Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Ферменты метаболизма эстрогенов и их рецепторы при раке молочной железы

□03053545

На правах рукописи

ШАШОВ А Елена Евгеньевна

ФЕРМЕНТЫ МЕТАБОЛИЗМА ЭСТРОГЕНОВ И ИХ РЕЦЕПТОРЫ ПРИ РАКЕ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

14.00.14 - онкология 14.00.16 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

ТОМСК - 2007

003053545

Работа выполнена в ГУ НИИ онкологии Томского научного центра СО РАМН.

Научные руководители: доктор медицинских наук

доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор,

заслуженный деятель науки

доктор медицинских наук, профессор

Кондакова Ирина Викторовна Слонимская Елена Михайловна

Удут Владимир Васильевич Степовая Елена Алексеевна

Ведущая организация: ФГУ Российский онкологический научный центр им. H.H. Блохина РАМН, г. Москва.

Защита состоится «_» февраля 2007 г. в _ часов на заседании

диссертационного совета Д.ОО 1.032.01 при НИИ онкологии Томского научного центра СО РАМН (634009, Россия, г. Томск, пер. Кооперативный 5).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ онкологии Томского научного центра СО РАМН.

Автореферат разослан_декабря 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

д.м.н. Фролова И.Г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Злокачественные новообразования молочных желез занимают лидирующее место в структуре онкологических заболеваний среди женского населения. Статистические данные констатируют ежегодное увеличение числа диагностируемых случаев рака молочной железы (РМЖ). В мире выявляют около 1 млн. новых случаев за год, к 2010г. прогнозируется рост числа заболевших до 1,45 млн [Давыдов М. И, Аксель Е. М, 2001]. Отмечается неуклонный рост численности больных, увеличение показателей смертности и возникновение злокачественных новообразований этой локализации в более раннем возрасте по сравнению с прошлыми десятилетиями [Писарева Л.Ф., 2002]. Развитие и биологические характеристики РМЖ во многом определяются метаболизмом эстрогенов [Берштейн JI.M., 2000]. Показан широкий спектр важных функций, которые регулируют эстрогены, связываясь с внутриклеточными рецепторами и активируя экспрессию различных генов [Suzuki Т., et al. 2005]. К наиболее значимым проявлениям действия эстрогенов относят активацию пролиферации [Han II., et al., 2006], ингибирование процесса апоптоза, а так же стимуляцию выработки факторов роста (трансформирующий фактор роста а, эпидермальный фактор роста) [Secger Н., 2006]. Вышеперечисленные эффекты могут обуславливать развитие пролиферативных гиперпластических процессов и рака в эстроген-звисимых тканях, в которых имеются рецепторы эстрогенов.

В молочной железе эстрогены могут образовываться в тканях или захватываться из циркулирующей крови. Внутриорганлая выработка эстрогенов преимущественно осуществляется ароматазой, которая способствует конверсии андрогенов в эстрогены, а также стероидсульфатазой, преобразующей неактивный эстрон сульфат в эстрон [Nakata Т., et al., 2003]. Влияние эстрогенов на клетки опосредовано их взаимодействием с рецепторами. Комплекс гормона с рецепторами транслоцируется в ядро, активирует соответствующие гены и стимулирует пролиферацию ткани молочной железы, а также ингибирует апоптоз. В процессе пролиферации увеличивается вероятность появления мутаций и ограничивается время, необходимое для репарации повреждений, что играет важную роль в развитии злокачественных опухолей. Не связавшиеся с рецепторами эстрогены и их метаболиты обладают генотоксическим эффектом [Seeger Н., 2005; Zhao Z., 2006]. Инактивация эстрогенов включает их гидроксилирование 2,4- эстрогенгидроксилазами и коньюгирование в реакциях, катализируемых катехол-О-метилтрансферазой (КОМТ) и глютатион-S-трансферазой (TST). Снижение активности ферментов метаболизма эстрогенов может приводить к накоплению высокоактивных промежуточных метаболитов и повреждению внутриклеточных структур, главным образом ДНК. Усиление процессов пролиферации и непосредственное генотоксическое действие эстрогенов является важным патогенетическим звеном в канцерогенезе, развитии первичной опухоли, дальнейшей опухолевой прогрессии РМЖ [Zhu В.Т., Соппеу А.Н., 1998].

В настоящее время при определении прогноза заболевания и выбора наиболее адекватной тактики лечения больных РМЖ основываются на ряде факторов, определяющих как особенности организма (возраст, состояние

менструальной функции), так и биологические характеристики самой опухоли (размер опухоли, наличие метастазов в регионарные лимфоузлы, тип опухолевого роста, гистологическая принадлежность, степень злокачественности, инвазия кровеносных и лимфатических сосудов, уровень экспрессии рецепторов эстрогенов и прогестерона и др.). Однако результаты лечения далеко не всегда являются удовлетворительными, и в настоящее время ведется поиск новых, более информативных параметров, позволяющих адекватно учитывать молекулярные механизмы развития опухолевого процесса.

Все сказанное определяет актуальность исследования метаболизма и рецепции эстрогенов в тканях при раке молочной железы, а также их связи с основными клинико-морфологическими характеристиками и прогнозом заболевания.

Цель и задачи исследования:

Изучить активность ферментов метаболизма эстрогенов и уровня рецепторов эстрогенов и прогестерона в неизмененной, опухолевой ткани, лимфогенных метастазах и оценить их прогностическую значимость.

1. Изучить активность ферментов метаболизма эстрогенов (ароматазы, стероид сульфатазы, 2-/4-эстрогенгидроксилаз, катехол-О-метилтрансферазы и глугатион-5-трансферазы) у больных РМЖ в неизмененной, опухолевой ткани и лимфогенных метастазах.

2. Оценить содержание рецепторов эстрогенов и прогестерона у больных РМЖ в неизмененной, опухолевой тканях, лимфогенных метастазах и сопоставить с активностью ферментов метаболизма эстрогенов.

3. Исследовать взаимосвязь между активностью ферментов метаболизма эстрогенов в изучаемых тканях и основными клинико-морфологическими параметрами у больных РМЖ.

4. Оценить прогностическую значимость активности ферментов метаболизма эстрогенов и содержания рецепторов стероидных гормонов в тканях при РМЖ.

Научная новизна:

Впервые в комплексе изучены метаболизм и рецепция эстрогенов в неизмененной, опухолевой ткани и лимфогенных метастазах у больных раком молочной железы. Показано, что синтез эстрогенов в опухоли обеспечивается стероидсульфатазой, а в перифокальных тканях превалирует ароматазный путь. В опухолях наблюдается недостаточная инактивация метаболитов эстрогенов за счет сниженной активности КОМТ, а в ткани лимфогенных метастазов метаболизм эстрогенов ингибирован из-за снижения активности и КОМТ и ГБТ. Впервые показано, что метаболизм эстрогенов опухолей и перифокальных тканей находится в тесной взаимосвязи.

Получены новые данные фундаментального характера, касающиеся различных путей метаболизма эстрогенов у больных РМЖ в различные возрастные периоды. Результаты исследования показали, что у женщин моложе 40 лет нарушены процессы инактивации эстрогенов за счет высокой активности 2,4-эстрогенгидроксилаз, низкой активности Г8Т и КОМТ, что, вероятно,

обуславливает более агрессивное течение злокачественного процесса. У пациенток старше 50 лет наблюдались высокий уровень локального синтеза эстрогенов, их инактивации и рецепции, что оказывает влияние на развитие более благоприятного течения РМЖ.

Впервые получены данные о прогностической значимости активности ароматазы, 2,4-эстрогенгидроксилаз и ГБТ в опухоли. Установлено, что низкая активность ароматазы (менее 20 фмоль андростендиона/мг белка в час), высокая активность 2,4-эстрогенгидроксилаз (более 230 пмоль метоксиэстрогенов/мг белка в час) являются неблагоприятными факторами прогноза в отношении возникновения рецидива заболевания, а низкая активность Г$Т (менее 40 мкмоль ХДНБ/мг белка в мин) является значимым критерием риска развития отдаленных метастазов при РМЖ.

Теоретическая и практическая значимость:

Изучение активности ферментов метаболизма эстрогенов и уровня рецепторов женских половых гормонов расширило представление о патогенезе развития РМЖ и об их вкладе в процесс метастазирования. Новые данные фундаментального характера, касающиеся различных путей метаболизма эстрогенов у больных РМЖ в различные возрастные периоды, могут служить основой для дальнейшего изучения механизмов канцерогенеза и прогрессирования опухолевого процесса.

Выявленные изменения активности ферментов метаболизма эстрогенов могут рассматриваться в качестве параметров, характеризующих биологические особенности опухоли. Высокая активность ароматазы и стероидсульфатазы, низкая активность ГБТ сопряжены с большим размером опухоли (Т3) и обширным поражением регионарных лимфоузлов (N2-3). Низкая активность ГБТ наблюдается при большей степени злокачественности (03). Доказано, что недостаточная инактивация метаболитов гормонов связана с наличием наиболее злокачественного фенотипа опухоли. Данные о прогностической значимости активности ароматазы, эстрогенгидроксилаз, ГБТ в опухоли свидетельствуют о целесообразности использования изучаемых параметров в качестве дополнительных прогностических критериев при РМЖ.

Положения, выносимые на защиту

1. Активность ферментов метаболизма эстрогенов имеет свои отличия в ряду «неизмененная ткань - опухоль -лимфогенные метастазы». В опухоли синтез эстрогенов обеспечивается стероидсульфатазой, а в перифокальных тканях молочной железы превалирует ароматазный путь. Ингибирование процессов инактивации метаболитов эстрогенов в опухолевой ткани обусловлено снижением активности КОМТ, а в ткани лимфогсииых метастазов - и КОМТ, и ГЭТ.

2. Активность ферментов метаболизма эстрогенов может использоваться в качестве критериев, характеризующих биологические особенности опухоли. Высокая активность ароматазы и низкая активность ГБТ сопряжены с большим размером опухоли (Т3) и обширным поражением регионарных

лимфоузлов (N2.3). Низкая активность TST наблюдается при большей степени злокачественности (G3). 3. Активность ферментов метаболизма эстрогенов можно рассматривать в качестве дополнительных прогностических критериев. Активность ароматазы менее 20 фмоль/мг белка в час, активность 2,4-эстрогенгидроксилаз более 230 пмоль/мг белка в час являются неблагоприятными факторами прогноза в отношении возникновения рецидива заболевания, а активность FST менее 40 мкмоль/мг белка в мин является значимым критерием риска развития отдаленных метастазов при РМЖ.

