Автореферат и диссертация по медицине (14.00.15) на тему:Значение мононуклеарных лейкоцитов в эпителиальных пролиферативных процессах желудка и толстой кишки

НАДЁЖИН Александр Сергеевич

Р Г б ОД

I ! . :

ЗНАЧЕНИЕ МОНОНУКЛЕАРНЫХ ЛЕЙКОЦИТОВ В ЭПИТЕЛИАЛЬНЫХ ПРОЛИФЕРАТИВНЫХ ПРОЦЕССАХ ЖЕЛУДКА И ТОЛСТОЙ КИШКИ

(морфологическое исследование)

На правах рукописи 4.00.15 - патологическая анатомия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 1996

Работа выполнена на кафедре патологической анатомии Ярославской государственной медицинской академии.

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор К.И.Панчёнко Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор И.А.Казанцева доктор медицинских наук, профессор А.А.Чумаков

Ведущая организация: Российский государственный медицинский университет.

Защита диссертации состоится " " 1996 г.

в часов на заседании диссертационного совета Д.084.08.03 при Московском медицинском стоматологическом институте (Москва, 103474, ул. Делегатская, д. 20/1).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института (Москва, ул. Вучетича, д. 9а).

Автореферат разослан " " 1996 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор мед. наук, профессор Б.М.Уртаев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Среди онкологических за-олеваний раки желудка и толстой кишки занимают по :астоте одно из ведущих мест [Nagayo, 1986, Кудряшов и оавт., 1992; Гребнев и Склянская, 1996]. Поскольку до :астоящего времени меры профилактики обоих заболева-:ий не разработаны, то их ранняя диагностика является :аилучшей гарантией успешного лечения и, соответствен-:о, способом снижения смертности [Минг, 1987; Уайтхед, 987].

В желудочно-кишечном тракте к раннему раку словно относят опухоли, растущие в пределах слизистой болочки и подслизистого слоя, независимо от их разме-ов и наличия метастазов в регионарных лимфатических злах [Роттенберг, 1993]. Этот термин широко использует-я в литературе [Серов и соавт., 1985, Берестова, 1988].

Дифференциальная диагностика ранних форм адено-арцином названных органов все еще в ряде случаев есьма субъективна, даже если применяются трудоемкие етодики. Существование этой проблемы подчеркивается ак зарубежными, так и отечественными патогистологами ГЪловин, 1982; Самсонов, 1989; Капуллер и Калитеев-кий, 1993; Роттенберг, 1993; Sipponen, 1990].

Количественное исследование митозов и их патоло-ли в биопсиях человека при неопластических процессах озволило разработать и внедрить в практику патоморфо-огов метод исследования митотического режима ткани в иагностике предраковых процессов и рака [Казанцева, 981].

Изучение лимфоидного инфильтрата столь же просто исполнении и помогает в диагностике и прогнозирова-ии опухолей ряда локализаций [Панченко и соавт., 1980; п и соавт., 1987; Jass, 1986, 1990], но в отношении пищеварительного тракта попытки использовать данный рием не принесли существенных результатов С.И.Панченко и С.В.Панченко, 1985].

Отмеченная проблема, по-видимому, во многом объ-зняется известной [Paul, 1987; Cantor, 1987; Janeway и >авт., 1987; Tada, 1988] гетерогенностью лимфоцитов и

недостаточным знанием биологических свойств их различных субпопуляций. Лимфоциты не только гетероген-ны, но и гетероморфны [Струков и соавт., 1990; Bolhuis, 1980; Burton, 1980; Pross и Baines, 1980; Allavena и Ortaldo, 1984; Schneider и соавт., 1984], причем последнее во многом связано с первым [Davies и Parrot, 1981; Schuurman и соавт., 1987; Батчер и Вайссман, 1987]. Поэтому представляется перспективным анализ корреляционных связей между количеством различных форм агра-нулоцитов стромы и эпителия, с одной стороны, и мито-тическим режимом последнего при различной степени дисплазии, с другой. Подобный подход мог бы способствовать как пониманию биологической сущности дисплазии эпителия, так и роли различных лимфоцитов в ее пато- и морфогенезе.

Цель исследования - улучшить дифференциальную диагностику тяжелой дисплазии и начальной карциномы желудка и толстой кишки путем повышения информативности изучения лимфоидной инфильтрации ткани.

Задачи исследования:

1. Используя оригинальную методику окраски ДНК, изучить митотический режим. эпителиоцитов желудка и толстой кишки при хронических антральном гастрите, неспецифическом неязвенном колите, гиперпластических полипах, тубулярных и ворсинчатых аденомах с различной степенью дисплазии и аденокарциномах.

2. В том же материале выявить особенности соотношения инфильтрирующих эпителий клеток, отличающихся друг от друга строением ядра.

3. Определить при указанных патологических процессах количество плазмоцитов в собственной пластинке и строме новообразований и изучить соотношение клеток, содержащих иммуноглобулины A, G и М.

4. Проанализировать корреляционные связи перечисленных особенностей иммунного инфильтрата с показателями митотического режима эпителия.

