Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему:Значение молекулярно-биологических маркеров при лечении больных колоректальным раком таргетными препаратами

На правах рукописи

АНТОНОВ МАКСИМ ВИКТОРОВИЧ

Значение молекулярно-биологических маркеров при лечении больных колоректальным раком таргетными препаратами

14.01.12 - онкология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

2 8 ИЮЛ 2011

Москва 2011

4851785

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Тюменской государственной медицинской академии» Минздравсоцразвития России

Научные руководители:

доктор медицинских наук, доцент

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук

Сабиров Ахат Халимович

Петерсон Сергей Борисович Ананьев Виталий Сергеевич

Ведущая организация: ФГУ МНИОИ им. П.А. Герцена

Росмедтехнологий

Защита состоится '» и ич-* А 2011г. в _ часов на заседании

диссертационного совета Д.001.17.01 РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН по адресу: 115478 г. Москва, Каширское шоссе, д. 23.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН.

Автореферат разослан «??» _2011 г.

Учёный секретарь

диссертационного совета Д.001.17.01 профессор, доктор медицинских наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Актуальной проблемой современной онкологии является колоректальный рак, занимающий третье место в структуре онкологической патологии. Неуклонный рост числа больных колоректальным раком обусловливает актуальность исследований, связанных с поиском путей оптимизации алгоритмов хирургического и комбинированного лечения последних [Аксель Е.М., Давыдов М.И., 2005].

В России ежегодно регистрируется 40 тысяч случаев рака толстой кишки. Умирает 31 тысяча больных. Средний показатель заболеваемости колоректальным раком составляет примерно 13,1 на 100 тысяч населения. Прослеживается стойкая тенденция к росту частоты развития опухолей этой локализации во всех развитых станах, в том числе и России. При этом отмечается значительное число случаев с поздней стадией заболевания, когда существенно затрудняется возможность выполнения радикального хирургического вмешательства и оказания полноценной медицинской помощи. Ведущей причиной поздней диагностики новообразований кишечника является разнообразие клинических форм заболевания и скудность их появлений на ранних стадиях, а как следствие - несвоевременное обращение больных за медицинской помощью.

За последние несколько десятилетий достигнут значительный прогресс в понимании молекулярной биологии клетки. Стали известны многие механизмы контроля клеточного деления и смерти, поддержания генетической стабильности, путей передачи сигнала и т.д. На сегодняшний день известно более 100 белков и/или генов, изменения которых находят в злокачественных клетках. Каждая опухоль является уникальной по набору нарушений, вовлеченных в процессы канцерогенеза.

Определение молекулярно-биологических маркеров в ткани опухоли может давать дополнительную информацию о биологическом поведении опухоли: о быстроте ее роста, способности к инвазии и метастазированию, устойчивости к химиопрепаратам [Степанова Е.В., 2009] Однако до сих пор не определены наиболее значимые молекулярно-биологические маркеры для прогнозирования течения заболевания и выбора обоснованной терапии.

В настоящее время большое внимание онкологов привлекают новые терапевтические подходы, базирующиеся на достижениях молекулярной биологии. Разработаны препараты, направленные на блокирование различных белков-продуцентов онкогенов в опухолевых клетках (Герцептин, Лабатиниб, Цетуксимаб, Пресса, Тарцева, Гливек, Сутент, Авастин и др.). Результаты проведенных исследований демонстрируют существование принципиально нового этапа лечения злокачественных новообразований, основанного на определении мишени направленного действия препарата.

В настоящее время не изучено влияние таргетных препаратов на молекулярно-генетические маркеры опухолевых клеток, а также влияние молекулярно-генетических мутаций на чувствительность опухолевых клеток к таргетной терапии.

Цель исследования. Определить значение молекулярно-биологических маркеров при лечении больных колоректальным раком (КРР) таргетными препаратами.

Задачи исследования:

1. Определить молекулярно-генетические маркеры в опухоли и сыворотке крови больных колоректальным раком до и в процессе лечения таргетными препаратами.

2. Определить клиническую значимость особенностей экспрессии молекулярно-генетических маркеров.

3. Оценить эффективность результатов лечения больных колоректальным раком с применением таргетных препаратов бевацизумаб и цетуксимаб.

Научная новизна.

Впервые определены молекулярно-генетические маркеры в сыворотке крови больных колоректальным раком. Показано, что больные колоректальным раком имеют выраженные молекулярно-генетические нарушения. Наиболее часто встречаются мутации генов р53 в 6, 7 экзонах, APC, C-kit, E-cadherin. Впервые показано изменение некоторых молекулярно-генетических маркеров в процессе лечения больных таргетными препаратами. Добавление в лечение больных КРР таргетных препаратов улучшает молекулярно-генетический статус, увеличивает время до прогрессирования и общую выживаемость. Показано преимущество комбинации схемы FOLFIRI с таргетными препаратами по сравнению со схемой FOLFIRI. Обнаружена корреляция между степенью морфологической дифференцировки опухоли и экспрессией некоторых молекулярно-генетических маркеров. В процессе исследования, схема химиотерапии FOLFIRI + бевацизумаб показала себя более эффективной по сравнению с FOLFIRI + цетуксимаб. При сравнении этих схем медиана выживаемости на 1,7 месяца больше при применении FOLFIRI + бевацизумаб, чем при FOLFIRI+ цетуксимаб.

