Автореферат и диссертация по медицине (14.01.01) на тему:Значение определения сывороточного амилоида А 1 в дифференциальной диагностике опухолей яичников

На правах рукописи

НАРИМАНОВА МЕТАНАТ РАФНГ КЫЗЫ

ЗНАЧЕНИЕ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СЫВОРОТОЧНОГО АМИЛОИДА А 1 В ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКЕ ОПУХОЛЕЙ ЯИЧНИКОВ.

14.01.01 - «акушерство и гинекология».

Автореферат диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 5 ПАР 2015

Москва-2015 005561156

005561156

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И.Пирогова» Министрства здравохранения Российской Федерации

Научный руководитель:

Доктор медицинских наук, профессор Макаров Олег Васильевич

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор Баринов Владимир Васильевич Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Российский онкологический научный центр им.Н.Н.Блохина», отделение гинекологии, ведущий научный сотрудник

Доктор медицинских наук, профессор Высоцкий Максим Маркович ГБОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет имени А.И. Евдокимова», кафедра эндоскопической хирургии ФПДО МГМСУ, профессор

Ведущая организация:

Государственное бюджетное учреждение здравохранения Московской области "Московский областной научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии" Министрества здравоохранения Московской области

Защита диссертации состоится "_"_2015 года в_часов на

заседании Диссертационного Совета Д.208.072.12. на базе ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России по адресу: г.Москва, ул.Островитянова, Д.1

С диссертацией можно ознакомится в Научной библиотеке и на сайте ГБОУ ВПО РНИМУ им. H.H. Пирогова Минздрава России по адресу : 117997, г. Москва, ул. Островитянова , д. 1. ; http://rsmu.ru

Автореферат разослан "_"_2015г.

Ученый секретарь Диссертационного совета

Доктор медицинских наук, профессор Хашукоева Асият Зульчифовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. В конце XX века злокачественные опухоли женской репродуктивной системы во всем мире стали одним из главных факторов отрицательных демографических тенденций. Наиболее фатальной из них является рак яичников. В структуре умерших от злокачественных новообразований рак яичников занимает 6-е место. Ежегодно в мире регистрируется 165 тысяч новых случаев злокачественных новообразований яичников и 101 тысяча случаев смертей от него. В России в 2000 году от рака яичника умерло 7,3 тысячи больных (5,5% от всех злокачественных новообразований у женщин). Пик смертности (6,7%) пришелся на возраст 40-59 лет [Аксель Е.М., 2012].

Пятилетняя выживаемость больных варьирует в зависимости от стадии заболевания: около 70% при I стадии, 45% при II стадии, 17% при III стадии, около 5% при IV стадии. При этом практически у 70-80% больных рак яичников впервые диагностируются в III-IV стадиях. В среднем пятилетняя выживаемость больных составляет 35-40% [Прокопенко П.Г. и соавт., 2011; Аксель Е.М., 2012; Jemal A. et al, 2011]. Основными причинами столь неутешительных статистических тенденций является бессимптомное течение рака яичников на ранних стадиях и, как следствие, крайне низкий уровень его ранней диагностики, малоэффективное лечение, особенно при рецидивах заболевания [ Макаров О.В., 1998; Жорданиа К.И., 2012; Лихтенштейн А.И. с соавт., 2013] .

Стратегия повышения эффективности ранней диагностики рака яичников предполагает проведение скрининга женского населения - массового и селективного (обследование групп риска). Для осуществления таких мероприятий требуются простые, надежные и дешевые скрининговые методы, которые, к сожалению, пока отсутствуют [Акуленко Л.В., 2005; Имянитов E.H., 2011; Шелепова В.М. и соавт., 2012, Высоцкий М.М.,2012; Kurman RT, 2010].

Большие надежды в 90-х годах прошлого века возлагались на маркер

рака яичников CA 125. Однако, как оказалось, чувствительность этого биомаркера составляет не более 65%. Известно большое количество и других сывороточных маркеров рака яичников, однако, ни один из них сам по себе не обладает высокой точностью, что, по-видимому, связано с гетерогенной этиологией рака яичников и сложным составом сыворотки крови [Высоцкий М.М., 2011; Касьяненко С.Н. 2012; Moore R.G. et al, 2009, Баринов B.B. и с соавторами, 2009J.

