Автореферат и диссертация по медицине (14.00.05) на тему:Значение определения альфа-1-антихимотрипсина в диагностике злокачественных опухолей легких

КАУНАССКАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ

На правах рукописи

ТВАРИЙОНАВЙЧЮС Далас Пятрович

ЗНАЧЕНИЕ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АЛЬФА-1 -АНТИХИМОТРИПСИНА В ДИАГНОСТИКЕ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ ОПУХОЛЕЙ ЛЕГКИХ

14.00.05 — внутренние болезни 03.00.04 — биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

КАУНАС — 1992

Работа выполнена в лаборатории Клинической химии ЦНИЛ Каунасской медицинской академии и Каунасской клинике.

Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор П. ШНИПАС,

доктор биологических наук, профессор, академик АН Литвы А. ПРАШКЯВИЧЮС.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор М. КРИКШТОПАЙТИС,

кандидат биологических наук М. МАУРИЦАС.

Ведущая организация: Онкологический научный центр России.

Защита состоится «¿V,» ..... ЬМГРМЛ..... 1992 г.

в ........часов на заседании специализированного совета

Д 061.04.01 в Каунасской медицинской академии (3007 Каунас, ул. Эйвеню, 4).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке академии по адресу: 3000 Каунас, ул. Мицкявичяус, 9.

Автореферат разослан «. 2.7» ... , .... 1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета Д 061.0401, кандидат медицинских наук, доцент

А. КОНДРОТАС

"?гг тт-',

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ "£1£В,и^Дктуальность темы. Проблема дифференциальной диагностики рака легкого остается весьма актуальной в современной клинике. Име-кяциеся в настоящее время D арсенале врачей-клипицистоп рентгенологические и инструментальные мэтсди обгледооання больного не позволяют своевременно выявить рак легкого, более того, примерно в 10-20% случаев исчерпьшакецее обследование больного оказывается недостаточным, и для постановки точного диагноза приходится прибегать к диагностической торакотомии (Трахтенберг, 1987). Актуальной остается также проблема ранней диагностики рака. Метод цитологи-' ческого определения атипичных клеток в бронхиальных выделеьиях обладает низкой диагностической чувствительностью (около 40*) и не может считаться удовлетворительным для ранней диагностики и скрининга рака легкого (Hulka, 1988).

В последнее время рядом исследовательских групп аредприни-мались попытки нспольоовать специфические белки - онкологические маркеры г целях ранней и дифференциальной диагностики разных видов рака, в том числе и рака легкого (Bates, 1988). . Иссги£ования в данной области считаются перспективными, не еще не получил» широкого распространения в клинической практике. И хотя к настоящему времени не найдено абсолютно специфических маркеров отдельных типов рака, определение некоторых из них (например, pane&e-&&3pvo~ иального антигена для злокачественных новообразований ЖвАуДвЧпо-кишечного тракта; канцер-ассоциированного автигейй 12& для рака яичников) уже с успехом и flocTfltonfftf гаироко rtptfMeЙЙЬТся в клинической .практике во многих странах (Sfrwaf-tSi, Idfitit. К сожалению, определение в сыворотке крови большинства о"?7?ельно аэятнх известных в настоящее время биохимических маркеров опухолей имеет ограниченную диагностическую ценность при раке легкого (Labarge,

4

1988). Естественными по этому являются попытки использовать для

втого другие, менее подробно исследованные и, возможно, 'менее селективные белки. В качестве перспективного неселективного маркера ряда опухолевых заболевании .был предложен сывороточный ингибитор протеаз альфа-1-аитихимотрипсин (АХИ) (Kelly,1979). Однако практическое применение определения этого белка было ограниченным ио-за отсутствия подходящей тест-системы для его определения. К моменту завершения данной работы опубликованы данные ряда исследований о диагностической эффективности АХИ при раке желудка и печени (Matsuzaki, 1983, Oyarr.u, 1984, Chawla, 1984, Bernacka, 1988, Wu, 1EGC, Tahara, 19-30). Схожие данные по раку легкого полностью отсутствуют. Кроме того, интерес представляют такае диагностические возможности сочетания антихимотрипсина и других известных мар5«рй>ы, -а такие сочетание определения маркерных белков с другими параклиническими диагностическими процедурами. Необходимыми являются такае студий по корреляции уровня маркеров с результатами других общепринятых методов диагностики рака легкого и стандартных лабораторных тестов. На всех этих направлениях и было построено данное исследование.

Цель работы - исследовать возможности определения белка ел»фа-1-антнхимотрипсина в качестве маркера бронхогенного рака и определить эффективность данного анализа в целях ранней и дифференциальной диагностики этого оаболевания.

Задачи:

1. Разработать тиэт-систему для количественного определения альфа.-1~аити;шмотрлпеина человека, подходящую для определения концентраций втого белка в разных биологических жидкостях;

2. Неяолг.яук оту. систему, исследовать уровень альфа-1-анти-химзтрмпсина б лаважной жидкости бронхов и сыворотке крови больных раком легкого, больных другими заболеваниями бронхо-легочной система и контрольных групп;

3. Исследовать в те* асе группах уровни других маркеров, применяемых для диагностики рака легкого, и сравнить их эффективность с эффективность» альфа-1-антихимотрипсина;

4. Установить, имеется ли патофизиологическая связь между изменениями концентрации альфа-1-аитихимотрипсина и наличием в-организме опухолевого процесса (® частности рака .¡егхого); и обусловлено ли это с синтезом этого белка опухолевыми клетками или же другими механизмами.

^.У-ЗЕ"*'?...-'^вичяя ■ ^ я- '.¡■л', --»те работ;» впервые применена тест-систвма яоликдоиа;1Ь.ч1!й ^ чтглах для количественного опре-

деления а.»ь^8-1-»итияимотрг'Ясг':1а человека твердофазовцм иммуно-■*■-грчен\ .шн методом. Подгзергдемм ареймущества данной методики исследования перед другими методами ммму.чо химивеского анализа.

