Автореферат и диссертация по медицине (14.00.06) на тему:Значение сосудистых факторов роста в развитии рестеноза коронарных артерий у больных ИБС после коронарной ангиопластики

На правах рукописи

КАМАРДИНОВ ДЖАМШЕД ХУ ШКАДАМОВИЧ

Значение сосудистых факторов роста в развитии рестеноза коронарных артерий у больных ИБС после коронарной ангиопластики

14.00.06 - Кардиология

14.00.44 - Сердечно-сосудистая хирургия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских нал

Москва, 2004

Работа выполнена в Научном Центре сердечно-сосудистой хирургии им. А.Н.Бакулева РАМН

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ:

Академик РАМН Л.А.Бокерия

Доктор медицинских наук, профессор Ю.И.Бузиашвили

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

Доктор медицинских наук, профессор И.В. Мартынов Доктор медицинских наук, профессор А.П. Савченко

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Московский Областной Научно-исследовательский Клинический Институт имени М.Ф. Владимирского

Защита диссертации состоится « сЗ£ » /пл. 2004 года в

часов на заседании диссертационного совета Д.001.015.01 при Научном Центре сердечно-сосудистой хирургии им. А.Н.Бакулева РАМН (121552, Москва, Рублевское шоссе 135).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Научного Центра сердечно-сосудистой хирургии им. А.Н.Бакулева РАМН.

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета

Доктор медицинских наук Д. Ш. Газизова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы:

Одним из важнейших достижений-медицинской» науки и техники последнего десятилетия является разработка и внедрение эндоваскулярных методов лечения ишемической болезни сердца, объем которых прогрессивно увеличивается по. отношению к другим методам реваскуляризации миокарда (Бокерия Л.А., 1998; MylerR., 1999).

Восстановление суженного просвета атеросклеротически измеленной коронарной артерии путем раздувания внутрикоронарного баллона приводит к немедленному увеличению кровотока. Тем не менее, высокая частота повторных стенозов в области дилатации - рестенозов, - достигающая 5060%, снизила первоначальный объем показаний для проведения баллонной ангиопластики, и инициировала поиск эффективных средств, направленных на борьбу с подобным явлением. Это привело к созданию внутрикоронарных протезов (стентов), применение которых достоверно, снизило частоту столь актуального осложнения, однако не решило проблему полностью (Fischman D., 1994; Serruys P., 1994).

По данным- различных исследователей стартовым механизмом развитияфестеноза коронарных артерий у больных ИБС, подвергнутых» эндоваскулярным вмешательствам, могут выступать воспалительная реакция (Schwartz R:, 1990), гиперплазия гладкомышечных волокон (Carter. A., 1994), формирование пристеночного тромба с его последующей организацией (Schwartz R., 1992), а также* влияние ангиотензинпревращающего фермента (Suzuki M., 1997), который активирует ангиотензин- II, индуцирующий клеточную пролиферацию, и подавляет активность брадикинина, ингибирующего клеточный рост.

Последние исследования молекулярных и клеточных механизмов рестеноза на моделях сосудистого повреждения у животных, а также гистологические исследования коронарных артерий человека показали, что в основе развития рестеноза лежат

активация миграции и пролиферации сосудистых клеток под влиянием факторов роста, вызванные повреждением, что является проявлением ангиогенеза и приводит к гиперплазии неоинтимы и неоадвентиции, суживающих просвет артерий (Nicoh S., 1996; Schwartz R., 1997; Schwartz R., 1998).

Однако на сегодняшний день отсутствует единая точка зрения относительно роли сосудистых факторов роста в развитии рестенотического процесса, также крайне ограничено количество исследований, освещающих динамику концентрации сосудистых факторов роста в ответ на баллонное расширение или имплантацию коронарных стентов, И) их возможную роль в формировании неоинтимы и развитии рестеноза.

Цель исследования: определить значение сосудистых факторов роста в развитии рестеноза коронарных артерий у больных ишемической болезнью сердца после коронарной ангиопластики и обосновать возможность коррекции их нарушений.

Задачи исследования:

1. Определить содержание основных ангиогенных факторов (VEGF, bFGF, PDGF, IGF)- в крови» у больных ИБС, направляемых на коронарную ангиопластику.

2. Исследовать временную динамику, концентрации сосудистых факторов роста при проведении» эндоваскулярных вмешательств и определить ее прогностическую значимость в отношении развития рестеноза коронарных артерийЛ

3. Разработать экспериментальное обоснование возможности

i

модуляции ангиогенеза с целью улучшения результатов коронарной ангиопластики.

Работа выполнена в клинико-диагностическом отделении (руководитель - д.м.н., профессор Ю.И. Бузиашвили), отделении рентгенохирургических методов исследования и лечения сердца и сосудов (руководитель- д.м.н., профессор Б.Г.Алекян).

Научная новизна исследования:

Для решения поставленных задач в работе впервые была изучена динамика гуморальной экспрессии.сосудистых факторов

1 .i-'i'.;.»» .i'j; и ^ц), 2

; , ♦«* г« (ч> »

роста у больных ИБС во время проведения коронарной ангиопластики. Оценена прогностическая значимость каждого фактора и показано, что характер экспрессии тромбоцитарного фактора роста и основного фактора роста фибробластов может служить прогностическим маркером отдаленных результатов. процедуры.

Проведен анализ характера экспрессии изоформ-VEGF в различных тканях человека и осуществлено выделение кДНК, кодирующих изоформы VEGF. Впервые были сконструированы и встроены в вектор pCI-Neo плазмидные ДНК VEGF 121, 165 и 183.

Практическая ценность работы:

Возможность определения групп высокого риска рестеноза. коронарных артерий после эндоваскулярных вмешательств на основании исследования содержания сосудистых факторов роста (VEGF, bFGF, PDGF) в крови у больных ИБС, и разработка, методов модуляции ангиогенеза с целью улучшения результатов коронарной ангиопластики.