Практическая значимость. Настоящая работа представляет практический интерес для оценки прогноза больных КРР и выбора схемы лечения.

Определение молекулярно-генетического статуса по образцам сыворотки крови больных (в отличие от образцов опухоли) позволяет проводить мониторинг изменений молекулярно-генетического статуса и прогнозировать течение заболевания.

Настоящее исследование показало преимущество терапии

колоректального рака таргетными препаратами по сравнению со схемой FOLFIRI.

Апробация работы. Основные положения работы были доложены и обсуждены на Всероссийской научно-практической конференции «Биотерапия» Москва, 2008.; конференции онкологов Поволжья. Казань, 2008; на 3-ем Евразийском радиологическом форуме Астана, 2009г.; II Всероссийской научной конференции с международным участием «Наноонкология» г. Тюмень 26-28 сентября 2010 г. и на региональной онкологической конференции ЯНАО март 2011 г.; совместной научной конференции кафедр: онкологии с курсом лучевой диагностики и лучевой терапии, хирургии ФПК и ППС, патанатомии, гистологии и эмбриологии, оперативной хирургии и топографической анатомии, социальной гигиены и организации здравоохранения ГОУ ВПО ТюмГМА Минздравсоцразвития РФ 12 апреля 2011 года.

Внедрение результатов исследования. Результаты исследования внедрены в практику ГУ Курганского областного онкологического диспансера, ГЛПУ Тюменского областного онкологического диспансера и в учебный процесс на кафедре хирургических болезней с курсами эндоскопии, урологии и рентгенологии ГОУ ВПО «Тюменской государственной медицинской академии» Минздравсоцразвития России.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 научных работ, 3 из них - в рецензируемых ВАК журналах.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 116 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, главы результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, практических рекомендаций и выводов. Текст иллюстрирован 15 таблицами, 2 диаграммами и 31 рисунком (в том числе микрофотографиями). Библиографический список включает 64 отечественных и 101 зарубежных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования. Работа основана на анализе клинических данных и результатов лабораторных методов диагностики 150 больных КРР, подвергшихся хирургическому лечению и получавших противоопухолевое лечение в Салехардской Окружной клинической больнице (главный врач Коган М.И).

Клиническая характеристика больных.

Средний возраст больных на момент постановки диагноза составил 56 ± 1,1 лет (от 29 до 75 лет), мужчин - 71 и 79 женщины.

Общее состояние оценивалось по 5-ти балльной шкале ECOG. Соматический статус всех наблюдаемых на момент операции не превышал 2 баллов.

Во всех 150 наблюдениях диагноз злокачественного новообразования толстой кишки был верифицирован морфологическим способом, с использованием парафиновых блоков первичной опухоли данных больных. В исследование были включены первичные больные, у которых в удаленной во время операции опухоли был определен «дикий» тип гена K-Ras, т.к. цетуксимаб не оказывает действия при мутации этого гена [Ahmed F.E., 2005].

У большинства больных - 93,3% (140 из 150) при морфологическом исследовании операционного материала была обнаружена аденокарцинома толстой кишки (АТК). Минимальное число больных - 6,7% (10 из 150) имело неоплазии кишечника со слизеобразованием. Опухоли по степени дифференцировки распределялись следующим образом: 23 - низко-, 115 -умеренно и 12 - высокодифференцированных новообразований.

Окончательная стадия заболевания и распространенность опухолевого процесса на зоны регионарного лимфооттока устанавливалась после патоморфологического анализа удаленного новообразования кишечника. При этом из общего числа рассматриваемых пациентов с КРР у 44% стадия заболевания согласно классификации Dukes соответствовала категории Dukes'C, а у 56% - Dukes'D.

Схемы лечения больных.

Всем больным выполнен оперативный этап лечения - радикальная или циторедуктивная резекция ободочной или прямой кишки (правосторонняя гемиколэктомия, резекция поперечно-ободочной кишки, левосторонняя гемиколэктомия, резекция сигмовидной кишки, различные варианты резекции прямой кишки).