Впервые с помощью иммуиофермвнтиого анализа проведено сравнительное поучение антихнмогрипсина я других онкологических маркеров в биологических жидкостях болькмх заболеваниями бронхо-легоч-пой системы и показана перспективность применения определения АХИ в клинической практике.

Показано, что сочетание диагностической бронхоскопии с определением аитихимотрипсина и канцер-ассоцинрованного антигена 19-9 в лезаяной хсиякрсм-: бронхов аоаволяет значительно повысить эффективность брь;г;:ологиччскэ1 о обследования больного а диагностически трудных случая*.

Путем определения аитихимотрипсина в лав&киой жидкости брои- « коп и непосредствекчо э ткани опухолей легкого показано его накопление п клетках нвхоторых тняов рака легкого и таким образом под-твэрждец ггсаотеа о том, что яовишениа уровня данного белка является в первую очередь следствием распада клеток рака легкого.

Практические значения работы. Намя модифицирован метод очистки альфа-1-аитихимотрипсина из сыворотки крови человека. Очшценкий '

атим методлм АХИ применяется в Институте прикладной внаимологии Литвы для получения монослональных антител.

Впервые нами примененная тест-система для количественного определения АХИ методом -пгрдофазиого иммунофермьнткого анализа может применяться в клинической лабораторьой практике.

Количественное определение альфа-J-антихимотрнпсина и маркера СА 19-9 внедрено и применяется а диагностических целях в отделении грудной хирурги» клиники нг'дици»с::оА акадеьгы г. Каунаса.

Основные поло—епкя данной работы о<> ясно; г.зоиапки определения ракояых маркеров в целях диагностики раг.а легкого оключени в методические рекомендации школи-семинаря Онкологического центра России "Иммунофермектный анализ п онкологии".

Апробация работа,:. Материалы диссертации докладывались на совместном заседании кафедры биологической и бноорганнческой химик Каунасской медицинской академии (КМА), лабораторий клинической химии и патохимии биомедицинского института при КМА, II кафедры внутренних болезней КМА, на I республиканской конференции молодых ученых - медиков (Каунас, 1986), на II международной сонф£р<гк1->:я по биохимической очистке (Будапешт, 1988!, на всесоюзной ejko;:¿~ . семинаре "Иммуноферментный анялий онкологии" (Москва, 1S39).

¡Публикации. По материалам i й^^лйкоиаии t рпоот.

Объем и структура диссертации■ Диссертация состоит из введен i, 3 глав, включающих обоор литературы, оннсание материалов и методов исследования, результатов и их обеукдения, выводов и списка цитируемой литературы.

Работа излоаеиа на 121 странице машинописного текста, содержит 10 таблиц к 17 рисунков, библиография включает 201 наименование .

овънкт и «втода исследования Обследуемую группу составили 223 больных, с 1986 по 1990 г. госпитализированная а отделения грудной хирургии или внутренних болезней Каунасской клинической больницы с подозрением на рак легкого (157 случая) или se больных гнойными заболеваниями легких (66 случаев). Две контрольные группы составляли соответств<i to 50 клинически здоровых доноров в возрасте от 20 до 35 лет н 50 клинически здоровнх звнщли в последнем триместре беременности.

'¿zsrr.yz. .. __________.учали во время бронхологического

обследования больная. Кровь у Сольгшх брали утром натощак методом занеаункцк::. К.кшичаские, рентгенологические, инструментальные, .гарфологические, цитологические и лабораторные исследования больных проводились з Каунасской клинике как рутинные.

АУ.М очищали но свехей человеческой алаомы, полученной от клинически здоровы* доноров. Метод очистки АХИ (по Travis, 1986), модифицированный нами, включал несколько последовательных этапов: осагдание сульфатом аммония, аффинную хроматография на Голубой сефарозе и препар&тианое изо»лектрофскусирование. Модификация состояла з применены на конечном зтапе очистки метода препаративного изоэлектрическсго фокусирования, обладающего высокой разрешающей способностью. Зга аогас-тчло добиться высокой воспроизводимости и высокой гомогеииэсти выделенного таким образом АХИ.

Осаяденне аразодил:: сульфатом аммония в концентрации 50* от насыщения н осадок удаляли центрифугированием.

Аффиннуи хроматограф!!^ на цнбакрон-голубой сефарозе проводили зо мзтоднке Travis et al. О373)

АХИ .".оачищчяи методом препаративного изоэлектрофокусиравания согласно рекомендациям фнрми LKB.

Активность аптихнмотрнпсика определяли спектрофотометрически зо HuEvnal (1959).

Чистоту антихимотрилсина проверяли методами вертикального ©лзктрофорьаа в полиакриламидном геле, нммуиоэлектрофоргпа и аналитического изовлектрофокусировапия.

Вертикальный влектрофорео пророулл'.; в 10S н ISs-uom полиакриламидном геле в присутствии а©*»чичеуяъфата иг.грия по методу Laemml 1 (1979) на аппаратуре фир^г.: lkb.

Иммуновлектрофорез проводили в ><им агарссном геле по методу Grabar & Williams (1953).

Аналитическое изоэлектрофохусировькие проводили на приборе "Multlphor" согл&сно рекомендациям фярма

Концентрацию гомогенного АХИ определяли спектрофотометрическк (Tr.ivls, 1978).

Кроликов иммунизировали гомогенным АХИ последовательными внутримышечными инъекциями 0.5 мг"белка в 1 ral неполного адъюванта Фрейида. Полный адъювант Фрейнда кспольоовали для первой иммуниоа-ции. Кровопускания из ушной вены кроликов начинали с 3-ей недели после четвертой инъекции.

Титр антител в сыворотке опредэляли методом двойной имму-нодиффузия по Ouchtarlony (1956).

Фр&кцшэ иммуноглобулинов выделяли хроматографией на ДЗАЗ-аффи-гель голубой сефароое ф;:р>«г: "Bio-Rad" согласно рекомендациям фирмы-иоготовителя.

Часть очшценых антител метили пароксидааой хрена перьйодатным метг чм (Wilson St Hakane, 1978).

Для проведения иммунофермеитного анализа была использована схема двойных антител по Engwall (1S07). Оптимальные концентрации внтйтел для покрытия плашки, разведения исследуемых образцов и гонмогата подбирали методом "шахматного" титрования.