Положения, выносимые на защиту:

1. Исследование концентрации, сосудистых факторов роста в крови у больных ИБС является объективным методом, отражающим состояние коронарного русла, при этом, их концентрация коррелирует с тяжестью и распространенностью атеросклеротического процесса.

2. Характер экспрессии основного фактора роста фибробластов и тромбоцитарного фактора роста у больных ИБС во время проведения- коронарной ангиопластики может служить прогностическим маркером отдаленных результатов процедуры.

3. Разработанные конструкции плазмидной ДНК сосудистого эндотелиального фактора роста могут быть использованы. в плане терапевтического ангиогенеза.

Реализация результатов работы:

Результаты диссертационного исследования внедрены в практику и находят применение в клинико-диагностическом

отделении, отделении хирургического лечения сочетанных поражений коронарных и периферических артерий, отделении рентгенохирургических методов исследования и лечения сердца и сосудов НЦ ССХ им. А.Н.Бакулева РАМН, а также могут быть использованы в других кардиохирургических центрах

Апробация диссертации:

Материалы диссертации доложены на VI и VII ежегодных сессиях НЦССХ им. А.Н. Бакулева РАМН с Всероссийской конференцией молодых ученых (Москва, 2002, 2003 гг.); на объединенной научной конференции клинико-диагностического отделения, отделения хирургического лечения сочетанных поражений коронарных и периферических артерий, отделения рентгенохирургических методов исследования и лечения сердца и сосудов НЦССХ им. А.Н.Бакулева РАМН (Москва, 22 мая 2003 года).

Структура и объем диссертации:

Диссертация состоит из введения, 4-х глав, выводов, практических рекомендаций и указателя использованной литературы. Работа изложена на 129 страницах машинописного текста, содержит 14 таблиц, 20 рисунков. Список литературы включает 16 работ отечественных и 181 - зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ:

Материал и методы исследования» включают в себя клинический и экспериментальный разделы.

Клиническая часть. В группу исследования вошли результаты обследования и лечения 58 пациентов с ИБС (средний возраст 58.2 ± 1.34 лет), госпитализированных в клинико-диагностическое отделение НЦ ССХ им. А.Н. Бакулева РАМН с ноября 2001 по ноябрь 2002 года.

Для сравнительного анализа уровня основных ангиогенных факторов в крови была сформирована контрольная группа из здоровых добровольцев (п=29) в возрасте от 25 до 59 лет.

Всем больным проводился комплекс диагностических мероприятий до и после интервенционных процедур,

выполнявшихся по стандартной методике. Неинвазивпая диагностика: электрокардиография (ЭКГ) в 12 стандартных отведениях; ЭхоКГ в покое; стресс-ЭхоКГ (с тредмилом или добутамином) с количественным анализом сегментарной сократимости ЛЖ. Инвазивная диагностика: селективная коронарография. Лабораторная диагностика:

иммуноферментный анализ крови для определения факторов роста проводился на микропланшетном анализаторе фирмы "Anthos" модель 2020 (Австрия) с реактивами фирмы «R&D SYSTEMS» (Великобритания), «CYTIMMUNE» (США), а также «DIAGNOSTIC SYSTEMS LABORATORIES» (США). Забор крови осуществлялся непосредственно перед эндоваскулярной процедурой, сразу после нее, через 30 мин, через 3 и 24 часа после вмешательства, образцы и стандарты исследовались в дубликатах.

На момент госпитализации 46.6% пациентов имели клиническую картину стенокардии III функционального класса (ФК) по Канадской классификации, 34.5% - IV ФК, 13.8% - II ФК и 5.2% больных имели безболевую ишемию миокарда. В анамнезе 46.5% пациентов перенесли инфаркт миокарда; у 27.6% ранее было выполнено аортокоронарное шунтирование (АКШ) и/или коронарная ангиопластика. Из факторов риска наиболее часто встречались гиперхолестеринемия (62.1%), артериальная гипертензия (65.5%) и гиподинамия (72.4%). По данным эхокардиографии (ЭхоКР) в покое нарушения локальной сократимости были зафиксированы у 58.6%; общая фракция выброса (ОФВ) ЛЖ составила в среднем 52.6 ± 0.83%. Для определения толерантности к физической нагрузке и выявления «клинико-зависимой» артерии выполнялась стресс-эхокардиография (стресс-ЭхоКГ) с тредмил-тестом (86.2%) или фармакологической пробой (13.8%). У подавляющего большинства пациентов физическая активность была резко ограничена: низкий порог толерантности определен у 38.9%, средний - у 48.1% и высокий - у 13% больных (в среднем 1.74±0.09 ступени по протоколу Брюса). При ЭхоКГ-контроле ОФВ ЛЖ снижалась с исходной 52.6 ± 0.83% до 47.83 ± 1.09% на пике нагрузки (р < 0.05).

Результаты коронарографии представлены в табл. 1.

Таблица 1

Результаты коронарографического исследования»

Тип кровоснабжения (количество больных)

Правый Левый сбалансированный Всего

48 (82.7%) 5 (8.65%) 5 (8.65%) 58 (100%)

Характер поражения (количество больных)

Однососудистое Двухсосудистое Трехсосудистое Всего

18(31%) 13 (22.4%) 27 (46.6%) 58 (100%)

Коллатерали (количество больных)

Внутрисистемные Межсистемные Всего

4 (6.9%) 17 (29.3%) 21 (36.2%)

Среднее количество пораженных основных эпикардиальных артерий составило 2.15±0.11, при этом было выявлено 3.01±0.21 гемодинамически значимых стеноза на пациента. Средняя степень сужения составила 79.2± 1.84%.