Интенсивное развитие протеомных технологий в начале XXI века открыло новые перспективы для поиска биомаркеров заболеваний. Одной из наиболее перспективных технологий, используемых в этих целях, является масс-спектрометрия белковых чипов SELDI-TOF-MS - экспрессный и высокоселективный метод для анализа белков и пептидов, который обладает высокой воспроизводимостью результатов. В настоящее время масс-спектрометрия находит все более широкое применение в медицине. Благодаря этому методу возникло новое направление - клиническая протеомика, которая занимается инвентаризацией белков человека, кодируемых его генами, дополняя, таким образом, геномные исследования. В настоящее время основной идеологией поиска новых малоинвазивных способов диагностики онкологических заболеваний, в том числе и рака яичников, является разработка диагностических систем на основе протеомного профилирования сыворотки крови для идентификации опухолевых маркеров [Toropygin I., Serebryakova M.V. et al, 2007].

Особый интерес вызывает сывороточный амилоид А острой фазы (А-SAA). Несмотря на то, что этот белок давно известен как маркер воспаления, он обладает рядом уникальных свойств. Известно его концентрация в сыворотке крови в норме в 10-100 раз ниже, чем концентрация других опухолевых маркеров. Также при воспалении его концентрация увеличивается в 100 раз и более, тогда как концентрация большинства других маркеров меняется сравнительно слабо. A-SAA синтезируется в тканях некоторых злокачественных опухолей [Gutfeld et al, 2006; Kovacevic et al, 2006]. Кроме

того, была показана способность амилоида А индуцировать экспрессию транскрипционного фактора NFkB [Не et al, 2006], играющего ведущую роль в блокировании апоптоза и матриксных металлопротеиназ ММР1, ММРЗ и ММР9, вызывающих деградацию межклеточного матрикса и тем самым, способствующих ангиогенезу и метастазированию [ Белушкина Н.Н. 2008 Lee et al, 2005].

Вышеизложенные научные факты побудили нас инициировать клинико-экспериментальное исследование, направленное на поиск новых маркеров рака яичников с использованием, как традиционных (ИФА), так и новейших протеомных (масс-спектрометрия SELDI-TOF) технологий.

Цель исследования Изучить возможности повышения эффективности дифференциальной диагностики опухолей гениталий и своевременной диагностики рака яичников на основе использования комбинации сывороточных белков A-SAA и СА125.

Задачи исследования

1. Проанализировать и сформировать исследуемую выборку пациенток, отвечающую требованиям разработки адекватного диагностического метода и банк образцов их сывороток крови.

2. Методом иммуноферментного анализа определить концентрации CAI25 и A-SAA в сыворотке крови пациенток исследуемой выборки.

3. Провести масс-спектрометрическое профилирование (SELDI-TOF) сывороток крови пациенток исследуемой выборки в условиях, оптимизированных для измерения уровня A-SAA.

4. Определить чувствительность масс-спектрометрической детекции A-SAA в сыворотке крови пациенток исследуемой выборки.

5. На основе многофакторного анализа оценить возможность использования в качестве сывороточного маркера рака яичников A-SAA, определяемого методом масс-спектрометрии отдельно и в комбинации со значениями концентраций A-SAA и СА125, измеряемых методом иммуноферментного анализа.

Научная новизна

Впервые показана применимость масс-спектрометрического метода для распознавания сывороток крови больных раком яичников, доброкачественными опухолями яичников, миомой матки и здоровых женщин.

Определена чувствительность масс-спектрометрии 5ЕЬ01-Т0Г-' для определения белка А-БАА в составе сыворотки крови.

На основе многофакторного анализа комбинации данных масс-спектрометрической детекции А-ЯАА и значений концентраций А-БАА и СА125, измеренных методом иммуноферментного анализа, впервые разработана экспериментальная система диагностики рака яичника, точность которой составляет 95,2%.

Практическая значимость исследования Разработанная нами система протеомной диагностики опухолей яичника является научно-обоснованной основой для создания и внедрения в практику аппаратно-программного комплекса, который целесообразно использовать для скрининга и ранней диагностики рака яичников. Рассчитанные пороговые значения диагностически значимых маркеров способствуют повышению точности дифференциальной диагностики овариальных образований.

Положения , выносимые на защиту

1. Точность распознавания сывороток крови больных раком яичников, доброкачественными опухолями яичников, миомой матки и здоровых женщин методом масс-спектрометрии 8ЕЬБ1-ТОР составляет 89,5%.

2. Сывороточный А-5АА, определяемый методом масс-спектрометрии БЕЬОЬ ТОЕ, является маркером рака яичника при критическом значении его концентрации 0,3 г/л (2,6x10-5 М), обладая чувствительностью 50% и специфичностью 96,4%.

3. Добавление к данным масс-спектрометрической детекции A-SAA данных о концентрациях A-SAA и СА125, измеряемых методом иммуноферментного анализа, повышает точность диагностики рака яичников до 95,2%.

