Автореферат и диссертация по медицине (14.01.23) на тему:Значение молекулярных маркеров в прогнозе послеоперационного пиелонефрита у больных коралловидным нефролитиазом (клиническое исследование)

Гражданов Роман Александрович

Значение молекулярных маркеров в прогнозе послеоперационного пиелонефрита у больных коралловидным нефролнтиазом

14.01.23-урология 14.03.10 -клиническая лабораторная диагностика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

- 8 ДЕК 2011

Саратов-2011

005006576

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Саратовский государственный медицинский университет имени В.И.Разумовского» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

Научные руководители:

член-корреспондент РАМН, профессор доктор медицинских наук, профессор

Петр Витальевич Глыбочко; Наталья Борисовна Захарова.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор доктор медицинских наук, профессор

Владимир Васильевич Кузьменко; Зураб Леванович Девдариани.

Ведущее учреждение:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

Защита состоится «_»_2011 года в_часов на заседании

диссертационного совета Д 208.094.01 при ГБОУ ВПО Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского Минздравсоцразвития России по адресу: 410012, г. Саратов, ул. Большая Казачья, 112.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского Минздравсоцразвития России.

Автореферат разослан «_»_2011 года.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

Маслякова Г. Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Мочекаменная болезнь (МКБ) занимает одно из ведущих мест в структуре урологических заболеваний (в среднем по России 34,2%) и также, как и другие заболевания почек, имеет большое социальное значение.

Среди больных с МКБ коралловидный нефролитиаз (КН) встречается в 27,3% случаев (Лопаткин H.A., Яненко Э.К.,2000; Лоран О.Б., 2008). Заболевание отличается тяжестью течения, обусловленной сопутствующими пиелонефритом и хронической почечной недостаточностью. Пиелонефрит при КН, переходящий в стадию активного воспаления, вызывает развитие тубулоинтерстициальных изменений в ткани почек, которые, в конечном счете, приводят к формированию интерстициального фиброза, атрофии канальцевого эпителия и развитию почечной недостаточности (Шилов Е.М., Мухин H.A.,2002; Нанчикеева М.Л.и соавт.,2004; Leiske J.C., Toback F.G., 2000).

Тяжесть осложнений, злокачественное течение, быстрое рецидивирование, преимущественное поражение лиц молодого и наиболее трудоспособного возраста, 30- 50 лет, делают крайне актуальными вопросы диагностики и лечения КН и его осложнений (Дутов В.В. 2000; Тиктинский ОЛ., Александров В.П.,2000; Лопаткин H.A. Дзеранов Н.К., 2003).

В настоящее время благодаря внедрению в диагностическую практику новых клинико-лабораторных, биохимических, иммунологических, инструментальных, ультразвуковых, рентгеноурологических, радиоизотопных (ренография, сканирование почек) и специальных (пункционная биопсия почек, ангиография почечных сосудов и др.) методов исследования, существенно повысилось качество диагностики повреждения почечной паренхимы.

Вместе с тем, несмотря на широкое внедрение современных технологий в диагностику поражения почек при калькулезных пиелонефритах, одной из основных проблем лечения заболевания остается раннее выявление структурно-функциональных изменений в почках, приводящих к поражению почечной паренхимы и развитию почечной недостаточности. К одному из перспективных

А'

з О

направлений в диагностике повреждения паренхимы почек при калькулезных пиелонефритах можно отнести исследование молекулярных маркеров. В их число наряду с креатинином сыворотки крови, скорости клубочковой фильтрации, входят целый ряд сигнальных молекул, цитокинов, хемокинов, факторов роста и ряда белков, выделяемых с мочой. По прогнозам, ряд «мочевых маркеров» в ближайшем будущем потеснит основные лабораторные показатели повреждения паренхимы почек.

Цель исследования: улучшить диагностику и выявить факторы прогноза развития послеоперационного пиелонефрита у больных коралловидным нефролитиазом при различных вариантах хирургического пособия.

Задачи исследования:

1.Установить диагностическое и прогностическое значение нарастания экскреции с мочой провоспалительных цитокинов у больных коралловидным нефролитиазом, осложненным пиелонефритом.

2.Определить особенности структурных изменений паренхимы почек у больных коралловидным нефролитиазом, осложненным пиелонефритом.

3. Уточнить степень соответствия повреждений паренхимы почек, ассоцированных с избыточной продукцией провоспалительных интерлейкинов, с изменением показателей поражения тубулярного, гломерулярного аппаратов и сосудистого русла ткани почек (л-глутатион в-трансфераза и коллаген IV типа мочи, оксид азота, эндотелии-1,фактор роста эндотелия сосудов сыворотки крови) у больных коралловидным нефролитиазом.

4. Установить значение уровней экскреции с мочой провоспалительных цитокинов в прогнозе развития послеоперационного пиелонефрита у больных коралловидным нефролитиазом при различных видах оперативного лечения.

Научная новизна исследования. Впервые проведено сопоставление структурных изменений почечной паренхимы и содержания биомаркеров воспаления в моче и сыворотке крови у больных КН. Показаны диагностическое и прогностическое значения при обострении пиелонефрита, подъема в моче

содержания основных провоспалительных цитокинов. Установлено, что у больных КН при обострении заболевания для оценки тяжести воспалительног о процесса в почечной паренхиме наибольшее диагностическое значение имеет определение содержания в моче Ил-8.

Впервые показана взаимосвязь развития воспалительных изменений в почечной паренхиме у больных КН с изменением уровня биомаркеров повреждения тубулярного эпителия, эндотелиальной дисфункции и активации ангиогенеза (нарастание содержания в моче 7с-глутатион-8-трансферазы, снижение концентрации оксида азота, увеличение уровня ФРЭС, эндотелин-1 в сыворотке крови).

Впервые показано, что исследование содержания Ил-8 в моче у больных КН может быть рекомендовано в качестве прогностического показателя обострения пиелонефрита в послеоперационном периоде при дистанционной ударно-волновой литотрипсии, нефролитолапаксии, открытых оперативных вмешательствах.