Также рассчитывался обструкционный г индекс коронарных артерий (ОИКА), который в общей группе больных составил в среднем 13.4 ± 0.9 баллов: при стенозировании одного сосуда -7.4 ± 0.6 баллов, двух сосудов - 11.4 ± \А баллов и трех сосудов -18.4 ± 1.1 баллов. Данная величина была достоверно ниже у больных с изменениями одной артерии в сравнении с группами двух- (р = 0.008) и трехсосудистого (р < 0.0001) поражения. Статистически значимые различия также были выявлены между пациентами с наличием стенозов в двух и трех коронарных сосудах (р = 0.0005).

Экспериментальная часть (конструирование плазмидных ДНК). Для выделения- кДНК различных изоформ УБОР проводили реакцию РТ-ПЦР. В качестве матриц использовали суммарную РНК (С1ои1есИ, США) человека из семенников, мозга, костного мозга, сердца, легких, почек, тимуса, матки, селезенки, гладких мышц и печени. Для синтеза «первой цепи» применяли

праймер (dT)18 и ревертазу Superscript И (Gibco BRL, США). Амплификацию проводили с использованием ExTaq-полимеразы (Takara, Япония).

Статистические методы. Обработку результатов проводили с помощью компьютерной программы IN STAT. Достоверность различий определяли по критерию t Стьюдента. При корреляционном анализе использовали коэффициент ранговой корреляции Спирмена (г). Данные считались статистически достоверными при значении р < 0.05.

Полученные результаты:

Коронарная ангиопластика

Непосредственные результаты интервенционного лечения. В группе исследования было выполнено 63 эндоваскулярных вмешательства: у пациентов с однососудистым поражением КА -18 процедур, с двухсосудистым - 15 и с трехсосудистым - 30 вмешательств. В общей сложности реваскуляризирована 81 артерия (в среднем 1.39±0.06 на пациента). При этом кровоток был восстановлен в 138 сегментах (табл. 2): 30 из них было подвергнуто транслюминальной баллонной ангиопластике и в 108 - стентированию (в т.ч. в 38 случаях использовались стенты с антипролиферативным покрытием — «Cypher», Cordis, США).

Таблица 2

Структура эндоваскулярных вмешательств

Стентирование Ангиопластика

Коронарные артерии ПМЖВ ПКА О В/ВТК ПМЖВ ПКА О В/ВТК

Кол-во сегментов 47 (43.5%) 42 (38.9%) 19 (17.6%) 8 (26.7%) 18 (60%) 4 (133%)

Всего 108(100%) 30 (100%)

Все процедуры в группе больных с однососудистым поражением КА оценены как ангиографически и клинически

эффективные. Осложнений и летальных исходов при проведении вмешательств не было. После интервенционного лечения ФК стенокардии достоверно уменьшился в среднем с 3.0±0.16 до 0.2±0.09 (р<0.0001); толерантность к физической нагрузке при тредмил-тесте возросла с 1.9±0.14 ступени до 2.8±0.09 (р<0.0001).

При множественном поражении коронарных артерий ангиопластике были подвергнуты 63 сосуда (в среднем 1.5±0.07 на пациента). Объем эндоваскулярных вмешательств в основном ограничивался одной артерией (60%), в 32.5% случаев воздействие осуществлялось на 2 артериях, и только в 7.5% случаях реваскуляризации подверглись все три основные артерии. Ангиографический успех при реваскуляризации составил 93.65%. Клинически эффективной ангиопластика расценена у 90% больных: достоверное снижение ФК стенокардии в среднем с 3.3±0.11 до 0.96±0.14 (р<0.0001); повышение толерантности к физической нагрузке при тредмил-тесте с 1.6±0.09 ступени до 2.2±0.11 (р<0.0001). Осложнения возникли в 5% случаев и включали интраоперационную фибрилляцию желудочков и подострый тромбоз стента, ставший причиной формирования не Q-волнового инфаркта миокарда.

Отдаленный период наблюдения (от 3 до 7 месяцев, в среднем 5.2 ± 2.2 мес). Контрольная коронарография выполнялась у 67.2% пациентов. Возврат или прогрессирование стенокардии наблюдалось у 29.3% больных, ангиографически подтвержденный рестеноз был выявлен у 24.1% пациентов в 16 из реваскуляризированных сегментов. Рестеноз одного подвергнутого ангиопластике поражения КА отмечали у 85.7% больных, двух - у 14.3% пациентов.

Частота рестенозов составила 35.9% в группе, где использовались обычные стенты. Ретроспективный анализ показал, что они возникали преимущественно у пациентов с многососудистым поражением (30%) и только 11.1% больных изначально относились к группе однососудистого поражения коронарных артерий.

В среднем, у пациентов с рестенозом коронарных артерий изначально выполнялась коронарная ангиопластика 3.1±0.61

артериальных сегментов по сравнению с 2.1±0.19 в группе больных без рестеноза (р=0.06). Имплантировано 27 стентов, в среднем 1.9±0.23 стента на одного больного; в группе без рестеноза данный показатель составил 1.8±0.14 (р=0.87). В отдаленном периоде наблюдения 18.75% пациентов направлены-на операцию аортокоронарного шунтирования, 37.5% - на повторные эндоваскулярные вмешательства.

Результаты иммуноферментного анализа

Динамика уровня сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF). Базальный уровень VEGF в плазме обследованных больных составил 169.9± 13.4 пкг/мл (29-415 пкг/мл) и был выше, чем в группе контроля 61.8 ± 7.65 пкг/мл (20-123 пкг/мл), рО.0001. Достоверное различие- его концентрации выявлено между группами' пациентов с сахарным диабетом и при его отсутствии: исходные показатели 237.3 ± 31.17 пкг/мл и 154.2 ± 14.2 пкг/мл соответственно, р = 0.013 (рис. 1).