Научная новизна. Предложен новый метод раздельного анализа внутриэпителиальных мононуклеарных лейкоцитов, отличающихся друг от друга конфигурацией, размерами и оптической плотностью ядер. Впервые уста

новлены корреляционные связи между особенностями мо-нонуклеарной инфильтрации эпителия, показателями его митотического режима и степенью дисплазии эпителия в желудке и толстой кишке. На этой основе получены новые данные, свидетельствующие о достоверных отличиях тяжелой дисплазии железистого эпителия желудка и толстой кишки от умеренной дисплазии и аденокарциномы, а также о значительных различиях местной иммунной реакции в тубулярных и ворсинчатых аденомах.

Практическая значимость. В процессе исследования разработан и использован новый метод блокады активных групп полисахаридов, белков и нуклеиновых кислот, а на его основе - способ гистохимического выявления нуклеиновых кислот, отличающийся простотой исполнения, стабильностью результатов, контрастностью и возможностью окраски ДНК и РНК в любой цвет. Уточнены дифферен-циально-диагности-ческие критерии для тяжелой дисплазии и аденокарциномы.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. При патоморфологической диагностике опухолей и дисплазий желудка и толстой кишки ценную информацию дает определение количества внутриэпителиальных мононуклеарных лейкоцитов, особенно их "активированных" форм (размерами со средний лимфоцит, отличающихся неправильной формой, более широкой полосой цитоплазмы, комковатым ядром с изрезанным контуром и конденсацией хроматина вблизи ядерной мембраны).

2. Соотношение различных типов внутриэпителиальных мононуклеарных лейкоцитов в слизистой оболочке желудка и толстой кишки обусловлено особенностями пролиферативного патологического процесса.

3. Тяжелая дисплазия эпителия желудка и толстой кишки в тубулярных аденомах достоверно отличается от дисплазии меньшей степени и от аденокарцином по показателям местной иммунной реакции (повышенное содержание ПФК при минимальном количестве активированных ВЭЛ).

4. При тяжелой дисплазии эпителия желудка и толстой кишки неблагоприятными прогностическими призна-

ками являются следующие: митотический индекс выше 35%о в желудке и выше 63%о в толстой кишке, количество патологических митозов свыше 21%, активированных внутриэпителиальных лимфоцитов более 6%о, а моноцитов менее 1%о.

Апробация работы. Основные положения работы обсуждались на 12-й конференции "Морфометрия в диагностике болезней" (Москва, 1993), на заседании Ярославского областного общества патологоанатомов (1996), на межкафедральной конференции кафедр патологической и нормальной анатомии, гистологии, микробиологии и судебной медицины (1996) Ярославской государственной медицинской академии.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ.

Объем и структура диссертации.

Диссертация общим объемом 107 стр. машинописи состоит из введения, обзора литературы, методической главы, главы собственных данных, обсуждения, выводов и указателя литературы (последний включает 162 работы, в том числе 54 иностранных источника). Количественные данные обобщены в 9 таблицах, 19 графиках и схемах. Работа содержит 40 микрофотографий.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Поскольку целью настоящей работы была оценка возможности использования особенностей лимфоцитарной инфильтрации эпителия желудка и толстой кишки для суждения о степени дисплазии и малигнизации, то это и определило круг изучаемых патологических состояний. Исследовались тубулярные аденокарциномы, как наиболее часто встречающиеся в данных органах, тяжелые дисплазии, как морфологический эквивалент облигатного пред-рака и, наконец, заболевания желудка и толстой кишки, считающиеся наиболее частыми - фоновыми состояниями для раковых опухолей: хронический антральный гастрит с фовеолярной гиперплазией и хронический неязвенныг колит, гиперпластические полипы, аденомы тубулярные: а в толстой кишке также тубулярно-ворсинчатая и вор

синчатая опухоли. Следует отметить, что поскольку тяжелые дисплазии анализировались нами особо, то во всех случаях аденом без специальной оговорки речь идет об опухолях с умеренной или легкой степенью дисплазии эпителия, отличия которых друг от друга весьма субъективны и нами не учитывались. Тяжелые дисплазии в толстой кишке исследовали отдельно в тубулярных и ворсинчатых опухолях. По всем изученным и представленным ниже параметрам мононуклеарно-эпителиальных отношений различные формы гастритов не различались достоверно между собой, а потому объединены нами в одну группу. То же следует сказать и о хронических неязвенных колитах. Тубулярно-ворсинчатые аденомы толстой кишки по аналогичным соображениям объединены в одну группу с тубулярными.

Материал брали при эндоскопии, фиксировали в течение 2 - 4 часов в 96% этаноле (либо в течение 18-24 часов в 10% нейтральном формалине), заливали в парафин, окрашивали гематоксилин-эозином и по Моури, метиловым зеленым и пиронином по Браше, определяли активность кислой фосфатазы и неспецифической эстеразы посредством реакции азосочетания с прочным красным GG и соответственно с фосфатом нафтола AS-TR или с ацетатом нафтола AS-MX, обрабатывали кроличьими сыворотками, мечеными флуоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ), против иммуноглобулинов А, G и М человека, а также использовали оригинальную методику окрашивания ДНК (см. раздел "Практические рекомендации").

37 гастро- и 14 колонобиопсий были получены из эндоскопического центра территориального медицинского объединения № 1 г.Ярославля, 53 колонобиопсии - из эндоскопического кабинета Ярославского областного онкологического диспансера, 13 случаев относились к архивному материалу кафедры патологической анатомии ЯГМА. Морфологическая характеристика материала изложена в первых двух столбцах, таблиц 1 и 2.