Практическая значимость результатов исследования. В диагностике обострения пиелонефрита у больных КН обосновано исследование содержания в моче Ил-8. Установлено, что исследование содержания Ил-8 в моче у больных КН является прогностически значимым показателем обострения пиелонефрита после таких оперативных вмешательств, как литотрипсия, нефролитолапаксия, открытые оперативные вмешательства. Количественное определение Ил-8 мочи является высокочувствительным и неинвазивным показателем при выборе тактики оперативного лечения больных КН, осложненным пиелонефритом.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Структурные изменения почечной паренхимы у больных КН с латентной формой калькулезного пиелонефрита связаны с повреждением тубулярного эпителия и сопровождаются подъемом содержания в моче провоспалительных цитокинов.

2. У больных КН при обострении пиелонефрита развивается достоверный подъем основных провоспалительных цитокинов в моче. Наиболее высокую чувствительность и специфичность имеет подъем содержания ИЛ-8 в моче.

3. Развитие воспалительных изменений в почечной паренхиме у больных КН сопровождается изменением показателей повреждения тубулярного эпителия, эндотелиальной дисфункции и ангиогенеза (нарастание содержания в моче я-глутатион-Б-трансферазы, снижение концентрации оксида азота, увеличение уровня эндотелии-1, ФРЭС в сыворотке крови).

4. Исследование уровня ИЛ-8 в моче у больных КН является показателем прогноза развития послеоперационного пиелонефрита и может быть рекомендовано при выборе вида оперативного вмешательства (дистанционная ударно-волновая литотрипсия, нефролитолапаксия, открытые оперативные вмешательства).

Внедрение результатов исследования. Материалы исследования используются в практической работе НИИ фундаментальной и клинической урологии и нефрологии; кафедр урологии; клинической лабораторной диагностики; ЦНИЛ ГБОУ ВПО Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского Минздравсоцразвития России и клинической больницы им.С.Р. Миротворцева ГОУ ВПО Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского Минздравсоцразвития России. Полученные результаты и практические рекомендации используются при проведении занятий на кафедрах урологии, клинической лабораторной диагностики, патологической физиологии ГБОУ ВПО Саратовский ГМУ им.В .И. Разумовского Минздравсоцразвития России.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены на конференциях молодых ученых ГБОУ ВПО Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского Минздравсоцразвития России (Саратов, 2009, 2010); на заседании НИИ фундаментальной и клинической урологии и нефрологии ГБОУ ВПО Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского Минздравсоцразвития России (Саратов, 2010, 2011); на общероссийской научно-практической конференции Первый МГМУ им.И.М.Сеченова «Обеспечение доступности современных лабораторных исследований: аналитические возможности, клинические потребности, организационно-экономические условия» (Москва,2011).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 научных работ, из них 4 в изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 128 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, глав результатов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и практических рекомендаций. Фактические данные иллюстрированы 46 рисунками и 30 таблицами. Список литературы включает 291 источник (124 отечественных и 167 иностранных). Все материалы, представленные в диссертации, получены, обработаны и проанализированы лично.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

При проведении исследования были обследованы 115 человек. Среди них 30 практически здоровых лиц в возрасте от 25 до 45 лет 15 мужчин и 15 женщин, составивших контрольную группу; 70 пациентов, проходивших лечение в клинике урологии Клинической больницы им.С.Р.Миротворцева, НИИ фундаментальной и клинической урологии и нефрологии ГБОУ ВПО Саратовский ГМУ им.В.И,Разумовского Минздравсоцразвития России с 2008 по 2010 год, имевших характерные клинические проявления КН. Из них с осложненным латентным пиелонефритом обследованы 45 лиц; с обострением хронического пиелонефрита - 25 человек (табл. 1); группу сравнения составили 15 пациентов с хроническим циститом.

Критерии включения пациентов в исследование - наличие у пациентов КН подтвержденного инструментальными исследованиями (компьютерная томография почек, ультразвуковая диагностика мочевыводящих путей, обзорная и экскреторная урография, радиоизотопная ренография); все пациенты после постановки диагноза и до начала хирургического лечения; размеры конкрементов составляли от 2 до 7 сантиметров (К 1-3 стадии).

Критерии исключения пациентов из исследования - коралловидный нефролитиаз 4-й степени (К-4); отказ пациента от участия в исследовании; доказанный врожденный или приобретенный иммунодефицит; заболевания крови и злокачественные новообразования в анамнезе; пациенты с другими формами мочекаменной болезни; пациенты с выявленными онкоурологическими заболеваниями любой локализации.

Пациентам проводили комплексное обследование, включавшее изучение жалоб и сбор анамнеза, лабораторные анализы. Ренгенологические исследования начинали с обзорного снимка мочевых путей, затем проводили экскреторную урографию с выполнением при необходимости отсроченных снимков. Исследования выполняли на аппарате «Medics-R-Amico» (Россия-Италия). Для уточнения морфологических изменений выполняли ультросонографию (УЗИ) на аппарате «Medison CD SA 9900» (Корея). Изотопная ренография осуществлялась с 131 I-гиппраном на эмиссионном компьютерном гамма-томографе DIACAM фирмы Sirnens (Германия). Пошаговую, спиральную и мультиспиральную компьютерную томографию (МСКТ) с реконструкцией изображения, магнитно-резонансную томографию (МРТ) осуществляли на аппарате «Asteion S4 Toshiba» (Япония).