В группе больных с поражением 3-х основных эпикардиальных артерий и высоким обструкционным индексом (18.4 ± 1.1 баллов) базальное значение VEGF составило 241.1 ±16.77 пкг/мл, что было достоверно выше по сравнению с группой двухсосудистого (143.7±24.82 пкг/мл, обструкционный индекс - 11.4 ± 1.4 баллов, р=0.0012) и однососудистого поражения КА (82.1 ±10.41 пкг/мл, обструкционный индекс - 7.4 ± 0.6 баллов, г=0.73, р<0.0001). Существенные различия по данному параметру прослежены и между пациентами с гемодинамически значимыми изменениями одной и двух коронарных артерий (р = 0.0247).

У больных с наличием внутри- или межсистемных перетоков исходный уровень VEGF в 1.5 раза превышал значение, полученное в группе без развитого коллатерального кровообращения, и составил в среднем 209.2±18.61 пкг/мл и 147.6±17.45 пкг/мл, соответственно, р = 0.0075 (рис. 2).

Несмотря на то, что в этой группе окклюзирующие поражения коронарных артерий регистрировались не во всех

случаях (76.2%), достоверные различия по ОИКА были выявлены между пациентами с наличием перетоков и без них: 15.76± 1,49 и 12.1 ± 1.05 баллов соответственно, р=0.0046;

Достоверных изменений гуморальной экспрессии сосудистого эндотелиального фактора роста на госпитальном периоде после коронарной ангиопластики (к концу первых суток) не выявлено, несмотря на различную медикаментозную поддержку при проведении процедуры (гепарин или интегрилин): 169.9±13.4 пкг/мл исходно и 173.9±13.35 пкг/мл через сутки после вмешательства р=0.832.

Достоверные различия по послеоперационному уровню VEGF сохранялись между группами пациентов с сахарным диабетом и без диабета, и различным характером поражения коронарного русла (табл. 3).

Таблица 3

Послеоперационный уровень VEGF в различных группах больных

Ср. значения (пкг/мл) * Диапазон колебаний (пкг/мл) Р

Сахарный диабет 236.3 ± 30.6 115-381. 0.0225

Без сахарного диабета 159-3 ±14.3 33-397

1-сосудистое поражение 87.5 ±9.90 33 -174 0.0221 (1 и 2)

2-сосудистое поражение 150.5 ±25.7 56-360 0.0023 (2 и 3)

3-сосудистое поражение 242.9 ±17.07 75-397 0.0001 (3 и 1)

Сопоставляя исходный уровень VEGF с показателями в отдаленном периоде после ангиопластики, мы не нашли существенных различий между пациентами с развившимся рестенозом и больными с сохранившимся положительным клиническим эффектом процедуры: 204.0±25.94 пкг/мл и 159.1± 15.59 пкг/мл соответственно, р=0.1039.

Динамика уровня основного фактора роста фибробластов (bFGF). Базальный уровень bFGF в исследуемой нами группе

больных значительно превышал величину группы контроля: средние показатели составили 29.7±2.П и 13.1 ±1.11 пкг/мл соответственно, р<0.0001 (рис.3).

□ баи 1Ы1ЫЙ уровень в после к\

Рис. 3. Результаты иммуноферментного анализа (ЬРСК).

Достоверное различие по исходному уровню bFGF наблюдалось в зависимости от распространенности поражения коронарных артерий. Так, в группе пациентов с гемодинамически значимым поражением 3-х основных эпикардиальных артерий и высоким ОИКА (18.4 ± 1.1 баллов) базальный уровень bFGF заметно превышал его значение в группе больных со стенозирующим поражением одной коронарной артерии и более низким ОИКА (7.4 ± 0.6 баллов): 36.Ш. 16-И 18.9±2.30 пкг/мл соответственно (г=0.71, р=0.0005).

Статистически значимые различия были выявлены и между группами больных с двухсосудистым (ОИКА - 11.4 ± 1.4 баллов) и однососудистым (ОИКА - 7.4 ± 0.6 баллов) поражением: 31.4 ± 4.71 и 18.9 ± 2.30 пкг/мл соответственно, р = 0.0247.

В отличие от VEGF, средний уровень bFGF в послеоперационном периоде снизился с исходного 29.7±2.11 до 18.5±1.76 пкг/мл, р = 0.0001, при этом наиболее выраженное снижение отмечалось в группе с трехсосудистым поражением-коронарных артерий.

Прослеживалась четкая зависимость между объемом проведенного вмешательства и показателями экспрессии bFGF в послеоперационном периоде. Так, при ангиопластике 3-х и более стенозов, уровень bFGF снизился с базального 36.5±3.56 до 17.8±3.15 пкг/мл после процедуры (р = 0.0002), тогда как у пациентов с меньшим объемом вмешательства (1-го и 2-х стенозов) он практически не изменился: 25.2±2.40 пкг/мл исходно и 18.9±2.13 пкг/мл после эндоваскулярного лечения (р > 0,05).

Сроки изучения клинических результатов в отдаленном периоде колебались от 3-х до 7 месяцев. Рестеноз имел место в 24.1% случаев, в 5.2% - отмечалось прогрессирование атеросклеротического процесса в сегментах, раннее не подвергнутых эндоваскулярным вмешательствам, в 70.7% -сохранялся положительный результат вмешательства.

Среди всех больных с рестенозированием множественное исходное изменение коронарных артерий имело место у 85.7%. При этом, более чем в 52% случаев проводилась ангиопластика 3-х и более стенозов. Однако, возврат стенокардии, обусловленный развитием рестеноза, зафиксирован только в случаях выраженного (в 3 и более раза) снижения уровня bFGF в крови в послеоперационном периоде: с исходного 43.0±5.13 до 14.2±1.97 пкг/мл после ангиопластики (р < 0.0001) по сравнению с группой без рестеноза - 25.9±1.99 исходно и 19.7±2.2 пкг/мл после вмешательства, р = 0,094.

Необходимо отметить, что дооперационный уровень bFGF был также достоверно выше в группе рестенозирования по сравнению с пациентами без рестеноза (43.0±5.13 и 25.9±1.99 пкг/мл, соответственно), р = 0.0038, рис 4.