Апробация диссертации:

Основные положения и результаты научных исследований были доложены и обсуждены на Российской научно-практической конференции «Современное состояние и перспективы развития экспериментальной и клинической онкологии», г.Томск (2004); конференции молодых ученных НИИ Онкологии „Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онко' ;гии ", г.Томск (2004); на региональной конференции молодых ученых НИИ Онкологии .Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии", г.Томск (2006); на 13 международном конгрессе с международным участием по приполярной медицине г.Новосибирск (2006); на Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Онкология сегодня. Успехи и перспективы», г. Казань (2006).

Публикации:

По теме диссертации опубликовано 16 печатных работ, отражающих основные положения диссертации, из них 2 статьи в центральной печати.

Объем и структура диссертации:

Диссертационная работа изложена на 125 страницах машинописного текста, состоит из введения, трех глав, включающих обзор литературы, материал и методы исследования, главы с изложением собственных результатов, заключения, выводов, списка цитируемой литературы. Библиографический указатель включает 163 источника, из них 42 отечественных, 121 зарубежный. Работа иллюстрирована 14 таблицами и 24 рисунками.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В исследование было включено 85 больных РМЖ ТмЫ0.зМоВ возрасте 30-69 лет (средний возраст 53,62±1,08 лет), которые проходили лечение в отделении общей онкологии ГУ НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН с 2002 по 2005 год. У всех больных диагноз был морфологически верифицирован. Лечение включало в себя проведение 2-4 курсов неоадьювантной химиотерапии по схемам CMF, CAF, FAC с последующим выполнением хирургического вмешательства в объеме радикальной мастэктомии или радикальной резекции. В послеоперационном периоде проводилось 4-6 курсов адьювантной химиотерапии по одной из вышеуказанных схем, лучевая и антиэстрогенная терапия по показаниям. В представленном исследовании 8% составили лица моложе 40 лет, 31% в возрасте 41-50 и 61% больных - старше 50 лет. Характеризуя распределение больных в

зависимости от состояния менструальной функции отмечено, что 35% пациенток находились в репродуктивном периоде, 15% в перименопаузе и 50% в состоянии постменопаузы. У 9% больных размер первичной опухоли был до 2 см в диаметре (Т|), у 58% размер первичной опухоли был от 2 до 5 см (Т2), у 21% наблюдалась Тз стадия, когда опухоль была больше 5 см в диаметре и у 12% наблюдалось прорастание опухоли на близлежащие ткани (Т4). Лимфогенные метастазы (N0) отсутствовали у 37%, у 35% метастазами было поражено до 4 регионарных лимфоузлов (Nj), у 26% обнаружено от 5 до 10 метастатических лимфоузлов (N2), и у 2% было поражено метастазами более 10 лимфоузлов (N3). Вторая степень злокачественности опухоли отмечалась у 68% больных, и у 32% была третья степень злокачественности.

Срок наблюдения за больными, включенными в исследование составил от 3 до 42 месяцев. Прогрессирование процесса было отмечено у 10 (12%) больных за счет развития рецидивов опухоли и у 19 (22%) пациентов были выявлены отдаленные метастазы.

Активность ферментов метаболизма эстрогенов и их рецепторов изучали в тканях больных раком молочной железы. Для этого из операционного материала брали образцы опухолевой, неизмененной тканей молочной железы, находящейся на расстоянии 1 - 5 см от первичной опухоли, а также лимфоузлы с метастазами и без, очищали от участков некроза, кровоизлияний и помещали в жидкий азот.

Методы исследования:

Активность ароматазы оценивали по образованию тяжелой воды из меченного тритием в (-/¡¡-положении андростендиона [Ларионов A.A., 1998]. Счет радиоактивности производили на тритиевом канале жидкостного сцинтилляционного счетчика MICROBETA (Perkin Elmer, США). Активность фермента выражали в фмоль андростендиона/мг белка в 1 час.

Активность стероидсульфатазы оценивали по количеству образующегося [3Н]-эстрона из [3Н]-эстрон сульфата [Barth А., 2000]. Счет радиоактивности производили на тритиевом канале жидкостного сцинтилляционного счетчика MICROBETA (Perkin Elmer, США). Активность фермента выражали в фмоль эстрон сульфата/мг белка в час .

Определение суммарной 2,4-эстрогенгидроксилазной активности проводили радиометрическим методом [Theron, C.N., Rüssel V.A., Taljard J.J., 1986] с использованием 5-Аденозил-Ь-[метил 3Н]метионина молярной радиоактивностью 15 Ci/mmol ("Amersham Biosciences", Великобритания) в качестве субстрата. Счет радиоактивности производили на тритиевом канале жидкостного сцинтилляционного счетчика MICROBETA (Perkin Elmer, США). Активность фермента выражали в пмоль метоксиэстрогенов/мг белка в час.

Активность катехол-о-метилтрансферазы определяли радиометрическим методом [Zürcher G., Da Prada М., 1982] с использованием в качестве субстрата S-Аденозил-L-[метил 3Н] метионина с молярной радиоактивностью 15 Ci/mmol ("Amersham Biosciences", Великобритания). Счет радиоактивности производили на тритиевом канале жидкостного сцинтилляционного счетчика MICROBETA (Perkin Elmer, США). Активность фермента выражали в мкмоль гвоякола/мг белка в час.

Активность глютатионтрансферазы оценивали спектрофотометрическим методом. Принцип метода основан на образовании хромогенного комплекса

восстановленного глютатиона с хлординитробензолом (ХДНБ), регистрируемого спектрофотометрически при длине волны 340 им. [Keen et al. 1976]. Образование комплекса катализируется глутатионтрансферазой (rST). Измерение оптической плотности проводилось на спектрофотометре «SPECORD М40» (Carl Zeiss JENA - Германия). Активность фермента выражали в мкмоль хлординитробензола/мг белка в мин.

Рецепторы эстрогенов и прогестерона определяли радиолигандным методом [Бассалык J1.C., 1987]. В работе использовались [2, 4, 6, 7-3H]-Oestradiol и [1,2,6,7 - 3H]-Progesteron ("Amersham Biosciences", Великобритания). Содержание рецепторов стероидных гормонов в цитозоля тканей выражали в фмоль гормона, специфически связанного 1 мг цитозольного белка. Рецепторположительными считали ткани, в цитозолях которых содержалось более 10 фмоль специфически связанного эстрадиола или 10 фмоль специфически связанного прогестерона на 1 мг белка.

Содержание белка в исследуемых тканях определяли по методу Лоури.

Статистическую обработку результатов исследования проводили на персональном компьютере с использованием пакета прикладных статистических программ «STATISTICA 6.0». Характер распределения исследуемых выборок проводился по критерию Колмогорова-Смирнова. Достоверность различий между группами определяли с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни для независимых выборок. Статистически значимыми считались различия при р<0,05. Наличие связи между изучаемыми признаками проводили с использованием корреляционного анализа и оценивали по коэффициенту корреляции Спирмена (R). Для оценки прогностической значимости статуса рецепторов стероидных гормонов и активности ферментов метаболизма эстрогенов в тканях при раке молочной железы использовали однофакторный анализ прогностической значимости признаков, который был выполнен с использованием критерия Гехана-Вилкоксона (Survival Analysis, Statistica 6.0). Показатели 2-летней безрецидивной и безметастатической выживаемости анализировали с помощью построения кривых выживаемости по методу Каплана-Майера. Сравнение показателей выживаемости в группах проводили по критерию Гехана-Вилкоксона [В. П. Боровиков, П. П. Боровиков, 1998].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Для выявления особенностей метаболизма эстрогенов, характерных для разных тканей при раке молочной железы, была изучена активность ферментов синтеза и деградации эстрогенов в неизмененной, опухолевой тканях и лимфогенных метастазах.

При исследовании особенностей метаболизма эстрогенов было обнаружено, что активность ароматазы в неизмененной ткани в 1,5 раз выше, чем в опухолевой (р<0,01). В лимфогенных метастазах активность ароматазы достоверно не отличалась от опухолевой ткани. Активность стероидсульфатазы увеличивалась в ряду: «неизмененная ткань - опухоль - лимфогенные метастазы» (р<0,05). Это свидетельствует о высоком локальном образовании эстрогенов в неизмененной, опухолевой ткани молочной железы и в лимфогенных метастазах (рис.1).

Можно полагать, что высокий локальный синтез эстрогенов в перифокальных тканях за счет ароматазы обусловлен тем, что опухолевая ткань использует для своей жизнедеятельности эстрогены из окружающей ткани, что подтверждается литературными данными [Miller W.L., 2001]. Высокая активность стероидсульфатазы в опухоли связана с превалированием в ней процессов десульфатирования над ароматизацией.

Ш неизмененная ткань □ опухолевая ткань ЕЗлимфогенные метастазы

Рис. 1. Активность ферментов синтеза эстрогенов в тканях при раке молочной железы.

Примечание: * - значимая достоверность различий по отношению к неизмененной ткани.

При изучении ферментов деградации эстрогенов наблюдалось снижение активности КОМТ в ряду «неизмененная ткань - опухоль - лимфогенные метастазы». Активность глютатионтрансферазы была выше в опухолях по сравнению с неизмененной тканью (р<0,01) и тканью лимфогенных метастазов (р<0,05) (рис.2).

Таким образом, синтез эстрогенов в опухоли обеспечивается стероидсульфатазой, а ароматазный путь превалирует в перифокальных тканях. Инактивация эстрогенов в опухоли сопровождается высокой активностью эстрогенгидроксилаз и ГБТ, а также снижением активности КОМТ по сравнению с неизмененными тканями молочной железы. Вероятно, инактивирование активности КОМТ в опухолевой ткани может являться фактором, способствующим недостаточному метаболизму высокоактивных катехолэстрогенов, что может приводить к генотоксическому эффекту, обеспечивающему появление более злокачественного опухолевого фенотипа. Подтверждением этого предположения является дальнейшее ингибирование инактивации катехолэстрогенов за счет активности как КОМТ, так и ГБТ при развитии метастазов в регионарных лимфоузлах. По-видимому, это свидетельствует о том, что эстрогены принимают участие не только в канцерогенезе, но и в опухолевой прогрессии.