Таблица 1

Распределение больных КН по степени клинико-лабораторных проявлений активности пиелонефрита

Группы обследованных Количество пациентов %

Контрольная группа 30 100%

Больные с латентным хроническим пиелонефритом 25 35,7%

Больные с обострением хронического пиелонефрита 45 64,3%

У 25 больных КН взятие крови и мочи выполняли одновременно с проведением интраоперационной биопсии почек. Материал для гистологического исследования фиксировали в 10%-ном нейтральном водном растворе формалина. Затем обезвоживали кусочки исследуемых органов в спирте и помещали их в парафин по общепринятой методике; изготавливали срезы толщиной 5-7 мкм. Срезы окрашивали растворами гематоксилина Эрлиха и водно-спиртовым эозином, по Ван Гизону.

Проводили морфологическое исследование ткани почек с определением степени выраженности воспалительных изменений интерсгиция, а также значимости изменений эпителия канальцев. Изучение микроструктурных препаратов и их фотографирование осуществляли с использованием комбинированной автоматизированной платформы системы Ariol SL50 (Genetix), которая обеспечивала высокую производительность процессов визуализации, анализа и гистометрии. Система позволяла анализировать препараты как в проходящем свете, так и с помощью методов флуоресценции; осуществлялся многокомпонентный анализ окрашенных препаратов, проводили оценку результатов иммунохимических, иммунофлуоресцентных тестов и реакций флуоресцентной гибридизации in situ (FISH).

С помощью системы Ariol SL50 была оценена общая площадь рубцово-склеротических изменений вокруг клубочков, сосудов и канальцев, инфильтратов из полиморфно-ядерных лейкоцитов, лимфоцитов и плазматических клеток и устанавливали соотношение изменений в паренхиме почек, характерных для старого процесса и свежих воспалительных изменений.

При исследовании молекулярных маркеров взятие крови проводили у пациентов натощак в утренние часы из кубитальной вены. С целью стандартизации использовали пробирки для забора крови «Vacuette»; для исследования сыворотки крови применялись пробирки с активатором свертывания (кремнеземом) и разделительным гелем, образующим барьер между сывороткой и свернувшейся кровью после центрифугирования. Для определения молекулярных маркеров в моче осуществляли сбор утренней первой порции мочи в специальные стаканы с крышками для сбора мочи. Полученные аликвоты сыворотки крови и мочи размещали в пробирках с крышками «Эппендорф» и хранили до проведения исследования при t - 25°С,

Определение содержания основных про- и противоспалительных цитокинов интерлейкинов - Ил-1Э,Ил-6,Ил-8,Ил-10 в моче проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием наборов реактивов фирм Вектор-Бест (Новосибирск, РФ). Результаты выражали в пг/мл.

Определение содержания в моче л-Глутатион S-транферазы, коллагена IV типа в моче проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием реактивов фирм ВСМ Diagnostics. Результаты выражали в пг/мл.

Определение содержания в сыворотке крови ФРЭС, ЭТ-1 и NO осуществляли методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием реактивов фирм«Веп<1ег MedSystems» ,ВСМ Diagnostics, R&D Sistems Total NO/Nitrite/Nitrate Assay (США). Результаты выражали в пг/мл, ЭТ-1 - в фмоль/мл, N0 - в мкмоль/л (табл.2).

Таблица 2

Производители наборов реактивов для количественного определения биомаркеров

Показатели Фирма - производитель

Интерлейкин 1р(мочи) ЗАО» Вектор Бест» (Новосибирск, Россия)

Интерлейкин8 (мочи) ЗАО» Вектор Бест» (Новосибирск, Россия)

Интерлейкин 6 (мочи) ЗАО» Вектор Бест » (Новосибирск, Россия)

Интерлейкин 10 (мочи) ЗАО» Вектор Бест » (Новосибирск, Россия)

л-Глутатион я-транфераза (мочи) ВСМ Diagnostics (США)

Коллаген 1У типа (мочи) ВСМ Diagnostics (США)

Окись азота (сыворотка крови) ВСМ Diagnostics (США)

Эндотелин-1 (сыворотка крови) Biomedica group (Австрия)

Фактор роста эндотелия сосудов (сыворотка крови) Bender Medsystems(ABCTpiw)

Методы статистической обработки результатов исследования. Для статистического анализа данных применяли программу STATISTICA v.6.0 и STATGRAPHICS Plus for Windows. Для определения диагностической значимости показателей выполняли статистическую процедуру дисперсионного анализа ANOVA (One-Way Analysis of Variance), включавшую как параметрические, так и непараметрические методики (ранговый анализ вариаций Краскела-Уоллиса и медианный тест). В качестве критерия достоверности отличия между двумя независимыми группами использовался непараметрический критерий (U) Манна-Уитни. Во всех процедурах статистического анализа принимали уровень значимости р<0,05.

Чувствительность и специфичность результатов исследования таких показателей, как провоспапительные цитокины мочи, определяли с помощью построения характеристической кривой (ROC-анализ) при разных точках разделения значений лабораторных показателей (Власов В.В., 1988). Для выявленных методом ROC-анализа эффективных диагностических показателей построены кривые зависимости чувствительности и специфичности от уровня точки отсечения Информативность показателя оценивали по величине площади под кривой (AUC).

Результаты исследования

У всех обследованных пациентов КН с клиническими признаками хронического пиелонефрита и его обострением при проведении морфологического и морфометрического исследований почечных биоптатов выявлены разной степени выраженности признаки фиброза и воспалительной инфильтрации, представленной преимущественно лимфоцитами и плазмоцитами. Изменения почечных канальцев характеризовались расширением их просвета, уплощением эпителиальной выстилки; на отдельных участках наблюдалось слущивание эпителия в просвет канальцев. В клетках эпителия канальцев отмечали признаки дистрофии, вплоть до некробиотических изменений. Наибольшее скопление инфильтратов выявлялось вокруг канальцев, в экстрацеллюлярном матриксе мозгового и коркового слоев в ткани почек. Нарастание воспалительной инфильтрации происходило главным образом по ходу канальцев и сосудистого русла (рис. 1,2).

Рис.1.

Окр. Г.Э. Воспалительный инфильтрат в стороме. Биоптат больного Ш. с обострением калькулезного пиелонефрита.