Больных разделили на 3 группы по 50 человек. В 1-й группе в послеоперационном периоде через 3-4 недели больные получали химиотерапию по схеме FOLFIRI (иринотекан - 180 мг/м2 в/в, капельно в 1-й день, фолинат кальция (лейковорин) - 200 мг/м2 в/в, в 1-й день, фторурацил -400 мг/м2 в/в, струйно в 1-й день, затем фторурацил - 2,4-3,0 г/м2 24-часовая в/в инфузия). Повторные курсы через 2 недели. Все больные получили 6 курсов химиотерапии.

Во второй группе 50 пациентов получали химиотерапию FOLFIRI с таргетным препаратом цетуксимаб. Гуманизированные моноклональные антитела цетуксимаб (МЕРК-Сироно) в/в 400мг/м2 в первое введение, в последующем по 250 мг/м2 один раз в неделю.

В третьей группе 50 пациентов получали химиотерапию FOLFIRI с таргетным препаратом бевацизумаб. Гуманизированные моноклональные антитела бевацизумаб (Ф. Хоффманн-Ля Рош Лтд.) в/в, 5мг /кг 1 раз в 3 недели.

Все больные после хирургического лечения на протяжении 5 лет и более находились под тщательным наблюдением с периодическим контрольным обследованием.

Оценка эффективности проводилась после каждого четного цикла цитостатической терапии, а также всего курса таргетной терапии в соответствии со стандартными критериями ВОЗ [Miller A. et al., 1981].

Шшуногистохимические исследования.

Иммуногистохимическое исследование выполнено на парафиновых срезах опухолей с помощью биотинстрептавидинового иммунопероксидазного метода с моноклональными антителами, характеристика которых представлена в таблице 1. Для каждого антигена оценивали тип специфического окрашивания, который зависел от локализации продукта реакции в клетке (цитоплазматический, мембранный, ядерный, смешанный).

Таблица 1

Характеристика использованных в исследовании антител

Антиген Антитело, клон Фирма Рабочее разведение Функция белка

Ki-67 Mouse mAb MIB-1 Dako RTU Антиген клеточной пролиферации

VEGF Mouse mAb VG1 Dako 1:25 Активатор ангиогенеза

EGFR Mouse mAb Hll Dako 1:200 Рецепторная тирозинкиназа

Оценку интенсивности иммуногистохимической реакции с рецепторами ЕСРЯ и УЕСРЯ осуществляли согласно порядковой шкале:

О - мембранное окрашивание отсутствует;

1+ - слабое окрашивание неполного периметра мембран выявляется более чем в 10% клеток;

2+ - окрашивание мембран средней интенсивности по всему периметру

выявляется более чем в 10% клеток;

3+ - интенсивное окрашивание мембран по всему периметру выявляется более чем в 10% клеток.

При иммуногистохимическом окрашивании с использованием моноклональных антител к антигену Кл-67 в опухолевых клетках наблюдался ядерный тип реакции в первичных и вторичных очагах опухолевого роста, частота выявления которого в исходной опухоли и ее метастазах различалась незначительно. Уровень экспрессии белка Ю-67 в различных опухолях варьировал в широких пределах. Пролиферативную активность оценивали как низкую, умеренную и высокую на основе следующих критериев:

1. 0%-20% - низкая пролиферативная активность;

2. 21%-50% - умеренная пролиферативная активность;

3. 51%-100% - высокая пролиферативная активность.

Иммуноферментная диагностика сывороточных концентраций EGFR и VEGFR.

Иммуносорбентное определение EGFR, hVEGFR-165 проводилось на основании «сэндвич»-метода твердофазного иммуноферментного анализа с использованием иммуноферментных наборов BioSource International, Inc. Human EFG ELISA и BioSource International, Inc. Human VEFG ELISA.

Определение мутационного статуса онкогенов в сыворотке крови.

Полимеразная цепная реакция проводилась с использованием специфических праймеров фирм Синтол и Литех, ДНК выделялась из парафиновых образцов опухоли и плазмы крови хлороформно-фенольной методикой. Секвенирование нуклеотидных последовательностей проводили на генетическом анализаторе Applied Biosystems 3130x1. Определялись следующие онкогены: B-raf (15 экзон), C-kit (11 экзон) 560 кодон, АРС (16 экзон) 1309 кодон, K-ras (1 экзон) 12 кодон+13кодон+17кодон, р53 (5 экзон) 175 кодон, р53 (6 экзон), р53 (7 экзон) 248 кодон, р53 (8 экзон) 273 кодон, E-cadherin, р16.

Статистический анализ. Математический анализ полученных результатов проводили с использованием пакета статистических программ SPSS 7.0 for Windows и Microsoft® Office Excel 2003. Рассчитывали среднее значение показателей, стандартную ошибку среднего, а также их медианы. Определение достоверности различий частот признаков в изучаемых группах проводили с использованием критерия X2 и непараметрического точного критерия Фишера для малых выборок. Различия между показателями считались статистически значимыми при р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Иммуногистохимическое определение EGFR и VEGFR.