Поскольку все перечисленные патологические процессы сопряжены с пролиферацией, то особенности лим-фоцитарной инфильтрации эпителия желудка и толстой кишки сопоставляли с показателями его митотического

режима. Последний изучали в препаратах, окрашенных гематоксилин-эозином и на ДНК, на основании определения показателей, характеризующих его по Алову [1965]:

Таблица 1

Митотический режим эпителия желудка

Патологический процесс Лисло наблюдений е- С5 С. С! Е 51 СЭ о 53 з и — & н о н Доля патологических митозов (в %)

всего мосты | отставание хромосом рассеивание хромосом |Моноцентрнческий 3-групиовая метафаза Асимметричный г/- К-митоз .прочие

Хронический антральпый гастрит 23 М 12,3 1,5 0,6 0,6 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,2

го 1,3 0,2 0,1 0,1 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,1

Гиперпдастический полип 4 М 7,8 5,0 1,5 2,3 0,3 0,3 0,0 0,3 0,0 0,5

т 2,3 0,9 0,3 0,8 0,3 0,3 0,0 0,3 0,0 0,3

Тубуляриая аденома 6 М 23,8 5,5 2,2 1,5 0,5 0.2 0,2 0,0 0,3 0,7

т 2,9 1,0 0,3 0,3 0,3 0,2 0,2 0,0 0,3 0,2

Аденома с тяжёлой дисплазией 8 М 30,4 18,6 6,8 4,1 1,3 0,5 0,0 1,1 1,1 3,6

т 2,0 1,1 0.5 0,4 0,4 0,2 0,0 0,5 0,3 0,5

Тубуляриая адепокарцинома 7 М 38,7 23,0 7,1 4,1 1,9 0,9 2,9 1,6 0,9 3,6

т 4,4 1,3 0,7 0,5 0,4 0,3 0,6 0,9 0,3 0,6

М - среднее арифметическое, т - стандартная ошибка.

1. Митотический индекс (МИ) - число митозов (как нормальных, так и патологических), приходящихся на 1000 эпителиоцитов (подсчитывали 10000 клеток);

2. Доля фаз митоза в общем количестве делящихся клеток - процент митозов, находящихся в профазе, мета-фазе, анафазе и телофазе соответственно;

3. Суммарный процент патологических митозов к общему числу митозов, а также отдельно по следующим их формам, встречавшимся в нашем материале: фрагментация хромосом, мосты, отставание хромосом, рассеивание хромосом, моноцентрический митоз, трехгрупповая метафаза, асимметричный митоз, К-митоз.

Таблица 2

Митотический режим эпителия толстой кишки

Патологический процесс Число наблюдений | Р а я п С. а С я о о з 5 О О 5: у- О Е- X Доля патологических митозов (%)

0.1 ээп мосты отставание хромосом Г |расссивание хромосом и (и о. о 3 о о Я л т л •ел н о ^ ПЗ а о с >, а и СО асимметричный К-митоз прочие

Хронический неязвенный колит 4 М 11,8 1,3 0,8 0.3 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,3

ш 1,7 0,5 0,3 0,3 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,3

Гилерлластический полип 7 М 7,7 5,4 0,7 2,4 0,6 0,0 0,0 1,1 0,0 0,6

!П 0,9 1,4 0,7 1,2 0,6 0,0 0,0 0,7 0,0 0,6

'Губулярная аденома 16 м 23,7 8,0 1,0 2,6 0,4 1,0 1,9 0,6 0,1 0,4

т 1,9 0,2 0,3 0,2 0,4 0,5 0,3 0,1 0,1 0,3

Ворсинчатая аденома 13 М 20,3 6,7 1,2 1,2 0,8 0,6 1,0 0,6 0,0 1,1

т 2,1 0,9 0,3 0,4 0,4 0,5 0,4 о,3 0,0 0,5

Тубулярная аденома с тяжелой дисплазией 9 М 38,2 12,7 2,0 4,8 0,7 0,8 1,8 0,3 1,4 0,9

гп 3,6 1,8 0,6 0,9 0,4 0,5 0,5 0,2 0,7 0,3

Ворсинчатая аденома с тяжелой дисплазией 4 М 56,5 21,3 5,5 1,8 0,5 1,8 1,5 1,8 2,5 6,0

т 7,4 1,9 1,9 1,0 0,3 0,6 1,0 1,0 1,9 1,4

Тубулярная аденокарщшома 11 М 64,9 21,9 5,4 4,2 1,1 0,5 3,5 3,5 2,4 1,1

ш 2,1 1,3 0,9 0,7 0,5 0,2 0,5 1,0 0,5 0,3

М - среднее арифметическое, т - стандартная ошибка.

После верификации диагноза с использованием общепринятых критериев вычисляли путем подсчета соответствующих клеток инфильтрата, приходящихся на 1000 эпителиоцитов 3 следующих индекса:

1) индекс внутриэпителиальных мононуклеарных лейкоцитов (ВЭМИ), ставший традиционным для работ подобного рода [С.В.Панченко, 1981; Доманин, 1989] ,

* который иногда называют индексом внутриэпителиальных лимфоцитов, что мы считаем не точным, из-за невозможности достоверной дифференцировки между лимфоцитами и макрофагами в препаратах, окрашенных гематоксилин-эозином.

