РЭ-->

MCF-7 MCF-7I.S .............i.......... ........i____

' И»

pcDNA3 wSnaill

МО'-7 мс: Г-7/LS

— — т

■""«■О»

«паши щщшт шш>» шшш

+ + + +

siRNA scrambled

600

4 500

a

5 400

э

8" 300

I 200

Si

3 100 0

□ pcDNA3 й wSnail 1

2500

Э 2000

i Ш

Hi

1500

it

ш a ш

1000

500

Ш II

Ш.

1 p

tm

□ siRNA

scrambled Hsi RNA Snail I

P

§L

IP

SSMft

И

MCF-7

MCF-7/LS

MCF-7

MCF-7/LS

Рисунок 3. Экспрессия и активность РЭ при гиперэкспрессии/подавлении Snaill в клетках MCF-7 и MCF-7/LS. а) Экспрессия Snaill и РЭ при трансфекции wSnaill в клетки MCF-7 и MCF-7/LS. Результаты иммуноблоттинга. б) Экспрессия Snaill и РЭ при трансфекции Snaill siRNA в клетки MCF-7 и MCF-7/LS. Результаты иммуноблоттинга. в) Транскрипционная активность РЭ при трансфекции wSnaill в клетки MCF-7 и MCF-7/LS. Репортерный анализ, г) Транскрипционная активность РЭ при трансфекции Snaill siRNA в клетки MCF-7 и MCF-7/LS. Репортерный анализ.

При направленном подавлении Snail путем трансфекции короткой интерферирующей РНК (siRNA Snaill) наблюдался противоположный эффект -стимуляция транскрипционной активности РЭ (рис. Зг), при этом экспрессия РЭ также не менялась (рис.36). Необходимо отметить, что трансфекция Snaill в клетки РЭ-негативной линии HBL-100 не оказывала влияния на активность репортерного гена. Полученные результаты свидетельствуют об участии Snail в негативной регуляции РЭ.

SDS-электрофорез

РЭ-иммунопрешшитат

V

Snail 1

wSnaill

Рисунок 4. Перекрестная коиммунопреципитация Snaill и РЭ: образование белкового комплекса в клетках MCF-7

Данные экспериментов по перекрестной иммунопреципитации Snail 1 и РЭ с последующим анализом комплекса методом иммуноблоттинга представлены на рис. 4. Наблюдаемая копреципитация Snaill и РЭ говорит об образовании комплекса РЭ и Snail 1; это может являться одной из причин снижения активности РЭ в клетках с повышенным содержанием Snaill. Полученные результаты могут служить примером начального этапа одного из возможных сценариев снижения активности аппарата рецепторов эстрогенов при гиперэкспрессии Snaill.

3. Snaill и гормональная резистентность.

Тамоксифен относится к нестероидным соединениям из группы антиэстрогенов; связываясь с его молекулами, РЭ образует неактивные комплексы. Это приводит к снижению эффективности передачи митогенных сигналов от каскада РЭ; транскрипционная активность РЭ снижается, происходит подавление репликации ДНК и остановка клеточного цикла в фазе GO или G1.

В случае потери гормональной чувствительности клетки становятся резистентными к антипролиферативному и цитостатическому действию тамоксифена, что сводит на нет эффективность применения этого антигормонального препарата.

Анализ чувствительности клеток к антипролиферативному действию тамоксифена показал, что подавление Snaill посредством РНК-интерференции способствует усилению цитостатического эффекта тамоксифена (рис. 5а).

5? 120 п

К контроль

В siRNA scrambled + Tam И siRNA Snaill + Tam

Я контроль 0pcDNA3 + Tam В wSnaill + Tam

MCF-7

MCF-7/LS

MCFT7

MCF-7/LS

Рисунок 5. Чувствительность клеток MCF-7 и MCF-7/LS к антипролиферативному действию тамоксифена после: а) трансфекции siRNA Snaill; б) трансфекции wSnaill. На вертикальной оси - количество клеток, в процентах; за 100% принято количество клеток, культивированных без тамоксифена. Результаты МТТ-теста

Так, при культивировании клеток в присутствии тамоксифена было продемонстрировано снижение скорости их деления на 25-30%, однако при подавлении Snaill с помощью siRNA цитостатический эффект тамоксифена заметно усиливается, достигая 50-60%. Обратный эффект, снижение чувствительности клеток к тамоксифену, наблюдался при трансфекции в клетки плазмиды с полноразмерным геном wSnaill(pHC. 56).