Измерение концентрации АХИ в сыворотке крови методом влектро-иммуноаналиэа проводили по методике Laureil (1957).

Иммуноблоттинг проводили на аппарате "Transphor" фирмы "LKB" по методике ТоыЫп et al.(1979).

В лаважной жидкости бронхов и сыворотке крови больных раком легкого и нераковыми легочными заболеваниями определяли следующие раковые маркеры: раково-вмбриональньй антиген (РЭА), нейрон-специфическую властазу (11СЭ), канцер-ассоциированный антиген CA 125 и канцер-ассоциированный антиген CA 19-9« Определение канцер-ассоциировашшх антигенов проводили только в ляважной жидкости бронхоэ. Определение прород«лн с помощью наборов СП "Диаплюс" на аппаратуре фирмы "Диапдлс" - "Hoffman - La Roche" согласно инструкциям фирмы - вроизоаднтеля.

Мякокл-?!и:г и обработку данных вели на базе персонального ^кро-ЭВМ класса IBM PC АТ-386. При собирании я обработке материала использовали пакет прикладных программ Ashton-Tate dBase IV п качестве базы данных. Пакеты статистических программ CSS (Complete Statistical System) и Statgraphlcs v.2.б применялись для статистической обработки результатов. Так как распределение АХИ в большинстве групп было близким к нормальному, то применялись методы классичесской статистики. Для оценки разницы между всеми группами применяли F-крнтерки, а для оценки разницы между ос-aoBHLw грузна*.«. - критерии Стьюдента. При оценке корреляционных свпзей приме*; пли юррвлг^ми Пирсона г.

РЕЗУЛЬТАТЫ И 05СУКДВИИЗ На перлом птвле работы была поставлена задача выделить из плазмы крови человека гомогенный белок АХИ, что являлось необходимым для иммунизации в получения антител к нему, а также для из-гото1к.з|!ия ; андартоп и кат-ролей для количественного определения.

Известные по ли7ературв методики (Travis, 1978; Travis, 1983) на дали удовлетворительных результатов. Нами была разработана собственная методика очистки АХИ« В заключительной стадии очистки

мы применили высокоэффективный метод препаративного иооалсктро-фокуснрования, который дает высокое разрешение белховых зон, но черезвычайно чувствителен к перегрузкам белками, и соответственно его нельвя было применять на более речних стадиях очистки. АХИ фокусировался в виде нескольких оон в диапазоне pi 3,9-4,8 (вто соответствует данным литературы) с максимумом активности в зоне с pi 4,1. Гомогенность АХИ была подтверждена тремя методами контроля. Электрофорев в присутствии додецы^сульфата натрия показывал одну полосу с Ы ок. 64000 Да; ¡¡ммуьоюлектрофорез - одну полосу иммунопреципитации с антисывороткой против цельной плавми и против АХИ; нзовлектрофокусирование - одну полосу. Выход гомогенного АХИ по нашим данным составлял 8+1 мг из 100 мл плазмы, что сопоставимо с результатами других исследовательских групп. Разработанная нами схема очистки выгодно отличалась высокой воспроизводимостью (во всех девяти циклах очистки был выделен свободный от примесей АХИ).

2. Разработка тест-системы для иммуиоферментиого анализа.

Полученные после иммунизации кроликов очищенным АХИ полк-клональные антитела обладали необходимой моноспецифнчностыэ и были в достаточной степени гомогенна,: для разработки на их основании тест-системы для иммуноферментного анализа. Мы выбрали для количественного определения АХИ тест-систему по схеме "DAS" (double antibody sandwich). Первые антитела сорбировали на полистироловых планшетах, затем вносили исследуемые образцы и стандарты, а после BToi >, наносили те же поликлоналмше антитела, конъюгированные с ферментной меткой. Выли подобраны оптимальные условия для всех втапов определения. Разработанная тест-система обладала высокой чувствительность» (предел определения 2 нг/мл антихимотрипсина). Система имела линейный диапазон в интервале концентрации АХИ от 4 до 100 иг/мл. Высокая чувствительность системы позволяет оп-

ределять даже слгдоеые концентрации АХИ в таких биологических жидкостях, как бронхоальвеолярный лаваж.

В качества стандарта использовали гомогенный АХИ, добавленный а бычьо сыворотку, или аул иа 50 сывороток клинически здоровых доноров. Для построения калибровочной кривой всегда использовали стандарт на'гомогенном АХИ. Стандартная сыворотка с г.хила в качестве референс-контроля.

Проверка внутри- и иежанализной вариации показала высокую точность и иоспрмзеодк:;эсгь предлагаемой тест-системы. Коэффициент вариации ни в одном елу-ме .»с превышал допустимого значения 10*. Таким образом, разработанная тест-система обладала ссеми необ-;:однмжк качествами, "таЗы кспользовать ее для количественного определения антяхимотриасина в клинических образцах. 3. Сравнение результатов определения концентрации АХИ методом им-' г^упоферментного анализа и традиционная« иммунохимяческими методами!

Мы сраонивали результаты количественного определения АХИ методами иммунофер^ентного анализа и электроиммуноаналиоа. В литературе имеемся данные, указывающие на то, что результаты количественного определения комплексообразующих белков гелевыми истодами кй/гьоя считать надежными (Ьа1па, 1989). АХИ, будучи анти-яротезоой, образует прочные комплексы со многими протебли-Т!;ческкни (Ьермгитгн;-, В нашем исследовании комплексообразование практически не в чаяло ¡{а результат измерения уровня АХИ методом иммуноферментного анализа. Однако 'мы наблюдали значительное занижение результатов определения уровня АХИ методом влектроиммуно-ан&лкаа, к определяемая концентрация АХИ была обратно пропорциональна количеству протяазы, образующей комплекс с ингибитором. Таким образом, опмбка определения ксицектрацик лнтихимотрнпсина электроиммуноаиализом может достигать до 50* реальной концентрации

этого белке, в сыворотке.