2) индекс параэпителиальных мононуклеарных лейкоцитов (ПЭМИ),

3) индекс сегментоядерных лейкоцитов (ИСЛ), необходимый для суждения о степени выраженности воспаления и его возможной связи с типом пролиферативного процесса в эпителии. Кроме того, попарным сложением значений ВЭМИ и ПЭМИ определяли суммарный индекс мононуклеарных лейкоцитов (СМИ).

Наряду с этим, на препаратах, окрашенных при помощи оригинальной методики на ДНК, определяли абсолютное число каждой из 5 выделенных нами (см. ниже) клеточных форм ВЭМ в пласте из 1000 эпителиоцитов. Методика определения их количества состояла в следующем: для каждого случая сначала вычисляли доли анализируемых форм среди 100 ВЭМ, затем, умножая попарно эти относительные показатели на ВЭМИ данного случая, получали искомые абсолютные числа соответствующих ВЭМ в пласте из 1000 эпителиоцитов.

В препаратах, окрашенных по Браше, подсчитывали количество пиронинофильных (без тучных) клеток (ПФК) в строме (на 1000 клеток стромы, не считая сосудов), а также прилежащих к эпителиальному пласту (на 1000 эпителиоцитов). Аналогичным образом в препаратах, окрашенных гистохимической реакцией на кислую фос-фатазу и неспецифическую эстеразу, подсчитывали количество макрофагов.

В препаратах, обработанных мечеными ФИТЦ сыворотками против иммуноглобулинов A, G и М, при помощи люминесцентного микрофотометра ФМЭЛ-1 измеряли интенсивность люминесценции в поле зонда, затем путем деления на среднюю яркость одной клетки (этот показатель рассчитывался предварительно) определяли в поле зонда количество иммуноглобулинсодержащих клеток по отдельным классам иммуноглобулинов. После этого, зная площадь зонда при конкретном увеличении, рассчитывали количество клеток, содержащих иммуноглобулины разных классов на единицу площади среза.

Полученные результаты обрабатывались методами вариационной статистики [Урбах, 1964] с использованием компьютера.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Митотический режим эпителия

Проанализировав митотический режим эпителия желудка и толстой кишки мы обнаружили (табл.1 и 2), что процессы усиленной пролиферации и в еще большей степени малигнизации эпителия характеризуются достоверным возрастанием МИ, что в принципе совпадает с данными других исследователей [Казанцева, 1981; Доманин, 1989]. Что касается частоты патологических митозов, то в обоих органах она достоверно минимальна при хронических воспалительных процессах, максимальна в адено-карциномах и имеет промежуточные показатели в тубу-лярных аденомах с тяжелой дисплазией эпителия. Часто встречающаяся в толстой кишке ворсинчатая опухоль с умеренной дисплазией по данному признаку не отличаются от соответствующей тубулярной, а с тяжелой дисплазией - от аденокарциномы. Близость последних процессов отмечена также Доманиным [1989].

Нами установлено, что частота отдельных форм патологии митоза достаточно объективно характеризует биологическую сущность патологического процесса. Так, патологические митозы, связанные с повреждением хромосом, обнаруживаются с различной частотой при любой усиленной пролиферации, однако частота их достоверно возрастает при дисплазии и малигнизации. Особенно это относится к отставанию хромосом и их фрагментов в ана-, телофазе и мостам. Некоторые формы патологии митоза, обусловленные не только хромосомными аномалиями, но и повреждением митотического аппарата клетки, нам встретились только в опухолях, и только при тяжелой дисплазии и малигнизации процесса, что совпадает с данными Казанцевой [1981].

Мононукпеарно-эпителиальные отношения

Анализ корреляции между показателями митотического режима и клеточной инфильтрации показал, что исследуемые органы отличаются друг от друга в отношении связи между МИ и ИСЛ - в желудке ее нет, а в толстой кишке она есть (табл. 3 и 4).