4. Влияние Snaill на выживаемость клеток

Доксорубицин является одним из основных цитотоксических агентов, используемых при лечении быстрорастущих агрессивных опухолей, в том числе резистентных к антиэстрогенам. Доксорубицин блокирует активность топоизомеразы 2 и ингибирует репликацию в активно делящихся клетках; в ответ на ошибки репликации в клетках запускается масштабная апоптотическая программа. Известно, что активация Snaill способствует повышению выживаемости клеток после генотоксического шока, поскольку этот транскрипционный фактор подавляет синтез белков запрограммированной клеточной гибели - Bid и каспазы 6. Также Snaill ингибирует транскрипцию ряда генов, которые активируются в условиях стресса и участвуют в р53-индуцированном апоптозе.

7060

¡,<50 i

S ; fi

S40-

1:30 <

p20

ч

S i о

I 0

У / I

✓ 1

siRNA

scrambled

OkHDox

Ш

1

m

i

I

siRNA Snafll a) MCF-7

siRNA scrambled

6) MCF-7/LS

siRNA Srail

siRNA scrambled

B)HBL-100

siRNA Snail

Рисунок 6. Чувствительность клеток МСР-7 (а), МСР-7/ЬЗ (б) и НВ1*-100 (в) к апоптотическому действию доксорубицина после трансфекции БпаШ згКЫА. Результаты проточной цитофлуориметрии, представлено количество апоптотических клеток в %.

Мы предположили, что Snail 1 поддерживает выживаемость клеток РМЖ при индукции апоптоза под действием доксорубицина. Для оценки изменения апоптотического действия доксорубицина при подавлении Snail 1 в клетки MCF-7, MCF-7/LS и HBL-100 трансфицировали siRNA Snaill, либо контрольную siRNA; после трансфекции клетки культивировали в присутствии доксорубицина и анализировали уровень апоптоза методом проточной цитофлуориметрии. Полученные результаты, представленные на рис. 6, свидетельствуют о значительном усилении апоптотического ответа клеток MCF-7 (рис. 6а) и MCF-7/LS (рис. 66) при подавлении Snaill. Аналогичная закономерность была обнаружена и при подавлении Snaill в РЭ-негативных клетках HBL-100 (рис. 6в). Таким образом, нами было показано, что Snaill подавляет активность РЭ и одновременно стимулирует антиапоптотические сигнальные пути в клетках РМЖ, уже вне зависимости от их рецепторного статуса.

5. Регуляция Snaill в клетках РМЖ

Для изучения регуляции Snaill со стороны РЭ в клетки MCF-7, MCF-7/LS и HBL-100 трансфицировали репортерную плазмиду, содержавшую ген-репортер люциферазы под контролем Snaill-чувствительного промотора Е-кадхерина, после чего для активации РЭ клетки культивировали в присутствии 17-|3-эстрадиола. В РЭ-негативные клетки линии HBL-100, помимо репортерных конструкций, трансфицировали плазмиду для экспрессии РЭ дикого типа (в качестве контроля использовали вектор pcDNA3). Полученные результаты (рис.7) не выявили достоверных изменений в активности/содержании Snaill при стимуляции РЭ в присутствии 17-р-эстрадиола.

90 80 70 60 50 40 30

8 20

10 о

и

Ш:

Ш

□ k НЕ2

Ы

т

т<

■"'-'У Kgiv

MCF-7

MCF-7/LS

HBL-100

Е-кадхерин -» " • •

актин ->

К Е2

.V1CF-7 MCF-7/LS HBL-100

К Е2 К Е2

Рисунок 7. Влияние эстрадиола (Е2) на транс-репрессорную активность Snaill (а) и уровень Е-кадхерина (б) в клетках MCF-7, MCF-7/LS и HBL-100. Результаты репортерного анализа и иммуноблоттинга.

В литературе можно отметить отсутствие единого мнения о роли аппарата РЭ в регуляции Snaill. С одной стороны, было показано, что в присутствии эстрадиола РЭ непосредственно связывается с промотором гена МТА-3 (metastasis-associated gene) через сайт связывания SP-1, расположенный рядом с половиной

палиндрома эстроген-респонсивного элемента, и стимулирует транксрипцию МТА-3. Последний в составе комплекса MTA-3-MI-2/NuRD принимает непосредственное участие в подавлении транскрипции Snail!. Также известно, что в РЭ-негативных опухолях молочной железы часто наблюдается потеря экспрессии МТА-3 и Е-кадхерина, сопровождаемая гиперэкспрессией Snaill. С другой стороны, авторы некоторых работ утверждают, что РЭ способствует активации Snaill и, таким образом, стимулирует развитие эпителиально-мезенхимального перехода в клетках РМЖ; авторы одной из них обнаружили в дистальной части промотора Snaill предполагаемые сайты неспецифического связывания РЭ, среди которых есть последовательности, гомологичные респонсивным элементам Spl, Api и сАМР. Результаты наших экспериментов, в которых не было выявлено определенных изменений Snaill при добавлении эстрадиола и при экспрессии экзогенного РЭ в клетках HBL-100, вероятно, объясняются множественностью и неоднозначностью эффектов РЭ по отношению к Snaill и запускаемому им каскаду.