Виедерение результатов исследования Результаты исследования внедрены в практику работы гинекологических отделений ГБУЗ города Москвы «Городская поликлиника № 67 Департамента здравоохранения Москвы» и филиала №3 ФГБУ "3 Центральный военный клинический госпиталь имени А.А.Вишневского"

Результаты исследования используются для обучения студентов, врачей-интернов, ординаторов, аспирантов на кафедре акушерства и гинекологии лечебного факультета ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России.

Апробация диссертации

Основные положения работы представлены на 4-м Ежегодном Всемирном Конгрессе международной организации «Протеом человека» (HUPO 4-th Annual World Congress) [Мюнхен, Германия, 2005 ]; IV конференции с международным участием общества специалистов онкологов по опухолям репродуктивной системы «Актуальные вопросы женского здоровья» ( Москва, 2014), XVIII Российском онкологическом конгрессе ( Москва, 2014).

Апробация диссертации состоялась на совместной научно-практической конференции коллектива сотрудников кафедры акушерства и гинекологии лечебного факультета ГБОУ ВПО РНИМУ имени Н.И. Пирогова и врачей гинекологического отделения Городской клинической больницы № 1 имени Н.И. Пирогова, Городской клинической больницы № 4 12 ноября 2014г, протокол № 3.

Публикации

По теме диссертации опублтковано 9 печатных работ, из них 6 - в изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ.

Личное участие автора

Автором самостоятельно сформирована исследуемая выборка пациенток и банк образцов сывороток крови. Автор принимала участие в проведении

статистической обработки материала исследования, обсуждении результатов, подготовке и оформлении публикаций. Оформление диссертации и автореферата выполнены автором самостоятельно.

Объём и структура диссертации

Диссертация изложена на 112 страницах печатного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка использованной литературы и приложений. Иллюстративный материал включает 14 таблиц, 9 рисунков и диаграмм. Список использованной литературы содержит 115 источников; из них 22 отечественных и 93 зарубежных.

Материалы и методы исследования

Исследование выполнено на кафедре акушерства и гинекологии № 1 лечебного факультета ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова (клиническая база ГКБ № 55 и ФГБНУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина ) совместно с лабораторией диагностической протеомики ФГБНУ «Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича» .

При поступлении в стационар все пациентки были обследованы по стандартному плану, включаещему сбор анамнеза с учетом паспортных данных, национальности, постоянного места жительства, профессиональных и бытовых вредностей, вредных привычек, особенностей питания, семейного анамнеза, репродуктивного анамнеза, перенесенных заболеваний. При изучении анемнестических данных учитывали детальный анализ перенесенных и сопутствующих экстрагенитальных и гинекологических заболеваний. Тщательному анализу подвергнут характер менструального цикла с учетом таких показателей, как возраст менархе, особенности становления менструальной функции, длительности и объема кровопотери. Репродуктивная функция оценивалась по возрасту начало половой жизни, количеству беременностей, их течению и исходу. Далее проводилось физикальное исследование органов малого таза и молочных желез. Лабораторные

исследования включали в себя общий и биохимический анализ крови, общий анализ мочи, определение уровня СА125 иммуноферментным анализом. Среди иструментальных методов исследования использовались УЗ-томография органов малого таза и брюшной полости, маммография, рентгенография органов грудной клетки. Эндоскопическое исследование органов желудочно-кишечного тракта, включая ирригоскопию и эзофагогастроскопию проводилось у всех пациенток с новообразованиями яичников для исключения патологии желудочно-кишечного тракта (при невозможности применяли рентгенологические методы исследования желудка и двенадцатиперстной кишки). Далее обследование пациенток расширялось в пределах, необходимых для постановки диагноза. Компьютерная томография и магнитно-резонансная томография выполнялись у пациенток с распространенным опухолевым процессом для верификации метастазирования.

Как известно, выборки, используемые для разработки адекватного метода протеомной диагностики рака, должны соответствовать строгим требованиям [Wulfkuhle J.D. et all, 2003]:

• Должны отсутствовать статистически значимые отличия между сравниваемыми группами, кроме признака «наличие» или «отсутствие рака» конкретной локализации.

• Вся исследуемая выборка, включающая группы сравнения, должна быть этнически гомогенной.

• Сравниваемые группы должны включать в себя не только здоровых лиц, но и лиц, страдающих доброкачественными опухолями и неонкологическими заболеваниями.

• Не должно быть различий в возрасте пациентов в сравниваемых группах, иначе найденные отличия могут быть следствием не болезни, а возрастных изменений.