Кроме того, нами была выявлена прямая корреляция между динамикой концентрации bFGF и отдаленными результатами процедуры (г = 0.6108, р = 0.0014, по Spearman). Это означает, что

чем выраженнее степень снижения концентрации bFGF в послеоперационном периоде, тем выше вероятность последующего гиперпластического ответа сосудистой стенки.

без рестемпа рсстеноз

* бяэальиый уровень • после КА

Рис. 4. Результаты нммуноферменгного аиалига (ЬРСК),

Динамика уровня тромбоцитарного фактора роста (PDGF-AB). Количественный анализ на дооперационном этапе показал, что концентрация этого фактора в крови у исследуемой группе больных почти в 1.5 раза превышала значение группы контроля: 463.0±30.64 и 328.3± 10.66 пкг/мл соответственно, р = 0.0045.

По исходному уровню PDGF-AB группы пациентов с рестенозом и без него достоверно не различались. Однако в ближайший послеоперационный период (непосредственно и через 30 мин после ангиопластики) характер экспрессии данного фактора роста претерпел изменения, которые достигли статистической значимости. В более поздние сроки наблюдения (через 3 и 24 часа после вмешательства) эти различия нивелировались. Ретроспективно выявлены достоверные различия

между исходным уровнем PDGF-AB и степенью агрегации тромбоцитов. Так, у пациентов с агрегацией тромбоцитов 40% и выше (в среднем 54.6± 1.99%) он был выше по сравнению с больными со степенью агрегации 39% и ниже (в среднем 30.3±2.23%): 558.3±67.3 и 420.1±42.64 пкг/мл, соответственно, р = 0.0357. При этом имелась прямая корреляция между уровнем PDGF-AB в плазме крови и степенью агрегации тромбоцитов (г = 0.5184).

Наиболее интересной представляется динамика экспрессии тромбоцитарного фактора роста в ближайшие минуты и часы после оперативного вмешательства. Как видно, своего пикового уровня, который был выше исходного в 1.6 раза, PDGF-AB достигал в первые 5 минут после коронарной ангиопластики. В последующие 3 часа его концентрация снижалась почти до базального уровня. Последний забор крови, осуществлявшийся через сутки после операции, свидетельствовал о дальнейшем падении этого показателя и стабилизации его на значении несколько ниже базального. Статистическая обработка данных

показала достоверные различия между значениями PDGF-AB на 1-2 (рО.0001), 1-3 (р=0.0022), 2-3 (р=0.0069) и 2-4 (рО.0001) этапах исследования (рис. 5).

Большее значение могут иметь данные, полученные при сравнении величин концентрации PDGF-AB во время коронарной ангиопластики с отдаленными результатами процедуры. У больных с сохранившимся положительным клиническим эффектом процедуры и отсутствием объективных признаков рестеноза на протяжении последующих 6 месяцев, отмечался менее выраженный подъем уровня PDGF-AB в первые 5 мин после оперативного вмешательства по сравнению с группой пациентов, у которых имелся рестеноз. В количественном аспекте уровень данного фактора роста у больных без рестеноза сразу после ангиопластики возрос в 1.4 раза, тогда как в группе с рестенозом он увеличился более чем в 2 раза (рис. 6).

Между степенью изменения уровня PDGF-AB в непосредственном послеоперационном периоде и последующим развитием рестеноза нами была выявлена прямая корреляционная

зависимость (г = 0.6319). То есть, чем более выраженный всплеск PDGF-AB регистрируется в ближайшее время.после процедуры, тем выше вероятность формирования рестеноза на протяжении 67 месяцев после успешно проведенного лечения.

Динамика уровня инсулиноподобного фактора роста-1 (IGF-1). При планировании данного исследования, стояла задача не только выявить какую-либо динамику сосудистых факторов роста во время проведения коронарной ангиопластики, но и доказать, что возможные изменения не обусловлены введением контрастного вещества или самим вмешательством. В качестве референтного метода использовалось определение концентрации инсулиноподобного фактора роста-1 (IGF-1), причем, с учетом методики исследования, не было необходимости проводить сравнительный анализ с контрольной группой.

10-39 лс> 40-19 лет 50-59 лет 60 лет н мше

Рис. 7. Ре |у.1ьтаты иммуноферментного анализа (1СК-1).

Исходная концентрация IGF-1 составила в среднем 151. 1±7.91 нг/мл. В отличие от других сосудистых факторов роста уровень IGF-1 в крови подвержен возрастным колебаниям. Оценивая полученные данные и сопоставляя их с возрастными

нормами, мы не выявили отклонений у исследуемой группы-больных (рис. 7).

Проведенный» анализ уровня IGF-1 на всех этапах коронарной ангиопластики не показал какой-либо динамики его концентрации. Имеющиеся в нашем распоряжении результаты дали основание использовать инсулиноподобный фактор роста-1 в качестве эталона.

Конструирование плазмидных ДНК

При ПЦР-амплификации последовательностей,

кодирующих изоформы VEGF с использованием специфических праймеров - vegfU - ccatgacctttctgcagtctagg и vegfD — cctggagagagctctggatcc, на матрице суммарной кДНК был выявлен сложный набор фрагментов размером от 400 до 600 п.о. Гетерогенность продуктов ПЦР-амплификации была подтверждена при анализе рекомбинантных плазмид, содержащих клонированные ПЦР-фрагменты в векторе pGEM-T (Promega, США). Секвенирование полученных клонов позволило установить, что они содержат вставки, кодирующие различные изоформы VEGF, полностью соответствующие по своей первичной структуре ранее опубликованным

последовательностям изоформ мРНК VEGF121, 165, 183. Полученные данные свидетельствуют о различной представленности изоформ VEGF в анализированных тканях и могут отражать особенности тонкой регуляции экспрессии этого гена на уровне альтернативного сплайсинга.

