Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Исследование молекулярного механизма развития и поддержания эстрогеннезависимого роста клеток рака молочной железы человека: роль сигнальных белков STAT3, PI3K и NF-kappa B

На правах рукописи

Лобанова Юлия Сергеевна

Исследование молекулярного механизма развития и поддержания эстрогеннезависимого роста клеток рака молочной железы человека: роль сигнальных белков вТАТЗ,

Р13К и Ш-карра В

14.00.14 - онкология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 2007

Работа выполнена в ГУ Российский Онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина Российской академии медицинских наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук М А Красильников

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук А.А.Штиль

доктор биологических наук, профессор Н.С.Сергеева

Ведущая организация

ФГУ Российский научный центр рентгенорадиологии Росмедтехнологий

Защита состоится » 2007 г в часов

на заседании диссертационного ученого совета К. 001 17.01 ГУ РОНЦ им Н Н.Блохина РАМН по адресу 115478, Москва, Каширское шоссе, 24.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ РОНЦ им Н.Н Блохина РАМН

Автореферат разослан «_»_2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук, профессор ] /„ Ю А. Барсуков

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Фундаментальной проблемой современной экспериментальной онкологии является исследование механизма адаптации опухолевых клеток к действию противоопухолевых препаратов, в том числе ингибиторов пролиферации стероидной природы Стероидные гормоны играют исключительно важную роль в регуляции пролиферации нормальных тканей организма, выступая в роли физиологических ингибиторов клеточного деления (глюкокортикоидные гормоны, прогестины) или стимуляторов пролиферации (эстрогены, андрогены) (Берштейн JIМ, 2004) Однако не все злокачественные опухоли сохраняют зависимость от гормонов, уровень гормональной зависимости опухолей может существенно снижаться по мере проведения терапии стероидами, приводя в итоге к формированию гормоннезависимых форм Оказалось, что во многих случаях снижение гормональной зависимости опухолей не связано с потерей специфических рецепторов, ответственных за связывание гормона внутри клетки-мишени (Encarnacion С A et al, 1993) Что препятствует действию гормонов в таких опухолях, какие факторы могут определять истинный уровень гормональной зависимости опухолей - окончательные ответы на эти вопросы пока не получены

Одним из перспективных направлений экспериментальной онкологии является исследование механизма развития приобретенной резистентности к эстрогенам в клетках рака молочной железы (РМЖ) За последние годы с помощью исследований in vitro выявлено несколько ключевых механизмов, поддерживающих эстрогеннезависимый рост опухолевых клеток активация рецепторных тирозинкиназ, нарушение регуляции белков клеточного цикла, активация митогенных путей, изменение функциональной активности рецепторов эстрогенов и др (Clarke R et al, 2003, Henderson B.E et al, 2003, Ring A et al, 2004) Исследования последних лет показали, что активное участие в регуляции роста и выживаемости опухолевых клеток принимают фосфатидилинозит-3-киназа (PI3K, phosphatidylinositol-3 kinase) и PI3K-зависимые ферментативные системы, под контролем которых находятся важнейшие сигнальные пути клетки.

Поскольку одной из характерных особенностей метаболизма гормон-резистентных клеток является конститутивная, независимая от гормонов,

активация митогенных и антиапоптотических сигнальных путей, то особое внимание привлекает возможное участие рецепторов в лиганднезависимой активации таких сигнальных белков Так, было продемонстрировано, что рецепторы стероидов взаимодействуют с регуляторной субъединицей PI3K, стимулируют фосфорилирование и приводят к дополнительной активации белков семейства STAT (signal transducers and activators of transcription) (Bjomstrom L et al., 2002) Описано взаимодействие рецепторов и с некоторыми другими сигнальными белками, включая рецепторы ростовых факторов, NF-kappa В, р53 и др (Nicholson RI et al, 2001, Osborne С К et al, 2001, Sengupta S et al, 2001), но в целом вопрос о значении кооперации между рецептором эстрогенов и митогенными сигнальными путями в развитии гормональной резистентности клеток остается открытым

В этой связи особое внимание исследователей привлекает феномен парадоксальной сенсибилизации гормонрезистентных клеток РМЖ к апоптотическому действию эстрадиола Обнаружено, что при развитии резистентности клеток рака молочной железы к пролиферативному действию эстрадиола и активизации эстрогеннезависимого роста опухолевые клетки могут приобретать чувствительность к апоптотическому действию эстрадиола (Song R X et al, 2003, Liu H et al, 2003, Osipo С et al, 2003, Song R X et al, 2005) Феномен парадоксальной чувствительности к апоптотическому действию эстрадиола, как правило, наблюдается в клетках, длительное время культивированных в бесстероидной среде и/или в присутствии антиэстрогенов in vitro, не чувствительных к пролиферативному действию эстрогенов, но сохранивших высокий уровень экспрессии рецепторов эстрогенов (Song R X et al, 2001, Liu H et al, 2003, Lewis J S et al, 2005) Целый ряд экспериментальных и клинических наблюдений, показавших эффективность эстрогеновой терапии при лечении резистентных форм рака молочной железы, подтверждает возможность сенсибилизации опухолевых клеток к апоптотическому действию эстрадиола in vivo (Lonning Р Е et al, 2001, Jordan V С et al, 2003, Song R X et al, 2003, Lewis J S et al, 2005, Osipo С et al, 2005) В целом известные сегодня литературные данные позволяют рассматривать сенсибилизацию клеток к апоптотическому действию эстрогенов в качестве одного из возможных и распространенных вариантов прогрессии опухолей, развивающихся в условиях дефицита эстрогенов и(или) продолжительной терапии антиэстрогеновыми препаратами

Цель работы: исследование природы сигнальных путей, ответственных за поддержание эстрогеннезависимого роста клеток рака молочной железы и изучение возможной кооперации между рецепторами эстрогенов и внутриклеточными сигнальными белками в процессе развития гормональной резистентности

Задачи исследования:

1 Выделение и сравнительная характеристика сублиний клеток рака молочной железы MCF-7, полученных в условиях длительного культивирования клеток с антиэстрогеном тамоксифеном (серия MCF-7/T) или в бесстероидной среде (сублиния MCF-7/LS)

2 Сравнительный анализ активности фосфатидилинозитольного пути и митогенных сигнальных белков в родительской линии MCF-7 и эстрогеннезависимых сублиниях

3 Исследование экспрессии, связывающей способности и транскрипционной активности рецептора эстрогенов (ER) в клетках MCF-7, MCF-7/T и MCF-7/LS Значение фосфатидилинозит-3-киназы (РБК) в регуляции активности ER

4 Исследование механизма сенсибилизации эстрогеннезависимых клеток РМЖ к апоптотическому действию эстрадиола роль NF-kappa В -сигнального пути