С целью демонстрации присутствие комплексов АХИ с протеазами в биологических щдкостях намы Ьк.*^ кримеп-'Га натодикг. и;-:-муноблоттинга. Ыу добасаяли с сбр&сцы сыг^роткю t- /алм бронхоаль-веолярного лаваг^ человека гомогсниь-^ Си .ий '¿ьмотрипсмк в вог.рас-тшяцнх количествах. Посла разделения белков опелог-!.-:: ¿ucfs жидкости в геле методом электрофореза в яригутегг' ДС:'; иср&носнлись

на мембрану, после чего npo?o¿¡v<*n« нммунозч-.млчес¡»у.-* окраску полос, содерасаенх АХИ. 11ммуаеСлбП.»г «аглядг., „^-¡онгтрг; о^л присутствие как свободного, так и связанного в комплекс актихиыотрипсина v лавахноЛ жидкости. Соогношэние между свободно)" и связанной о комплекс (комплексы) фракциями Ентнкямотрипсина менялось с зависимости от количества добавленных иротаолитнческш: фгрментоп. Это указывает ка непригодность влектроиммуноанализа и радиальнсГ: иммуиодиффуош: для количественного определения АХИ в биологически:; жидкостях ио-ва искажения получаемых данных в реоультатг ком-плексообразования АХИ. Таким образом, иммунофермвптиый анализ остается практически единственным ко альтернативных методов опр -деления концентрации аитихимотрмпепт. *

4. Аяалиа раковия маркеров о давав£?Г; яг-дко<?т?|' Вроигое■

Мы определял:! "ZZ-—' - ----- " -г-рбо

гидратные антигены СА 125 и СА 15-9) в лавазздой кндк.ости бронхов. В сыворотке кроои Определялись уровни АХИ, РЗА и НСЭ. Повышенного уровня карбогидратных антигенов СА 125 и СА 19-S в сыворотке кровк пр! раке легкого другими авторами' не было найдено, и поэтому мы считали их определение в сыворотке нецелесообразным. Однако возможность изменения их уровня-в близкой к опухоли среде - в данном случае в лаважной жидкости бронхов - не была исклвчена. Повто-' му мы решили намерить уровень этих антигенов в лаважной жидкости бронхов наряду с другими маркерами.

АХИ и РЗА оаределллм в лаважной едкости 43 ьсдышх. Но них у 15 Сыл установлен диагноз рака легкого: а 8 случаях плоскоклеточная карцинома, в 4 - малкоклеточный рак и 3 аденокар-цннома. В 23 случаях были определены другие оаболевания легких: в 8 случях был диагнозирован туберкулез, в 10 - хронический бронхит, в 2 - абсцесс легкого, в 2 - гангрена легкого, в 3 - бронхвктавы, з 2 - сиесмония и п 1 случае - доброкачественная опухоль легкого. Из-за относительной по сравнению с образцами сыворотки крови мел-кочислзнности оЗеледованиего контингента мы разделили всех обследовали- ¡„. вольных раг.ом легкого (вне зависимой гц ст гистологического и больных остальными заболеваниями .¿йгких (а последнюю группу мы отнесли как больных хроническими заболеваниями легких, так и больных, у которых имелись воспаление легких или даже гнойные заболевания: абсцесс ил» гангрена легкого). Карбогидратные антигены СА 125 и СА 19-9 определяли с лаважной алдкости 20 (из них у 10 установлен рак легкого) и 32 (10 случаев рака легкого) Зольных соответственно.

На рис.1 и 2 представлена картина- распределения уровней концентраций четырех наследованных нами маркеров: РЭА, СА 19-9, СА 125 и актихимотрипсина. Видим, что РЭА и СА 125 были малопригодными для диагностических целей из-за низкой специфичности. В отличий от РЭА ц СЛ 125, * :7мхтмотрипсин и СА 19-9 показала себя очень перспективы:*-.и маркерам:. В табл.! представлены данные по ' диагностической чувсчстельности и специфичности всех четырех маркеров • в лаважной жидкости бронхов. Как видим, показатель эффективности АХИ и Сд 19-9 очень высок. Сочетанное применение втих маркеров давило обит/« чувствительность 8В§> и специфичность 90%. Яялее детальной картины, как при исследованиях зтик же мархерор н сыпороткг кроен, в этом случае нам не удалось получить из-за небольшого объема обследованной группы. Вовмояю', что в

Таблица I, Диагностические показатели АХИ, РЗЛ, СА 19-9 а СА 125 в лааазсш;" зядвости бронхов больниз раком легкого (контрольная группа - больные хроническими оабояеа&княк:: легким).

Маркер Дискриминационная концентрация Чувствите кость (%; Сп«цич>»ч-::ссч,1 ¡si ¡;¿í.vb (Si)

АХИ 100 мг/л 05 i 9 ÖB

РЭА 10 иг/мл 86 65

СА 19-9 750 Ед/мл 80 90 СО

СА 125 200 Ед/ш £0 7Í ñíi

данной выборке всехроническис нераковые заболевания, пораж^эт^с

1

бронхиальное дерево, не были представлении б полной мере и в достаточном числе для то-го, чтобы делать выводи о незначительных колебаниях . уровня данных маркеров при наличии той или инной патологий. Однако основную задачу - дифференциацию между наличием и отсутствием рака в системе бронхов - сримененне данных маркеров позволяло решать весьма успешно.

Кроме этого, наличие повышенного уровня антикимо-т^псини в близкой к опухоли среде (в данном случ&е лавакнои зкиг.кости) и то обстоятельство, что уровень о жидкости бронхов при рьке

легкого значительно превышает кошде>. грацию яХИ в сыворотке крови тех же больных (учитывая разведение во время процедуры лаважа) -вти факты свидетельствуют о правильности предположения, что при н•1ичии злокачественной опухоли непосредственно в ее клетках происходит накопление данного белка. Увеличение его уровня в первую очередь в близкой к опухоли среде со всей видимости происходит из-за распада клеток опухоли. Как известно, некроз трансформированных клеток наблюдается уже в самих ранних стадиях злокачественного роста. Именно вто обстоятельство, по нашему мнению, и слукит

1000

300

еоо

200

АХИ(тг ГА )

СА 19-9 (Ед/тл)

РЛ

4-

ХЗЛ РЛ АХЦ Сл 10-О

и +

++

ХЗЛ

2600

2000

1600

1000

500

Рк.с, 3. Концентраций АХИ и СА 19-9 р жидкости бронхоальвеолярного ла-важа больных раком легкого (РЛ) и хроническими заболеваниями легких (ХЗЛ).