Таблица 3

Мононуклеарно-эпителиальные отношения в желудке

Патологический процесс п % МИ ИСЛ СМИ ВЭМИ ПЭМИ

Хронический аптральнмй гастрит 24 М 12,3 10,8 48,9 23,2 25,3

ш 1 ,3 1,6 2,3 1,7 1 ,9

Гиперпластический полип 5 М 7,8 5,8 41,2 24,6 16,6

тп 2,3 1,6 3,0 2,7 2,4

Тубулярная аденома 6 М 23,8 8,7 46,5 28,8 17,7

т 2,9 2,6 5,1 3,8 1,8

Тубулярная аденома с тяжёлой дисилазией 8 М 30,4 17,1 45,4 28,6 16,8

т 2,0 4,0 4,7 3,0 2,4

Тубулярная аденокарцинома 6 М 38,7 7,7 50,8 32,8 18,0

т 4,4 2,9 6,4 4,4 5,5

п. - число наблюдений, М - среднее арифметическое, ш -стандартная ошибка

Таблица 4

Мононуклеарно-эпителиальные отношения в толстой кишке

Патологический процесс п %0 МИ ИСЛ СМИ ВЭМИ ПЭМИ

Хронический неязвенный колит 6 М 11,8 10,2 51,8 31,0 22,5

ш 1,7 3,5 7,3 5,6 2,4

Гиперпластический полип 7 М 7,7 1Д 27,6 14,1 13,1

ш 0,9 0,5 1,7 1,5 1,0

Тубулярная аденома 16 М 23,7 12,1 52,4 29,9 22,5

га 1,9 1,6 1,7 1,5 1,0

Тубулярная аденома с тяжелой дисплазией 9 М 38,2 16,4 43,1 24,1 19,3

ш 3,6 1,1 2,9 3,2 0,8

Тубулярная аденокарцинома 12 М 64,9 23,8 48,4 30,0 18,0

ш 2,1 3,0 2,9 2,7 1,6

Ворсинчатая аденома 13 М 20,3 11,2 44,6 20,9 23,7

т 2,1 2,9 4,7 2,8 3,2

Ворсинчатая аденома с тяжелой дисплазией 4. М 56,5 4,0 75,3 63,0 • 12,3

т 7,4 1,3 6,1 3,1 3,8

п - число наблюдений, М - среднее арифметическое, т -стандартная ошибка

Подмеченные особенности, по-видимому, свидетельствует о различной степени участия воспаления в проли-феративных процессах в каждом органе. Напротив, одинаково в желудке и толстой кишке отсутствует корреляция между значениями ИСЛ, с одной стороны, и СМИ, ВЭМИ и ПЭМИ, с другой, что не позволяет объяснить одной воспалительной реакцией увеличенное содержание мононуклеарных лейкоцитов в эпителиальном пласте при пролиферативных процессах. Вместе с тем регрессионный анализ выявил в желудке обратную зависимость между содержанием ВЭМ и количеством ПЭМ в последовательности процессов, соответствующей возможной опухолевой прогрессии (коэфф. корреляции гВЭми,пэми -0,53; коэфф. регрессии ЬВэми/пэми = -0,5 , ЬПЭМи/вэми = -0,6 ), а в толстой кишке нет никакой связи между соответствующими показателями (коэфф. корреляции г=0,042).

И то, и другое в еще большей степени обосновывают известное сужение [Bartnik и соавт., 1980; К.И.Панченко и соавт., 1981; Selby и соавт., 1981; Cerf-Bensussan и соавт., 1987] о различиях лимфоцитов эпителия и стромы, поскольку количество даже тех из мононуклеарных лейкоцитов, которые прилежат непосредственно к эпителиальному пласту, не коррелирует положительно с числом одноименных внутриэпителиальных клеток. К тому же, следует, что необходимо дифференцированно изучать ВЭМ и ПЭМ.

Проведенным исследованием ВЭМ установлено, что в обоих органах количество их не связано с МИ, но зависит от типа патологического процесса, хотя и не в такой степени, чтобы с уверенностью учитывать показатель ВЭМИ для идентификации изменений в эндоскопических биоп-татах. Полученные результаты в целом согласуются с данными других исследователей [Берестова, 1988], но если в теоретическом отношении они и представляют определенный интерес, то значение их для патологоанатоми-ческой практики оставляет желать лучшего. Поэтому, учитывая гетероморфность ВЭМ, разработав новый простой метод окраски ДНК, посредством которого хорошо идентифицируются их разные формы, мы проанализиро-

вали количественные соотношения последних при различных процессах.

Внутриэпителиальные мононуклеарные лейкоциты

Всего в эпителии, при окраске на ДНК оригинальным методом, на основании светооптической морфологической характеристики их было выделено 5 форм, обозначенных, как: 1) моноцит - имеет крупное бобовидное ядро и широкий хорошо видимый ободок светлой цитоплазмы; 2) лимфоцит малый - клетка с небольшим округлым ги-перхромным ядром и неразличимой при световой микроскопии цитоплазмой; 3) лимфоцит средний - по диаметру в 1,5-2 раза больше малого, ядро его, округлое или овальное, окрашено бледнее, цитоплазма в виде узкой полосы; 4) лимфоцит большой - в поперечнике в 2,5-3 раза больше малого, ядро его округлое или овальное, цитоплазма в виде широкой полосы; 5) лимфоцит активированный - по размеру подобен среднему, имеет неправильную форму, широкую полосу цитоплазмы и комковатое ("церебриформное", либо "скрученное") ядро с изрезанным контуром и конденсацией хроматина вблизи ядерной мембраны.

Оказалось, что как в желудке, так и в толстой кишке при всех изученных процессах в эпителии преобладают малые и средние лимфоциты (табл. 5 и 6), что близко к данным [Davies и Parrot, 1981].

Меньше всего в эпителии содержится моноцитов и больших лимфоцитов. Что касается особой группы так называемых активированных лимфоцитов, то число их в эпителии тубулярных опухолей обоих органов в целом соответствует его пролиферативной активности, за исключением того, что заметно снижено в аденомах с тяжелой дисплазией эпителия. Моноциты в тубулярных структурах и желудка и толстой кишки в наибольшем количестве находятся в аденомах с умеренной дисплазией эпителия. Поэтому в тубулярных структурах с дисплазированным эпителием повышенное содержание активированных лимфоцитов при низком содержании моноцитов можно считать неблагоприятным прогностическим признаком.