Научная новизна работы. Установлено, что длительное культивирование клеток эстрогензависимого рака молочной железы MCF-7 в присутствии антиэстрогена тамоксифена и/или в бесстероидной среде приводит к формированию эстрогеннезависимой популяции клеток, характеризующейся резистентностью к пролиферативному действию эстрадиола, выраженной активацией эстрогеннезависимых митогенных путей (STAT3, VEGFR2) и, одновременно, парадоксальной чувствительностью к апоптотическому действию эстрадиола Впервые продемонстрировано, что в клетках, чувствительных к апоптотическому действию эстрадиола, последний практически не влияет на содержание рецепторов TNF-R1 и Fas, но существенно подавляет транскрипционную активность NF-kappa В Обнаружено, что в таких клетках на фоне некоторого снижения концентрации и связывающей способности рецепторов эстрогенов резко увеличивается базальная (в отсутствие лиганда) ER-зависимая транскрипционная активность, и продемонстрировано существование взаимной негативной регуляции между ER и NF-kappa В Получены доказательства участия PI3K в

поддержании лиганд-независимой активации ЕЯ В целом результаты работы свидетельствуют, что увеличение базальной транскрипционной активности ЕЯ, наряду с сохранением в клетках способности к эстрогензависимому подавлению ОТ-карра В, относятся к числу характерных признаков, определяющих сенсибилизацию клеток рака молочной железы к эстроген-индуцированному апоптозу

Научно-практическая значимость работы. Исследование носит экспериментальный характер и направлено на изучение природы сигнальных путей, поддерживающих эстрогеннезависимый рост клеток рака молочной железы Представленные данные демонстрируют, что развитие гормональной резистентности ЕЯ-положительных опухолей может сопровождаться изменением активности некоторых про- и антиапоптотических белков и частичной сенсибилизацией клеток к действию проапоптотических соединений Установлено значение транскрипционного фактора КР-карра В как возможного участника кооперации между рецепторами эстрогенов и внутриклеточными сигнальными белками, определяющего чувствительность эстрогеннезависимых клеток РМЖ к действию проапоптотических соединений Полученные данные свидетельствуют о перспективности использования комбинированного определения активности №-карра В, ЕЯ и Р13К в качестве дополнительного маркера чувствительности опухолей молочной железы к химио- и гормонотерапии

Апробация работы. Диссертационная работа была доложена 28 сентября 2007 года на совместной научной конференции лабораторий молекулярной эндокринологии, механизмов гибели опухолевых клеток, регуляции клеточных и вирусных онкогенов, генетики опухолевых клеток и биохимии опухолей НИИ канцерогенеза ГУ РОНЦ им Н Н.Блохина РАМН

Публикации: по материалам диссертации опубликовано 9 научных работ

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания использованных в работе материалов и методов, трех глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы Материалы диссертации изложены на 120 страницах машинописного текста, включают 35 графических иллюстраций и схем и 219 ссылок на публикации по теме исследования

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Клеточные культуры. Клетки эстрогензависимого рака молочной железы человека линии MCF-7 (Levenson AS et al, 1997) были получены из коллекции клеточных культур ГУ РОНЦ им ННБлохина РАМН Клетки культивировали в среде DMEM, содержавшей 5%-ную эмбриональную сыворотку телят («Gibco») и гентамицин (50 ед/мл) («Рапесо», Россия) при 37°С в атмосфере с 5% С02 Эстрогеннезависимая сублиния MCF-7/T была получена в результате длительного, в течение 2 мес , культивирования клеток родительской линии MCF-7 в стандартной среде DMEM в присутствии 10~6М тамоксифена В дальнейшем рост клеток MCF-7/T поддерживали в среде без тамоксифена в течение 20-50 пассажей Сублиния MCF-7/T1 была получена из клеток MCF-7/T в условиях продолжительного (4мес) культивирования клеток в среде, не содержавшей стероидов (DMEM без фенолового красного + 5% бесстероидной эмбриональной сыворотки (Provost Р R et al, 2000)) Сублиния MCF-7/LS была получена в результате культивирования клеток родительской линии MCF-7 в бесстероидной среде в течение 4 мес При определении скорости роста клеток использовался стандартный МТТ-тест (Merlin JL et al, 1992), основанный на способности митохондриальных и цитоплазматических дегидрогеназ живых метаболически активных клеток восстанавливать бесцветную соль тетразолия (3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолия бромид, МТТ) до образования голубых кристаллов формазана, количество которого измеряется на спектрофотометре

Электрофорез и иммуноблотинг. Клетки на стадии формирования 80% монослоя промывали физиологическим раствором, снимали с чашек и получали клеточные экстракты как описано ранее (Красильников М А и др, 2004) Электрофорез образцов, содержавших по 60-80 мкг белка, проводили в 10%-ном SDS-полиакриламидном геле, затем белки переносили на нитроцеллюлозные фильтры («Amersham», Великобритания) методом электропереноса Для иммуноблотгинга использовали антитела к рецепторам эстрогенов (Е-1396, «Sigma-Aldnch»), VEGFR-2 (AF357, «R&D Systems», USA), Akt/PKBa (Upstate, #05-591) и phospho-Aktl/РКВа (Ser473) (Upstate, #07-310), STAT3 («Bio Labs» #9132), к рИО-субъединице PI3K («Santa Cruz Biotechnology», США), TNFR1 (#AF225, «R&D Systems», США), NF-kappa В («Abcam»), p53 (OP29, «Oncogene Research Products») Для оценки эффективности нанесения экстрактов на нитроцеллюлозные фильтры

использовали метод окрашивания раствором Pontsou и иммуноблоттинг с антителами к ß-актину (АС-15, «Sigma-Aldrich»)

Транзиторная трансфекция и определение активности гена-репортера. Для транзиторной трансфекции клеток использовалась плазмида, содержавшая к ДНК транскрипционного фактора STAT3, любезно предоставленная Dr С M Horvath, и плазмидой, содержавшая кДНК PTEN, любезно предоставленная Dr A Chan Для определения транскрипционной активности ER и NF-kappa В проводили трансфекцию клеток плазмидами, содержавшими ген-репортер люциферазы под контролем промотора с эстрогенчувствительным и NF-kappa B-чувствительным элементами соответственно, любезно предоставленными Dr G Reíd и А Гаспарьяном Для контроля за эффективностью и потенциальной токсичностью процедуры трансфекции применялась котрансфекция клеток плазмидой, содержавшей ген ß-галактозидазы Активность люциферазы измерялась по стандартному протоколу («Promega», США) на люминометре «Turner BioSystems 20/20n» (США) Активность ß-галактозидазы измерялась по стандартной методике, основанной на использовании в качестве субстрата ß-галактозидазы ONPG (О-нитрофенил-Ь-О-галактопиранозидазы) («Sigma-Aldrich») Расчет относительной активности люциферазы проводили в условных единицах (отношение общей активности люциферазы к активности галактозидазы в исследованных образцах)

Определение уровня апоптоза. Уровень апоптоза в исследуемых клеточных линиях определяли методом проточной цитофлуориметрии после окраски йодистым пропидием («Sigma Aldrich») в цитометре «FACSCalibur» (Becton Dickinson, USA) Дальнейшую компьютерную обработку данных проводили с помощью программы WinMDI 2 9 (Joseph Trotter, La Jolla, CA, USA) Число апоптотических клеток (в процентах) определяли как npe-Gl-пик на ДНК гистограмме (Hotz M A et al, 1994)

Определение уровня экспрессии Fas. Число Fas-позитивных клеток (в процентах) оценивали методом непрямой иммунофлуоресцентной проточной цитометрии Для этого клетки инкубировали в течение 30 мин при 20° с первичными антителами к CD95/Fas (ICO 160) («МедБиоСпектр», Россия), дважды промывали фосфатным буфером и затем инкубировали 30 мин при 4° со вторичными антителами («МедБиоСпектр»), конъюгированными с флуоресцентной меткой FITC (fluorescein isothiocyanate) Образцы анализировали в цитометре «FACSCalibur» («Becton Dickinson», США).