100

во

во

40

20

РЗА (нг /тл)

РЛ

и:

4-

ХЭЛ РЛ

«'ЗА ♦ СА 125

СА 125 (Ед/тл)

500

400

Ч

+Т

ХЗЛ

эоо гоо 100

>ис. 4. Концентраций РЗА и СА 125 в жидкости бронхоальвеолярного ла-}а*а больных раком легкого (РЛ) и хроническими заболеваниями легких [ХЗЛ) .

причиной повышения уровня АХИ (и других маркеров) в жидкости бронхов. Происходит ли накопление АХИ в клетках опухоли благодаря синтезу эго самими клетками или ааяватг*. его ко кровотог.а - иа этот вопрос ответить в данной работе «в было вэзмсйй' сти.

Таким образом, ислледованис маркеро;? в лаважной жидкости бронхов позволило сделать вывод, что на крайней мере два из них -антихимотрнпсин и СА 19-9 - обладают чувстнитг.чихостыо и спеки-фичностыо, необходимыми для диагностических целс?-. !!сследоваш;о не является более сложным, чем. цнтологг'^сс^е ис-..<зелование смибоп и/или лаважной жидкости, и мокет слукить в тех же целях как дополнительный или самостоятельный метод диагностики. Определзяме маркеров может бить • черезвычайно полезным для дифференциальной диагностики в ситуациях, когда другие традиционные методы инструментального исследобйкйя не в состоянии дать ответ о наличии или отсутствии злокачественной опухоли в системе бронхов. Определение РЭА и СА 125 в лаважней жидкости, согласно нашим данным, не имеет практического значения из-за малой спчцифнчности. В целях вняв-лен!!я влияния различных хронических незлокачественных заболеваний и курения на уровней различных маркеров (в перяур очередь АХИ и СД 19-9) необходима более углубленнр.к я ойклрная студни-

5. Исследование уроввя АХИ и яр?тг- : ".гкер;в сыоорг.ткс__кров;»

больны» раком легкого н другими ^¿гпчк^-л забод<зпгзййпг-и.

Концентрация антихимотрипсина била измерена в сыворотке 213 больных. Большинство из них были госпитализировании с отделение гругной хирургии с подозрением на рак легкого. Другая же часть Сбб бо пных) лечились по поводу гнойных (заболеваний легких, и мы исследовали их с целью выяснения реакции уровня АХИ на воспалительный процесс. Из числа больных основной группы в бб случаях был подтвержден диагноз рака легкого,- в том числе плоскоклеточный рак был обнаружен в 43 случаях, мелкоклеточный - в

17, аденокарцинома - в б случаях. Вторую группу составили больные легочным туберкулезом <16 случаев). Среди них инфильтративный туг беркулев был выявлен в 4 случаях, очаговый - в 3, туберкулема легких - в 8, и первичный туберкулезный комплекс --в 1 случае.. Третью группу составили больные хроническими заболеваниям;! легких (15 больных). Из них в 7 случаях был поставлен диагноз хронического бронхита, в б была выявлена броихэктатическая болезнь, в 2 случаях была обнаружена первичная ямфизема легких. Четвертую группу составили больные доброкачественными опухолями легочной локализации (всего 10 случаев). У 14 больных в качестве основного заболевания выявлена пневмония. У б больных сбкаруие:ш другие заболевания (стриктура пищевода, сужение трахьи, девиация аорты и пр ). У 20 больных обнаружены первичные злокачественные новообразования вне-легочной локализации (в тоМ число у * с метастазами в легкие).

Данные по количественному • определению АХП в сыворотке болышх исследуемой группы и здоровых доноров представлены в таблице П, Как видно, уровень АХИ статистически значимо повышен у всех больных раком легкого как по сравнению со здоровыми донорами, так и по ■ сравнению с больными хроническим бронхитом, бронхэктати-ческой болезнью, туберкулезом легких и доброкачественными опухолями легких (во воех случаях р<0,001). Если брать о отдельности три основных гистологических типа бронхогенной карциномы легкого, то найболее высокие концентрации наблюдались на&м у больных плоскоклеточным раком легкого. Они были статистически значимо (р<0,05) - те, чем уровень АХИ у больных мелкоклеточным раком легкого. Очень большой разброс результатов наблюдался в случаях аде-нокарциномы легкого, однако в среднем уровень АХИ был ниже, чем I г>и глоскоклеточном раке. Не было статистически значимых различий между уровнями АХИ у больных всеми видами туберкулеза легких, хро-

Таблица II. Концентрация АХИ о сыворо.ке крови при (заболеваниях легких

Эаболс.' яни^ Число больных .-онц. ЧЙ tr/л) Ошибка среднего

Рак легкого 58 0,36 0,01

в том числе:

плоскоклеточный рак 40 0,37 0,01

мелкоклеточный рак 10 0,34 0,01

аденокарцинома 8 0,28 0,01

Другие заболевания 46 0,28 0,005

легких, в том числе:

туберкулов 15 0,27 0,005

хронический бронхит* 16 0,30 0,015

доброкачестьеннме 10 0,25 0,005

опухоли

Дль- -г>ы 50 0,16 0,005

Беременные 48 0,22 0,01

Примечание: р < 0,001 при всех других состояниях по сравнению с раком легкого. * - й бронхоктааы.