Таблица 5

Соотношение различных видов внутриэпителиальных мо-нонуклеарных лейкоцитов желудка (на 10 ООО эпителио-цитов)_

Лимфоциты

Патологический процесс п о. ь У й а ^ |моноциты малые ¡средние большие активир.

Хронический антральный 9 М 9,1 75,6 108,2 15,3 19,1

гастрит ш 2,2 13,5 11,2 3,7 2,9

Гиперпластический полип 5 М 14,8 66,1 121,4 12,7 34,1

ш 3,7 8,2 18,5 5,0 5,8

Тубулярная аденома 6 М 23,8 66,6 126,0 31 ,4 43,0

т 6,6 8,4 13,9 8,1 10,8

Тубулярная аденома с тяжелой 8 М 12,3 88,2 137,7 21 ,7 26,6

длсплазией эпителия т 3,4 8,1 17,0 4,2 10,5

Тубулярная аденокарцинома 7 М 8,9 101,4 112,6 14,8 78,0

т 3,0 19,6 14,1 4,6 10,9

М - среднее арифметическое, гп - стандартная ошибка, п -число наблюдений, активир. - активированные.

Таблица 6

Соотношение различных видов внутриэпителиальных мо-нонуклеарных лейкоцитов толстой кишки (на 10 ООО эпи-телиоцитов)_

Патологический процесс и |параметр Моноциты Лимфоциты

Г малые 1 средние большие активир.

Хронический неязвенный колит 5 М 8,8 101,1 131,6 32,4 48,1

ш 2,8 18,8 26,1 14,7 12,4

Гиперпластический полип 4 М 5,2 63,2 40,7 9,5 19,0

ш 2,0 14,0 6,2 2,1 5,7

Тубулярная аденома 1 1 М 20,2 96,5 106,5 16,4 57,8

ш 3,8 13,8 8,2 4,1 7,0

Тубулярная аденома с тяжелой диснлазией эпителия 8 М 8,1 98,2 95,2 16,7 16,8

ш 1,7 17,8 13,1 2,5 4,9

Тубулярная аденокарцинома 6 М 2,9 129,5 69,7 38,2 70,2

171 1,3 14,1 6,6 11,7 15,7

Ворсинчатая аденома 13 М 8,5 47,4 87,8 11,1 54,4

т 1,6 9,4 11,9 2,3 8,4

Ворсинчатая аденома с тяжелой дисплазией эпителия 4 М 24,4 160,0 295,6 35,0 117,1

т 6,5 15,2 14,9 16,7 2,9

М - среднее арифметическое, т - стандартная ошибка, п -число наблюдений, активир. - активированные.

Нами установлено, что ворсинчатые опухоли толстой кишки принципиально отличаются от тубулярных аналогов соотношением различных форм ВЭМ. Тем самым подтверждается их особый статус, что соответствует данным Яковлевой [1983] и согласуется с представлениями Самсо-нова [1989] в отношении аналогичных опухолей желудка.

Плазмоциты в слизистой оболочке желудка и толстой кишки

Как уже отмечалось выше, для всех изученных процессах характерно постоянное присутствие плазмоцитов в строме, в том числе в субэпителиальнойзоне. Оказалось, что тяжелая дисплазия эпителия в тубулярных опухолях характеризуется достоверным возрастанием числа ПФК, прилежащих к эпителию, а также свободно расположенных в строме (табл. 7).

Таблица 7

Пиронинофильные клетки в слизистой оболочке желудка и толстой кишки

Патологический процесс п %„ ПЭ ПФК ПФК стромы

Хронический антральный гастрит 7 М 16,1 260,9

т 4,6 27,6

Хронический неязвенный колит 5 М 13,8 170,0

т 7,6 38,4

Гиперлластический полип 4 М 12,0 217,0

т 1,6 18,8

Тубулярная аденома 5 М 9,8 249,0

т 2,4 87,2

Тубулярная аденома с тяжёлой дисплазией эпителия 8 М 43,5 451,9

т 9,4 40,9

Тубулярная аденокарцинома б М 8,0 333,7

т 1,7 32,5

Ворсинчатая аденома 6 М 18,3 363,7

га 3,3 33,9

Ворсинчатая аденома с тяжёлой дисплазией эпителия 4 М )6,0 364,0

т 3,5 34,0

л - число наблюдений, М - среднее арифметическое, т -стандартная ошибка, ПЭ ПФК - на 1000 клеток эпителия, ПФК стромы - на 1000 клеток стромы

Т.е. и по названным признакам тубулярная аденома : тяжелой дисплазией занимает особое положение в ряду 1зученных патологических процессов, что в общем согла-:уется с данными других исследователей [Дикштейн и :оавт., 1984, Фаустов и Холлани, 1994].

Следует отметить, что при ультраструктурном и им-луногистохимическом анализе процессов в ряду: плоско-слеточная метаплазия - дисплазия - плоскоклеточный рак пейки матки [Петров и соавт., 1995], было также опреде-1ено особое место дисплазии. Подтверждаются нами и вы-юды сделанные выше в отношении ворсинчатых опухо-гей: последние отличаются от аналогичных тубулярных и ю количеству ПФК обеих групп, причем ворсинчатая щенома с тяжелой дисплазией эпителия по числу ПФК шалогична тубулярной аденокарциноме. Регрессионный шализ показал наличие корреляции между соответствующими группами пиронинофильных клеток. Коэффициент корреляции - 0,57.