Определение уровня мРНК 1кВа методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции. Клеточную РНК выделяли с использованием раствора TRIzol («Sigma Aldrich»), обратную транскрипцию проводили по стандартной методике (Красильников МА и др, 2004) В полимеразной цепной реакции использовались праймеры для [J-actm и 1кВ alpha Для амплификации кДНК 1кВ alpha проводили тридцать циклов, и 22 цикла для амплификации кДНК [i-актина Амплификацию проводили на аппарате Терцик («ДНК-Технология», Россия) Продукты реакции разделяли электрофорезом в 2,0% агарозном геле, окрашивали бромистым этидием и анализировали в УФ-свете

Определение связывающей способности рецепторов эстрогенов. Использовали модифицированный радиолигандный метод, описанный ранее в работе (Olea-Serrano N et al, 1985) Специфическое связывание определяли при насыщающей концентрации 3Н-меченного 17|3-эстрадиола («GE Healthcare», Великобритания, удельная радиоактивность 85-95 Ки/ммоль) в присутствии или в отсутствие 200-кратного избытка немеченого гормона (диэтилстильбэстрол, «Sigma_Aldrich») Образцы анализировали на (3-счетчике LS 6500 («Beckman», США)

Статистическая обработка результатов. Расчеты и обработку результатов проводили с помощью программ "Статистика для Windows" (StatSoft Inc, 2001, версия 6 0) и Ongin 6.0 (OnginLab Corporation, 1999, США) Рассчитывали среднее значения и стандартное отклонение в трех независимых экспериментах Результаты представляли в виде среднего значения + стандартное отклонение Во всех случаях критерии считали статистически достоверными при р<0,05

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Получение и характеристика зстрогеннезависимой сублинии клеток рака молочной железы (эксперименты выполнены совместно с А МЩербаковъш) Для получения зстрогеннезависимой сублинии клетки рака молочной железы MCF-7 культивировали в стандартной среде DMEM с 5% эмбриональной сывороткой телят (FCS) в присутствии 10"6 М тамоксифена в течение 2 месяцев После этого рост клеток, в дальнейшем MCF-7/T, поддерживали в стандартной среде без тамоксифена в течение 2050 пассажей.

Продемонстрировано, что сублиния МСР-7/Т отличается резким снижением чувствительности как к пролиферативному действию эстрадиола, так и к цитостатическому действию тамоксифена по сравнению с родительскими клетками МСР-7 (рис.1).

юоо -

500 -

□ Контроль

□ Эстрадиол [Тамоксифен

МСР-7 МСР-7/Т

Рис.1. Влияние тамоксифена (1(Г6М) и 17(3-эстрадиола (10"9 М) на рост клеток линий МСР-7 и МСР-7/Т. Здесь и далее представлены средние значения ± стандартное отклонение значений, полученных в трех независимых экспериментах.

Определение уровня экспрессии рецепторов эстрогенов (ЕЙ) методом иммуноблоттинга (рис.2а) и анализ связывающей способности ЕЯ стандартным радиолигандным методом (рис.26) показали незначительное, на 25-30%, снижение уровня Е11 и связывания эстрадиола в гормон-резистентной линии МСР-7/Т по сравнению с клетками МСР-7.

(а)

(б)

МСЯ-7 МСР-7Я

СП 5

т « о о

МСР-7

МСР-7/Т

Рис.2. Экспрессия (а) и лиганд-связывающая способность (б) рецепторов эстрогенов в клетках МСР-7/Т и МСР-7.

Для дальнейшего исследования механизма гормональной резистентности клеток MCF-7/T был проведен сравнительный анализ уровня экспрессии ключевых митогенных белков и отдельных рецепторных тирозинкиназ в клетках MCF-7 и MCF-7/T. При изучении экспрессии р 110, каталитической субъединицы PI3K, и эффектора PI3K - Akt/PKB, не было обнаружено существенных изменений в их содержании в клетках MCF-7 и MCF-7/T (рис.За). В то же время анализ экспрессии транскрипционного фактора STAT3 и одного из его позитивных регуляторов - рецептора фактора роста эндотелия сосудов 2-го типа (VEGFR-2/KDR) показал значительное увеличение содержания этих белков в клетках MCF-7/T (рис.36).

(а)

(б)

MCF-7 MCF-T/T

MCF-7 MCF-7/T

Рис.3. Экспрессия pllO, Akt, фосфо-Akt (a), STAT3 и VEGFR-2 (б) в клетках MCF-7/T и MCF-7.

Для дальнейшего изучения роли БТАТЗ в поддержании эстроген-независимого фенотипа клеток исследовалось влияние трансфекции 8ТАТЗ-содержащей плазмиды на чувствительность клеток МСР-7 к действию тамоксифена. Было продемонстрировано, что транзиторная трансфекция 8ТАТЗ в клетки МСР-7 приводит к заметному увеличению выживаемости клеток при действии тамоксифена (рис.4).

В целом, полученные на этом этапе работы результаты показали, что снижение гормональной зависимости клеток МСР-7 сопровождается координированной активацией экспрессии митогенных транскрипционных факторов (8ТАТЗ) и рецепторных тирозинкиназ (УЕ0РК-2), и продемонстрировали непосредственное участие БТАТЗ в поддержании тамоксифен-резистентного фенотипа клеток рака молочной железы.

§ 100-, н

| 80 -

ю 60 -

н

и

® 40 -

I 200

£

рсОМЗ БТАТЗ

Рис.4. Чувствительность клеток МСР-7 к действию тамоксифена после трансфекции БТАТЗ. Клетки трансфицировали плазмидой, содержавшей контрольный пустой вектор pcDNAЗ или кДНК 8ТАТЗ и затем культивировали 2 суток в отсутствие или в присутствии 10"^ М тамоксифена. Представлен процент выживших клеток, 100% -количество клеток, культивированных без тамоксифена.

Феномен сенсибилизации клеток к апоптотическому действию эстрогенов. Задачей следующего этапа экспериментов явилось исследование возможных изменений эстрогеннезависимого фенотипа клеток в условиях полного прекращения лиганд-зависимой активации ЕЯ. С этой целью клетки эстрогеннезависимой сублинии МСР-7/Т культивировали 4 мес в бесстероидной среде (далее - сублиния МСР-7/Т1) с последующим определением кинетики роста клеток в присутствии 17Р-эстрадиола (10"9 М) или тамоксифена (10"6М). Как видно из представленных данных, уровень резистентности к эстрадиолу и тамоксифену клеток МСР-7/Т1 остался на высоком уровне и практически не изменился по сравнению с сублинией МСР-7/Т (рис.5, сравнить с рис.1).