Для создания плазмидных ДНК, направляющих синтез изоформ в клетках млекопитающих и человека, фрагменты, кодирующие изоформы VEGF 121, VEGF 165, VEGF 183 были встроены в вектор pCI-Neo (Pharmacia, Швеция) по сайту Smal. Генетическая карта плазмиды pCFNeoVEGF165 представлена на рис. 8. Карты плазмид pCINeoVEGF121, pCINeoVEGF183 выглядят аналогично.

Таблица 4

Уровни продукции VEGF при транзиентной экспрессии различных изоформ в клетках линии 293

Вектор Содержание белка в супернатантах по данным ИФА (нг/мл, среднее из 4 независимых определений)

РС11МеоУЕОР121 20.38

РС^еоУЕСР165 19.94

РС1№оУЕСР183 0

РЕвРР-С! 0

Анализ уровней экспрессии VEGF (табл. 4) в супернатантах культурал ьной1 среды клеток линии 293, трансфицированных

различными плазмидными ДНК, показал, что VEGF 121 и VEGF 165 эффективно секретируются этими клетками. В то же время, йзоформа VEGF 183, как-и ожидалось, отсутствовала в среде культивирования, оставаясь, по-видимому, связанной с протеогликанами внеклеточного матрикса.

Таким образом, созданные плазмидные ДНК или их производные могут быть использованы не только в различных схемах терапевтического ангиогенеза, но и в качестве антипролиферативной терапии при коронарной ангиопластике.

ВЫВОДЫ

1. Определение плазменной концентрации сосудистых факторов роста у больных ИБС является объективным методом исследования, отражающим состояние коронарного русла пациентов. Уровень основных ангиогенных факторов роста (VEGF и bFGF) у больных ИБС в несколько раз выше (в 2,7 и 2 раза, соответственно, р<0.05), чем у здоровых лиц и коррелирует с объемом поражения коронарных артерий (г=0.73 и г=0.71 соответственно, р<0.05).

2. У больных ИБС с сопутствующим сахарным диабетом отмечается более высокая экспрессия VEGF (более чем в 1.5 раза) по сравнению с пациентами без нарушения углеводного обмена.

3. Динамика концентрации bFGF зависит от объема выполненных эндоваскулярных вмешательств: после ангиопластики 3-х и более артериальных сегментов в большинстве случаев (80% и более) отмечается снижение уровня bFGF в 2,3 раза (р<0.05), в то время, как после ангиопластики 1 или 2-х стенозов отмечаются умеренные колебания его концентрации, не достигающие статистической значимости.

4. В группе пациентов с ангиографически документированным рестенозом коронарных артерий отмечается значительное снижение концентрации bFGF после интервенционного

вмешательства (в 3 и более раза) по сравнению с группой без рестеноза (1.3 раза). Также отмечается выраженное увеличение концентрации PDGF-AB непосредственно после дилатации коронарной артерии или имплантации стента с последующим снижением до уровня ниже исходного, причем степень повышения концентрации PDGF-AB в послеоперационном периоде пропорциональна вероятности последующего развития рестеноза (г=0,6319, р<0.005).

5. Созданные плазмидные ДНК или их производные стимулируют синтез и секрецию сосудистых факторов роста (VEGF-121 и VEGF-I65) клетками млекопитающих и, таким образом, могут быть использованы в различных схемах терапевтического ангиогенеза.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. У больных ишемической болезнью сердца, направляемых на коронарную ангиопластику, целесообразно проводить исследование концентрации сосудистых факторов роста в крови (VEGF, bFGF, PDGF) для выявления групп повышенного риска рестеноза коронарных артерий.

2. У больных с повышенным риском рестеноза КА по данным исследования динамики сосудистых факторов роста применять стенты с антипролиферативным покрытием.

3. На основании данных экспериментальных исследований внедрить метод терапевтического применения плазмид ДНК VEGF у пациентов, направляемых на эндоваскуларное лечение, для стимуляции ангиогенеза с целью улучшения результатов коронарной ангиопластики.

Список опубликованных работ:

1. Значение сосудистых факторов роста в развитии рестеноза коронарных артерий у больных ИБС после интервенционных вмешательств / в соавт. с Бузиашвили Ю.И., Асымбековой Э.У., Мацкеплишвили СТ., Ариповым М.А. // Материалы

Международной, конференции «Неинвазивная диагностика ишемической болезни сердца: настоящее и будущее». -Москва, 2001 (25-26 октября). -С.53.

2. Влияние дипиридамола на содержание в крови сосудистого эндотелиального фактора роста и фактора роста фибробластов у больных ишемической болезнью сердца / в соавт. с Бузиашвили Ю.И., Мацкеплишвили СТ., Асымбековой Э.У., Хапий И.Х., Бувапьцеввым В.И. // Кардиология -2003. -№б. -С.14-17.

3. Сосудистые факторы роста и ремоделирование коронарных артерий сердца после баллонной дилатации / в соавт. с Бузиашвили Ю.И., Алекяном Б. Г., Асымбековой Э.У., Стаферовым А.В., , Мацкеплишвили СТ., Хапий И.Х., Лобжанидзе Т.Г. // VI ежегодная сессия Научного Центра сердечно-сосудистой хирургии им. А.Н. Бакулева РАМН с Всероссийской конференцией молодых ученых. -Москва, 2002. -С.156.

4. Применение дипиридамола для фармакологической модуляции ангиогенеза у больных ишемической болезнью сердца / в соавт. с Бузиашвили Ю.И., Мацкеплишвили СТ., Асымбековой Э.У., Хапий И.Х. // VII, ежегодная сессия Научного Центра сердечно-сосудистой хирургии им. А.Н. Бакулева РАМН с Всероссийской конференцией молодых ученых.-Москва, 2003. -С. 182.