Проведенный нами анализ клеток стромы, содержащих иммуноглобулины М, G и А показал, что только хронический антральный гастрит отличается от прочих процессов в желудке, а также от колита более высоким содержанием в очаге патологического процесса клеток, несущих IgM (табл. 8).

Тубулярные аденомы с тяжелой дисплазией эпителия имеют наименьшие значения суммарного числа клеток с иммуноглобулинами, и хотя различия достоверны только по сравнению с хроническим антральным гастритом и ги-яерпластическим полипом, но обнаруженная особенность ае согласуется со свойственным опухолям данного типа достоверно максимальным количеством пиронинофильных клеток.

Такая диссоциация признаков может быть обусловлена несколькими причинами: один плазмоцит может вырабатывать иммуноглобулины нескольких классов [Пол, 1987; Купер и соавт., 1987; Тил и Клинман, 1988], не все иммуноглобулин содержащее клетки являются плазмоци-гами и не все пиронинофильные клетки являются продуцентами антител, т.к. пиронинофилия клеток связана с

усиленным синтезом не только иммуноглобулинов, но и других белков.

Таблица 8

Иммуноглобулинсодержащие клетки слизистой оболочки желудка и толстой кишки (в тыс.кл. на 1 кв.мм. площади среза)

Патологический процесс п Параметр 1« м I* О 1й А Сумма

Хронический антральный гастрит 18 М 9,0 1,4 5,4 15,8

ш 1,1 0,2 0,5 1,2

Хронический и с я з в е кн ы й колит 4 М 4,9 3,1 4,0 12,0

т 1,1 1,2 1 ,4 2,2

Гиперпластический полип 10 М 5,2 1 ,3 5,5 12,0

т 1,0 0.3 1,2] 1,5

Тубулярная аденома 9 М 4,6 1,3 4,0 10,0

т. 0,5 0,3 1 ,о 1,2

Тубулярная аденома с тяжёлой дисплазией эпителия 6 М 2,8 1,2 3,6 7,5

ш 0,5 0,2 0,6 0,9

Тубулярная адсиокарцинома 12 М 4,7 1,6 4,0 10,3

т 1,0 0,3 1,0 1,4

п - число наблюдений, М - среднее арифметическое, т -стандартная ошибка

Таким образом, все исследованные патологические процессы в желудке и толстой кишке так или иначе отличаются друг от друга показателями пролиферации эпителия и местной иммунной реакции. В частности, при хроническом воспалении констатируется самая низкая частота патологических митозов эпителиоцитов, а при хроническом антральном гастрите - еще и большее содержание клеток с ^М в собственной пластинке слизистой. Для гиперпластических полипов свойственны самые минимальные значения МИ эпителия и инфильтрации последнего всеми типами мононуклеарных лейкоцитов. Тубулярна* аденома с умеренной дисплазией эпителия характеризуется наибольшим содержанием в нем моноцитов. Тубуляр ная аденома с тяжелой дисплазией эпителия выделяете*

довольно высокими МИ и частотой патологических митозов, максимальным содержанием ПФК вблизи эпителия и во всей строме при минимальном количестве активированных ВЭЛ. Особенностями аденокарцином являются максимальные значения МИ и частоты патологических митозов, а также количества активированных лимфоцитов при минимальном наличии моноцитов в эпителии. Ворсинчатая аденома толстой кишки в отличие от своего ту-булярного аналога с умеренной дисплазией эпителия имеет в паренхиме меньше моноцитов и малых лимфоцитов, а с тяжелой - напротив содержит в эпителии больше моноцитов и лимфоцитов всех форм. Кроме того, ворсинчатые аденомы толстой кишки по показателям митотиче-ского режима эпителия и количеству ПФК в строме и паренхиме близки к аденокарциноме.

Выводы

1. Из показателей митотического режима наибольшей информативностью для диагностики опухолей желудка и толстой кишки обладают митотический индекс, частота патологических митозов и особенно форм последних, связанных с повреждением митотического аппарата клетки (рассеивание хромосом в метафазе, моноцентрический митоз, трехгрупповая метафаза, асимметрический митоз).

2. Из показателей клеточной инфильтрации наибольшую информативность для диагностики опухолей желудка и толстой кишки имеют количество внутриэпители-альных монояуклеарных лейкоцитов, особенно их активированных форм (размерами со средний лимфоцит, но отличающихся неправильной формой, более широкой полосой цитоплазмы и комковатым ядром с изрезанным контуром и конденсацией хроматина вблизи ядерной мембраны).

3. Соотношение форм внутриэпигелиальных моно-нуклеарных лейкоцитов в эпителии . желудка и толстой кишки варьирует при патологических процессах с разной степенью пролиферации и дисплазии эпителия.

4. Тубулярные аденомы с тяжелой дисплазией эпителия желудка и толстой кишки отличаются от состояний

с меньшей степенью дисплазии и от аденокарцином максимальным содержанием ПФК вблизи эпителия и в стро-ме при минимальном количестве активированных ВЭЛ, что свидетельствует об их особом статусе, отражающем стадию канцерогенеза.