з? юоо -

о

□ Контроль

□ Эстрадиол ШТамоксифен

о

500 -

о

ф

т

о

МСР-7/Т1

Рис.5. Влияние тамоксифена и 17(3-эстрадиола на рост клеток МСК-7/Т1.

Однако, при изучении влияния длительного, в течение 8 сут, культивирования с эстрадиолом на выживаемость клеток оказалось, что наряду с сохранением резистентного фенотипа, клетки МСР-7/Т1 неожиданно приобретают способность к активной апоптотической реакции в ответ на эстрадиол. При этом родительские клетки МСР-7, как и резистентная сублиния МСР-7/Т, оказались практически нечувствительными к апоптотическому действию эстрадиола (рис.6).

-25 *

0

5 20 §

*15 «10

1 5

н с

О О

25 п 20 15 10 5 -О

| □ Контроль □ Е2 |

Рис.6. Влияние длительного воздействия эстрадиола на уровень апоптоза в клетках МСГ-7, МС¥-7ГТ и МСР-7/Т1.

Из полученных результатов следовало, что продолжительное культивирование в бесстероидной среде является одним из необходимых условий сенсибилизации клеток к апоптотическому действию эстрадиола. Для изучения механизма сенсибилизации клеток к апоптотическому действию эстрадиола из родительских клеток МСР-7 путем длительного культивирования только в бесстероидной среде была получена новая сублиния клеток - МСР-Т/ЬБ. При сравнительном анализе клеток МСР-7 и МСР-7/Ь8 установлено, что МСР-7/Ь8 по сравнению с клетками родительской линии отличаются низкой чувствительностью к пролиферативному действию эстрадиола и относительно более высокой скоростью роста в бесстероидной среде (рис.7).

□ контроль

□ Е2

МСР-7

МСР-7/1-8

Рис.7. Влияние эстрадиола (Е2) на рост клеток рака молочной железы МСР-7 и МСК-7/Ь8.

Определение уровня экспрессии рецепторов эстрогенов методом иммуноблоттинга и анализ связывающей способности ЕЯ стандартным радиолигандным методом показали незначительное уменьшение содержания ЕЯ и связывания эстрадиола в клетках МСР-7/Ь8 по сравнению с МСР-7 (рис.8).

Рис.8. Экспрессия (а) и связывающая способность (б) рецепторов эстрогенов в клетках МСР-7 и МСР-7/Ь8.

При изучении влияния длительного воздействия эстрадиола на выживаемость клеток было установлено, что клетки МСР-7/ЬБ, как и описанная выше сублиния МСР-7/Т1, отличаются гиперчувствительностью к апоптотическому действию эстрадиола (рис.9).

(а)

(б)

МСР-7 МСР-7 Л. Б

МСБ-7 МСР-7/1.8

25 20 15 10

MCF-7LS

□ Контроль

□ Е2

Рис.9. Влияние длительного воздействия эстрадиола на уровень апоптоза в клетках MCF-T/LS.

Для исследования механизма эстроген-индуцированного апоптоза был проведен сравнительный анализ экспрессии апоптотических белков TNF-R1, Fas и активности NF-kappa В в клетках MCF-7 и MCF-7/LS. Определение базального уровня TNF-R1 методом иммуноблоттинга и экспрессии Fas иммунофлуоресцентным методом не выявило существенных различий в содержании этих белков в клетках MCF-7/LS по сравнению с таковым в клетках MCF-7. Культивирование клеток в присутствии эстрадиола также не приводило к заметным изменениям в экспрессии TNF-R1 и Fas (рис.10).

(а)

(б)

К Е2

MCF-7

К

Е2

TNF-R1 ■ актин

5 -,

4 -

3 -

2 -

1 -

0 -

Fas, %

□ контроль ПЕ2

MCF-7/LS

MCF-7

MCF-7/LS

Рис.10. Содержание TNF-R1 (а) и Fas (б) в клетках MCF-7 и MCF-7/LS.

Для изучения транскрипционной активности №-карра В проводили трансфекцию клеток МС¥-7 и МС¥-7/ЪБ плазмидой, содержавшей ген-репортер люциферазы под контролем №-карра В-чувствительного промотора, с последующим определением активности люциферазы по

стандартному протоколу (Оаэрапап А. V. е1 а1., 2002). Обнаружено, что в клетках МСР-7/Ь8 транскрипционная активность существенно снижена и составляет 25-30% от активности №"-карра В в родительских клетках. Добавление эстрадиола вызывает существенное снижение активности карра В, причем, несмотря на резистентность к митогенному действию эстрадиола, клетки МСР-7/ЬБ в полной мере сохраняют способность к подавлению ЫБ-карра В-зависимой транскрипционной активности в ответ на действие эстрадиола (рис. 11 а). Аналогичные изменения были выявлены при анализе методом ОТ-ПЦР экспрессии мРНК одного из №-карра В-зависимых генов - 1кВа (рис. 11 б).

00

(б)

< 300

о

^ 250 -

л

« 200 р.

и

150 | 100 50

2

□ Контроль □ Е2

МСР-7 МСР-7/1_Э

«л,...^» »«Лед

К Е2 К Е2

МСР-7

ПсВ актин

Рис.11. Транскрипционная активность ОТ-карра В (а) и уровень мРНК 1кВ а (б) в клетках ¡\ICF-7 и МСТ-7/Ь5.

Таким образом, полученные результаты показали, что сенсибилизация эстрогеннезависимых клеток РМЖ к апоптотическому действию эстрадиола развивается независимо от приобретения клетками способности к эстрогеннезависимому росту и требует длительного периода культивирования в бесстероидной среде. Характерными признаками, определяющими сенсибилизацию клеток РМЖ к эстроген-индуцированному апоптозу, является снижение транскрипционной активности №-карра В, наряду с сохранением в резистентных клетках способности к эстрогензависимому подавлению №-карра В.

Анализ транскрипционной активности рецепторов эстрогенов.

Следует отметить, что способность эстрадиола подавлять транскрипционную активность, а по некоторым данным и экспрессию NF-kappa В хорошо известна и описана для многих экспериментальных моделей (Song R. X. et al., 2005; Biswas D. К. et al., 2005). Поскольку резистентные клетки MCF-7/LS сохраняют способность к эстрогензависимому подавлению NF-kappa В, мы предположили, что аппарат рецепторов эстрогенов может быть одним из факторов, ответственных за негативный контроль NF-kappa В в клетках MCF-7/LS.

Для анализа транскрипционной активности ER был использован метод транзиторной трансфекции в клетки репортерной плазмиды, содержавшей ген люциферазы под контролем эстроген-чувствительного элемента. Действительно, было обнаружено, что в клетках MCF-7/LS на фоне некоторого уменьшения концентрации и лиганд-связывающей способности ER отмечается резкое увеличение базальной транскрипционной активности ER. Примечательно, что добавление к клеткам TNF-a, одного из специфических индукторов NF-kappa В, вызывало существенное подавление транскрипционной активности ER, что свидетельствует о взаимной негативной регуляции между ER и NF-kappa В, сохраняющейся и в эстрогеннезависимой сублинии MCF-7/LS (рис.12).