Рис.2.

Окр. Ван Гизон. Склероз клубочка, дистрофия и слущивание в просвет канальцев

эпителия, воспалительные инфильтраты. Биоптат больного А. вне обострения калькулезного пиелонефрита

При оценке общей площади рубцово-склеротических изменений вокруг клубочков, сосудов и канальцев, инфильтратов из полиморфно-ядерных лейкоцитов, лимфоцитов и плазматических клеток с применением системы Апо1 установлено значимое увеличение площадей изменений в паренхиме почек, характерных для воспалительных изменений и фиброза.

Морфометрическое исследование с помощью системы Апо1 препаратов, окрашенных по Ван Гизону, показало, что у пациентов с обострением хронического калькулезного пиелонефрита происходит достоверное увеличение как объёмных долей (ОД) рубцовой соединительной ткани паренхимы почек (р<0,001), так и ОД инфильтратов из лимфоидных и плазматических клеток. Соотношение ОД рубцовой соединительной ткани к ОД инфильтратов из лимфоидных и плазматических клеток составляло 3,18 ед. в микропрепаратах биоптатов пациентов с хроническим калькулезным пиелонефритом. У пациентов с обострением хронического калькулезного пиелонефрита соотношение ОД рубцовой соединительной ткани к

12

ОД инфильтратов из лимфоидных и плазматических клеток было более низким -2,28 ед. Таким образом, при оценке общей площади рубцово-склеротических изменений вокруг клубочков, сосудов, канальцев и инфильтратов из полиморфно-ядерных лейкоцитов, лимфоцитов и плазматических клеток с применением системы Апо1 БЬ50 установлено их значимое увеличение в паренхиме почек. Нарастание размеров инфильтратов и площади фиброзных изменений в ткани почки выявлено у больных КН с обострением пиелонефрита, то есть, результаты морфометрических исследований с применением системы Апо1 БЬ50 могут быть использованы для прогноза степени восстановления функции почек при длительном существовании препятствия оттоку мочи в виде камня после оперативного вмешательства, а также для оценки эффективности других методов активного лечения мочекаменной болезни.

К одной из наиболее значимых характеристик обострения пиелонефрита у больных КН может быть отнесено нарастание содержания основной группы провоспалительных цитокинов в моче. Сопоставление результатов количественного определения содержания основных провоспалительных цитокинов в моче с результатами морфологического и морфометрического исследований биоптатов больных КН показало, что подъем их уровня является одной из характеристик выраженности воспалительного процесса в мочевыводящих путях (табл.3, рис.3). Нарастание содержания в моче провоспалительных цитокинов у больных с обострением капькулезного пиелонефрита было сопоставимо с увеличением количества воспалительных инфильтратов в паренхиме почек и степенью повреждения эпителиальной выстилки мочевых канальцев. По-видимому, внедрение патогенных микроорганизмов в мочевыводящие пути сопровождается развитием воспалительного процесса на уровне эпителиальной выстилки мочевыводящих путей, проявлением которого становится выброс в мочу, таких провоспалительных цитокинов как Ил-1Р, Ил-6 и Ил-8. Они становятся одними из основных активаторов дальнейшего развития тубулоинтерстициапьного воспаления.

Таблица 3

Цитокиновый профиль мочи больных хроническим калькулезным пиелонефритом вне обострения и при обострении воспалительного процесса

Группы обследованных Ил-1(3 (пг/мл) Ил-6 (пг/мл) Ил-8 (пг/мл) Ил-10 (пг/мл)

Больные с обострением хронического калькулезного пиелонефрита 1,96 [1; 7,5 ] 20,83 [5,3; 86,7] 298,2 [189,1; 383,3] 10,5 [6; 21]

Больные вне обострения хронического калькулезного пиелонефрита 1,1 [0,2; 7,3] Г 9,4 [2; 24,5] 74,6 [23,5; 291,5] 18 [6; 37]

Достоверность* (Р) j >0,05 >0,05 0,0015 >0,05

Примечание: по критерию Манна-Уитни (и).

9000% 8000% 7000% 6000% 5000% 4000% 3000% 2000% 1000% 0%

. ■ ■

I

...

В 1

Ш 2

□ 3

□ 4

иги

ИЛ6

ИП8

Рис. 3. Провоспалительные цитокины мочи в процентах от величины нормы у больных хроническими воспалительными заболеваниями мочевыводящих путей: 1 - контрольная группа; 2 - больные с циститом; 3 - больные с латентным хроническим пиелонефритом; 4 - больные с обострением хронического пиелонефрита.

Как видно из полученных данных, наиболее значимым подъем содержания провоспалительных цитокинов в моче был у больных КН с обострением калькулезного пиелонефрита. У больных с циститами и с латентной формой калькулезного пиелонефрита имело место менее выраженное нарастание уровня провоспалительных цитокинов в моче. Наиболее значительным у больных КН с латентной формой пиелонефрита и при его обострении был подъем содержания ИЛ-8 в моче. Изменение уровня противовоспалительного цитокина - Ил-10 в моче у больных КН не было связано с обострением хронического пиелонефрита.

Диагностическое значение исследования содержания провоспалительных цитокинов в моче при хроническом и остром калькулезном пиелонефрите установлено с помощью построения характеристических кривых (ЯОС-анализ) (рис.4,5).

Рис.4.

ЯОС-кривые диагностической

эффективности выявления калькулезного пиелонефрита у больных КН методом исследования цитокинового профиля мочи.

Рис.5.

ЯОС-кривые диагностической эффективности определения

степени активности воспалительного процесса при калькулезном пиелонефрите у

больных КН методом исследования цитокинового профиля мочи.

Как видно, одной из представленных характеристик воспалительного процесса в мочевыделительной системе у больных с циститами и пиелонефритами является подъем содержания в моче ИЛ-ф (чувствительность - 65-79%, специфичность — 6095%); ИЛ-6 (чувствительность -71-72%, специфичность - 65-92%); ИЛ-8 (чувствительность - 92-97%, специфичность - 90-99%).По-видимому, наличие

любых воспалительных изменений в мочевыводящих путях сопровождается достоверным подъемом основных провоспалительных цитокинов в моче.