5. При тяжелой дисплазии тубулярного эпителия в желудке и толстой кишке о плохом прогнозе свидетельствует следующая совокупность морфологических признаков: митотический индекс выше 35%о в желудке и 63%о в толстой кишке, количество патологических митозов превышает 21%, активированных внутриэпителиальных лимфоцитов больше 6%о, а моноцитов меньше 1%о.

6. Ворсинчатые аденомы толстой кишки с тяжелой дисплазией эпителия по показателям митотического режима эпителия и количеству ПФК вблизи эпителия в строме и близки к аденокарциномам.

Практические рекомендации:

1. При тяжелой дисплазии тубулярного эпителия в желудке и толстой кишке в подозрительных на малигни-зацию случаях следует определить митотический индекс и частоту патологических митозов, а также количество различных форм внутриэпителиальных мононуклеарных лейкоцитов, особенно активированных.

2. В случае тубулярной опухоли следует диагностировать аденокарциному, если митотический индекс эпителия выше 35%о в желудке и 63%0 в толстой кишке, количество патологических митозов превышает 21%, активированных внутриэпителиальных лимфоцитов больше 6%о, а моноцитов меньше 1%о.

3. Способ блокады активных групп в гистологических срезах:

Гистологические срезы при комнатной температуре выдержать в 5-10% растворе соляной кислоты в 96% этаноле. При экспозиции 6 суток остаются ^заблокированными ДНК и РНК, а 12 суток - только ДНК. Блокада обратима - снимается омылением в растворе щелочи.

4. Способ выявления нуклеиновых кислот в гистологических срезах:

1) Провести блокаду активных групп (см. выше п.З.).

2) Срезы поместить в 96% этанол на 10-15 минут (время, необходимое для выполнения пп. 3) и 4).

3) Приготовить свежедиазотированный парарозани-лин [Берстон, 1965].

4) Смешать свежедиазотированный парарозанилин с боратным буфером (рН=8,6) в соотношении 2 капли на 5 мл растворов соответственно.

5) Погрузить срезы из 96% этанола в приготовленный раствор на 10-15 минут.

6) Приготовить раствор следующего состава: 30 мг резорцина растворяли в 0.25 мл диметилформамида, ди-метилсульфоксида или ацетона, добавляли 20 мл боратно-го буфера с рН=8.6.

7) Сполоснуть срезы в боратном буфере с рН=8.6 (2-3 секунды).

8) Погрузить срезы в приготовленный (см. п. 6) раствор резорцина на 5-10 минут.

9) Срезы промыть в дистиллированной воде, обезводить, просветлить и заключить в бальзам.

Места локализации нуклеиновых кислот при данном подборе реагентов окрашиваются в красно-коричневый цвет.

Список работ, опубликованных по теме

диссертации:

1. Изменение содержания мононуклеаров и пиронино-фильных клеток в эпителии пищеварительного тракта при его пролиферации /К.И.Панченко, А.С.Надежин, А.Е.Блинов, М.Ю.Вершинина, К.А.Хлопова //Российские морфологические ведомости. - 1994. - N 4. - С. 58-58.

2. Надёжин A.C. Зависимость пиронинофильноклеточной инфильтрации слизистой оболочки пищеварительного тракта от воспалительных и пролиферативных процессов в ней //Системные васкулиты, системная красная волчанка. Критерии диагностики и активности: Матер.

симпоз. 19-21 октября 1993 г. - Ярославль, 1994. - С. 102-103.

3. Надёжин A.C. Иммуноглобулинсодержащие клетки слизистой оболочки желудка и толстой кишки при воспалительных и пролиферативных процессах // Современные проблемы ревматологии: Матер, науч.-практ. конф. - Ярославль, 1994. - С. 88-88.

4. Надежин A.C., Панченко К.И., Политов В.Я. Лимфо-цитарно-эпителиальные отношения и митотический режим опухолей толстой кишки и окружающей их слизистой //Абдоминальная хирургия (диагностика, лечение): Сб. науч. тр. Ярославского гос. мед. ин-та. Ярославль, 1993. - С. 67-70.

5. Надёжин A.C. Пролиферативная активность эпителия и клеточная инфильтрация его при гастрите, колите, полипозах и раках желудка и толстой кишки //Яросл. гос. мед. ин-т. - Ярославль, 1995. - 10 с. - Деп. в ГЦНМБ. - 1995. - № Д-24842 от 17.11.1995г.

6. Особенности лимфоцитарной инфильтрации и митотический режим эпителиев разного генеза /К.И.Панченко, Ю.А.Кудачков, А.В.Саприцкий, А.С.Надежин, С.В.Панченко, Ю.Н.Виноградов, С.А.Туманова //Морфология (архив анатомии, гистологии и эмбриологии. - 1993. - Т. 105, вып. 9-10. - С. 127127.

7. Панченко К.И., Надежин A.C., Хлопова К.А. Способ выявления нуклеиновых кислот в гистологических срезах // Яросл. гос. мед. акад. - Ярославль, 1996. - 7 с. - Деп. в ГЦНМБ. - 1996. -М» Д-25153 от 29.04.1996г.