6. Роль NF-kB в регуляции Snaill

Известно, что NF-kB участвует в активации транскрипции мезенхимальных генов таких белков, как фибронектин, Lefl и др. Конститутивная активация NF-kB-сигнального пути, связанного с генами ЭМП, наблюдается в большинстве опухолей молочной железы и во многих клеточных линиях РМЖ. Мы показали, что при культивировании клеток MCF-7 в присутствии 12-О-тетрадеканоилфорбол-13-ацетата (ТРА), специфического активатора NF-kB, происходит значительное повышение экспрессии и трансрепрессорной активности Snaill (рис. 8а,б). При направленном подавлении NF-kB в клетках MCF-7 с использованием коротких интерферирующих РНК к NF-kB (рис. 8д), а также путем трансфекции вектора для экспрессии конститутивно-активного ингибитора NF-kB □ pMIG-IkB, не подверженного протеасомной деградации благодаря двум нуклеотидным заменам (рис. 8в,г), мы наблюдали не только значительное снижение транскрипционной активности NF-kB, но и уменьшение трансрепрессорной активности Snaill. Полученные результаты свидетельствуют о выраженной позитивной регуляции Snail 1 под действием NF-kB.

зиии -

NF-kB/люцифераза Е-каднерин/люцифержа

Д

и 1000

QJ

Я

Н 800

а

1 600 к

£Г

| 400

к

К 200

ft

л

¥

w о

И scrambled s£RNA 0 NF-kB siRNA

g *-Snail 1

Г

200

160 120 80 40 0

NF-kB/люц Е-кадхерин/люц

MCF-7 MCF-7/LS

Рисунок 8. Роль NF-kB в регуляции Snaill: а) Повышение экспрессии NF-kB и Snaill под действием TP А; б) повышение транскрипционной активности NF-kB и трансрепрессорной активности Snaill под действием TP А; в) снижение экспрессии Snaill при трансфекции ингибитора NF-kB рМЮ; г) снижение трансрепрессорной активности Snaill и транскрипционной активности NF-kB при трансфекции ингибитора NF-kB рМЮ; д) снижение трансрепрессорной активности Snaill при трансфекции короткой интерферирующей РНК NF-kB.

В качестве репортеров использованы векторные конструкции, содержащие ген люциферазы светлячка под контролем Snaill-респонсивного участка промотора Е-кадхерина и NF-kB-респонсивного элемента, соответственно.

7. NF-kB и гормональная резистентность

В ряде работ приводятся сведения о взаимном антагонизме NF-kB и РЭ; полученные нами данные подтверждают эти наблюдения. Так, репортерный анализ транскрипционной активности РЭ с использованием гена люциферазы под контролем эстроген-респонсивного элемента показал, что подавление NF-kB с помощью siRNA вызывает значительное, почти двукратное повышение люциферазной активности ERE в клетках MCF-7 и MCF-7/LS (рис. 9).

600 j. 500 Б 400 I 300

л.

5

I 200

S

5

щ 100 -о

□ scrambled siRNA S3 NF-kB siRNA

□ к

a scrambled siRNA + Tam ¡DNF-kB SiRNA + Tam

MCF-7

MCF-7/LS

MCF-7/LS

о *

a g

о ï

40 30 20

□ scrambled siRNA

Ш scrambled siRNA + Dax

□ NF-kB siRNA

□ NF-kB siRNA + Pox

хгМ

MCF-7

MCF-7/LS

Рисунок 9. а) Восстановление активности эстроген-респонсивного элемента при подавлении №Р-кВ в клетках МСЕ-7 и МСР-7/15. Репортерный анализ, б) Усиление цитостатического действия тамоксифена в МСР-7/Ь5 при подавлении МР-кВ. Представлено количество клеток, в %; результаты МТТ-теста. в) Усиление ответа клеток МСР-7 и МСР-7/ЬЗ на доксорубицин при подавлении МР-кВ. Представлено количество апоптотичесих клеток в %. Результаты проточной цитофлуориметрии.