• Не должно быть различий в методиках получения и хранения образцов сывороток крови между сравниваемыми группами.

После верификации диагноза и с учетом указанных требований нами бы-

ла сформирована исследуемая выборка из 91 пациентки, подразделенная на 4 сравниваемые группы (I-IV группы). В I группу вошли 34 пациентки больные раком яичников. Среди них у 7 пациенток верифицированы ранние стадии заболевания (Ia-Нв), а у 27 пациентки - диссеменированный процесс рака яичников (Ив-IV). Во II группу вошли 14 пациенток с доброкачественными опухолями яичников. III группа представлена 17 пациентками с миомой матки и 26 практически здоровых женщин составили 4 группу (таблица № 1).

Все пациентки исследуемой выборки являлись русскими по национальности, их средний возраст находился в пределах 41-47.

Материалом исследования явились клинико-морфологические данные пациенток исследуемой выборки и сыворотки их крови. Взятие венозной крови у всех пациенток производилось натощак до начала любого вида лечения. Образцы инкубировались при комнатной температуре (18-20 С) в течение 30-40 минут до полного образования сгустка. После ретракции сгустка пробы центрифугировали в течение 10-15 минут, затем сыворотку сливали во вторичные пробирки и маркировали. Полученные пробы замораживали и хранили при температуре -70 С, вплоть до верификации диагноза.

Для определения концентрации A-SAA и CA 125 использовали спектрофотометр Labsystems Multiscan PLUS, Финляндия. Для определения концентрации СА125 использовали набор для иммуноферментного анализа СА125 EIA (CanAg, Канада), для определения концентрации A-SAA - набор для иммуноферментного анализа Human SAA (Biosource, США). Анализ проводили в соответствии с протоколами производителя.

Профилирование сывороток крови проводили на масс-спектрометре SELDI-TOF Protein Biology System II (PBS II) (Ciphergen, США). Для оптимизации условий профилирования были использованы различные типы белковых чипов. Анализ пиков масс-спектров проводили в пределах 5500 - 17500 Да с использованием программы Biomarker Wizard™.

Таблица № 1. Количественный состав исследуемой выборки пациенток

с учетом диагноза и возраста.

Группы Клинический диагноз Гистологический диагноз Количество пациенток Средний возраст (минимальный - максимальный)

Рак яичников 1а-Нв стадии Серозная цистаденокарци-нома 5

Муцинозная цистадено-карцинома 2 47

I Рак яичников Нв-1У стадии Серозная цистаденокарци-нома 22 (26-70)

Муцинозная цистадено-карцинома 5

Всего 34

Серозная цистаденома 9

Доброкачественная опухоль яичника 44

II Муцинозная цистаденома 2

Зрелая тератома 3 (19-73)

Всего 14

III Миома матки Лейомиома 17 44 (22-56)

IV Здоровые 26 41 (21-59)

Статистическую обработку материала проводили с помощью R языка, находящегося в открытом доступе [www.r-project.org].

Для создания диагностического алгоритма были применены два метода классификации: метод опорных векторов (SVM) и метод логистической регрессии (LR) [White C.N. et all, 2005].

Для проверки чувствительности и специфичности разработанных диагностических моделей использовали 10-кратную перекрестную проверку достоверности с использованием метода пар с наибольшим счетом (TSP). Для анализа взаимосвязи между интенсивностью масс-спектрометричекого сигнала и

концентрации амилоида А в сыворотке, измеренной методом иммунофермент-ного анализа, использовали ранговый коэффициент корреляции Спирмана.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Значения концентраций А-8АА и СА125 в сыворотках крови пациенток исследуемой выборки, измеренные методом иммуноферментного анализа (ИФА), представлены в таблице № 2 и на рисунках 1, 2.

Рисунок 1. Концентрации А-БАА в исследованных сыворотках крови. Буквами по горизонтальной оси обозначены группы пациенток (субъектов): С - здоровые женщины, и - миома матки, В - доброкачественная опухоль яичника, О -рак яичника.

с с с с с с с с с с с с с ииииииии в в в в в вео о о о о о о о о о о о о о о о о

Гпиппы Ли^КОЬ'ТПС

Нами установлено что, у большинства больных раком яичников наблюдались значительно повышенные уровни А-БАА в сыворотке крови, вплоть до 3-4 г/л (в норме концентрация А-8АА составляет 0,01-0,03 г/л ), не связанные ни со стадией опухолевого процесса, ни с гистологическим типом опухоли. Из 7-

ми пациенток, страдавших раком яичников ранних стадий, у 4-х уровень А-5АА был чрезвычайно высоким (рис.1). Пунктирной линией показано примерное критическое значение А-ЭАА, идентифицирующее сыворотки крови больных раком яичников. Конкретные значения концентраций выше 1 г/л не показаны. Столбики, соответствующие ранней стадии рака яичников, выделены черным цветом.