эстрогенгидроксилазы

EI неизмененная ткань В опухолевая ткань □ лнмфогенные метастазы

Рис. 2. Активность ферментов метаболизма эстрогенов в тканях при раке молочной железы.

Примечание: * - значимая достоверность различий по отношению к неизмененной ткани; ** - по отношению к опухолевой ткани.

В проведенном нами исследовании были получены результаты о низком соответствии статуса рецепторов стероидных гормонов в первичных опухолях и метастазах, что возможно обусловлено изменением уровня стероидных рецепторов при прогрессии заболевания. Изменение рецепторного статуса лимфогенных метастазов по сравнению с первичной опухолью отмечалось в 43% случаев, причем у 31% статус ЕР метастазов менялся на отрицательный по сравнению с ЕР+ опухолью. Тождественность рецепторного статуса первичной опухоли со статусом в ткани лимфогенных метастазов была показана в 57%. Вероятно, конверсия ЕР с (+) в опухолях до ЕР(-) в метастазах может быть причиной неудач гормонотерапии в адьювантном режиме.

Было показано, что активность ферментов метаболизма эстрогенов в опухолевой ткани не изменяется в зависимости от статуса рецепторов эстрогена или прогестерона. Наши данные согласуются с результатами других исследователей [Prost О., 1984; Silva М.С., et al 1989; Co'.ovai A.I.,1992; Evans T.R., 1994; Imoto S., 1997]. Однако, изучая другие ткани, вовлеченные в опухолевый процесс, было обнаружено, что при отрицательном ЕР статусе опухоли, активность ароматазы в перифокальных тканях была на 33% ниже (р<0,05), по сравнению с EP-положительными опухолями. Полученные данные свидетельствуют о превалирующем воздействии статуса рецепторов эстрогена опухолевой ткани на синтез гормонов в неизмененной ткани.

В онкологической практике к группе прогностических факторов, определяющих возможный исход рака молочной железы, относят такие клинические признаки, как возраст, состояние менструальной функции, размер первичного очага, метастатическое поражение регионарных лимфатических

узлов, степень злокачественности и гистологический тип опухоли. Однако, как показывает анализ литературных данных г.о этой проблеме, использование только клинических признаков не всегда позволяет ответить на вопросы, связанные с прогнозом заболевания, а, следовательно, и назначением адекватного лечения [Герштейн Е. С., 2002; Киселев В.И., 2005; Кгошап N.. 2000].

К числу стандартных клинических факторов, которые могут в существенной мере определять характер течения заболевания и обязательно учитываются при планировании комплексного лечения больных раком молочной железы, относятся возраст пациенток и состояние менструальной функции.

В нашем исследовании было отмечено достоверное увеличение в 2,2 раза активности фермента локального синтеза эстрогенов - ароматазы в ткани опухоли у больных старше 50 лет по сравнению с молодыми пациентками (до 40 лет) (р<0,05). При изучении ферментов деградации эстрогенов в опухолевой ткани наблюдалось прогрессирующее снижение суммарной 2/4 эстрогенгидроксилазной активности на 59% у больных РМЖ в возрасте 41-50 лет и и на 64% у больных старше 50 лет по сравнению с пациентками моложе 40 лет (р<0,05). Активность КОМТ, напротив, увеличивалась в 1,5 раза у больных в возрасте старше 50 лет, по сравнению с пациентами средней возрастной группы (р<0,05). Активность ГБТ увеличивалась в возрасте 41-50 лет, по сравнению с больными до 40 лет в 2,3 раза, и в 1,6 раз по сравнению с пациентами старше 50 лет (р<0,05) (рис.3).

* * * **

ЕЭароматаза □2,4эстрогенгидроксилаза НКОМТ ЕЭГТ

Рис. 3. Активность ферментов метаболизма эстрогенов в опухолях больных раком молочной железы в зависимости от возраста.

Примечание: * - значимая достоверность различий по сравнению с больными в возрасте до 40 лет; ** - по сравнению с больными в возрасте 41-50 лет.

Кроме этого, у пациенток в возрасте до 40 лет в 60% случаев были обнаружены ЕР(-) новообразования, тогда как у больных старше 50 лет чаще встречались ЕР(+) опухоли (67%). Полученные нами данные позволяют предположить, что развитие РМЖ у женщин моложе 40 лет связано,

преимущественно, с гентоксическим путем канцерогенеза, обеспечиваемого нарушением процессов инактивации эстрогенов. Вероятно, для этих пациенток характерно наличие значительного количества эстрогенов, не связавшихся с рецепторами стероидных гормонов из-за недостатка полноценно функционирующих ЕР [Бассалык Л.С., 1982; Цырлина Е.В., 1984], в результате чего гормоны метаболизируются через 2,4-эстрогенгидроксилазный путь, производя в большом количестве мутагенные катехолэстрогены, которые не обезвреживаются полностью путем метилирования КОМТ и коньюгирования с глутатионом в реакции ГБТ. Катехолэстрогены, не инактивированые на этом этапе, через ряд превращений могут оказывать ДНК-повреждающее действие, усугубляя течение опухолевого процесса. У женщин старше 50 лет, напротив, преобладали ЕР-положительные опухоли, а также наблюдался высокий уровень синтеза и инактивации эстрогенов. В связи с чем, вероятно, у этих пациенток генотоксический путь канцерогенеза менее выражен, и наблюдается превалирование промоторного пути, при котором эстрогены проявляют свое биологическое действие через связывание с рецепторами.

При сопоставлении активности ферментов метаболизма эстрогенов с менструальной функцией было показано, что активность ферментов локального синтеза эстрогенов в опухоли достоверно не изменялась в зависимости от состояния менструальной функции, в то время как активность ферментов деградации женских половых гормонов существенно зависит от этого признака. Так, суммарная 2/4-эстрогенгидроксилазная активность была снижена на 25% у больных РМЖ, находящихся в состоянии постменопаузы по сравнению с пациентками репродуктивного периода (р<0,05). Активность КОМТ, напротив, достоверно увеличивалась в 1,8 раза в перименопаузс, ив 1,5 раза в постмеиопаузе, по сравнению с больными репродуктивного периода (р<0,05) (рис.4).

*

период

□ 2/4-эстрогенгидроксилаза О КОМТ ПГБТ

Рис. 4. Активность ферментов метаболизма эстрогенов в опухолях больных РМЖ в зависимости от состояния менструальной функции.

Примечание: * - значимая достоверность различий по сравнению с больными в репродуктивном периоде.

Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют о том, что для больных РМЖ в репродуктивном периоде характерна высокая суммарная 2/4 -эстрогенгидроксилазная активность и низкая активность КОМТ, по сравнению с пациентками, находящимися в пери- и постменопаузе. Обращает на себя внимание тот факт, что в перименопаузальном периоде активность ферментов деградации эстрогенов - ГБТ и КОМТ выше при меньшем образовании катехолэстрогенов за счет 2/4-эстрогенгидроксилазы, по сравнению с пациентками, находящимися в постменопаузе. Вероятно, это связано с постепенным угасанием функции яичников, истощением запасов системного уровня эстрогенов и перестройкой метаболизма гормонов, что и отражается на биологических характеристиках опухолей, развившихся в этом периоде.

Одним из наиболее значимых факторов, определяющих прогноз заболевания и тактику лечения рака молочной железы, является стадия заболевания, отражающая размер первичного новообразования и состояние регионарных лимфоузлов. В ходе нашего исследования было выявлено, что по мере увеличения размера первичной опухоли происходит повышение активности ароматазы и снижение активности ферментов их инактивации - ГБТ и КОМТ (рис.5).

□ ароматаза Остероидсульфатаза

□ 2/4-эстрогенгидроксилаза □ КОМТ □ ГБТ

Рис. 5. Активность ферментов синтеза эстрогенов (А) и их деградации (Б) в зависимости от размера первичной опухоли.

Примечание: * - значимая достоверность различий по сравнению с группой Т|; ** - по сравнению с группой Т2.

Кроме того, если размер первичной опухоли был более 5 сантиметров, в неизмененной ткани молочной железы наблюдалось достоверное снижение активности КОМТ и ГБТ, по сравнению с новообразованиями меньших размеров. Таким образом, высокая активность ароматазы и низкая активность КОМТ и ГБТ в опухолевой ткани является неблагоприятным признаком, сопряженным с большим размером новообразований.

Важным клиническим показателем, характеризующим

распространенность опухолевого процесса, является наличие или отсутствие метастазов в регионарных лимфатических узлах. Показано, что при обширном лимфогенном метастазировании (N3) активность ароматазы была выше в 2,4 раза и в 2,5 раз, а активность СС выше в 1,3 раза и в 2 раза по сравнению с N1 и N2, соответственно (р<0,05) (рис. 6). Активность 2/4 - эстрогенгидроксилаз снижалась в 1,4 раза, а активность ГБТ в 1,9 раз (р<0,05) при увеличении вовлеченности в опухолевый процесс лимфатических узлов с N1 до N2. Еще более выраженное снижение активности 2/4 - эстрогенгидроксилаз - в 5 раз, ГБТ - в 1,6 раз и увеличение активности КОМТ - в 2 раза наблюдалось при обширном метастатическом поражении лимфоузлов - с N2 до N3.

N1 N2 N3

Эароматаза ШСС Ш 2/4-эстрогенгидроксилаза ЕЗГ8Т 0КОМТ

Рис. 6. Активность ферментов метаболизма эстрогенов в опухоли больных РМЖ в зависимости от характера лимфогенного метастазирования.

Примечание: * - значимая достоверность различий по сравнению с N1; ** - по сравнению с N2.

Полученные данные свидетельствуют о том, что процесс метастазирования в регионарные лимфатические узлы сопровождается увеличением активности ферментов локального синтеза эстрогенов и снижением активности ферментов их инактивации (2,4-эстрогенгидроксилаз и ГБТ) в опухолевой ткани. Можно полагать, что выявленные нарушения метаболизма эстрогенов связаны с опухолевой прогрессией и развитием лимфогенных метастазов.