Среди провоспалительных цитокинов наибольшую диагностическую чувствительность и специфичность имеет определение содержания в моче ИЛ-8.

Увеличение содержания Ил-8 в моче до 16,15 пг/мл характеризует скрытую форму воспалительных изменений в мочевыводящих путях (хронический калькулёзный пиелонефрит в стадии ремиссии). Нарастание уровня Ил-8 выше 132,2 пг/мл подтверждает обострение калькулезного пиелонефрита у больных КН.

Одновременно с нарастанием уровня провоспалительных цитокинов в моче у пациентов с калькулезным пиелонефритом изменяется содержание биомаркеров состояния тубулярного и гломерулярного аппаратов почек, эндотелиальной дисфункции и ангиогенеза. Отмечено нарастание уровня зсСБТ, коллагена IV типа в моче при одновременном снижении концентрации оксида азота, подъеме концентрации ФРЭС, эндотелина-1 в сыворотке крови. Это свидетельствует об активации процессов ремоделирования тубулоинтерстициальной ткани почки. При обострении пиелонефрита у больных КН или по мере вовлечения в воспалительный процесс почечной паренхимы происходит дальнейший подъем концентрации я^Т, коллагена IV типа в моче, содержания эндотелина-1, ФРЭС и снижение оксида азота в сыворотке крови (рис.6,7).

О контрольная группа

I хронический пиелонефрит

□ обострение хронического пиелонефрита

коллаген IV ттСБТ

Рис.6. Изменение показателей гломерулярной фильтрации и канальцевой дисфункции у больных коралловидным нефролитиазом с разной степенью выраженности воспалительного процесса: I - коллагена IV; 2 -тсОБТ (а процентах от уровня нормы).

□ контрольная группа

■ хронический

— пиелонефрит

□ обострение

— хронического пиелонефрита

■т

Рис. 7. Изменение показателей ангиогенеза и эндотелиальной дисфункции у больных коралловидным нефролитиазом с разной степенью выраженности воспалительного процесса: 1 - ФРЭС, 2 - эндотелии-1, 3 - NO (в процентах от уровня нормы).

Можно считать, что патогенетической основой механизмов включения клеточных структур почечной паренхимы в воспалительный процесс при КН являются:

- повреждение эпителиальной выстилки проксимальных канальцев почки и активация нейтрофильной и мононуклеарной инфильтрации интерстициальной ткани с нарастанием экскреции с мочой ИЛ-1р,ИЛ-6,ИЛ-8 и подъёмом выброса я-GST;

- развитие эндотелиальной дисфункции и активация ангиогенеза, критериями которых являются снижение содержания NO, нарастание уровня ЭТ-1 и ФРЭС в сыворотке крови;

- повреждение гломерулярной мембраны клубочков с увеличением коллагена IV типа мочи.

Исследование прогностического значения подъема уровня провоспалительных цитокинов мочи перед оперативным вмешательством у больных КН проведены при разделении всех обследованных больных на три группы, исходя из оказанных им оперативных пособий: дистанционная ударно-волновая литотрипсия - 22 пациента (в работе использовался литотриптор фирмы «Доренье Компакт Дельта» (Германия) и «Санолит» (Франция)); нефролиголапаксия - 22 больных (с помощью нефроскопа и литотриптора US LIHO R.WOLF); открытые оперативные вмешательства- 31пациент.

Установлено, что подъем содержания провоспалительных цитокинов у пациентов, разделенных по группам в зависимости от характера оперативного вмешательства, был связан с клиническими признаками обострения хронического пиелонефрита в послеоперационном периоде. Как оказалось, в зависимости от уровня провоспалительных цитокинов в моче у всех обследованных больных КН был определен вид оперативных вмешательств. Наиболее высокий уровень провоспалительных цитокинов в моче, прежде всего Ип-8, был отмечен у пациентов до открытых оперативных пособий. Это было связано с клиническими проявлениями обострения пиелонефрита перед оперативным вмешательством и в послеоперационном периоде. Анализ диагностического значения уровня Ил-8 перед оперативными вмешательствами показал, что данный показатель имеет высокую диагностическую чувствительность и специфичность для прогноза активации клинических проявлений обострения пиелонефрита в послеоперационном периоде у больных КН. С помощью ЯОС-анализа доказано, что количественное определение в моче содержания ИЛ-8 позволяет не только прогнозировать развитие обострения пиелонефрита у больных КН в послеоперационном периоде, но в связи с вероятными осложнениями индивидуализировать выбор метода оперативного лечения. При уровне Ил-8 мочи до 32,3 пг/мл пациентам с КН может быть рекомендовано проведение дистанционной ударно-волновой литотрипсии; от 32,3 пг/мл -97,6 пг/мл -выполнение нефролитолапаксии; выше 97,6 пг/мл - целесообразно осуществлять только открытые оперативные вмешательства с надлежащей санацией и дренированием мочевыводящих путей.

Выводы

1. У больных КН развитие пиелонефрита, особенно в стадии его обострения, сопровождается существенным, но неоднозначным подъёмом содержания в моче прововоспалительных цитокинов (Ил-1в, Ил-6,Ил-8).

2. У больных КН, осложненным пиелонефритом, основой развития структурных изменений ткани почек является активация нейтрофильной и мононуклеарной инфильтрации интерстициальной ткани, выраженность которой сопоставима с уровнем экскреции Ил-8 мочи, что позволяет рекомендовать исследование содержания Ил-8 мочи в качестве дополнительного лабораторного показателя для оценки степени обострения пиелонефрита у больных КН.