Рисунок 2. Средние значения концентрации А-БАА в сыворотках крови пациенток исследуемой выборки в сравнении

РЯ1-Па РЯII в-IV ЦА яичника Миома матки Здоровые ■A-SAA у пациенток A-SAA в норме

Следует отметить, что у некоторых пациенток, не страдавших раком яичников, концентрация A-SAA в сыворотке крови также была существенно выше по сравнению с принятой в литературе нормой, достигая значения 0,180 мг/мл. Так, у 2-х из 14 пациенток с доброкачественными опухолями яичника уровень A-SAA в сыворотке крови достигал 3-4 г/л. Обе пациентки страдали серозной цистаденомой яичника.

Таблица № 2 .Уровни концентраций A-SAA и CA 125 в сыворотках крови

пациенток исследуемой выборки, измеренные методом ИФА

A-SAA (г/л) CA 125 (МЕ/мл)

Группы Количество Среднее ± среднее Среднее ± среднее

обследованных пациенток квадратичное отклоне- квадратичное отклоне-

ние/ Медиана ние / Медиана

(Min- Мах) (Min- Мах)

Норма =0,01-0,03 Норма = 0-30

Больные раком яич- 7 0,748 ± 0,688 230 ±251

ника 1а-Пв стадии 0,708 139

(0,01-1,760) (33-826)

Больные раком яич- 27 1,080 ± 1,489 780 ± 1021

ников Пв-1У стадии 0,247 466

(0,005-4,465) (2-4177)

Всего больных ра- 34 0,981 ± 1,376 667 ±957

ком яичников 0,333 257

(0,005-4,465) [2-4177]

Больные с доброка- 14 0,565 ± 1,393 33 ±30

чественными опухо- 0,031 21

лями яичника (0,002-4,767) (2-106)

Больные миомой 17 0,013 ±0,008 56 ±35

матки 0,011 45

(0,004-0,038) (14-140)

Здоровые 26 0,044 ± 0,053 15 ± 7

женщины 0,026 14

(0,003-0,184) (5-41)

Всего без рака 56 0,163 ±0,717 32 ±30

яичников 0,017 20

(0,002-4,767) (2-140)

Полученные результаты показали, что А-8АА, как маркер рака яичника, обладает чувствительностью 50% (из 34 в 17 (50%) определенных случаях) и специфичностью 96,4% (из 56 в 54 (96,4%) определенных случаях) при критическом значении его концентрации 0,3 г/л (2,6х 10° М).

Что же касается концентраций СА125, то у больных раком яичников она была значительно выше референсных значений (0-30 МЕ/мл), а у больных ци-стаденомой яичников и здоровых женщин не превышала нормативных показателей. У больных миомой матки значения концентраций СА125 незначительно превышали референсные значения. В то же время, концентрация А-БАА во всех исследованных случаях миомы была очень низкая (таблица № 2, рис. 3).

Рисунок 3. Средние значения концентраций СА125 в сыворотках крови пациенток исследуемой выборки в сравнении со значениями верхней границы нормы.

МЕ/мл 500

РЯ1-Н а РЯ Пв-1У ЦА яичника Миома матки Здоровые

■ СА125 у пациенток СА125 в норме

Для наилучшего определения пика, соответствующего А-БАА, был проведен подбор условий профилирования с использованием сывороток крови с известными концентрациями А-8АА (таблица № 2). С этой целью были апробированы различные типы чипов (анионообменный, катионообменный, обра-щеннофазовый, нормальнофазовый). Наилучших результатов удалось добиться при применении нормальнофазовых чипов ЫР20 и предельно простой и быстрой процедуры профилирования, поэтому было проведено профилирование всех сывороток крови именно на ЫР20 чипах с помощью протокола снятия спектров, сфокусированное на массах 11,52-11,68 кДа. Примеры масс-спектров, полученные с использованием нормальнофазовых чипов ЫР20, приведены на рисунке 4.