ническим бронхитом, эмфиземой легких, бронхэктатической болезнью и доброкачественными опухолями легких. Однако группы больны» туберкулезом и броехвктазами значимо отличались от здоровых доноров (р<0,05). • -

Наличие статистически оначимого повышения концентрации анти-

химотрнпсинг в сыворотке больных раком легкого, в первую очередь % ... плоскоклеточной его формой, еще ие укааывает на то, что данный

тест мозге? быть полезным в целях диагностики и дифференциальной диагностики втого ¡заболевания. С целы» оценки эффективности АХИ как предполагаемого маркера рака легких мы анализировали его чувствительность и специфичность ври подобранном оптимальном дискриминационном значении концентрации (ДК) АХИ. Значение ДК было подобрано равным 280 мг/л. При превышении втой величины ставили диагноз "рак легкого", при. уровне АХИ ниже его - " отсутствие рака

легкого". На рис.3 представлена скатерограма- определения уротп АХИ у осел больных основной группы. Рок легкого по данным этого теста правильно классифицировали в 35 случаях на 50. Отсутствие яэ рака было правильно оязздалено 0 .103 случаях из 152 (в скатерограммз представлены 44 случая; ио ния 30 (6ПЗ;) были

г

классифицированы правильно). Таким образом, с.Зи'.ая чувствительность метода составила 70*. специфичность - 58%. Дальнейшее повияяяио специфичности возможно, используя более пизхжое онач<.*1ие дискриминационной концентрации. При изменений значения ДК до 350 мг/л

650

450

350

геа

150

АХН (тлй)

'ПКР/1 МКРЛ АКЛ- ТВ ХБ ДОЛ

Рис, 3. Концентраций АХИ в сыворотка» болындо исследуемой группы Сие показаны больные гнойники ааболеваннями! легких). ПКРЛ - плоскоклеточяый рак легкого; ЯЗСРЛ - мелкоклеточный- рак легкого; .'КЛ - адеиокарцинома легкого; ТВ - туберкулез; ХБ -хронический бронхит; ДОЛ - доброкачественные опухоли легкого,

пецифичноегь мето, . составила 93%. Чувствительность

соответственно падала до 36%.

В -="1йстро рефереис-маркеров мы использовали ракоэо-вмбрио-чый антиген Сдальшэ РЭА) и нейрон-специфическую виолаоу СНСЭ). Эти маркерц являются найволее подробно исследованными и 'результаты их определения при раке легкого хорошо иояеетвы., На рис. 4

предстаЕдепа скатерограма определений коицтитрацпЛ РЭА во ъсех образцах исследуемой группы и контрольной группы одоровых доноров. Мы брали стандартные дискриминационные значения концентрации РЭЛ 5 нг/мя {рекомендуемое фирмой-производителем) и 2,5 нг/мл, р«; йендуемое рядом исследователей в качестве ДК для рака легкого и молочной келеоы. Как видно, специфичность ана..лза действпт" 'с была высокой (94% при ДК 5 нг/мл), как и моасно было предполоо. ^ для тест-системы на моноклональных антителах. Однако чувствительность определения РЭА была еще нике, чем в студиях других авторов

РЭА (нт/тя)

30 г "•••

}

SS I*

SO

«I •

ю •

ПКРЛ . мцрп АКЛ ТБ ХБ ДОЛ

Püc. 3. Концентраций РЭА в сыворотках больных исследуемой группы (не'показаны больные гнойными заболеваниями легких). ПКРЛ - плоскоклеточный ррк легкого; MKPJ! - мелкоклеточный рак легкого; АКЛ - аденокарцинома легкого;'ТВ - туберкулез; ХБ -хронический бронхит; ДОЛ - доброкачественные опухоли легкого.

("Abbot",1S941, и составила всего 33*. Понижение ДК до 2,5 нг/мл улучшало картину ' .упстангельность бб* я специфичность 71% соответственно). Значение ДК РЭА 2,5 нг/мл представляется нам более целесообразной.

Обобщая наши данные по ИСЗ, можно сказать, что в нашем исследовании ИС.Э не зарекомендовала себя в качестве хорошего маркера

I

19

на рак легкого (суммарная чувствительность для всех гистологических типов 41* и специфичность 77% при дискриминационной концентрации 25 нг/мл). Указываемая в литературе, селективность НСЭ в отношении мелкоклеточной карциномы тоже была слабовыракенной.

В табл.III приводятся показатели диагностической чупствитель ностн, специфичности и вффективнистн предсказания дгагиоон используя в отдельности определение антихимотрипсииа, РЭА, НОЭ. также найболее эффективного сочетания двух маркеров. 1,уммарнэн специфичность использования РЭА с АХИ при ДГС АХИ 350 мг/л и РЭА 2,5 нг/мл была 71% яри суммарной чувствительности 82«. Следовательно, совместное определение АХИ и РЭА п отдельных случаях является целесообразным.

б. "c.-j •'j :•' : .......... ~r, !'rr.o-:r г-лмаг"_?гт дчнлмики

:"- \ - талесь, .з ; лт j .....: ::зс. • . • . ist >ри

группа. D первой из к«;.., » d к а..»..; ^¿p-et:«. дон ров

>

(п=50), средний уровень AXÜ составил 160 нг/мл. Дл:: -ценг*.:т влияния фона "встрогенов ка конце;;-грацию АХИ ¡¡селадоиа.лаеj группа клинически здоровых молодых жемзин в последнем триместре беременности. Средняя концентрация АХИ а сыворотке пациенток этоЛ группы была 220 мг/мл, что иа 302 визе, чем а первой контрольной rpynfi-(разница мекду группами статистически значима, р<0,05 Следовательно, концентрация AX}i умеренно зазист от уровня 9стр>-генов. Это подтверждает д&пные других авторов о том, что АХИ но является типичным реактантом острой фазой, ко тори.! сю. ¿твеина сильная эстрогеноэависнмость.

С целью более подробного изучения дгшампкм урозня анть-химотрипсина при острофаоовых реакциях ми исследовали концентрацию втого ингибитора в сыворотке болышх гнойными заболеваниями легких. Нами было вамеч'чо, что'уровень ЛХМ бил поветей при остром

Таблица 211. Ди&гаостнческ»о показатели АХИ, РЭА1и КСЭ в сыворотки кро j.: бо.:ьных раком легкого, (контрольная группа - больные хроническими заболеваниями легких).