ч

ш

с; 200 -, о

а 150 -га

а 100 -8-s =г 2 с ш а. ш

50

MCF-7

□ Контроль DTNF-alpha

MCF-7/LS

Рис.12. Транскрипционная активность ER в клетках МСР-7 и МСР-7/ЬЭ. Влияние ТОТ-а на активность ЕЙ.

На заключительной стадии работы исследовались возможные пути регуляции транскрипционной активности рецепторов эстрогенов в клетках сублинии МСР-7/Ъ8. При изучении влияния тамоксифена на

транскрипционную активность ЕЯ было обнаружено, что добавление к клеткам, трансфицированным плазмидой ЕЯЕ-ТК-ЬиС, тамоксифена вызывает существенное, более чем в 6 раз, снижение эстроген-индуцированной активности репортерного гена и лишь незначительное подавление его базальной активности (рис.13). Скорее всего, столь слабое влияние тамоксифена на базальную активность гена-репортера обусловлено лиганднезависимой активацией ЕЯ — процесса, который основан на образовании активных комплексов ЕЯ с некоторыми сигнальными белками. Следует отметить, что относительное увеличение ЕЯ-зависимой транскрипционной активности в клетках МСР-7/Ь8 по сравнению с таковой в родительских клетках сохраняется и в присутствии тамоксифена, что может быть связано с усилением лиганд-независимой активации ЕЯ в клетках МСР-

400

□ Контроль

□ Тамоксифен ШЕ2

0 Е2 + тамоксифен

МСР-7

МСР-7/1_3

Рис.13. Влияние тамоксифена и эстрадиола на ЕЯ-зависимую транскрипционную активность клеток МСР-7 и МСР-7/Ц5.

В настоящее время механизм лиганд-независимой активации ЕЯ до конца не ясен, однако установлено, что в поддержании базальной транскрипционной активности ЕЯ могут принимать участие некоторые из белков Р13К-сигнального пути. В наших экспериментах для исследования роли Р13К-сигнального пути в регуляции экспрессии ЕЯЕ-зависимого промотора была проведена котрансфекция клеток МСР-7/Ь8 плазмидой ЕЯЕ-ТК-ЬиС и плазмидой, содержавшей кДНК РТЕЫ - фосфатазы, дефосфорилирующей 3-ОН фосфоинозитиды. Было обнаружено, что

трансфекция клеток кДНК РТЕЫ приводит к заметному снижению ЕЯ-зависимой транскрипционной активности, что свидетельствует о возможном участии Р13К-сигнального пути в регуляции и поддержании лиганднезависимой активации ЕЯ (рис.14).

ч;

Щ 40

с;

о

3-

I о

К ш

-3-

рсО№3

РТЕЫ

Рис. 14. Влияние трансфекции PTEN на экспрессию ЕЯЕ-содержащей репортерной плазмиды в клетках МСР-7/Ь8. Ко-трансфекцию клеток МСР-7/Ь8 проводили плазмидой ЕЫЕ-ТК-ЬиС и плазмидой, содержавшей контрольный вектор pcDNAЗ или кДНК РТЕГЧ. Через 24 ч в клетках определяли активность люциферазы по стандартному протоколу.

Взятые вместе, результаты исследования транскрипционной активности ЕЯ свидетельствуют о выраженном повышении базальной (в отсутствие лиганда) активности рецепторов эстрогенов в клетках, чувствительных к апоптотическому действию эстрадиола, и демонстрируют важную роль Р13К-сигнального пути в регуляции активности ЕЯ.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Несмотря на очевидные достижения в лечении рака молочной железы, наметившиеся в последние годы, механизм развития резистентности этих опухолей к эндокринной терапии остается малопонятен. В настоящей работе исследовалась природа сигнальных путей, ответственных за поддержание эстрогеннезависимого роста клеток рака молочной железы, и значение кооперации между рецепторами эстрогенов и внутриклеточными сигнальными белками в процессе развития гормональной резистентности. Мы показали, что переход клеток рака молочной железы от

эстрогензависимой к эстрогеннезависимой стадии роста сопровождается активацией эстрогеннезависимых митогенных путей (VEGFR2/STAT3) и, одновременно, развитием гиперчувствительности к апоптотическому действию эстрадиола Было продемонстрировано, что активация митогенных сигнальных путей, характерная для резистентных клеток, не является достаточным условием для сенсибилизации клеток к эстроген-индуцированному апоптозу Установлено, что сенсибилизация клеток к эстроген-индуцированному апоптозу развивается независимо от приобретения клетками способности к эстрогеннезависимому росту, и требует длительного периода культивирования в бесстероидной среде

При исследовании влияния эстрадиола на содержание и активность основных компонентов NF-kappa В-сигнального пути было обнаружено, что эстрадиол практически не влияет на содержание рецепторов TNF-R1 и Fas, но вызывает существенное подавление транскрипционной активности NF-kappa В Оказалось, что эстрогеннезависимые сублинии, несмотря на резистентность к рост-стимулируюшему действию эстрадиола, сохраняют способность к подавлению активности NF-kappa В в ответ на действие эстрадиола При анализе содержания и функциональной активности рецептора эстрогенов мы обнаружили, что в резистентных клетках на фоне некоторого снижения концентрации и связывающей способности ER отмечается резкое увеличение его базальной транскрипционной активности Было продемонстрировано существование взаимной негативной регуляции между ER и NF-kappa В и получены доказательства участия PI3K в поддержании лиганд-независимой активации ER Учитывая способность эстрадиола подавлять активность NF-kappa В, мы предположили, что конститутивное повышение базальной транскрипционной активности ER может являться одним из факторов, поддерживающих функционирование негативной регуляторной петли ER - NF-kappa В и усиливающих апоптотическое действие эстрадиола в резистентных клетках

Мы полагаем, что в клетках рака молочной железы в условиях длительного отсутствия эстрогенов сохраняется функционирование негативной регуляторной петли ER - NF-kappa В, в том числе - в результате лиганд-независимой активации ER, что на фоне развития резистентности к митогенному действию эстрадиола может приводить к нарушению баланса между про- и антиапоптотическими сигнальными путями клетки и усилению апоптотического действия эстрадиола Косвенным доказательством

существования подобного дисбаланса может служить повышенная чувствительность клеток к действию некоторых проапоптотических агентов, развивающаяся параллельно с сенсибилизацией к апоптотическому действию эстрадиола

Взятые вместе, полученные данные свидетельствуют о перспективности использования комбинированного определения активности NF-kappa В, ER и PI3K в качестве дополнительного маркера чувствительности опухолей молочной железы к химио- и гормонотерапии Мы рассчитываем, что дальнейшие исследования в этом направлении позволят установить детальный механизм сенсибилизации опухолевых клеток к апоптотическому действию эстрогенов и идентифицировать основные внутриклеточные белки, участвующие в передаче апоптотического сигнала от эстрогенов