Значимым критерием, характеризующим агрессивность новообразований, является степень злокачественности опухоли (О). Изучая активность ферментов метаболизма эстрогенов было показано, что при С2 активность ГБТ в опухолевой ткани была в 2,5 раза выше, чем при вз (табл.1). Данный факт указывает на то, что снижение активности ГБТ в опухоли является неблагоприятным фактором, который обуславливает более агрессивный характер течения опухолевого процесса. Для неизмененной ткани, окружающей опухолевый очаг, было характерно снижение активности ароматазы более чем на 50% и снижение суммарной 2/4-эстрогенгидроксилазной активности на 68% при опухолях 3 степени злокачественности. Полученные данные свидетельствуют о возможном влиянии окружающих опухоль тканей на формирование более злокачественного фенотипа опухолей.

Таблица 1

Активность ферментов метаболизма эстрогенов в тканях больных раком молочной железы в зависимости от степени злокачественности

Ферменты Показатели активности ферментов

2 степень злокачественности 3 степень злокачественности

Опухолевая ткань | Ароматаза, фмоль андростендиона/ мг белка в 1 час п=40 24,46±3,27 п=9 19,78±5,21

Стероидсульфатаза, фмоль эстрон сульфатаата/мг белка в 1 час п=18 121,99±18,51 п=5 107,4ШЗ,41

2,4-эстроген гидроксилаза, пмоль метоксиэстрогенов/мг белка в 1 час п=20 249,82±57,83 п=7 134,34±88,83

Глютатионтрансфераза, мкмоль ХДНБ/ мг белка в 1 минуту п=38 34,57±4,35 п=9 14,07±3,07*

КОМТ, мкмоль гвоякола/ мг белка в 1 час п=39 245,19±25,09 п=9 249,08±39,21

Неизмененная ткань Ароматаза, фмоль андростендиона/ мг белка в 1 час п=35 38,30±3,44 п=6 15,11±4,66*

Стероидсульфатаза, фмоль эстрон сульфатаата/мг белка в 1 час п=12 81,04±21,51 п=5 86,17±3,74

2,4-эстрогенгилроксилаза, пмоль метоксиэстрогенов/мг белка в 1 час п=24 246,52±41,16 п=7 79,04±25,83*

Глютатионтрансфераза, мкмоль ХДНБ/ мг белка в 1 минуту п=37 16,94±2,82 п=7 13,83±3,47

КОМТ, мкмоль гвоякола/ мг белка в 1 час п-37 295,44±59,59 п=9 284,31±139,52

Примечание: *- значимая достоверность различий по отношению к больным со 2 степенью злокачественности опухоли

При оценке прогностической значимости активности ферментов метаболизма эстрогенов в тканях при раке молочной железы было выявлено, что статистически значимыми факторами в отношении 2-летней безрецидивной выживаемости, являются активность ароматазы и 2,4-эстрогенгидроксилазы в опухоли (рис. 7, 8). Так, при активности ароматазы в опухоли более 20 фмоль

андростендиона/мг белка в 1 час ни у одной больной не было выявлено признаков местного прогрессирования заболевания. Все рецидивы РМЖ были выявлены только у тех пациентов, активность ароматазы в опухоли которых была ниже 20 фмоль/ мг белка в 1 час (р<0,05).

Активность ароматазы

- менее 20 фмоль О 6 12 18 24 30 36 42 - 7

----более 20 фмоль

Срок наблюдения месяцев

Рис. 7. Показатели 2-летней безрецидивной выживаемости в зависимости от активности ароматазы в опухоли.

Активность 2,4-эстрогенгидроксилаз в опухоли менее 230 пмоль метоксиэстрогенов/ мг белка в час явилась благоприятным фактором прогноза в отношении безрецидивной выживаемости. Пи у одной больной с активностью 2,4- эстрогенгидроксилаз менее 230 пмоль метоксиэстрогенов / мг белка в час не было выявлено признаков рецидивирования РМЖ и продолжительность жизни составила 100%, тогда как при активности фермента более 230 пмоль/мг белка в час показатели выживаемости составили 80% (р<0,05).

й

М "•90 Я

ш

§ 0.85

• ; н----1— -М---1—н-н—и- —-4-—у*.......'......

} р< 0,05 ■ .....

' М 1 1 1—1-

Активность 2,4 эстрогенгидроксилаз

болев 230 пкопь менее 230 пмоль

О 6 12 18 24 30 36 42

Срок наблюдения месяцев

Рис. 8. Показатели 2-летней безрецидивной выживаемости в зависимости от суммарной активности 2,4-эстрогенгидроксилаз в опухоли.

Статистически значимым критерием, сопряженным с показателями безметастатической выживаемости, явилась активность ГБТ в опухоли (рис.9). При активности Г8Т выше 40,0 мкмоль ХДНБ/мг белка в мин показатели 2-летней безметастатической выживаемости составили 85%, а при активности данного фермента менее 40 мкмоль, этот показатель был значимо ниже и составил 68% (р<0,05).

Активность ГБТ

-бытее 40 мгалоль

----менее 40 мкмоль

6 12 18 24 30 36 Срок наблюдения месяцев Рис. 9. Показатели 2-летней безметастатической выживаемости в зависимости от активности Г8Т в опухоли.

Полученные в работе данные позволяют рассматривать активность ароматазы в опухоли менее 20 фмоль андростендиона/мг белка в 1 час, активность 2,4-эстрогенгидроксилаз более 230 пмоль метоксиэстрогенов/ мг белка в 1 час и активность глютатионтрансферазы менее 40 мкмоль ХДНБ/ мг белка в 1 мин в качестве критериев, свидетельствующих о возможном неблагоприятном исходе РМЖ. Следует отметить, что эти результаты являются принципиально новыми, поскольку в литературе практически нет данных о взаимосвязи между активностью ферментов синтеза и инактивации эстрогенов и показателями выживаемости у больных РМЖ.

Таким образом, выполненное исследование свидетельствует о том, что ферменты метаболизма эстрогенов играют важную роль в патогенезе рака молочной железы, оказывают значимое влияние на характер течения и прогноз заболевания, а также могут использоваться в качестве дополнительных критериев, характеризующих биологические особенности опухоли.

Выводы:

1. При раке молочной железы в ткани опухоли локальный синтез эстрогенов осуществляется преимущественно стероидсульфатазой, а в неизмененной — ароматазой. Ингибирование процессов инактивации эстрогенов в

опухолевой ткани происходит за счет снижения активности катехол-О-метилтрансферазы, а в лимфогенных метастазах - и катехол-О-метилтрансферазы, и глютатион-8-трансферазы.

2. В опухолевой.ткани содержание рецепторов женских половых гормонов выше, по сравнений' • с неизмененной тканью и тканью лимфогенных метастазов. В опухоли активность ферментов метаболизма эстрогенов не зависит от рецепторного статуса. В перифокальных тканях активность ароматазы была на 33% ниже (р<0,05) при отрицательном ЕР статусе новообразования, по сравнению с ЕР-позитивными опухолями.

3. У пациенток в возрасте до 40 лет в ткани опухоли выявлено снижение активности ароматазы на 45% и 60%, глутатион-В-трансферазы на 60% и 20%, а также повышение активности 2,4-эстрогенгидроксилаз на 60% и 65% по сравнению с больными 41 - 50 и старше 50 лет (р<0,05), соответственно, что обуславливает недостаточную инактивацию высокореакционоспособных метаболитов эстрогенов и может характеризовать более агрессивное течение РМЖ в молодом возрасте.

4. Ферменты метаболизма эстрогенов могут рассматриваться в качестве критериев, характеризующих биологическую агрессивность РМЖ. Высокая активность ароматазы и низкая активность глутатион-8-трансферазы сопряжены с большим размером опухоли: (активность ароматазы при Т1 -14,66±4,50; при ТЗ - 26,51±5,38 фмоль /мг белка в ч; (р<0,05); активность ГБТ при Т1 - 51,81±21,36; при ТЗ - 21,58±3,69 мкмоль/мг белка в мин (р<0,05)) и обширным поражением регионарных лимфоузлов (активность ароматазы при N1- 21,08±2,98; при N3- 51,5±34,21 фмоль/мг белка в час (р<0,05); активность Г5Т при N1- 48,75±9,19; при N3- 16,83±3,78 мкмоль/мг белка в мин, (р<0,05)).

5. Низкая активность ароматазы в опухоли (менее 20,0 фмоль/мг белка в час) и высокая активность 2,4-эстрогенгидроксилаз (более 230,0 пмоль/мг белка в час) являются неблагоприятными факторами в отношении риска возникновення рецидивов. Для новообразований с низкой активностью глютатион-Б-трансферазы (менее 20,0 мкмоль/мг белка в мин) характерен неблагоприятный прогноз в плане развития отдаленных метастазов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Активность ферментов метаболизма эстрог енов в ткани рака молочной железы. // Современные проблемы экспериментальной и клинической онкологии. Материалы VI конференции молодых онкологов Украины. - Киев. - 2003. - с. 5455. (в соавт. с Кондаковой И.В., Слонимской Е.М., Кокориной Ю.Л., Красулиной Н.А).

2. Гормонозависимые опухоли и активность ферментов метаболизма эстрогенов. // III съезд онкологов и радиологов СНГ. - часть И. - Минск. - 2004. - с. 289. (в соавт. с Кондаковой И.В., Слонимской Е.М., Глущенко С.А.).

3. Ферменты метаболизма эстрогенов и рецепторы как факторы риска развития и прогноза при раке молочной железы. // Сибирский онкологический журнал. -2004. - №1(9). -с.34-43. (в соавт. с Кондаковой И.В., Слонимской Е.М.).

4. Роль ферментов метаболизма эстрогенов в патогенезе рака молочной железы. // Современное состояние и перспективы развития экспериментальной и клинической онкологии. Материалы Российской научно - практической конференции, посвященной 25 - летию НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН. -Томск. - 2004. - Часть I. - с. 225-226. (в соавт. с Кондаковой И.В., Слонимской Е.М., Глущенко С.А.).

5. Ферменты метаболизма эстрогенов при раке молочной железы. // VIII российский онкологический конгресс. Материалы конференции. - Москва. -

2004. - с. 195-196. (в соавт. с Кондаковой И.В., Слонимской Е.М., Глущенко С.А.).