Способность NF-kB ингибировать РЭ дополняется его антиапоптотической активностью, что определяет особую роль NF-kB в опухолевой прогрессии и, в частности, в развитии резистентности РМЖ к антиэстрогенам и химиотерапевтическим агентам. Мы показали, что подавление NF-kB с помощью РНК-интерференции приводит к существенному увеличению ответа клеток на тамоксифен (рис.9б) и доксорубицин (рис.9в). Учитывая значение NF-kB в позитивной регуляции Snail 1, подавлении активности РЭ и снижении чувствительности к апоптотическим стимулам, мы предположили, что этот фактор вполне можно рассматривать в качестве потенциальной мишени таргетной терапии РМЖ.

8. Подавление Snaill и NF-kB: потенциальная стратегия таргетной терапии.

Результаты, полученные в нашей работе, показали, что эффективность восстановления лиганд-зависимой функции РЭ, необходимого для сенсибилизации резистентных линий РМЖ к действию тамоксифена, повышается при подавлении активности Snaill. Принимая во внимание участие NF-kB в позитивной регуляции Snaill, мы предположили, что максимальное подавление Snaill и более эффективная индукция ответа на антиэстроген возможны при одновременном блокировании в клетках NF-kB- и Snail-сигнэльных путей. Результаты экспериментов, выполненных для проверки этой гипотезы, показали, что в гормон-независимых клетках MCF-7/LS подавление в отдельности Snaill и NF-kB вызывает снижение активности Snaill и некоторое усиление антипролиферативного эффекта тамоксифена. При этом одновременное подавление NF-kB и Snaill действительно приводит к максимальному снижению транс-репрессорной активности Snaill (рис. 10) и существенному усилению ответа клеток на тамоксифен (рис. 11).

В целом, полученные результаты свидетельствуют о перспективности использования Snaill и NF-kB в качестве мишеней таргетной терапии РМЖ, в том числе при лечении агрессивных эстроген-независимых опухолей молочной железы.

5

a

400 -i

300 •

200

% 100 -

0

□ scrambled siRNA S Snail siRNA Ю NF-kB siRNA в Snail siRNA + NF-kB siRNA

MCF-7/LS

Рисунок 10. Эффективность снижения транс-репрессорной активности Snaill при комбинированном подавлении Snaill и NF-kB в клетках MCF-7/LS. Репортерный анализ.

ё

и siRNA scrambled + Tam asiRNA Snaill +Tam BsiRNA NF-kB + Tam 0 siRNA Snaill + siRNA NF-kB -

MCF-7/LS

Рисунок 11. Усиление цитостатического действия тамоксифена при комбинированном подавлении Snaill и NF-kB в клетках MCF-7/LS. Результаты МП теста.

Заключение

Во многих случаях потеря опухолями молочной железы чувствительности к эстрогенам не связана с изменениями РЭ, но вызывается перестройкой внутриклеточных сигнальных каскадов: активацией тирозинкиназных рецепторов, развитием альтернативной регуляции белков клеточного цикла и т.д. Приобретение клетками эстроген-независимых опухолей молочной железы отдельных свойств, характерных для мезенхимального фенотипа, говорит о возможном участии в развитии гормональной резистентности специфических сигнальных путей, связанных с индукцией ЭМП. В нашей работе продемонстрировано участие Snail 1, одного из основных активаторов ЭМП, в негативной регуляции аппарата рецепторов эстрогенов клеток РМЖ. Мы обнаружили, что развитие гормональной резистентности сопровождается активацией Snail 1 и снижением содержания Е-кадхерина, при этом подавление Snail 1 приводит к увеличению транскрипционной активности РЭ и повышению чувствительности клеток РМЖ к антипролиферативному действию тамоксифена. Полученные результаты согласуются с клиническими исследованиями, которые свидетельствуют о существовании обратной корреляции между уровнем Snail 1 в опухолях молочной железы и уровнем гормональной зависимости. Мы продемонстрировали важную роль, которую играет NF-kB-сигнальный путь в регуляции Snail 1, и показали, что подавление NF-kB можно рассматривать в качестве способа дополнительного подавления активности Snail 1 в клетках РМЖ.

Одна из основных тенденций современной таргетной терапии заключается в необходимости одновременного подавления минимум двух сигнальных путей (как правило, участвующих в регуляции роста/выживаемости опухолевых клеток), -иначе, при подавлении только одной сигнальной цепи, в клетках немедленно активируется параллельный каскад, передающий митогенный сигнал в о.бход заблокированных белков. В нашей работе было показано, что комбинированное подавление NF-kB и Snail 1 приводит к максимальному снижению активности Snail 1 и выраженному увеличению чувствительности клеток к тамоксифену. В целом, мы полагаем, что направленное подавление Snail 1 и его основного активатора - NF-kB — может способствовать частичному восстановлению активности РЭ, что свидетельствует о перспективности использования Snail 1 и

NF-kB в качестве мишеней таргетной терапии для лечения опухолей молочной железы.