Рисунок 4. Примеры масс-спектров сывороток, полученных с использованием нормальнофазовых чипов 1МР20

5000 10000 15000 20000

Все пики в спектрах определяли автоматически с помощью программы Ciphergen Protein с базовыми настройками. При этом пик массой 11,68 кДа был определен во всех сыворотках с концентрацией A-SAA 0,333 г/л и более (по данным иммуноферментного анализа). Другими словами, все 19 сывороток с концентрацией A-SAA выше 0,3 г/л (измеренные иммунофертментным методом) имели хорошо выраженный пик в интересующем нас интервале значений m/z (рисунок 5). Среди исследованных образцов сывороток крови не было таковых с концентрацией A-SAA в пределах от 0,333 до 0,184 г/л. Это обстоятельство позволяет утверждать, что чувствительность масс-

спектрометрического определения А-5АА в сыворотке крови лежит в пределах концентраций 0,2-0,3 г/л (1,7-2,6x10° М), что показано пунктирной линией на рисунке 1.

Рисунок 5. Чувствительность определения А-8АА в сыворотке крови с помощью масс-спектрометрии 8ЕЬО!-ТОР. Для каждого спектра показаны значения концентрации А-вАА, измеренные методом иммуноферментного анализа. Стрелками показаны пики А-БАА на спектрах.

Нами установлена тенденция к увеличению интенсивности масс-спектрометрического сигнала, соответствующего сывороточному амилоиду Ala, с увеличением концентрации последнего, однако это увеличение не является монотонным.(рис 6).

Рисунок 6. Значения концентрации сывороточного амилоида А (г/л) и значения интенсивностей пика с m/z 1681, соответствующего основной форме сывороточного амилоида - SAAla.

Коэффициент корреляции Спирмана между концентрацией A-SAA в сыворотке и интенсивностью масс-спектрометрического сигнала составил 0,55, что соответствует умеренной корреляции. Невысокое значение коэффициента корреляции обусловлено тем, что в 72 из 91 пробы сывороточный A-SAA содержался в концентрации ниже 0,180 г/л, что является ниже предела чувствительности определения A-SAA в сыворотке крови. При концентрациях A-SAA выше 1 г/л наступает насыщение и величина масс-спектрометрического сигнала не увеличивается. Кроме того, следует учитывать, что во многих сыворотках крови присутствует несколько пиков разных форм A-SAA, но иммунофермент-ный анализ позволяет измерить только его суммарное содержание.

Полученные результаты свидетельствуют, что масс-спектрометрическая детекция A-SAA не является количественной, однако она позволяет определять

А-8АА в сыворотке крови при его концентрациях 0,3 г/л и выше. Критический уровень 0,2-0,3 г/л соответствует 1,7-2,6*10"5 М.

Следует отметить, что критический уровень А-8АА, определяемый с помощью масс-спектрометрии БЕЬОЬТОР, очень близок к критическому уровню этого белка для ряда воспалительных заболеваний и поэтому дает возможность использовать прямое масс-спектрометрическое профилирование для быстрого определения повышенного уровня А-8АА в сыворотке.

Масс-спектрометрическое определение масс методом 8ЕЬВ1-ТОЕ-М8 обладает невысокой точностью. Тем не менее, поскольку спектры были отка-либрованы с использованием в качестве внешних стандартов белков, близких по массе к А-БАА, погрешность в определении массы А-БАА не превышала 3-5 Да, что позволяет различить различные формы А-БАА в сыворотках с содержанием А-БАА более 0,3 г/л.

С целью определения оптимального набора протеомных данных, которые могли бы использоваться для диагностики рака яичников, нами был предпринят многофакторный анализ методами опорных векторов (8УМ) и логистической регрессии (ЬЯ). В качестве исходных данных были апробированы различные варианты комбинаций протеомных данных:

1. Концентрации Са125, измеренные методом - ИФА - БУМ (СА125).

2. Концентрации СА125 и А-БАА, измеренные методом ИФА - 8УМ (ИФА).

3. Значения интенсивностей 48 8ЕЬ01-М8 т/г пиков, определенные методом масс-спектрометрии - 8УМ И^Е (МБ).

4. Концентрации СА125 и А-БАА, измеренные методом ИФА и данные масс-спектрометрии - БУМ (Т8Р(М8)+ИФА).

5. Концентрации СА125 и А-8АА, измеренные методом ИФА и формализованные данные масс-спектрометрии (две переменные, отобранные методом пар с наибольшим счетом) - 8УМ ЯРЕ (ИФА+М8). Эффективность диагностических алгоритмов, полученных на основе указанных комбинаций с помощью классификаторов 8УМ и ЬЯ, проверяли путем

перекрестной проверки на достоверность. Доверительный интервал вычисляли для доверительной вероятности, равной 0,05.

Результаты многофакторного анализа представлены в таблице № 3. Значения точности, чувствительности и специфичности полученных диагностических алгоритмов свидетельствуют, что добавление значений концентраций А-8АА к значениям концентраций СА125 не приводит к повышению точности классификации, несмотря на то, что у некоторых больных раком яичников уровень А-БАА был существенно повышен на фоне нормального уровня СА125.