6. Ферменты метаболизма эстрогенов прк раке молочной железы: особенности опухолевой, нормальной и метастатической тканей Я Физиология и медицина. Материалы Всероссийской конференции молодых исследователей. - Санкт-Петербург. -2005. - с.137. (в соавт. с Кондаковой И.В., Слонимской Е.М., Глущенко С.А.).

7. Ферменты метаболизма эстрогенов в злокачественных новообразованиях молочной железы: протоколы общества онкологов. // Сибирский онкологический журнал. - 2005. - № 2. - с. 64. (в соавт. с Кондаковой И.В., Слонимской Е.М.).

8. Ферменты метаболизма эстрогенов в опухолевой и нормальной тканях молочной железы. // Актуальные проблемы онкологии. Материалы I конгресса онкологов республики Узбекистан. Ташкент. - 2005. - с. 195-196. (в соавт. с Кондаковой И.В., Слонимской Е.М., Глущенко С.А.).

9. Рак молочной железы: значение ферментов метаболизма эстрогенов в патогенезе и прогнозе данного заболевания. // Практическая медицина. - 2006. -№3. - с.5-6. (в соавт. с Кондаковой И.В., Слонимской Е.М., Бочкаревой Н.В.).

10. Ферменты метаболизма эстрогенов в гормонозавнеимых опухолях. // IX российский онкологический конгресс. Материалы конференции. - Москва. -

2005. - с. 215. (в соавт. с Кондаковой И.В., Бочкаревой Н.В, Коломиец Л.А, Слонимской Е.М.).

11. Enzyme of estrogen metabolism in breast cancer: features of tumoral, normal and metastatic tissues. // 5th Biennial International meeting of the FGOG Endocrine treatment & prevention of breast and gynaecological cancers. Belgium, Brussels. -

2006. - p.l68 (with I.V. Kondakova, E.M. Slonimskaya, S.A.Gluschenko).

12. Ферменты метаболизма эстрогенов при раке молочной железы: особенности опухолевой, нормальной и метастатической тканей. // Лечение рака в XXI веке.

Материалы И-ой научно-практической конференции молодых специалистов-онкологов УрФО. - Челябинск. - 2006. - с.85. (в соавт. с Кондаковой И.В., Слонимской Е.М., Глущенко С.А.).

13. Активность ферментов метаболизма эстрогенов в тканях рака молочной железы и их влияние на исход заболевания. // Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии. Материалы региональной конференции молодых ученых. - Томск. - 2006. - с. 66-67. (в соавт. с Кондаковой И.В., Слонимской Е.М., Глущенко С.А.).

14. Ферменты метаболизма эстрогенов при раке молочной железы: особенности опухолевой, нормальной и метастатической тканей и их влияние на исход заболевания. И Проблемы фундаментальной и прикладной медицины. Материалы VI Всероссийской конференции молодых ученых в рамках 13 Международного конгресса по приполярной медицине. - Новосибирск. - 2006. - с.51-52. (в соавт. с Кондаковой И.В., Слонимской Е.М.).

15. Активность ферментов метаболизма эстрогенов при раке молочной железы и их взаимосвязь с клинико-морфологическими параметрами. II Современные методы лечения онкологических больных: достижения и неудачи. Материалы Российской научно-практической конференции с международным участием. -Барнаул. - 2006.- с. 242. (в соавт. с Кондаковой И.В., Слонимской Е.М., Глущенко С.А.).

16. Рак молочной железы: значение ферментов метаболизма эстрогенов в патогенезе и прогнозе данного заболевания. // Онкология сегодня. Успехи и перспективы. Материалы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием. - Казань. - 2006. - с.35-37. (в соавт. с Кондаковой И.В., Слонимской Е.М., Бочкаревой Н.В).

Список сокращений

ГБТ - глютатион-Б-трансфераза

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ЕР - рецепторы эстрогена

ЕР(-) - рецепторы эстрогена отрицательные

ЕР(+) - рецепторы эстрогена положительные

КОМ'Г - катехол-О-метилтрансфераза

ПР - рецепторы прогестерона

ПР(-) - рецепторы прогестерона отрицательные

ПР(+) - рецепторы прогестерона положительные

2-ОНЕ2 - 2- гидроксиэстрадиол

4-ОНЕг -4 гидроксиэстрадиол

РМЖ - рак молочной железы

СС - стероид сульфатаза

ХДНБ - хлорди нитробензол

II - коэффициент корреляции Спирмена

Тираж 100. Заказ № 1295. Томский государственный университет систем управления и радиоэлектроники 634050, г. Томск, пр. Ленина, 40

Актуальность проблемы Злокачественные новообразования молочных желез занимают лидирующее место в структуре онкологических заболеваний женщин в мире. Статистические данные констатируют ежегодное увеличение числа диагностируемых случаев рака молочной железы (РМЖ). В мире выявляют около 1 млн. новых случаев за год, к 2010г. прогнозируется рост числа заболевших до 1,45 млн [12]. Отмечается

U ^ W неуклонный рост численности больных, увеличение показателей смертности и возникновение злокачественных новообразований этой локализации в более раннем возрасте по сравнению с прошлыми десятилетиями [41]. Развитие и биологические характеристики РМЖ во многом определяются метаболизмом эстрогенов [3]. Показан широкий спектр важных функций, которые регулируются эстрогенами, связываясь с внутриклеточными рецепторами и активируя экспрессию различных генов [78]. К наиболее важным проявлениям действия эстрогенов относят активацию пролиферации [90], ингибирование процесса апоптоза, а так же стимуляцию выработки факторов роста (трансформирующий фактор роста а, эпидермальный фактор роста) [29; 63]. Вышеперечисленные эффекты могут обуславливать развитие пролиферативных гиперпластических процессов и рака в эстроген-звисимых тканях, в которых имеются рецепторы эстрогенов [42].

Эстрогены могут образовываться непосредственно в тканях или захватываться из циркулирующей крови. Внутриорганная выработка эстрогенов в молочной железе преимущественно осуществляется ферментами локального синтеза: ароматазой, которая способствует конверсии андрогенов в эстрогены, а так же стероидсульфатазой, преобразующей неактивный эстрон сульфат в эстрон [144]. Влияние эстрогенов на клетки опосредовано их взаимодействием с рецепторами. Комплекс гормона с рецепторами транслоцируется в ядро, активирует соответствующие гены и стимулирует пролиферацию ткани молочной железы, а так же ингибирует апоптоз. В процессе пролиферации увеличивается вероятность появления мутаций и ограничивается время, необходимое для репарации повреждений, что играет важную роль в развитии злокачественных опухолей [14]. При адекватной работе системы инактивации эстрогенов проявление генотоксического эффекта опосредованно снижается за счет работы ферментов глютатионтрансферазы (rST) и катехол-О-метилтрансферазы (КОМТ), которые препятствуют повреждению ДНК [149; 160]. В противном случае, не связавшиеся с рецептором эстрогены и их производные - катехолэстрогены, которые образуются под действием 2- и 4-эстрогенгидроксилаз, способны оказывать ДНК-повреждающее действие [120]. Усиление процессов пролиферации и непосредственное генотоксическое действие эстрогенов является важным патогенетическим звеном в канцерогенезе, развитии первичной опухоли, дальнейшей опухолевой прогрессии РМЖ.

В настоящее время при определении прогноза заболевания и выбора наиболее адекватной тактики лечения больных РМЖ основываются на ряде факторов, определяющих как биологические особенности организма (возраст, состояние менструальной функции), так и биологические характеристики самой опухоли (размер опухоли, наличие метастазов опухоли в регионарные лимфоузлы, тип опухолевого роста, гистологическая принадлежность и степень злокачественности опухоли, инвазии кровеносных и лимфатических сосудов, уровень экспрессии рецепторов эстрогенов и прогестерона). Однако результаты лечения далеко не всегда являются удовлетворительными, и в настоящее время ведется поиск новых, более информативных параметров, адекватно учитывающих молекулярные механизмы развития опухолевого процесса.

Все сказанное определяет актуальность исследования метаболизма и рецепции эстрогенов в тканях при раке молочной железы, а также поиска новых маркеров прогноза заболевания, характеризующих метаболические особенности новообразования.

Цель исследования:

Изучить активность ферментов метаболизма эстрогенов и уровня рецепторов эстрогенов и прогестерона в неизмененной, опухолевой ткани, лимфогенных метастазах и оценить их прогностическую значимость.

Задачи исследования:

1. Изучить активность ферментов метаболизма эстрогенов (ароматазы, стероид сульфатазы, 2-/4-эстрогенгидроксилаз, катехол-О-метилтрансферазы и глутатион-Б-трансферазы) у больных РМЖ в неизмененной, опухолевой ткани и лимфогенных метастазах.

2. Оценить содержание рецепторов эстрогенов и прогестерона у больных РМЖ в неизмененной, опухолевой ткани, лимфогенных метастазах и сопоставить с активностью ферментов метаболизма эстрогенов.

3. Исследовать взаимосвязь между активностью ферментов метаболизма эстрогенов в изучаемых тканях и основными клинико-морфологическими параметрами у больных РМЖ.

4. Оценить прогностическую значимость активности ферментов метаболизма эстрогенов и содержания рецепторов стероидных гормонов в тканях при РМЖ.

Научная новизна

Впервые изучены в комплексе метаболизм и рецепция эстрогенов в неизмененной, опухолевой ткани и в ткани лимфогенных метастазов у больных раком молочной железы.

Показано, что синтез эстрогенов в опухоли обеспечивается стероидсульфатазой, а в перифокальных тканях превалирует ароматазный путь. В опухолях наблюдается недостаточная инактивация метаболитов эстрогенов за счет сниженной активности КОМТ, а в ткани лимфогенных метастазов метаболизм эстрогенов ингибирован из-за снижения активности КОМТ и TST.

Получены новые данные фундаментального характера, касающиеся различных путей метаболизма эстрогенов у больных РМЖ в различные возрастные периоды. Результаты исследования показали, что в возрастном периоде до 40 лет нарушены процессы инактивации эстрогенов за счет высокой активности 2,4-эстрогенгидроксилаз, и низкой активности TST и КОМТ, что, вероятно, объясняет более агрессивное течение злокачественного процесса. У женщин старше 50 лет наблюдались высокий уровень локального синтеза эстрогенов, их инактивации и рецепции, что оказывает влияние на развитие более благоприятного течения РМЖ.