ВЫВОДЫ

1 Длительное культивирование in vitro клеток эстрогензависимого рака молочной железы MCF-7 в присутствии антиэстрогена тамоксифена и/или в бесстероидной среде приводит к формированию субпопуляции клеток, характеризующейся устойчивым эстрогеннезависимым ростом - и низкой чувствительностью к действию тамоксифена

2 Переход клеток рака молочной железы MCF-7 от эстрогензависимой к эстрогеннезависимой стадии роста сопровождается выраженным увеличением экспрессии эстрогеннезависимых сигнальных белков (VEGFR2, STAT3) на фоне незначительного снижения содержания рецепторов эстрогенов

3 Установлено, что эстрогеннезависимые сублинии, несмотря на резистентность к рост-стимулируюшему действию эстрадиола, сохраняют способность к подавлению активности антиапоптотического белка NF-kappa В в ответ на действие эстрадиола, и продемонстрировано существование взаимной негативной регуляции между NF-kappa В и рецепторами эстрогенов

4 Описан феномен сенсибилизации эстрогеннезависимых сублиний рака молочной железы к апоптотическому действию эстрадиола, развивающейся на фоне конститутивного снижения активности NF-kappa В в клетках Установлено, что сенсибилизация к апоптотическому действию эстрадиола развивается независимо от приобретения клетками способности к

эстрогеннезависимому росту и требует длительного периода культивирования в бесстероидной среде

5 В клетках, чувствительных к апоптотическому действию эстрадиола, обнаружено выраженное повышение базальной (в отсутствие лиганда) транскрипционной активности рецепторов эстрогенов, получены доказательства участия фосфатидилинозит-3-киназы в поддержании лиганднезависимой активации рецепторов эстрогенов

6 Полученные данные демонстрируют, что конститутивное повышение базальной активности рецепторов эстрогенов, наряду с сохранением в клетках способности к эстрогензависимому подавлению NF-kappa В, относятся к числу характерных признаков, определяющих сенсибилизацию клеток рака молочной железы к эстроген-индуцированному апоптозу Результаты работы свидетельствуют о перспективности использования комбинированного определения активности NF-kappa В, ER и PI3K в качестве дополнительного маркера чувствительности опухолей молочной железы к химио- и гормонотерапии

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. ЮС Лобанова, AM Щербаков, В А Шатская, МА Красильников Эстроген-зависимый апоптоз в клетках рака молочной железы роль сигнального пути, регулируемого NF-kappa В Биохимия, 2007, т 72, вып 3, с 392-401

2. А М Щербаков, Ю.С Лобанова, В А Шатская, О В Онопченко, А В Гаспарьян, Е С Герштейн, М А Красильников Сенсибилизация клеток рака молочной железы MCF-7 к апоптотическому действию эстрадиола Бюлл эксп биол мед , 2006, т 141, №3, с 334-337

3. А М Scherbakov, Y S Lobanova, V A Shatskaya, О V Onopchenko, Е S Gershtem, М A KrasiPnikov Activation of mitogenic pathways and sensitization to estrogen-induced apoptosis two independent characteristics of tamoxifen-resistant breast cancer cells9 Breast Cancer Research and Treatment 2006, 100 1-11

4. Ю С Лобанова, A M Щербаков, А В Гаспарьян, M А Красильников Механизм регуляции эстрогеннезависимого роста клеток рака молочной железы роль NF-кВ — сигнального пути IV съезд онкологов и радиологов СНГ Материалы съезда 28 сентября - 01 октября 2006 г, Баку, с 46, тез 171

5. Ю С Лобанова, А.М Щербаков, М А Красильников. Механизм эстроген-индуцированного апоптоза в клетках рака молочной железы роль NF-kB -сигнального пути. В сб «Актуальные вопросы теоретической, экспериментальной и клинической онкологии», Оренбург, изд. «Южный Урал», 2006 г., стр. 92-99.

6. А.М.Щербаков, Ю С Лобанова, Е.С.Герштейн, М А.Красильников. Сенсибилизация к апоптотическому действию эстрадиола и активация митогенных путей в тамоксифен-резистентных клетках рака молочной железы. XIII международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2006». 12-15 апреля 2006 г., Москва. Тезисы докладов, секция биология, с.258-259.

7. AM Щербаков, Ю.С.Лобанова, ЕС.Герштейн, М.А.Красильников Активация митогенных путей и сенсибилизация к апоптотическому действию эстрадиола в тамоксифен-резистентных клетках рака молочной железы. IV съезд онкологов и радиологов СНГ. Избранные лекции и доклады. 28 сентября - 01 октября 2006 г, Баку, с. 115-118.

I 8. М А Красильников, В.АШатская, ЕВЛузай, О.В Павличенко, AM Щербаков, Ю С Лобанова Механизм регуляции гормоннезависимого роста злокачественных опухолей, роль фосфатидилинозитольной , сигнальной системы. Тезисы Российской конференции по фундаментальной онкологии, Санкт-Петербург, 15 апреля 2005 г., стр 1213

9. A Scherbakov, Е S Gershtein, J.Lobanova, A.Shishkin, M.A.Krasil'mkov. VEGF signaling pathways in tamoxifen-resistant breast cancer cells. ISOBM 2005, The XXXIII Meeting of the International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine, 24-28 September 2005, Rhodes, Greece. Abstracts P-15, p 59

Подписано в печать 11 10.07 г. Формат 60x84/16 Тираж 100 экз Заказ №252. Отпечатано в службе множительной техники ГУ РОНЦ им. Н Н. Блохина РАМН 115478, Москва, Каширское ш, 24

Фундаментальной проблемой современной экспериментальной онкологии является исследование механизма адаптации опухолевых клеток к действию противоопухолевых препаратов, в том числе ингибиторов пролиферации стероидной природы. Стероидные гормоны играют исключительно важную роль в регуляции пролиферации нормальных тканей организма, выступая в роли физиологических ингибиторов деления клеток (глюкокортикоидные гормоны, прогестины) или стимуляторов пролиферации (эстрогены, андрогены) [Берштейн J1.M, 2004]. Однако далеко не все злокачественные опухоли сохраняют зависимость от гормонов, более того, уровень гормональной зависимости опухоли может существенно снижаться по мере проведения терапии стероидами (глюкокортикодами, антиэстрогенами или антиандрогенами), приводя в итоге к формированию гормоннезависимых форм. Оказалось, что во многих случаях снижение гормональной зависимости опухолей не связано с потерей специфических рецепторов, ответственных за связывание гормона внутри клетки-мишени [Encarnacion С.A. et al., 1993]. Что препятствует действию гормонов в таких опухолях, какие факторы могут определять истинный уровень % гормональной зависимости опухолей — окончательные ответы на эти вопросы пока не получены.