Таблица 3. Результаты применения метода опорных векторов (ЯУМ) и логистической регрессии (ЪЯ ) для классификации сывороток крови

пациенток исследуемой выборки .

Методы многофакторного анализа Точность (В %) Специфичность (в %) Чувствительность (в %)

БУМ (СА125) 86,2+0,7 98,8+0,3 64,7+1,7

БУМ (ИФА) 86,4±0,7 96,5±0,5 70,3+1,8

8УМ ЯРЕ (Мв) 89,5+0,7 93,3±0,7 83,6±1,6

5УМ (Т5Р(М5)+ИФА) 86,7+0,7 92,8±0,8 77,5±1,6

БУМ ЛБЕ (ИФА+МБ) 95,2+0,4 98,1 ±0,4 90,8+1,1

ЬЯ (СА125) 85,1+0,7 95,6±0,5 67,5+1,7

ЬЯ (ИФА) 86,6+0,7 94,3±0,6 74,2+1,7

ЬЯ (МБ) 86,0±0,7 87,5±1,3 83,7+1,5

ЕЯ А1С (Т8Р(М8)+ИФА) 90,7±0,6 96,9± 0,5 81,2±1,4

ЕЯ АТС (ИФА+М8) 91,9±0,6 92,7±0,7 90,7±1,1

Многофакторный анализ данных масс-спектрометрии методом опорных векторов дал лучшие результаты, чем метод логистической регрессии: точность

метода опорных векторов (БУМ) для данных масе-епектрометрии оказалась значительно выше, чем при использовании только концентрации СА125 (89,5% против 86,1%, соответственно).

ЬЯ-классификатор, напротив, дал существенно лучшие результаты, чем БУМ при обработке бинарных данных методом пар с наибольшим счетом (Т8Р) в комбинации с данными ИФА, причем данные ТБР существенно повысили точность классификации (90,7% по сравнению с 85-86% только для СА125).

Наилучшей точности распознавания рака яичников и его отсутствия, составившей 95,2%, удалось достичь при использовании метода опорных векторов для анализа комбинированных данных ИФА и масс-спектрометрии.

Для методов классификации, построенных с использованием метода опорных векторов на основе только масс-спектрометрических данных и на основе комбинации масс-спектрометрических данных с данными ИФА, был проведен подробный анализ результатов перекрестной проверки достоверности.

В таблице № 4 приведен усредненный процент ошибочных диагнозов для каждой исследованной группы. Как можно видеть, наибольшим этот процент оказался в группе сывороток больных доброкачественными опухолями яичника. Следует отметить, что согласно полученным нами данным, рак яичников на ранних стадиях диагностируется не хуже, чем рак на более поздних стадиях. Из семи исследованных сывороток больных раком на ранней стадии 4 были правильно диагностированы все 100 раз.

Таблица 4. Усредненные значения ошибочных распознаваний каждой группы исследуемых образцов

Группа образцов Средние значения ошибочных распознаваний (в %)

5УМ (М5) БУМ (ИФА+М5)

Рак яичника (ранняя стадия) 2,1 1,7

Рак яичника (поздняя стадия) 14,5 7

Доброкачественные опухоли яичника 17,4 6,6

Миома матки 2,2 0,5

Здоровые 5 1,2

Всего 10,2 4,2

Что же касается сывороток крови больных миомой матки, то все они были распознаны правильно, так что средний процент ошибок в группе больных миомой матки оказался ниже такового для группы здоровых женщин.

Результаты проведенного исследования показали, что используя масс-спектрометрическую технологию ЯЕиЛ-ТОК можно с достаточно высокой эффективностью распознавать сыворотки крови больных раком яичников, здоровых женщин и больных доброкачественными опухолями яичников и миомой матки.

Основой разработанной экспериментальной диагностической системы являются масс-спектрометрические данные, использование которых в отдельности позволило получить точность диагностики около 90%. Добавление к масс-спектрометрическим данным значений концентраций А-БАА и СА125, измеренных иммуноферментным методом, привело к повышению точности диагностики до 95,2%. Наилучшие результаты были достигнуты при применении метода опорных векторов.

Преимуществом предложенного нами метода профилирования является его простота. Отсутствие стадий префракционирования сыворотки приводит к повышению воспроизводимости результатов и увеличивает шансы на внедрение методики в практическую диагностику. Полученные рзультаты могут служить предпосылками для разработки специального аппаратно-программного комплекса.