Впервые получены данные о прогностической значимости активности ароматазы, 2,4-эстрогенгидроксилаз и TST в опухоли. Установлено, что низкая активность ароматазы (менее 20 фмоль/мг белка в час), высокая активность 2,4-эстрогенгидроксилаз (более 230 пмоль/мг белка в час) являются неблагоприятными факторами прогноза в отношении возникновения рецидива заболевания, а низкая активность TST (менее 40 мкмоль/мг белка в мин) является значимым критерием риска развития отдаленных метастазов при РМЖ.

Теоретическая и практическая значимость

Изучение активности ферментов метаболизма эстрогенов и уровня рецепторов женских половых гормонов расширило представления о патогенезе развития РМЖ и об их вкладе в процесс метастазирования. Новые данные фундаментального характера, касающиеся различных путей метаболизма эстрогенов у больных РМЖ в различные возрастные периоды, могут служить основой для дальнейшего изучения механизмов канцерогенеза и прогрессирования опухолевого процесса.

Выявленные изменения активности ферментов метаболизма эстрогенов могут рассматриваться в качестве параметров, характеризующих биологические особенности опухоли. Высокая активность ароматазы и стероидсульфатазы, низкая активность TST сопряжены с большим размером опухоли (Тз) и обширным поражением регионарных лимфоузлов (N2-3)- Низкая активность TST 8 наблюдается при большей степени злокачественности (G3). Доказано, что недостаточная инактивация метаболитов гормонов связана с наличием наиболее злокачественного фенотипа опухоли. Данные о прогностической значимости активности ароматазы, эстрогенгидроксилаз, TST в опухоли свидетельствуют о целесообразности использования изучаемых параметров в качестве дополнительных прогностических критериев при РМЖ.

Положения, выносимые на защиту

1. Активность ферментов метаболизма эстрогенов имеет свои отличия в ряду «неизмененная ткань - опухоль - лимфогенные метастазы». В опухоли синтез эстрогенов обеспечивается стероидсульфатазой, а в перифокальных тканях молочной железы превалирует ароматазный путь. Ингибирование процессов инактивации метаболитов эстрогенов в опухолевой ткани обусловлено снижением активности КОМТ, а в ткани лимфогенных метастазов - и КОМТ, и TST.

2. Активность ферментов метаболизма эстрогенов может использоваться в качестве критериев, характеризующих биологические особенности опухоли. Высокая активность ароматазы и низкая активность TST сопряжены с большим размером опухоли (Тз) и обширным поражением регионарных лимфоузлов (N2.3). Низкая активность TST наблюдается при большей степени злокачественности (G3).

3. Активность ферментов метаболизма эстрогенов можно рассматривать в качестве дополнительных прогностических критериев. Активность ароматазы менее 20 фмоль/мг белка в час, активность 2,4-эстрогенгидроксилаз более 230 пмоль/мг белка в час являются неблагоприятными факторами прогноза в отношении возникновения рецидива заболевания, а активность TST менее 40 мкмоль/мг белка в мин является значимым критерием риска развития отдаленных метастазов при РМЖ.

Апробация диссертации

Основные положения и результаты научных исследований были доложены и обсуждены на Российской научно-практической конференции «Современное состояние и перспективы развития экспериментальной и клинической онкологии», г. Томск (2004); конференции молодых ученных НИИ Онкологии «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии»", г. Томск (2004); на региональной конференции молодых ученых НИИ Онкологии «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии», г. Томск (2006); на 13 международном конгрессе с международным участием по приполярной медицине г. Новосибирск (2006); на Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Онкология сегодня. Успехи и перспективы», г. Казань (2006).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 16 печатных работ, отражающих основные положения диссертации.

Объем и структура диссертации

выводы

1. При раке молочной железы в ткани опухоли локальный синтез эстрогенов

1 W W осуществляется преимущественно стероидсульфатазои, а в неизмененной — ароматазой. Ингибирование процессов инактивации эстрогенов в опухолевой ткани происходит за счет снижения активности катехол-О-метилтрансферазы, а в лимфогенных метастазах — и катехол-О-метилтрансферазы, и глютатион-Б-трансферазы.

2. В опухолевой ткани содержание рецепторов женских половых гормонов выше, по сравнению с неизмененной тканью и тканью лимфогенных метастазов. В опухоли активность ферментов метаболизма эстрогенов не зависит от рецепторного статуса. В перифокальных тканях активность ароматазы была на 33% ниже (р<0,05) при отрицательном ЕР статусе новообразования, по сравнению с ЕР-позитивными опухолями.

3. У пациенток в возрасте до 40 лет в ткани опухоли выявлено снижение активности ароматазы на 45% и 60%, глутатион-8-трансферазы на 60% и 20%, а также повышение активности 2,4-эстрогенгидроксилаз на 60% и 65% по сравнению с больными 41 - 50 и старше 50 лет (р<0,05), соответственно, что обуславливает недостаточную инактивацию высокореакционоспособных метаболитов эстрогенов и может характеризовать более агрессивное течение РМЖ в молодом возрасте.

4. Ферменты метаболизма эстрогенов могут рассматриваться в качестве критериев, характеризующих биологическую агрессивность РМЖ. Высокая активность ароматазы и низкая активность глутатион-S-трансферазы сопряжены с большим размером опухоли: (активность ароматазы при Т1 - 14,66±4,50; при ТЗ - 26,51±5,38 фмоль /мг белка в ч; (р<0,05); активность TST при Т1 - 51,81±21,36; при ТЗ - 21,58±3,69 мкмоль/мг белка в мин (р<0,05)) и обширным поражением регионарных лимфоузлов (активность ароматазы при N1- 21,08±2,98; при N3- 51,5±34,21 фмоль/мг белка в час (р<0,05); активность TST при N1- 48,75±9,19; при N3-16,83±3,78 мкмоль/мг белка в мин, (р<0,05)).

5. Низкая активность ароматазы в опухоли (менее 20,0 фмоль/мг белка в час) и высокая активность 2,4-эстрогенгидроксилаз (более 230,0 пмоль/мг белка в час) являются неблагоприятными факторами в отношении риска возникновения рецидивов. Для новообразований с низкой активностью глютатион-8-трансферазы (менее 20,0 мкмоль/мг белка в мин) характерен неблагоприятный прогноз в плане развития отдаленных метастазов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Рак молочной железы (РМЖ) занимает первое место в структуре злокачественных новообразований среди женского населения во всем мире. Развитие РМЖ во многом определяются метаболизмом эстрогенов [4]. Показан широкий спектр важных биологических функций, которые регулируются эстрогенами, связываясь с внутриклеточными рецепторами и активируя экспрессию различных генов [78]. К наиболее значимым эффектам эстрогенов относят активацию пролиферации [90], ингибирование процесса апоптоза, а так же стимуляцию выработки факторов роста (трансформирующий фактор роста а, эпидермальный фактор роста) [63]. Вышеперечисленные эффекты могут обуславливать развитие пролиферативных гиперпластических процессов и рака в эстроген-звисимых тканях, в которых имеются рецепторы эстрогенов.

Наибольший вклад в процесс синтеза эстрогенов вносят ферменты ароматаза и стероидсульфатаза. Ароматаза осуществляет превращение андростендиона и тестостерона в эстрон, тогда как стероидсульфатаза катализирует конверсию биологически инертного эстронсульфата в эстрон. Основной транспортной формой эстрогенов, циркулирующих в периферической крови, у женщин в постменопаузе является эстронсульфат, поэтому стероидсульфатаза имеет особое значение в патогенезе гормонозависимых опухолей в постменопаузальном периоде. Доказано, что локальное образование эстрогенов в постменопаузе является важным фактором патогенеза РМЖ по сравнению с системным уровнем циркулирующих гормонов [144]. Высокий уровень экспрессии гена ароматазы коррелировал с низкой выживаемостью и прогрессированием заболевания. Результаты анализа 10-летней выживаемости показали, что в образцах тканей опухолей больных РМЖ, имеющих регионарные и отдаленные метастазы, экспрессия гена ароматазы была значительно выше по сравнению с тканями опухолей больных, характеризующихся безметастатическим течением заболевания [47].

Гормоны, не связавшиеся с соответствующими рецепторами, подвергаются инактивации. Первоначально происходит окисление эстрогенов до высокоактивных электрофильных интермедиатов - катехолэстрогенов в реакции, катализируемой 2-,4-,16-эстрогенгидроксилазами [120]. Дальнейшее превращение катехолэстрогенов происходит в ходе реакций метилирования, осуществляемых катехол-О-метилтрансферазой (КОМТ), и коньюгирования, катализируемых различными трансферазами, наиболее важной среди которых является глутатион-Б-трансфераза (TST). Недостаточная активность этих ферментов может являться причиной накопления таких высокоактивных метаболитов эстрогенов, как катехолэстрогены, хиноны и семихиноны, которые могут связываться с ДНК и индуцировать генотоксические повреждения, мутагенез и канцерогенез [160]. Кроме того, метаболиты эстрогенов, главным образом 4- и 16-катехолэстрогены, также обладают сильным митогенным эффектом, стимулируют пролиферацию и ингибируют апоптоз в тканях молочной железы, что увеличивает риск развития рака данной локализации [120; 149]. Все это указывает на необходимость изучения ферментов инактивации эстрогенов при раке молочной железы.

В связи с вышеизложенным целью настоящей работы явилось изучение активности ферментов метаболизма эстрогенов и уровня рецепторов эстрогенов и прогестерона в неизмененной, опухолевой ткани, лимфогенных метастазах и оценка их прогностической значимости.

При этом решались следующие задачи:

1. Изучить активность ферментов метаболизма эстрогенов (ароматазы, стероид сульфатазы, 2-/4-эстрогенгидроксилаз, катехол-О-метилтрансферазы и глутатион-Б-трансферазы) у больных РМЖ в неизмененной, опухолевой ткани и лимфогенных метастазах.

2. Оценить содержание рецепторов эстрогенов и прогестерона у больных РМЖ в неизмененной, опухолевой ткани, лимфогенных метастазах и сопоставить с активностью ферментов метаболизма эстрогенов.

3. Исследовать взаимосвязь между активностью ферментов метаболизма эстрогенов в изучаемых тканях и основными клинико-морфологическими параметрами у больных РМЖ.