5. Динамика сосудистых факторов роста до и после коронарной ангиопластики / в соавт. с Бузиашвили Ю.И., Мацкеплишвили СТ., Стаферовым А.В., Скрябиным К.Г, Бокерия Л.А., Петровым Р.В. // В материалах Российского Национального конгресса кардиологов. -Москва, 2003. -С51.

6. Содержание сосудистых факторов роста у больных ишемической болезнью сердца с аневризмой левого желудочка при использовании дипиридамола / в соавт. с Бузиашвили Ю.И., Мацкеплишвили СТ., Хапий И.Х. // В материалах Российского Национального конгресса кардиологов. -Москва, 2003.-С52.

7. Тромбоцитарный фактор роста (PDGF) и рестеноз коронарных артерий после интервенционных вмешательств / в соавт. с Мацкеплишвили СТ. // VII ежегодная сессия Научного Центра

сердечно-сосудистой хирургии им. А.Н. Бакулева РАМН с Всероссийской конференцией молодых ученых. -Москва, 2003. -С.242.

8. Плазмидные ДНК для индукции терапевтического ангиогенеза / в соавт. с Бузиашвили Ю.И., Эльдаровым М.А., Мацкеплишвили СТ., Скрябиным К.Г., Бокерия Л.А. // VII ежегодная сессия Научного Центра сердечно-сосудистой хирургии им. А.Н. Бакулева РАМН с Всероссийской конференцией молодых ученых. —Москва, 2003. -С. 189.

9. Плазмидные ДНК для индукции терапевтического ангиогенеза / в соавт. с Бузиашвили Ю.И., Эльдаровым М.А., Мацкеплишвили СТ., Скрябиным К.Г., Бокерия Л.А. // В материалах Российского Национального конгресса кардиологов. -Москва, 2003. -С.54.

Тираж 100

Отпечатано в НЦССХ им. А. Н. Бакулева РАМН

€ 36s8

Одним из колоссальных достижений науки и техники последнего десятилетия является разработка эндоваскулярных методов - лечения ишемической болезни сердца, объем которых прогрессивно увеличивается по отношению к другим методам реваскуляризации миокарда (4; 130).

Восстановление суженного просвета атеросклеротически измененной коронарной артерии путем раздувания внутрикоронарного баллона приводит к немедленному увеличению кровотока. Тем не менее, высокая частота повторных стенозов в области дилатации (рестенозов), достигающая 50-60%, снизила первоначальный объем показаний для проведения баллонной ангиопластики, и инициировала поиск эффективных средств, направленных на борьбу с ней. Это привело к созданию внутрикоронарных протезов (стентов), применение которых достоверно снизило частоту столь актуального осложнения, однако не решило проблему полностью (73; 168).

По данным различных исследователей стартовым механизмом развития рестенозов коронарных артерий у больных ИБС, подвергнутых эндоваскулярным вмешательствам, могут выступать повреждение интимы и обнажение тромбогенного субэндотелия с формированием пристеночного тромба и последующей его организацией (163), воспалительная реакция в ответ на повреждение или имплантацию стента и рост экспрессии рецепторов адгезии (165), окислительный стресс и гиперплазия гладкомышечных волокон (41), а также влияние ангиотензинпревращающего фермента (181), который активирует ангиотензин П, индуцирующий клеточную пролиферацию, и подавляет активность брадикинина, ингибирующего клеточный рост.

Последние исследования молекулярных и клеточных механизмов рестеноза на моделях сосудистого повреждения у животных, а так же гистологические исследования коронарных артерий человека (аутопсия) 5 показали, что в основе развития рестеноза лежат активация миграции и пролиферации сосудистых клеток под влиянием факторов роста, вызванные повреждением, что является проявлением ангиогенеза и приводит к гиперплазии неоинтимы и неоадвентиции, суживающих просвет артерий (133; 161; 162).

Факторы роста, секретируемые неспециализированными клетками, локализованными во всех тканях, оказывают влияние на поведение клеток сосудистой стенки. Этот аспект имеет важное значение в механизме развития и прогрессирования не только атеросклеротического процесса, но и процесса рестенозирования коронарных артерий после эндоваскулярных вмешательств, когда, в ответ на внешнее воздействие, клетки сосудистой стенки и крови (эндотелиальные клетки, тромбоциты, макрофаги и гладкомышечные клетки) вырабатывают биологически активные вещества (тромбоцитарный фактор роста, основной фактор роста фибробластов, инсулиноподобный фактор роста и др.). С другой стороны, сосудистые клетки сами являются мишенями воздействия факторов роста.

При первичной ангиопластике нативной коронарной артерии механизм дилатации заключается в следующем: происходит фрагментация атеросклеротической бляшки раздутым баллоном и выдавливание фрагментированных элементов в глубокие слои сосудистой стенки через надрывы оболочки интимы. Это приводит к выходу содержимого атеросклеротической бляшки в сосудистое русло и активизацию эндотелиальных клеток, тромбоцитов, макрофагов и фибробластов в ответ на повреждение. Результатом запущенного каскада реакций (с участием клеточных элементов сосудистой стенки, свертывающей и противосвертывающей системы крови, системы мононуклеарных фагоцитов) является пролиферация и миграция гладкомышечных клеток (ГМК), формирование неоинтимы и сужение просвета артерии.

Анализ литературных данных и систематизация последних разработок по данной проблеме показали отсутствие исследований, посвященных изучению динамики сосудистых факторов роста при проведении интервенционных вмешательств, а выявление дополнительных предикторов рестеноза могло бы способствовать более дифференцированному отбору больных для эндоваскулярного лечения и улучшению отдаленных результатов.

На основании этого, целью нашего исследования явилось - определить значение сосудистых факторов роста в развитии рестеноза коронарных артерий у больных ишемической болезнью сердца после коронарной ангиопластики и обосновать возможность коррекции их нарушений.