3. У больных КН развитие пиелонефрита на фоне нарастающего подъема экскреции ИЛ8 сопровождается заметным повышением экскреции с мочой белков пораженных клеток тубулярного эпителия (я-глутатион-Б-трансфераза мочи), увеличением уровня эндотелина -1 , фактора роста эндотелия сосудов (ФРЭС) и значимым снижением содержания оксида азота в сыворотке крови. Это является подтверждением многокомпонентности механизмов повреждения и нарастания выраженности структурных изменений в почечной паренхиме, особенно значимой при обострении хронического калькулёзного пиелонефрита.

4. Исследование содержания Ил-8 мочи может быть рекомендовано в качестве дополнительного лабораторного показателя при неоднозначности клинико-лабораторных данных для выбора хирургической тактики и объёма оперативного вмешательства у больных КН, осложненным калькулёзным пиелонефритом: при Ил-8 мочи до 32,3 пг/мл целесообразно назначение дистанционной ударно-волновой литотрипсии (чувствительность - 99,5%,специфичность-85%);

от 32,3 пг/мл до 97,6 пг/мл может быть предложено выполнение нефролитолапаксии (чувствительность-99,5%, специфичность-94%); выше 97,6 пг/мл - рекомендованы только открытые оперативные вмешательства (чувствительность- 99,5%,специфичность- 94%).

Практические рекомендации

1. Для объективной оценки обострения пиелонефрита у больных КН наряду с традиционными клинико-лабораторными и инструментальными методами перед оперативными вмешательствами и в послеоперационном периоде целесообразно включать мониторирование содержания Ил-8 в моче.

2. При выборе вида оперативного вмешательства у больных КН рекомендуется учитывать уровень Ил-8 в моче: при уровне Ил8- до 32,3 пг/мл целесообразно выполнение дистанционной ударно-волновой литотрипсии; от 32,3 до 97,6 пг/мл - нефролитолапаксии; выше 97,6 пг/мл - открытые оперативные вмешательства.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Граждапов, P.A., Влияние степени обструкции мочевыводящих путей при коралловидном нефролитиазе на дисфункцию эндотелия и ангиогенез /Р.А.Гражданов// Молодёжь и наука: итоги и перспективы: Материалы межрегиональной научно-практической конференции студентов и молодых учёных с международным участием.- Саратов, 2008.- С.172.

2. Сравнительная оценка хирургического и комбинированного лечения больных коралловидным нефролитиазом /П.В.Глыбочко, А.Н.Понукалин, А.Н.Россоловский, Р.А.Гражданов // Медицинский альманах: научно-практический журнал. Спецвыпуск,- 2008, май. - С.123.

3. Эффективность дистанционной литотрипсии в лечении коралловидного нефролитиаза /П.В.Глыбочко, А.Н.Понукалин, А.Н.Россоловский, Р.А.Гражданов // Медицинский альманах: научно-практический журнал. Спецвыпуск,- 2008, май. -С.123.

4. Гражданов, P.A. Значение молекулярных маркеров поражения почек у больных коралловидным нефролитиазом и обструктивным пиелонефритом /Р.А.Гражданов // Молодёжь и наука: итоги и перспективы: Материалы межрегиональной научно-практической конференции студентов и молодых учёных с международным участием - Саратов, 2009.- С.113.

5. Влияние степени обструкции мочевыводящих путей у больных с коралловидным нефролитиазом на состояние тубулоингерстициального аппарата почки и процессы ангиогенеза/П.В. Глыбочко, Б.И. Блюмберг, Н.Б.Захарова, Р.А.Гражданов // Медицинский вестник Башкортостана.-2009.-№2. - С.39-41.

6. Провоспалительный цитокиновый каскад в моче и сыворотке крови у больных при обострении калькулезного пиелонефрита/ Н.Б.Захарова, Н.А.Вараксин, А.Н.Понукалин, Р.А.Гражданов// Клиническая лабораторная диагностика.-2010.-№ 9.- С.11.

7. Диагностическое значение исследования провоспалительных цитокинов в моче при обострении калькулезного пиелонефрита /Н.Б.Захарова, Н.А.Вараксин, А.Н.Понукалин, Р.А.Гражданов // Цитокины и воспаление. -20Ю.-Том 9.-№ 3.-С.65.

8. Современные лабораторные методы в оценке повреждения почечной паренхимы при хирургическом лечении нефролитиаза/ П.В. Глыбочко, В.М.Попков, Н.Б.Захарова, Р.А.Гражданов // Саратовский научно-медицинский журнал.-2011 .Том 7.-№2,- С.71.

9. Диагностическое значение подъёма уровня провоспалительных цитокинов в моче при обострении калькулёзного пиелонефрита /П.В. Глыбочко, Н.Б.Захарова, А.Н.Понукалин, Р.А.Гражданов // Саратовский научно-медицинский журнал.- 2011.-Том 7.-№2,- С. 143.

10. Клеточно-молекулярные механизмы повреждения мочевыводящих путей при обострении хронического калькулёзного пиелонефрита/ П.В.Глыбочко, Р.А.Гражданов, Н.Б.Захарова, Г.Н.Маслякова // Медицинский вестник Башкортостана.-2011.- №2.- С. 55.

11. Значение биомаркёров дисфункции эндотелия и повреждения паренхимы почек при обострении хронического пиелонефрита у больных мочекаменной болезнью/ П.В. Глыбочко, Н.Б.Захарова, А.Н.Понукалин, Р.А.Гражданов // Клиническая лабораторная диагностика.-2011.-№ 10,- С. 12-13.