4. Оценить прогностическую значимость активности ферментов метаболизма эстрогенов и содержания рецепторов стероидных гормонов в тканях при РМЖ.

В исследование было включено 85 больных РМЖ T1.4N0.3M0 в возрасте 3069 лет (средний возраст 53,62±1,08 лет), которые проходили лечение в отделении общей онкологии ГУ НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН с 2002 по 2005 год. У всех больных диагноз был морфологически верифицирован. Лечение включало в себя проведение 2-4 курсов неоадьювантной химиотерапии по схемам CMF, CAF, FAC с последующим выполнением хирургического вмешательства в объеме радикальной мастэктомии или радикальной резекции. В послеоперационном периоде проводилось 4-6 курсов адьювантной химиотерапии по одной из вышеуказанных схем, лучевая и антиэстрогенная терапия по показаниям.

В данном исследовании изучали активность ароматазы. Стероидсульфатазы, 2,4-эстрогенгидроксилазы, TST, КОМТ, а так же содержание рецепторов эстрогена и прогестерона в неизмененной, опухолевой ткани и в ткани лимфогенных метастазов, взятых из операционного материала.

При исследовании особенностей синтеза и метаболизма эстрогенов в тканях при РМЖ было обнаружено, что активность ароматазы в неизмененной ткани в 1,5 раз выше, чем в опухолевой (р<0,01). В метастазах активность ароматазы оставалась довольно высокой, и не отличалась достоверно от опухолевой ткани. Активность стероидсульфатазы увеличивалась в ряду: «неизмененная ткань-опухоль-лимфогенные метастазы» (р<0,05). Эти данные свидетельствуют о высоком локальном образовании эстрогенов не только в опухолевой и метастатической тканях, но и в неизмененной ткани молочной железы. Вероятнее всего, высокий локальный синтез эстрогенов в перифокальных тканях за счет ароматазы обусловлен тем, что опухолевая ткань использует для своего развития эстрогены из окружающей ткани, что подтверждается литературными данными [117]. При этом высокая активность стероидсульфатазы в опухоли связана с превалированием в опухоли процессов десульфирования, по сравнению с процессами ароматизации.

При изучении ферментов деградации эстрогенов наблюдалось снижение активности КОМТ в ряду «неизмененная ткань - опухоль — лимфогенные метастазы». Активность глютатионтрансферазы была выше в опухолях по сравнению с неизмененной (р<0,01) тканью и тканью лимфогенных метастазов (р<0,05), и соответственно составила 37,67±3,73; 24,48±4,05 и 25,76±3,72 мкмоль хлординитробензола/мг белка в мин. При проведении корреляционного анализа были обнаружены обратные корреляционные зависимости между активностью 2,4-эстрогенгидроксилаз и активностью ферментов локального синтеза эстрогенов в опухоли и метастазах, а так же прямые зависимости между активностью эстрогенгидроксилаз, TST и КОМТ в опухолевой и перифокальной тканях.

Можно полагать, что синтез эстрогенов в опухоли обеспечивается

1 u w преимущественно стероидсульфатазои, а ароматазныи путь превалирует в перифокальных тканях, производя эстрогены для опухоли. Инактивация эстрогенов в опухоли сопровождается высокой активностью эстрогенгидроксилаз и снижением активности КОМТ, что свидетельствует о недостаточной завершенности процесса инактивации и вероятном накоплении высокореакционных метаболитов эстрогенов. При поражении метастазами регионарных лимфоузлов инактивация катехолэстрогенов еще в большей степени ингибируется за счет снижения активности и КОМТ и TST.

Таким образом, исследование активности ферментов метаболизма эстрогенов в неизмененной, опухолевой и метастатической тканях показало высокий уровень синтеза и недостаточную инактивацию эстрогенов при прогрессировании процесса, что может свидетельствовать о важной роли метаболизма гормонов в патогенезе РМЖ, и в частности, в опухолевой прогрессии.

На основании полученных результатов мы предположили схему, характеризующую процессы инактивации катехолэстрогенов в исследованных тканях (рис.23). эстрогены I

2,4 ЭГ кэ

TST i L TST TST -*i k

KOMT

КОМТ

Метастазы в регионарных лимфоузлах

Ж ■ ■ ▼

КОМТ

Рис.23. Схема возможных механизмов инактивации катехолэстрогенов в неизмененной, опухолевой тканях и ткани регионарных лимфатических узлов, пораженных метастазами при раке молочной железы.

Примечание: КОМТ - катехол-О-метилтрансфераза;

TST - глютатионтрансфераза.

КЭ - катехолэстрогены

2,4 ЭГ - 2,4 -эстрогенгидроксилаза * * Увеличение активности фермента

•4. Снижение активности фермента

2,4-эстрогенгидроксилазы преобразуют не связавшиеся с рецепторами эстрогенов гормоны в высоко реакционоспособные катехолэстрогены, которые далее должны метаболизироваться при участии TST и КОМТ, инактивируя эти промежуточные продукты. Высокая активность эстрогенгидроксилаз и TST в опухолях по сравнению с нормальной тканью связана, скорее всего, с наличием большого количество не связавшихся с рецепторами эстрогенов в опухолях, которые метаболизируются через глютатионтрансферазный путь. Сниженная

96 активность КОМТ в опухолях по сравнению с перифокальными тканями, вероятно, является причиной недостаточной инактивации катехолэстрогенов, что может способствовать их дальнейшему окислению до чрезвычайно реакционноспособных семихинонов и хинонов, обладающих генотоксическим эффектом. При образовании лимфогенных метастазов наблюдалось ингибирование процесса инактивации катехолэстрогенов как катехол-О-метилтрансферазой, так и глютатионтрансферазой. Эти данные могут свидетельствовать о том, что опухолевая прогрессия, сопровождающаяся появлением лимфогенных метастазов, связана с недостаточной инактивацией высокореакционных продуктов метаболизма эстрогенов.

При изучении содержания рецепторов стероидных гормонов при РМЖ было обнаружено, что в неизмененной и опухолевой ткани положительный статус ЕР встречается чаще, чем в лимфогенных метастазах, тогда как во всех тканях чаще встречается отрицательный статус ПР. Во всех изученных тканях чаще встречается отрицательный статус ПР. Возможно, это связано с тем, что прогестероновые рецепторы синтезируются на основе эстрогеновых рецепторов, а при РМЖ за счет усиленного локального синтеза эстрогенов наблюдается дефицит ЕР [16; 79]. Результаты о несоответствии статуса рецепторов стероидных гормонов в первичных опухолях и ткани регионарных лимфатических узлов, пораженных метастазами могут свидетельствовать о возможном изменении уровня рецепторов женских половых гормонов в течении прогрессии заболевания. Механизм конверсии рецепторов стероидных гормонов при прогрессии болезни до сих пор не известен, но можно предположить две биологические модели, которые объясняют данное преобразование [133]. Первая модель допускает изменение статуса рецепторов в отношении доли рецептор-положительных/отрицательных клеточных клонов, первоначально представленных в высоко гетерогенной опухоли, часть из которых может затем диффундировать в регионарные лимфоузлы и отличаться меньшей гетерогенностью. Вторая модель предполагает фенотипическое изменение рецепторов в пределах единственных клеток в процессе прогрессии опухоли.

Конверсия рецепторов эстрогенов с положительных в первичных опухолях на отрицательные в метастатически измененных регионарных лимфатических узлах имеет важное практическое значение и, вероятно, может быть полезной в отношении целесообразности назначения адьювантной гормонотерапии.

При сопоставлении активности ферментов синтеза и метаболизма эстрогенов с рецепторным статусом эстрогенов и прогестерона в тканях при раке молочной железы было выявлено, что активность ферментов метаболизма эстрогенов в опухолевой ткани не изменяется в зависимости от статуса рецепторов эстрогена или прогестерона. Наши данные согласуются с результатами других исследователей [77; 100; 102] Однако, изучая другие ткани, вовлеченные в опухолевый процесс было обнаружено, что при отрицательном ЕР статусе опухоли, активность ароматазы в перифокальных тканях была на 33% ниже (р<0,05), а активность СС в ткани метастатически измененных регионарных лимфоузлов была на 89% ниже (р<0,01), чем в ЕР-положительных опухолях. Этот факт свидетельствует о разной интенсивности локального синтеза эстрогенов в тканях, вовлеченных в паталогический процесс. Полученные данные свидетельствуют о превалирующем воздействии рецепторов эстрогена на синтез гормонов в неизмененной ткани и ткани метастатически измененных регионарных лимфоузлов.

Возможно, метаболизм эстрогенов опосредован их взаимодействием с рецепторами, и вероятно, влияет на биологическую агрессивность опухоли и прогрессию заболевания. Можно предположить, что при ЕР-отрицательных опухолях молочной железы наблюдается снижение локального синтеза эстрогенов в перифокальной ткани и ткани регионарных лимфатических узлов, пораженных метастазами, так как опухоль содержит достаточное для своих нужд количество эстрогенов. А при условии отсутствия ЕР в опухоли дальнейший метаболизм эстрогенов протекает по генотоксическому пути, вызывая повреждение ДНК и способствуя более агрессивному течению опухолевого процесса.

В онкологической практике к группе прогностических факторов, определяющих возможный исход рака молочной железы относят такие клинические признаки, как возраст, состояние менструального статуса, размер первичного очага, поражение регионарных лимфатических узлов метастазами, степень злокачественности и гистологический тип опухоли. Однако, как показывает анализ литературных данных по этой проблеме, использование только клинических признаков не дает четкого ответа на вопросы, связанные с биологическими характеристиками опухоли, а, следовательно, и назначением адекватного лечения [10; 27; 73; 155].

К числу важнейших стандартных факторов, которые могут в существенной мере определять благоприятное или неблагоприятное течение заболевания, и которые обязательно учитываются при планировании комплексного лечения больных раком молочной железы, относятся возраст пациенток и состояние менструальной функции.

Результатами нашего исследования показано достоверное увеличение активности ароматазы в 2,2 раза в опухоли у больных старше 50 лет по сравнению с пациентками в возрасте до 40 лет (р<0,05). Вероятнее всего, этот факт тесно связан с наступлением климакса у этого контингента пациенток и недостаточным поступлением эстрогенов из системного кровотока. По данным литературы, в этот период наблюдается преобладание локального синтеза эстрогенов над внутригонадным [21; 60].