Задачи исследования:

1. Определить содержание основных ангиогенных факторов (VEGF, bFGF, PDGF, IGF) в крови у больных ИБС, направляемых на коронарную ангиопластику.

2. Исследовать временную динамику концентрации сосудистых факторов роста при проведении эндоваскулярных вмешательств и определить ее прогностическую значимость в плане развития рестеноза коронарных артерий.

3. Разработать экспериментальное обоснование возможности модуляции ангиогенеза с целью улучшения результатов коронарной ангиопластики.

Научная новизна. Для решения поставленных задач в работе впервые была изучена динамика гуморальной экспрессии сосудистых факторов роста во время проведения коронарной ангиопластики. Оценена прогностическая значимость каждого фактора и показано, что характер экспрессии тромбоцитарного фактора роста и основного фактора роста фибробластов во время ангиопластики может служить прогностическим маркером отдаленных результатов процедуры.

Проведен анализ характера экспрессии изоформ VEGF в различных тканях человека и осуществлено выделение кДНК, кодирующих изоформы VEGF. Впервые были сконструированы и встроены в вектор pCI-Neo плазмидные ДНК VEGF 121,165 и 183.

Практическая значимость: возможность определения групп высокого риска рестеноза коронарных артерий после эндоваскулярных вмешательств на основании иммуноферментного анализа концентрации сосудистых факторов роста (VEGF, bFGF, PDGF) в крови у больных ИБС, и разработка методов модуляции ангиогенеза с целью улучшения результатов коронарной ангиопластики.

Положения, выносимые на защиту:

1. Исследование концентрации сосудистых факторов роста в крови у больных ИБС является объективным методом, отражающим состояние коронарного русла у этих больных, а их уровень коррелирует с тяжестью и распространенностью атеросклеротического процесса.

2. Характер гуморальной экспрессии основного фактора роста фибробластов и тромбоцитарного фактора роста у больных ИБС во время проведения коронарной ангиопластики может служить прогностическим маркером отдаленных результатов процедуры.

3. Разработанные конструкции плазм идной ДНК сосудистого эндотелиального фактора роста могут быть использованы в плане терапевтического ангиогенеза.

На страницах этой рукописи мне хочется выразить глубокую благодарность руководству Научного Центра сердечно-сосудистой хирургии им. А.Н.Бакулева РАМН во главе с директором, академиком РАМН Л.А.Бокерия, за неоценимую помощь и постоянную подцержку в выполнении данного исследования.

Очень сложно подобрать слова признательности профессору Ю.И.Бузиашвили, руководителю клинико-диагностического отделения. Неординарность мышления, полет творческой фантазии, необыкновенный энтузиазм и потрясающая работоспособность сделали реальным осуществление большого проекта, одним из этапов которого стала данная работа.

Теплые слова мне хочется произнести в адрес всего коллектива клинико-диагностического отделения, персонально С.Т.Мацкеплишвили и В.И.Иошиной, а также сотруднику отделения РХИСиС НЦ ССХ им. А.Н.Бакулева РАМН А.В.Стаферову.

Считаю своим долгом отдельно отметить огромный вклад в разработку и осуществление экспериментальной части исследования сотрудников института «Биоинженерии» РАН во главе с директором, академиком РАН К.Г.Скрябиным и выразить им слова огромной благодарности.

Не хватит слов, чтобы выразить всю любовь моим дорогим родителям, старшему брату и супруге за их чуткое понимание, нескончаемое терпение и постоянную поддержку.

выводы

1. Определение плазменной концентрации сосудистых факторов роста у больных ИБС является объективным методом исследования, отражающим состояние коронарного русла пациентов. Уровень основных ангиогенных факторов роста (VEGF и bFGF) у больных ИБС в несколько раз выше (в 2,7 и 2 раза, соответственно, р<0.05), чем у здоровых лиц и коррелирует с объемом поражения коронарных артерий (г=0.73 и г=0.71 соответственно, р<0.05).

2. У больных ИБС с сопутствующим сахарным диабетом отмечается более высокая экспрессия VEGF (более чем в 1.5 раза) по сравнению с пациентами без нарушения углеводного обмена.

3. Динамика концентрации bFGF зависит от объема выполненных эндоваскулярных вмешательств: после ангиопластики 3-х и более артериальных сегментов в большинстве случаев (80% и более) отмечается снижение уровня bFGF в 2,3 раза (р<0.05), в то время, как после ангиопластики 1 или 2-х стенозов отмечаются умеренные колебания его концентрации, не достигающие статистической значимости.

4. В группе пациентов с ангиографически документированным рестенозом коронарных артерий отмечается значительное снижение концентрации bFGF после интервенционного вмешательства (в 3 и более раза) по сравнению с группой без рестеноза (1.3 раза). Также отмечается выраженное увеличение концентрации PDGF-AB непосредственно после дилатации коронарной артерии или имплантации стента с последующим снижением до уровня ниже исходного, причем степень повышения концентрации PDGF-AB в послеоперационном периоде пропорциональна вероятности последующего развития рестеноза (г=0,6319, р<0.005).

5. Созданные плазмидные ДНК или их производные стимулируют синтез и секрецию сосудистых факторов роста (VEGF-121 и VEGF-165) клетками млекопитающих и, таким образом, могут быть использованы в различных схемах терапевтического ангиогенеза.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. У больных ишемической болезнью сердца, направляемых на коронарную ангиопластику, целесообразно проводить исследование концентрации сосудистых факторов роста в крови (VEGF, bFGF, PDGF) для выявления групп повышенного риска рестеноза коронарных артерий.

2. У больных с повышенным риском рестеноза коронарных артерий по данным исследования динамики сосудистых факторов роста применять стенты с антипролиферативным покрытием.

3. На основании данных экспериментальных исследований внедрить метод терапевтического применения плазмид ДНК VEGF у пациентов, направляемых на эндоваскулярное лечение, для стимуляции ангиогенеза с целью улучшения результатов коронарной ангиопластики.