ВЫВОДЫ

1. Сформированная выборка пациенток позволила доказать применимость метода масс-спектрометрии ЗЕЬБЬТОР для идентификации сывороток крови больных раком яичников, доброкачественными опухолями яичников, миомой матки и здоровых женщин с точностью 89,5%.

2. А-БАА определяется методом масс-спектрометрии БНЬОЬТОН в сыворотке крови при критическом значении его концентрации 0,3 г/л и выше, измеряемой методом иммуноферментного анализа, что соответствует 1,72,6*10-5 М.

3. Как самостоятельный маркер рака яичников А-БАА, определяемый методом масс-спектрометрии БЕЬОЬТОР, обладает чувствительностью 50% и специфичностью 96,4%.

4. Добавление к данным масс-спектрометрической детекции А-БАА значений концентраций А-БАА и СА125, измеряемых методом иммуноферментного анализа, позволяет повысить точность диагностики рака яичников до 95%.

5. На основе многофакторного анализа комбинированных данных масс-спектрометрической детекции А-БАА и иммуноферментного анализа концентраций А-БАА и СА125 в сыворотке крови разработана новая экспериментальная система протеомной диагностики рака яичников.

6. Полученные результаты являются научно обоснованной предпосылкой для разработки специального аппаратно-программного комплекса для осуществления, как протеомного скрининга, так и своевременной диагностики рака яичников.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Для внедрения в практику разработанного нами экспериментального алгоритма протеомной диагностики рака яичников необходимо создание специального аппаратно-программного комплекса для одновременного

определения концентрации A-SAA и CA 125 методом иммуноферментного анализа и определения A-SAA методом масс-спектрометрии в сыворотке крови и многофакторной статистической обработки полученных результатов.

Список опубликованных работ по теме диссертации:

1. М. Safarova "Serum amyloid A as ovarian cancer biomarker'7 S. Moshkovskii, O. Makarov, M. Safarova et all// Abstr. HUPO 4th Annual World Congress, (August 28-September 1, 2005, Munich). - Molecular & Cellular Proteomics. - August

2005,- Vol. 4, Number 8 (Suppl. 1);

2. M.P. Сафарова, "Молекулярная диагностика рака яичника с использованием протеомных технологий"/ С.А. Мошковский, М.Р. Сафарова , О.В. Макаров и др.// Биомедицинская химия. - 2005. - т. 51 № 4. - с. 367-383;

3. М.Р.Сафарова Протеомное исследование термостабильной фракции сыворотки пациентов с различными опухолями с применением двумерного электрофореза./ С.А. Мошковский, М.Р.Сафарова, О.В.Макаров и др.// Биохимия. -

2006. - т. 71 №4. - с. 354-360;

4. Safarova M.R. Acute phase serum amyloid A in ovarian cancer as an important component of proteome diagnostic profiling./ Moshkovskii S.A., Safarova M.R., Makarov O.V.et all // Proteomics. Clinical Applications. - 2007. - Vol. 1 (1). - p. 107-117.

5. Нариманова M.P. Перспектива определения сывороточного амилоида Al в качестве маркера для ранней диагностики рака яичников/ Нариманова М.Р.., Макаров О.В.// Материалы IV конференции общества специалистов онкологов по опухолям органов репродуктивной системы.-М.2014.-С.9.

6. Нариманова М.Р. Возможности использования сывороточных белков А-SAA и CA 125 для своевременной диагностики рака яичников /Макаров О.В., Нариманова М.Р.// Материалы XIII Российского онкологического конгресса .-М.-2014,- С.

7. Нариманова М.Р. Рак яичников: новое в вопросах этиопатогенеза и

диагностики. /Нариманова М.Р., Макаров О.В. //Вестник Российского Государственного Медицинского Ун11верситета.-2014-№4.-С.53-58

8. Нариманова М.Р. Современное состояние проблемы ранней диагностики рака яичников и пути ее решения./ Макаров О.В., Нариманова М.Р// Опухоли женской репродуктивной системы. Мамология/Онкогинекология. - 2015.-№1.-С 15-19.

9. Нариманова М.Р. Перспектива нового способа своевременной диагостики рака яичников на основе использования комбинации сывороточных белков CA 125 и SAA-AI./Макаров О.В.,Нариманова М.Р.,Мошковский С.А. и др.// Акушерство и гннекология.-2015.-№3.-С.48-57

Подписано в печать 11.03.2015 г. Формат А5 Бумага офсетная. Печать цифровая. Тираж 40 Экз. Заказ №3234-3-15 Типография ООО "Ай-клуб" (Печатный салон МДМ) 119146, г. Москва, Комсомольский пр-кт, д.28 Тел. 8-495-782-88-39