Одним из перспективных направлений экспериментальной онкологии является исследование механизма развития приобретенной резистентности к эстрогенам в клетках рака молочной железы (РМЖ). За последние годы с помощью исследований in vitro выявлено несколько ключевых механизмов, поддерживающих эстрогеннезависимый рост опухолевых клеток: активация рецепторных тирозинкиназ, нарушение регуляции белков клеточного цикла, активация митогенных путей, изменение функциональной активности рецепторов эстрогенов и др. [Красильников М.А., 2004; Clarke R. et al., 2003; Henderson B.E. et al., 2003; Ring

A. et al., 2004]. Известно, что одним из возможных механизмов гормональной резистентности РМЖ является активация сигнальных путей факторов роста, активация митогенных и антиапоптотических сигнальных путей клетки. Исследования последних лет показали, что активное участие в регуляции роста и выживаемости опухолевых клеток принимают фосфатидилинозит-3-киназа (PI3K, phosphatidylinositol-3 kinase) и Р13К-зависимые ферментативные системы, под контролем которых находятся важнейшие сигнальные пути клетки.

Поскольку одной из характерных особенностей метаболизма гормон-резистентных клеток является конститутивная, независимая от гормонов, активация митогенных и антиапоптических сигнальных путей, то особое внимание привлекает возможное участие рецепторов в лиганднезависимой активации таких сигнальных белков. Так, было продемонстрировано, что рецепторы стероидов взаимодействуют с регуляторной субъединицей PI3K, стимулируют фосфорилирование и приводят к дополнительной активации белков STAT, причем в этом случае действие рецепторов не связано с транслокацией в клеточное ядро, но ограничивается цитоплазматическими белок-белковыми взаимодействиями [Bjornstrom L. et al., 2002]. Описано взаимодействие рецепторов и с некоторыми другими сигнальными белками, включая рецепторы ростовых факторов, NF-kappa В, р53 и др. [Harnish D.C. et al., 2000; McKay L.A. et al., 1999; Nicholson R.I. et al., 2001; Osborne C.K. et al., 2001; Sengupta S. et al., 2001], но в целом вопрос о значении кооперации между рецептором эстрогенов и митогенными сигнальными путями в развитии гормональной резистентности клеток остается открытым.

В этой связи особое внимание исследователей привлекает феномен парадоксальной сенсибилизации гормонрезистентных клеток РМЖ к апоптотическому действию эстрадиола [Liu Н et al., 2003; Song RX et al., 2001; Song RX et al., 2005]. Обнаружено, что при развитии резистентности клеток рака молочной железы к пролиферативному действию эстрадиола и активизации эстрогензависимого роста опухолевые клетки могут приобретать чувствительность к апоптотическому действию эстрадиола [Song, R.X. et al., 2001; Song, R. X. et al., 2003; Song, R. X. et al., 2005; Liu H. et al., 2003; Osipo, C. et al., 2003; Shcherbakov A. M. et al., 2006]. Феномен парадоксальной чувствительности к апоптотическому действию эстрадиола, как правило, наблюдается в клетках, длительное время культивированных в бесстероидной среде и/или в присутствии антиэстрогенов in vitro, не чувствительных к пролиферативному действию эстрогенов, но сохранивших высокий уровень экспрессии рецепторов эстрогенов [Song, R. X. et al., 2001; Song, R. X. et al., 2003; Liu H. et al., 2003; Lewis J. S. et al., 2005]. Целый ряд экспериментальных и клинических наблюдений, показавших эффективность эстрогеновой терапии при лечении резистентных форм рака молочной железы, подтверждает возможность сенсибилизации опухолевых клеток к апоптотическому действию эстрадиола in vivo [Song, R. X. et al., 2001; Song, R. X. et al., 2003; Liu H. et al., 2003; Osipo, C. et al., 2003; Lewis J. S. et al., 2005; Osipo C. et al., 2005; Lonning P. E. et al., 2001; Peethambaram P. P. et al., 1999; Jordan V. C. et al., 2003; Osipo C. et al., 2004]. В целом известные сегодня литературные данные позволяют рассматривать сенсибилизацию клеток к апоптотическому действию эстрогенов в качестве одного из возможных и распространенных вариантов прогрессии опухолей, развивающихся в условиях дефицита эстрогенов и/или продолжительной терапии антиэстрогеновыми препаратами.

Цель работы:

Целью настоящей работы является исследование природы сигнальных путей, ответственных за поддержание эстрогеннезависимого роста клеток рака молочной железы и изучение возможной кооперации между рецепторами эстрогенов и внутриклеточными сигнальными белками в процессе развития гормональной резистентности.

Задачи исследования:

1. Выделение и сравнительная характеристика сублиний клеток рака молочной железы MCF-7, полученных в условиях длительного культивирования клеток с антиэстрогеном тамоксифеном (серия MCF-7/T) или в бесстероидной среде (сублиния MCF-7/LS).

2. Сравнительный анализ активности фосфатидилинозитольного пути и митогенных сигнальных белков в родительской линии MCF-7 и эстрогеннезависимых сублиниях.

3. Исследование экспрессии, связывающей способности и транскрипционной активности рецептора эстрогенов (ER) в клетках MCF-7, MCF-7/T и MCF-7/LS. Значение фосфатидилинозит-3-киназы (PI3K) в регуляции активности ER.

4. Исследование механизма сенсибилизации эстрогеннезависимых клеток РМЖ к апоптотическому действию эстрадиола: роль NF-kappa В - сигнального пути.

Научная новизна работы.

Установлено, что длительное культивирование клеток эстрогензависимого рака молочной железы MCF-7 в присутствии антиэстрогена тамоксифена и/или в бесстероидной среде приводит к формированию эстрогеннезависимой популяции клеток, характеризующейся резистентностью к пролиферативному действию эстрадиола, выраженной активацией эстрогеннезависимых митогенных путей (STAT3, VEGFR2) и, одновременно, парадоксальной чувствительностью к апоптотическому действию эстрадиола. Впервые продемонстрировано, что в клетках, чувствительных к апоптотическому действию эстрадиола, последний практически не влияет на содержание рецепторов TNF-R1 и Fas, но существенно подавляет транскрипционную активность NF-kappa В. Обнаружено, что в таких клетках на фоне некоторого снижения концентрации и связывающей способности рецепторов эстрогенов резко увеличивается базальная (в отсутствие лиганда) ER-зависимая транскрипционная активность, и продемонстрировано существование взаимной негативной регуляции между ER и NF-kappa В. Получены доказательства участия PI3K в поддержании лиганднезависимой активации ER. В целом результаты работы свидетельствуют, что увеличение базальной транскрипционной активности ER, наряду с сохранением в клетках способности к эстрогензависимому подавлению NF-kappa В, относятся к числу характерных признаков, определяющих сенсибилизацию клеток рака молочной железы к эстроген-индуцированному апоптозу.

Научно-практическая значимость.