12. Значение подъёма уровня провоспалительных цитокинов в моче при обострении хронического калькулёзного пиелонефрита /П.В. Глыбочко, Н.Б.Захарова, А.Н.Понукалин, Р.А.Гражданов//Уральский медицинский журнал.- 2011,- № 6.-С.121-123.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АГ - артериальная гипертензия

ИНФ - интерферон

ИЛ - интерлейкин

КН - коралловидный нефролитиаз

ЧЛС - чашечно-лоханочная система

УЗИ - ультразвуковое исследование

МСКТ - мультиспиральная компьютерная томография

МРТ - магнитно-резонансная томография

ФНО а - фактор некроза опухоли альфа

ЭТ-1 - эндотелин-1

N0 - окись азота

TtGST - я -глутатион-Б-трансфераза

ФРЭС - фактор роста эндотелия сосудов

ДЭ - дисфункция эндотелия

МКБ - мочекаменная болезнь

СКФ - скорость клубочковой фильтрации

Подписано в печать 16.11.2011. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Гарнитура Times New Roman. Печать RISO. Объем 1 печ. л. Тираж 100 экз.

Заказ № 489

Отпечатано с готового оригинал-макета Центр полиграфических и копировальных услуг Предприниматель Сермал Ю.Б. Свидетельство № 3117 410600, Саратов, ул. Московская, д. 152, офис 19, тел. 26-18-19,51-16-28

Актуальность проблемы. Мочекаменная болезнь (МКБ) занимает одно из ведущих мест в структуре урологических заболеваний, в среднем по России 34.2% и, как другие заболевания почек, имеет большое социальное значение. Среди больных с МКБ коралловидный нефролитиаз (КН) встречается у 27,3% (55,56) и отличается тяжестью течения обусловленной сопутствующим хроническим пиелонефритом и хронической почечной недостаточностью.

Тяжесть осложнений, злокачественное течение, быстрое рецидивирование, преимущественное поражение лиц молодого и наиболее трудоспособного возраста, 30-50, лет делают крайне актуальными вопросы диагностики и лечения КН и его осложнений (29, 36, 54,103).

Хронический пиелонефрит при КН, переходящий в стадию активного воспаления, вызывает развитие тубулоинтерстициальных изменений в ткани почек, которые в конечном счете приводят к формированию интерстициального фиброза, атрофии канальцевого эпителия и развитию почечной недостаточности (21,117, 194, 202, 234).

Клеточно-молекулярные механизмы фиброзной трансформации тубулоин-терстициальной ткани широко изучаются. Благодаря внедрению в диагностическую практику новых клинико-лабораторных, биохимических, иммунологических, инструментальных, ультразвуковых, рентгеноурологических, радиоизотопных (ренография, сканирование почек) и специальных (пункционная биопсия почек, ангиография почечных сосудов и др.) методов исследования существенно повысилось качество диагностики повреждения почечной паренхимы. С их помощью можно производить дифференциальную диагностику стадии поражения почек при мочекаменной болезни в соответствии с международными стандартами.

Вместе с тем, несмотря на широкое внедрение современных диагностических технологий в диагностику поражения почек при калькулезных пиелонефритах, одной из основных проблем лечения заболевания остается раннее выявление структурно-функциональных изменений в почках, приводящих к снижению почечной функции. В клинической практике достаточно редко применяются методы как морфологического, так и морфометрического исследования биоптатов почечной ткани при обструктивных уропатиях. Также одним из перспективных направлений в диагностике ранних форм поражения паренхимы почек при калькулезном пиелонефрите и сопровождающей его артериальной гипертензии является разработка диагностического значения исследования:

- цитокинового состава мочи и сыворотки крови;

- маркеров канальцевой и гломерулярной дисфункций;

- маркеров дисфункции эндотелия и ангиогенеза в сыворотке крови.

Цель исследования: улучшить диагностику и выявить факторы прогноза развития послеоперационного пиелонефрита у больных коралловидным нефролитиа-зом при различных вариантах хирургического пособия.

Задачи исследования:

1.Установить диагностическое и прогностическое значение нарастания экскреции с мочой провоспалительных цитокинов у больных коралловидным нефроли-тиазом, осложненным пиелонефритом.

2.Определить особенности структурных изменений паренхимы почек у больных коралловидным нефролитиазом, осложненным пиелонефритом.

3. Уточнить степень соответствия повреждений паренхимы почек, ассоцирован-ных с избыточной продукцией провоспалительных интерлейкинов, с изменением показателей поражения тубулярного, гломерулярного аппаратов и сосудистого русла ткани почек (тс-глутатион Б-трансфераза и коллаген IV типа мочи, оксид азота, эндотелии-1,фактор роста эндотелия сосудов сыворотки крови) у больных коралловидным нефролитиазом.

4. Установить значение уровней экскреции с мочой провоспалительных цитокинов в прогнозе развития послеоперационного пиелонефрита у больных коралловидным нефролитиазом при различных видах оперативного лечения.

Научная новизна

• Впервые проведено сопоставление структурных изменений почечной паренхимы и содержания биомаркеров воспаления в моче и сыворотке крови у больных КН. Показаны диагностическое и прогностическое значения при обострении пиелонефрита, подъема в моче содержания основных провоспалительных цитокинов. Установлено, что у больных КН при обострении заболевания для оценки тяжести воспалительного процесса в почечной паренхиме наибольшее диагностическое значение имеет определение содержания в моче Ил-8.

• Впервые показана взаимосвязь развития воспалительных изменений в почечной паренхиме у больных КН с изменением уровня биомаркеров повреждения тубулярного эпителия, эндотелиальной дисфункции и активации ангиогенеза (нарастание содержания в моче л:-глутатион-8-трансферазы, снижение концентрации оксида азота, увеличение уровня ФРЭС, эндотелина-1 в сыворотке крови).

• Впервые показано, что исследование содержания Ил-8 в моче у больных КН может быть рекомендовано в качестве прогностического показателя обострения пиелонефрита в послеоперационном периоде при дистанционной ударно-волновой литотрипсии, нефролитолапаксии, открытых оперативных вмешательствах.

Практическая ценность

1. В диагностике обострения пиелонефрита у больных КН обосновано исследование содержания в моче Ил-8. Установлено, что исследование содержания Ил-8 в моче у больных КН является прогностически значимым показателем обострения пиелонефрита после таких оперативных вмешательств, как литотрипсия, нефро-литолапаксия, открытые оперативные вмешательства.