Маркер Дис:;римг1яацион- Чуветвитель»- Спецкфич- Значение вози- Значение ■ нега- Эйфектив-' ' ная концентрация ность (*) ность (*$) тивнс.го пред- тивного вред- ность (%)

сказания (*) сказания (*)

АХИ > 280 мг/л ■ 70 68 71 67 69

AXtf 350 мг/л 36 93 86 56 63

РЭА 2,5 нг/мл 66 71 74 62 68

РЭА 5,0 нг/мл 33 94 87 52 60

НСЭ 12 нг/мл 79 15 59 . 32 54

НСЭ 25 нг/мл 41 77 74 '45 55

АХИ+РЭА 350 мг/л и 2.5 нг/мл S2 71 77 78 77

воспалении, слабо коррелироавд с клинико-лабораторными показателями активности воспалительного процесса и нормализировался при затяжном воспалительном процессе и при» переходе его в хронический. Это обстоятельство выгодно отличает АХИ от других белков - острофазовых реактантов.

7. Корреляция уровней маркеров с данными других клинических и параклинических исследований при олокачестпеяяых оиухолях легких.

В целях оценки диагностической информативности определения маркеров при раке легкого мы оценивали корреляцию их уровней со степенью распространения опухоли, а также с даявыми других кли-нико-лабораторкых методов исследования. В табл.IV представлены данные по корреляциям АХИ и РЭА с показателями стадия развития опухоли. Видно, что средний уровень АХИ тем выше, ченг больше распространена опухоль. Статистически значимое различие гумствует только между группами, соответствующим второй и третьей стадиям заболевания. Это обусловлено недостаточным числом наблюдений в

Таблица IV. зависимость уровня АХИ от стпдиеЛ рязжятмк оаухолн по ТНМ.

Стадия Число больных Конц. АХИ (г/л) Ошибка среднего

Т1-2МОМО 5 0.287 0,085

Т2М1И0• 16 0,316 о.о.;:

12»2Ж*-ТЭ№1-2М0 33 0,342 0,083*

Т2-ЗИ0-2М1 7 0,365 0,075

- р<0,05. Между другими группами разница статистически не значимая из-за недостаточного числа больных.

группе как случаев раннего р&ка легкого (п=5), так и запущенных :лучаев с отдаленными метастазами (п=7). Коэффициенты корреляции

уровня АХИ с другими лабораторными показателями были -0,52 с уровнем гемоглобина, 0,54 с СОЭ, -0,17 с уровнем общего белка и 0,24 с ьльфа-1-фракцией белка. Видим, что в отличии от других заболеваний при наличии злокачественных опухолей корреляция ме^ду уроцнеь маркера и показателями СОЭ или уровнем гемоглобина становится выраженной более сильно. Известно, что уровни'гемоглобина и СОЭ, равно как и все маркеры, коррелируют с распространение)» опухолевого процесса в организме. Корреляция между этим) показателями и уровнем АХИ и/или РЭА как раз иайболее выражена i поздних стадиях (ТЗ-Т4). В случае ранней онкологической патологи! вта корреляция отсутствует. Не наблюдается такой корреляции и i группе хронические заболеваний бренхолегочной системы. Все sti данные по¡, чти подтверждают предположение о том,' что антн-химотпипсин в данной .патологической группе является именно "маркером", а не "неспецифическим реактантрм".

С. ОСвдя оценка диагностической эффективности антихимотрнпсиня как маркера рака легкого".

По литературным источникам хорошо известно, .что теоретическ] определение даже'высокоспоцифичных онкологических маркеров в сыво-ргтке крови не в.состояний дать ответ, имеется ли у больного pai строго определенной интересующей врача локализации. Также ни оди> но маркеров пока что не оправдал себя в качестве "универсального в целях скрининга рака. Количественное определение маркера може' служить только в качестве вспомогательного теста, когда топика ПО' ражения уже определена либо по клиническим данным, либо по данньн одного на методов скрининга. Дополнительное значение определени< маркеров . может иметь чв тех,случаях, когда возможности клиническо! и, инструментальной диагностики (за исключением диагностически оппераций) исчерпаны и' не дали однозначного ответа. Типическо: задачей такого рода является дифференциальная диагностика округлы

рентгенологических теней в легких. Поскольку периферические новообразования редко когда доступны для бронхологического исследования (чувствительность составляет всего 10-20%), в. чувствительность трансторакальной пункции тоже достигает лшяь 30-40%, то дополнительные методы исследования могут принести ощутимую пользу клиницисту. В нашей исследуемой группе было 68 больных, у котор:»>' рентгенологически была обнаружена округлая тень в пола легкого. Ия них у 30 больных был установлен периферический рак легкого. В общей сложности проведены 32 диагностических торакотомий. Из них в 10 случаях (31,2%) установлен диагноз опперабельного рака легчи1« и произведено удаление опухоли. В 4 случаях была удалена т,.«Р кулема. В остальных случаях либо обнаружен нбопперабельный ряк. легкого (11 случаев), либо другие заболевания органов группой полости и средиостения, не требйпапшие опперативного имрп.а-гельства.

Определение маркеров (АХИ и РЭА) в сыворотке крови больных этой группы позволило бы асеысить сумг<з.рнуо диагностике с куг> эффективность до 77% (данные по периферическому и центральному раку легкого не различаются *. Еще Зояее (эффективным представляется метод определения маркеров в бронхоальвеолярнон лавагсе.

В случаях центрального рака легкого бронхольгическое исследование имеет решающее значение для установления диагноза, гистологического., типа опухоли и подбора тактики лечения. Однако в исследованной нами группе было 8 случаев центрального рака легкого, когда приходилось прибегать к диагностической торакотомми. Кроме того, в 11 случаях при повторных фибробронхоскспиях не удалось получить кгчественный материал для : криологической диагностики, и верификация диагноза не явля.-ась полной. Такзго ив удавалось обнаружить атнпию клеток с помощыз-цитологического исследования. В общем числе совокупность инструментальных методов ис-

следования не способствовала установлению правильного- диагноза рака легкого центральной локализации в 12 случаях (33%).