Исследования носят экспериментальный характер и направлены на изучение природы сигнальных путей, поддерживающих эстрогеннезависимый рост клеток рака молочной железы. Представленные данные демонстрируют, что развитие гормональной резистентности ER-положительных опухолей может сопровождаться изменением активности некоторых про- и антиапоптотических белков и частичной сенсибилизацией клеток к действию проапоптотических соединений. Установлено значение транскрипционного фактора NF-kappa В как возможного участника кооперации между рецепторами эстрогенов и внутриклеточными сигнальными белками, определяющего чувствительность эстрогеннезависимых клеток РМЖ к действию проапоптотических соединений. Полученные данные свидетельствуют о перспективности использования комбинированного определения активности NF-карра В, ER и PI3K в качестве дополнительного маркера чувствительности опухолей молочной железы к химио- и гормонотерапии.

выводы

1. Длительное культивирование in vitro клеток эстрогензависимого рака молочной железы MCF-7 в присутствии антиэстрогена тамоксифена и/или в бесстероидной среде приводит к формированию субпопуляции клеток, характеризующейся устойчивым эстрогеннезависимым ростом и низкой чувствительностью к действию тамоксифена.

2. Переход клеток рака молочной железы MCF-7 от эстрогензависимой к эстрогеннезависимой стадии роста сопровождается выраженным увеличением экспрессии эстрогеннезависимых сигнальных белков (VEGFR2, STAT3) на фоне незначительного снижения содержания рецепторов эстрогенов.

3. Установлено, что эстрогеннезависимые сублинии, несмотря на резистентность к рост-стимулируюшему действию эстрадиола, сохраняют способность к подавлению активности антиапоптотического белка NF-kappa В в ответ на действие эстрадиола, и продемонстрировано существование взаимной негативной регуляции между NF-kappa В и рецепторами эстрогенов.

4. Описан феномен сенсибилизации эстрогеннезависимых сублиний рака молочной железы к апоптотическому действию эстрадиола, развивающейся на фоне конститутивного снижения активности NF-kappa В в клетках. Установлено, что сенсибилизация к апоптотическому действию эстрадиола развивается независимо от приобретения клетками способности к эстрогеннезависимому росту и требует длительного периода культивирования в бесстероидной среде.

5. В клетках, чувствительных к апоптотическому действию эстрадиола, обнаружено выраженное повышение базальной (в отсутствие лиганда) транскрипционной активности рецепторов эстрогенов; получены доказательства участия фосфатидилинозит-3-киназы в поддержании лиганднезависимой активации рецепторов эстрогенов.

6. Полученные данные демонстрируют, что конститутивное повышение базальной активности рецепторов эстрогенов, наряду с сохранением в клетках способности к эстрогензависимому подавлению NF-kappa В, относятся к числу характерных признаков, определяющих сенсибилизацию клеток рака молочной железы к эстроген-индуцированному апоптозу. Результаты работы свидетельствуют о перспективности использования комбинированного определения активности NF-kappa В, ER и PI3K в качестве дополнительного маркера чувствительности опухолей молочной железы к химио- и гормонотерапии.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Несмотря на очевидные достижения в лечении рака молочной железы, наметившиеся в последние годы, механизм развития резистентности этих опухолей к эндокринной терапии остается малопонятен. В настоящей работе исследовалась природа сигнальных путей, ответственных за поддержание эстрогеннезависимого роста клеток рака молочной железы, и значение кооперации между рецепторами эстрогенов и внутриклеточными сигнальными белками в процессе развития гормональной резистентности. Мы показали, что переход клеток рака молочной железы от эстрогензависимой к эстрогеннезависимой стадии роста сопровождается активацией эстрогеннезависимых митогенных путей (VEGFR2/STAT3) и, одновременно, развитием гиперчувствительности к апоптотическому действию эстрадиола. Было продемонстрировано, что активация митогенных сигнальных путей, характерная для резистентных клеток, не является достаточным условием для сенсибилизации клеток к эстроген-индуцированному апоптозу. Установлено, что сенсибилизация клеток к эстроген-индуцированному апоптозу развивается позже и, возможно, независимо от приобретения клетками способности к эстрогеннезависимому росту, и требует длительного периода культивирования в бесстероидной среде.

При исследовании влияния эстрадиола на содержание и активность основных компонентов NF-kappa В-сигнального пути было обнаружено, что эстрадиол практически не влияет на содержание рецепторов TNF-R1 и Fas, но вызывает существенное подавление транскрипционной активности NF-kappa В. Оказалось, что эстрогеннезависимые сублинии, несмотря на резистентность к рост-стимулируюшему действию эстрадиола, сохраняют способность к подавлению активности NF-kappa В в ответ на действие эстрадиола. При анализе содержания и функциональной активности рецептора эстрогенов мы обнаружили, что в резистентных клетках на фоне некоторого снижения концентрации и связывающей способности ER отмечается резкое увеличение его базальной транскрипционной активности. Было продемонстрировано существование взаимной негативной регуляции между ER и NF-kappa В и получены доказательства участия PDK в поддержании лиганд-независимой активации ER-Учитывая способность эстрадиола подавлять активность NF-kappa В, мы предположили, что конститутивное повышение базальной транскрипционной активности ER может являться одним из факторов, поддерживающих функционирование негативной регуляторной петли ER -NF-kappa В и усиливающих апоптотическое действие эстрадиола в резистентных клетках.

В целом полученные данные демонстрируют, что конститутивное повышение базальной (лиганд-независимой) активности ER, наряду с сохранением в клетках способности к эстрогензависимому подавлению NF-kappa В, относятся к числу характерных признаков, определяющих сенсибилизацию клеток рака молочной железы к эстроген-индуцированному апоптозу. Мы полагаем, что в клетках рака молочной железы в условиях длительного отсутствия эстрогенов сохраняется функционирование негативной регуляторной петли ER - NF-kappa В, в том числе — в результате лиганд-независимой активации ER, что на фоне развития резистентности к митогенному действию эстрадиола может приводить к нарушению баланса между про- и антиапоптотическими сигнальными путями клетки и усилению апоптотического действия эстрадиола. В частности, сенсибилизация опухолевых клеток к эстроген-индуцированному апоптозу может быть основана на дисбалансе между апоптотическими (NF-kappa В) и проапоптотическими, в том числе р53-зависимыми, сигнальными путями. Поздние стадии развития гормональной резистентности клеток рака молочной железы сопровождаются конститутивным подавлением активности NF-kappa В при сохранении или увеличении активности проапоптотических сигнальных белков, что в конечном итоге провоцирует дальнейшее нарушение такого баланса и приводит к потенцированию апоптотического сигнала эстрадиолом и развитию апоптоза в клетках. Косвенным доказательством существования подобного дисбаланса может служить повышенная чувствительность клеток к действию некоторых проапоптотических агентов, развивающаяся параллельно с сенсибилизацией к апоптотическому действию эстрадиола.

Взятые вместе, полученные данные свидетельствуют о перспективности использования комбинированного определения активности NF-kappa В, ER и PI3K в качестве дополнительного маркера чувствительности опухолей молочной железы к химио- и гормонотерапии. Мы рассчитываем, что дальнейшие исследования в этом направлении позволят установить детальный механизм сенсибилизации опухолевых клеток к апоптотическому действию эстрогенов и идентифицировать основные внутриклеточные белки, участвующие в передаче апоптотического сигнала от эстрогенов.