2. Количественное определение Ил-8 мочи является высокочувствительным и неинвазивным показателем при выборе тактики оперативного лечения больных КН, осложненным пиелонефритом.

Внедрение результатов исследования

Результаты исследования внедрены в практику работы НИИ фундаментальной и клинической урологии и нефрологии, кафедры урологии, клинической лабораторной диагностики, ЦНИЛ ГБОУ ВПО Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского Росздрава и клинической больницы им.С.Р.Миротворцева ГБОУ ВПО Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского Росздрава. Полученные результаты и практические рекомендации используются при проведении занятий на кафедрах урологии, клинической лабораторной диагностики, патологической физиологии ГБОУ ВПО Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского Минздравсоцразвития России.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Структурные изменения почечной паренхимы у больных КН с латентной формой калькулезного пиелонефрита связаны с повреждением тубулярного эпителия и сопровождаются подъемом содержания в моче провоспалительных цитокинов.

2. У больных КН при обострении пиелонефрита развивается достоверный подъем основных провоспалительных цитокинов в моче. Наиболее высокую чувствительность и специфичность имеет подъем содержания ИЛ-8 в моче.

3. Развитие воспалительных изменений в почечной паренхиме у больных КН сопровождается изменением показателей повреждения тубулярного эпителия, эндотелиальной дисфункции и ангиогенеза (нарастание содержания в моче п-глутатион-8-трансферазы, снижение концентрации оксида азота, увеличение уровня эндотелина-1, ФРЭС в сыворотке крови).

4. Исследование уровня ИЛ-8 в моче у больных КН является показателем прогноза развития послеоперационного пиелонефрита и может быть рекомендовано при выборе вида оперативного вмешательства (дистанционная ударно-волновая литотрипсия, нефролитолапаксия, открытые оперативные вмешательства).

Внедрение результатов исследования. Материалы исследования используются в практической работе НИИ фундаментальной и клинической урологии и нефрологии; кафедр урологии, клинической лабораторной диагностики; ЦНИЛ ГБОУ ВПО Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского Минздравсоцразвития России и клинической больницы им.С.Р. Миротворцева ГОУ ВПО Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского Минздравсоцразвития России. Полученные результаты и практические рекомендации используются при проведении занятий на кафедрах урологии, клинической лабораторной диагностики, патологической физиологии ГБОУ ВПО Саратовский ГМУ им.В.И. Разумовского Минздравсоцразвития России.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены на конференциях молодых ученых ГБОУ ВПО Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского Минздравсоцразвития России (Саратов, 2009, 2010); на заседании НИИ фундаментальной и клинической урологии и нефрологии ГБОУ ВПО Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского Минздравсоцразвития России (Саратов, 2010, 2011); на общероссийской научно-практической конференции Первый МГМУ им.И.М.Сеченова «Обеспечение доступности современных лабораторных исследований: аналитические возможности, клинические потребности, организационно-экономические условия» (Москва,2011).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 научных работ, из них 4 в изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на128 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, главы результатов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и практических рекомендаций. Фактические данные иллюстрированы 46 рисунками и 30 таблицами. Список литературы включает 291 источник (124 отечественных и 167 иностранных авторов). Все материалы, представленные в диссертации, получены, обработаны и проанализированы лично.

выводы

1. У больных КН развитие пиелонефрита, особенно в стадии его обострения, сопровождается существенным, но неоднозначным подъёмом содержания в моче прововоспалительных цитокинов (Ил-1в, Ил-6,Ил-8).

2. У больных КН, осложненным пиелонефритом, основой развития структурных изменений ткани почек является активация нейтрофильной и мононуклеарной инфильтрации интерстициальной ткани, выраженность которой сопоставима с уровнем экскреции Ил-8 мочи, что позволяет рекомендовать исследование содержания Ил-8 мочи в качестве дополнительного лабораторного показателя для оценки степени обострения пиелонефрита у больных КН.

3. У больных КН развитие пиелонефрита на фоне нарастающего подъема экскреции ИЛ8 сопровождается заметным повышением экскреции с мочой белков пораженных клеток тубулярного эпителия (тс-глутатион-Б-трансфераза мочи), увеличением уровня эндотелина -1 , фактора роста эндотелия сосудов (ФРЭС) и значимым снижением содержания оксида азота в сыворотке крови. Это является подтверждением многокомпонентности механизмов повреждения и нарастания выраженности структурных изменений в почечной паренхиме, особенно значимой при обострении хронического калькулёзного пиелонефрита.

4. Исследование содержания Ил-8 мочи может быть рекомендовано в качестве дополнительного лабораторного показателя при неоднозначности клинико-лабораторных данных для выбора хирургической тактики и объёма оперативного вмешательства у больных КН, осложненным калькулёзным пиелонефритом: при Ил-8 мочи до 32,3 пг/мл целесообразно назначение дистанционной ударно-волновой литотрипсии (чувствительность - 99,5%,специфичность-85%); от 32,3 пг/мл до 97,6 пг/мл может быть предложено выполнение нефролитола-паксии (чувствительность-99,5%, специфичность-94%); выше 97,6 пг/мл - рекомендованы только открытые оперативные вмешательства (чувствительность- 99,5%,специфичность- 94%).

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для объективной оценки обострения пиелонефрита у больных КН наряду с традиционными клинико-лабораторными и инструментальными методами перед оперативными вмешательствами и в послеоперационном периоде целесообразно включать мониторирование содержания Ил-8 в моче.

2. При выборе вида оперативного вмешательства у больных КН рекомендуется учитывать уровень Ил-8 в моче: при уровне Ил8- до 32,3 пг/мл целесообразно выполнение дистанционной ударно-волновой литотрипсии; от 32,3 до 97,6 пг/мл - нефролитолапаксии; выше 97,6 пг/мл - проведение открытых оперативных вмешательств.