При изучении ферментов деградации эстрогенов наблюдалось прогрессирующее снижение суммарной 2/4-эстрогенгидроксилазной активности на 59% у больных РМЖ в возрасте 41-50 лет и на 64% у больных старше 50 лет по сравнению с пациентками в возрасте до 40 лет (р<0,05). Активность КОМТ, напротив, увеличивалась в 1,5 раза у больных в возрасте старше 50 лет, по сравнению с больными в возрасте 41-50 лет (р<0,05). Активность TST увеличивалась в возрасте 41-50 лет, по сравнению с больными до 40 лет в 2,3 раза, и в 1,6 раз по сравнению с больными старше 50 лет (р<0,05).

Полученные нами данные позволяют предположить, что развитие РМЖ в возрастном периоде до 40 лет связано с гентоксическим путем канцерогенеза. В противоположность этому, у женщин старше 50 лет, вероятно, этот путь менее выражен, и в большей мере сопряжен с превалированием промоторного пути канцерогенеза, который реализуется через усиленный локальный синтез гормонов в ароматазной реакции и дальнейшее взаимодействие эстрогенов с рецепторами (Рис. 24). Так, для больных РМЖ до 40 лет характерно наличие значительного количества эстрогенов, не связавшихся с рецепторами стероидных гормонов из-за недостатка полноценно функционирующих ЕР [24; 25], в результате чего гормоны метаболизируются через 2,4-эстрогенгидроксилазный путь, производя в большом количестве мутагенные катехолэстрогены, которые не инактивируются полностью путем метилирования КОМТ и коньюгирования с глутатионом в реакции TST. Катехолэстрогены, не инактивированные на этом этапе, через ряд превращений могут оказывать ДНК-повреждающее действие, усугубляя течение опухолевого процесса. У пациенток старше 50 лет, наибольшее значение приобретает локальный синтез эстрогенов, обеспечиваемых ароматазой, однако своевременная инактивация высокореакционных гормональных метаболитов оказывает влияние на развитие менее агрессивных форм РМЖ. Характерная для пациенток старше 40 лет низкая активность 2,4-эстрогенгидроксилаз, а так же высокие активности КОМТ и TST, по-видимому, обеспечивают полноценную инактивацию эстрогенов. Высокая активность КОМТ может быть связана с тем, что не происходит ингибирование этого фермента гидроксипроизводными, что препятствует возникновению редокс-циклов и окислительной модификации ДНК [120; 162]. Следовательно, можно полагать, что снижение суммарной 2/4 — эстрогенгидроксилазной активности, а также увеличение активностей КОМТ или TST, вероятно, являются факторами более благоприятного течения РМЖ у больных старше 50 лет по сравнению с пациентками, у которых опухоль диагносцирована в возрасте до 40 лет.

Рис. 24. Механизм развития РМЖ в различные возрастные периоды.

При изучении активности ферментов метаболизма эстрогенов в зависимости от состояния менструальной функции было показано отсутствие достоверных изменений на процессы локального синтеза в опухоли. Суммарная 2/4-эстрогенгидроксилазная активность была снижена на 25% у больных РМЖ, находящихся в состоянии постменопаузы по сравнению с пациентками в репродуктивном периоде (р<0,05). Активность КОМТ, напротив, достоверно увеличивалась в 1,8 раза в перименопаузе, и в 1,5 раза в постменопаузе по сравнению с больными, находящимися в репродуктивном периоде (р<0,05). Активность TST незначительно снижалась в постменопаузе. Следует отметить, что для больных РМЖ с сохраненной менструальной функцией была характерна высокая суммарная 2/4 - эстрогенгидроксилазная активность и низкая активность КОМТ, по сравнению с больными в пери- и постменопаузе. Обращает на себя внимание тот факт, что у больных РМЖ, находящихся в состоянии перименопаузы наблюдалось повышение активности TST и КОМТ при меньшем образовании КЭ за счет суммарной 2/4-эстрогенгидроксилазной активности, по сравнению с пациентками в постменопаузе. Вероятно, это связано с постепенным угасанием функции яичников, истощением запасов системного уровня эстрогенов и перестройкой метаболизма гормонов, что отражается на биологических характеристиках опухолей, развившихся в этом периоде.

При изучении взаимосвязи между основными клинико-морфологическими параметрами и активностью ферментов метаболизма эстрогенов было обнаружено достоверное увеличение активности ароматазы в 1,8 раз и в 1.2 раза (р<0,05) при увеличении размера первичной опухоли с Ti до Т2 и Т3. В опухолях с размером более 5 сантиметров наблюдалось достоверное снижение активности КОМТ в 1,7 раза (р<0,05), и снижение активности TST в 2 раза (р<0,01), по сравнению с опухолями размером от 2 до 5 сантиметров. Таким образом, по мере увеличения размера первичной опухоли происходит повышение активности ароматазы и снижение активности ферментов их инактивации - TST и КОМТ. Можно полагать, что снижение активности ферментов инактивации эстрогенов в тканях при РМЖ способствует более агрессивному росту опухоли.

Другим важным клиническим показателем, характеризующим распространенность опухолевого процесса, является наличие или отсутствие метастазов в регионарные лимфатические узлы (N). Для Nj было характерно наличие невысоких активностей ароматазы, СС и КОМТ, а также высокая активность 2,4-эстрогенгидроксилаз и TST в опухоли. При N2 наблюдались низкие значения для активности ферментов и синтеза, и деградации эстрогенов. При N3 были выявлены высокие активности ферментов синтеза эстрогенов и КОМТ, при значительном снижении активности 2,4-эстрогенгидроксилаз и КОМТ. Показано, что при N3 активность ароматазы была выше в 2,4 раза и в 2,5 раз, а активность СС выше в 1,3 раза и в 2 раза по сравнению с N1 и N2 (р<0,05). Рассматривая пути инактивации эстрогенов обнаружено, что активность 2/4 -эстрогенгидроксилаз снижалась в 1,4 раза, а активность TST снижалась в 1,9 раза (р<0,05) при увеличении распространенности опухолевого процесса на лимфатические узлы с Ni до N2. Наблюдалось дальнейшее снижение активности 2/4 — эстрогенгидроксилаз и TST в 5 и в 1,6 раз соответственно, а активность КОМТ увеличивалась в 2 раза при увеличении распространенности опухолевого процесса на лимфатические узлы с N2 до N3.

Полученные данные свидетельствуют о том, что процесс метастазирования в регионарные лимфатические узлы сопровождается увеличением активности ферментов локального синтеза эстрогенов и снижением активности ферментов их инактивации в опухолевой ткани. Вероятно, зарегистрированное нарушение метаболизма эстрогенов тесно связано с опухолевой прогрессией и развитием лимфагенных метастазов.

При изучении активность ферментов метаболизма эстрогенов во взаимосвязи со степенью злокачественности опухоли было обнаружено повышение активности TST в опухолевой ткани больных со второй степенью злокачественности в 2,5 раза по сравнению с опухолями 3 степени злокачественности. Данный факт указывает на то, что снижение активности TST в опухоли является неблагоприятным фактором, который влияет на агрессивное течение опухолевого процесса. Для неизмененной ткани, окружающей опухолевый очаг, было характерно снижение активности ароматазы более чем на 50% и снижение суммарной 2/4-эстрогенгидроксилазной активности примерно на 68% при опухолях 3 степени злокачественности. Это свидетельствует о важном влиянии окружающих опухоль тканей на формирование наиболее злокачественного фенотипа опухолей. Можно полагать, что формирование наиболее злокачественного фенотипа опухоли происходит под влиянием неизмененной ткани и указывает на важную роль изменений метаболизма гормонов в опухоли и перифокальных тканях на формировании более агрессивных новообразований.

Таким образом, особенности метаболизма гормонов в опухолевой и перифокальной тканях сопряжены с основными клинико-морфологическими параметрами (возраст, состояние менструальной функции, размер первичной опухоли, наличие метастазов в регионарных лимфоузлах, степень злокачественности опухоли). Представление доказательства влияния измененного метаболизма эстрогенов в опухолях и перифокальных тканях на основные клинико-морфологические характеристики дают основание для того, чтобы рекомендовать их в качестве дополнительных критериев оценки возможного прогноза заболевания.

Для оценки прогностической значимости статуса рецепторов стероидных гормонов и активности ферментов метаболизма эстрогенов в тканях при раке молочной железы использовался однофакторный анализ признаков, который был выполнен с использованием критерия Гехана-Вилкоксона (Survival Analysis, Statistica 6.0). Были проанализированны результаты безрецидивной и безметастатической выживаемости в группе больных раком молочной железы. Проведенный анализ выживаемости показал, что показатели 2-летней безрецидивной выживаемости лучше при возрасте больных старше 40 лет, активности ароматазы в опухоли более 20 фмоль/мг белка в час, активности 2,4 -эстрогенгидроксилаз в опухолях менее 230 пмоль/ мг белка в час и положительном ЕР статусе первичной опухоли. Показатели 2-летней безметастатической выживаемости лучше при возрасте больных старше 40 лет, отсутствии метастазов в регионарных лимфоузлах и активности TST в опухоли более 40 мкмоль/мг белка в час.

Полученные результаты являются принципиально новыми и позволяют использовать активность некоторых ферментов метаболизма эстрогенов в опухолевой ткани, наряду с уже известными стандартными показателями для прогноза заболевания. Изученные нами показатели, в частности, активность ароматазы, суммарная 2,4-эстрогенгидроксилазная активность, активность TST в опухоли могут явиться характеристиками биологических особенностей опухоли и использоваться в прогнозировании возможного исхода заболевания. Именно совместное применение факторов, отражающих биологические особенности организма больного и критериев, характеризующих молекулярно-биологические особенности опухолевой ткани, позволят с большей степенью вероятности предпологать возможный исход заболевания у больных РМЖ.

Таким образом, выполненное исследование свидетельствует о том, что ферменты метаболизма эстрогенов играют важную роль в патогенезе рака молочной железы, оказывают значимое влияние на характер течения и прогноз заболевания, а также могут использоваться в качестве дополнительных критериев, характеризующих биологические особенности опухоли.