Выводы

1. Сравнительный анализ эстрогензависимых (MCF-7, ВТ-474) и эстрогеннезависимых (MCF-7/LS, HBL-100, MDA-MB-231) клеточных линий рака молочной железы выявил значительное увеличение содержания Snail 1, основного белка эпителиально-мезенхимального перехода, в клетках эстроген-независимых линий.

2. Продемонстрирована способность Snail 1 непосредственно взаимодействовать с рецептором эстрогенов и снижать транскрипционную активность последнего.

3. Подавление Snail 1 увеличивает чувствительность клеток рака молочной железы к рост-ингибирующему действию антиэстрогена тамоксифена и усиливает апоптотическое действие химиопрепаратов негормонального ряда, в частности доксорубицина.

4. Установлено, что одним из активаторов Snail 1 является антиапоптотический транскрипционный фактор NF-kB. Подавление NF-kB приводит к повышению активности рецептора эстрогенов и увеличивает чувствительность клеток рака молочной железы к тамоксифену и доксорубицину.

5. Одновременное подавление Snail 1 и NF-kB приводит к максимальному снижению трансрепрессорной активности Snail 1 и существенному усилению ответа клеток на тамоксифен, что свидетельствует о перспективности использования Snail 1 и NF-kB в качестве мишеней таргетной терапии резистентного рака молочной железы.

СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ В ЖУРНАЛАХ, РЕКОМЕНДОВАННЫХ

ВАК

1. Андреева, О. Е. Значение транскрипционного фактора Snail 1 в регуляции гормональной чувствительности культивируемых in vitro клеток рака молочной железы / О. Е. Андреева, А. М. Щербаков, ВА. Шатская, МА. Красильников // Вопросы онкологии.- 2012,- Т. 58, № 1 - С.71-76.

2. Scherbakov, А. М. Oestrogen treatment enhances the sensitivity of hormone-resistant breast cancer cells to doxorubicin / A. M. Scherbakov, Y. S. Lobanova, О. E. Andreeva, V. A. Shatskaya, M. A. Krasil'nikov // Bioscience Reports -201 l.-Vol. 31, № 2 - P.137-143.

3. Scherbakov, A. M. The relationships between Snaill and estrogen receptor signaling in breast cancer cells / A. M. Scherbakov, О. E. Andreeva, V. A. Shatskaya, M. A. Krasil'nikov // Journal of Cellular Biochemistry.- 2012,-Vol. 113, № 6 - P.2147-2155.

4. Щербаков, A. M. Роль Snail-сигнального пути в развитии устойчивости к гипоксии клеток рака молочной железы / А. М. Щербаков, Л. Б. Стефанова, О. Е. Андреева, Д. В. Сорокин, М. А. Красильников // Технологии живых систем- 2012.-Т.9, № 9 - С.63-67.

5. Стефанова, Л. Б. Чувствительность к гипоксии культивируемых in vitro клеток рака молочной железы: роль аппарата рецептора эстрогенов / Л.Б.Стефанова, А. М. Щербаков, О. Е. Андреева, Н. А. Болотина, И. В. Терешкина, М. А. Красильников // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии - 2012.- № 10. - С.60-63.

ТЕЗИСЫ КОНФЕРЕНЦИЙ

6. Scherbakov, А. М. The sensitivity of hormone-resistant breast cancer cells to doxorubicin: the role of NF-kappa В signaling / A. M. Scherbakov, J. S. Lobanova, О. E. Andreeva, V. A. Shatskaya, M. A. Krasil'nikov // EJC Supplements - 2010,-Vol. 8, № 3 -P.113.

7. Scherbakov, A. M. Doxorubicin treatment of hormone-resistant breast cancer cells: the intrinsic role of NF-kappa В pathway / A. M. Scherbakov, О. E. Andreeva, V. A. Shatskaya, M. A. Krasil'nikov // FEBS congress, Turin, Italy, Abstracts - 2011. - P.232.

8. Стефанова, Л. Б. Механизм регуляции гормональной чувтвигельности клеток рака молочной железы в условиях хронической гипоксии. XIV Российский онкологический Конгресс / Л. Б. Стефанова, О. Е. Андреева, М.А. Красильников // Москва. Тезисы докладов - 2010.-С.246.

Подписано в печать 19.07.13. Формат 60x84/16. Бумага офисная «8уе№Сору». Тираж 100 экз. Заказ № 448. Отпечатано на участке множительной техники ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН 115478, г. Москва, Каширское шоссе, 24