Таким образом, количественное определение маркеров являлось бы диагностическим тестом, позволяющим получить дополнительную информацию в целях дифференциальной диагностики рака легкого. Применение РЭА возможно практически в любой клинической ситуации. АХИ является менее универсальным маркером. Его примепекле вполне оправдано в целях дифференциальной диагностики округлых рентгенологических теней легкого, однако слабо подходит (без динамического кайдвдеииа) для решения схожей задачи в случае затянувшейся пневмоний неясного происхождения. Имеются и общие «едостатви количественного определения маркеров в сыворотке крови. Во-первык, АХИ и РЭА ■ эта .. '.ркеры, которые не является видоспеци£шческими для раки легкого или одного из гистологических его типов. Во-вторых, РЭА, который обладает более высокой специфичностью, имеет слитком низicус чувствительность и не дает диагностической информаций в 343 случаев. В то zee время.антихимотрипеш; в сыворотке крови обладает недостаточной специфичностью. Сочетание обоих маркеров, хотя и повышает общую эффективность, но практически имеет те же не 4остлтки, что и каждый из них. Таким образом, в отношении рака легкого "методом выббра" монет служить определение маркеров, и е первую очередь альфа-1-аитихимотрипсина, в бронхоальвеолярнок лаваже.

ВЫВОДЫ

1. Примененный нами метод твердофазового иммуноферментногс анализа позволяет количественно. измерить уровень альфа-1-антихимотрипсина в жидкости бронхоальвеоляриого лаважа и с сыворотке крови при различных патологических состояниях.

2. Иммуноферментный метод определения антихимотрипсина имее! ряд весомых преимуществ перед методами количественного определен»!

АХИ, применявшихся другими авторами.

3. Количественное определение аитихимотрипсина в жидкости бронхоальвеолярного лапаяя является диагностическим тестом на бронхогоиную карциному и обладает диагностической специфичностью 89% при чувствительности 85% по сравнении с незлокачественными заболеваниями легких.

4. В сиаоротке крови найбольшую диагностическую информацию из исследованных нами маркеров дает совместное определение раково-ембрионального антигена и альфа**1-антихимотрипсина. Повышений уровень антнхимотрипсина мокет слукить показателем для ->олее углубленного . сбслгдования больного с помощью РЗА. НСЗ и/или инструментальных методов исследования.

5. Определение маркеров АХИ, РЗА, НСЗ в сыворотке крови является недостаточно чувствительным для целей скрининга.

6. Наличие повышенного уровня антшшкотрипснна в кидгеьсти бронхов, а такяг коррэляция уровня этого балка а сыворотке со степенью распостранении опухоли являс.-сг косаеннкм доказательством, подтверждающем гипотезу о том, чга альфа-1-антихимотрипсин непосредственно накапливается в клетках рака легкого. Механизм этого явления не известен.

Основной материал диссертации опублнковак в следующих работах:

1. Zuklys К., Tvarljonavlclus D., Lukoaius A. A circulo procedure for purificatíon of human aípha-l-antlchymolryprjln and lts quantitation Ъу the enzyrce lmraunoaüsay. Abstr. lAth Int.Congr.Blochoa. Pragu©,1988, Tu:554.

2. K.'Zuklys, D.. Tvarl Jonavlclus, A. Lukosius, L.LuIcoasvJciug Baldonas E. Human alpha-l-antlchymotrypsln: purificatíon by preparativa isoaloctrlc focusing and dovo3ep™cnfc oC the ana Ae lrcrnunoassay. Proc. 2nd Int. Conf. BiocftGir.. Scpsrat lons, Sds. Í»lc5: J.& Vajda J., Hung.Blochetn.Soc. , flung.Cticn.Scc., Sudtpast 1988, p. 89-101.

3. Жуслис К.Л,, ТварнЯоиавмчшс ДЛ1. , Дукоинос А.С., Подарена С.Р. Количественное определение альфа-1-антихймотрнпеина плазмы крови иммуноферментиым методом. Тезисы всасовэи.кснф. "Биохимия медицине", Ленинград, 1988, с.107.

4. Жуклис -К.Л., Тварийонавичюс Д.П., Лукопвос A.C.. Планчюнсне P.P., Вурняцкене Ю., Подяреие С. Р. Разработка тест-системы для количественного определения интихимотривсина плазмы крови человека 'иммунофермеиткым методом. Tes.IV съезда биохимиков ЛитССР, Вильнюс, 198С, с."гЗ-174.

5. D;Tvarlíonavicius, E.Bagdonas. K.ZuMys. Serum alpha-l-~ antlchymotrypsln as a possible lung cancer marker. Abstr. XXII Congr.Polish Surgeon Soc., Katowice,1988, p.165.

ß. оагдонас Э., Тварийонавичюс Д., Z/клис К. Альфа-1-антихимотрипсин плазмы крови, - возможный маркер рака легкого. В сб.¡"Современные вопросы торакальной хирургии и трансплантологии". Материалы VI научной конференции Прибалтийских респ.,Вильнюс, 1988, с.23-24.

7. Byклис К.Л., Тварийонавичюс Д.П., Лукошюс A.C. Альфа-1-антихимотриасин человека: очистка методом препаративного изовлектрйческого фокусирования и количественное определение иммунофермеитным матодом. Сборник научных трудов I респ. конф. молодых ученых медиков.-. ЛитССР, Каунас, 1988, чЛ, с,29-31.'

8. Тварийонавичюс Д.П., Вуклис К.Л., Прашкявичюс А.К. Альфа-1-аытихимотривсин как маркер рака легкого//'Актуальные вопросы в биохимический и иммунологической диагностике злокачественных новообразований: тев*. общесоюз, конференции (12-14 дек. 1989 г., М. , 1989, с.136-137

■9. Н.'.муноферментный анализ при онкологических заболеваниях органов, желудочно-кишечного тракта и легких (CEA, CA 19-9, AFP) (методические рекомендации. МЗ СССР)/ Ткачева Г.А., Модников О.П., Иванов П.К., ТелешВ.М-, Прохорова В.И., Леорг А.Л., Скворцов C.B., Тварийонавичюс Д.ft, - M.,1990, 35 с.