В большинстве случаев (146 из 150) у больных КРР в образцах опухоли обнаружили экспрессию EGFR. При высокой степени дифференцировки опухоли имелась низкая экспрессия антигена EGFR: 8 случаев с 1+, а у 4 пациентов отсутствовала полностью. При умеренной и низкой степени дифференцировки экспрессия антигена EGFR повышена.

В группе с низкодифференцированной АТК в 17 % экспрессия была 2+, в 83% экспрессия была 3+. Пациентов без экспрессии EGFR не было. Эти результаты статистически значимы (таблица 2).

Антиген VEGFR также был экспрессирован у большинства больных (146 из 150). При этом, чем выше степень злокачественности, тем заметнее увеличение экспрессии сосудисто-эндотелиального факторов роста. При высокодифференцированной аденокарциноме в группе из 12 пациентов только у одного отмечалась экспрессия VEGFR 2+; у 9 - 1+; у 2 пациентов экспрессии не выявлено. При низко дифференцированной аденокарциноме в группе из 23 пациентов только у одного отмечалась экспрессия VEGFR 1+; у 3 - 2+; у 19 (что составляет 83%) - 3+. Больных без экспрессии VEGFR не выявлено (таблица 3).

Распределение больных КРР в зависимости от степеии дифференкировки опухоли и экспрессии ЕСИ* в опухоли

Степень ифференцировки опухоли (п — кол-во пациентов)

Уровень экспрессии антигена ЕСР1*

1+

2+

%

33

67

%

29

25

*68

59

%

17

- статистически достоверно, р<0,05

Распределение больных КРР в зависимости от степени дифференцировки опухоли и экспрессии \HEGFR в опухоли

Степень дифференцировки опухоли (п - кол-во пациентов) Уровень экспрессии антигена УЕСП*

0 1+ 2+ 3+

п 2 9 1 0

Высокая

(п=12) % 17 75 8 0

п 2 * 25 64 24

Умеренная

(п=115) % 1 22 56 21

Низкая п 0 •1 3 *19

(п=23) % 0 4 13 83

*- статистически достоверно, р<0,05

Иммуногистохимическое определение экспрессии антигена Ю-67 в опухолевых клетках.

Уровень пролиферативной активности раковых клеток является ключевым фактором, определяющим потенциал злокачественности опухоли и агрессивность течения заболевания. В данном исследовании проведен анализ пролиферативной активности первичных аденокарцином толстой кишки с помощью оценки индексов пролиферации Ю-67 и сопоставления полученных данных с клинико-морфологическими факторами прогноза и показателями выживаемости больных КРР.

У большинства больных КРР выявлен высокий уровень пролиферативной активности Ю-67, при этом большой процент Ю-67 - позитивных клеток

(>50%) отмечен в 33 случаях, умеренные индексы пролиферации (21%-50%) - в 105 случаях и низкий уровень пролиферации (< 20%) - в 12 случаях.

Экспрессия маркера наблюдалась в опухолях с различной степенью гистологической дифференцировки и как правило, в меньшей степени была выражена в участках с секреторной активностью (слизеобразованием). Средний уровень экспрессии антигена Кл-67 прямо пропорционально коррелировал со степенью злокачественности КРР. В опухолях с более высоким уровнем злокачественности индекс Кл-67 был выше, чем в опухолях с более низким уровнем злокачественности (таблица 4).

Таблица 4

Распределение больных КРР в зависимости от степени дифференцировки опухоли и значения индекса Кл-67

Степень дифференцировки опухоли (п — кол-во пациентов) Уровень экспрессии антигена Ю-67

низкая пролиферативная активность < 20% (п=12) умеренная пролиферативная активность 21-50% (п=105) высокая пролиферативная активность > 50% (п=33)

Высокая (п=12) '12(100%) 0 0

Умеренная (п=115) 0 * 105 (91,3%) 10(8,7%)

Низкая (п=23) 0 0 *23 (100%)

Примечание: * - р<0,05

Изучение мутационного статуса больных КРР по образцам сыворотки крови.

Следующим этапом исследования стало изучение молекулярно-генетических изменений по образцам сыворотки крови, взятых до лечения и после 6-ти курсов химиотерапии. В сыворотке крови у больных определяли экспрессию ростовых факторов, количество мутаций в генах Р53, APC, B-raf, C-kit, E-cadherin.

При анализе экспрессии рецепторов ростовых факторов не было выявлено корреляции между уровнем экспрессии EGFR и степенью морфологической дифференцировкой опухоли. Однако, при изучении hVEGFR-165, обнаружено статистически достоверное снижение уровня экспрессии в зависимости от морфологической дифференцировки опухоли (чем ниже дифференцировка опухоли, тем выше уровень экспрессии сосудисто-эндотелиального фактора от 130 pg/ml. при высокодифференцированных аденокарциномах и до 174,7 pg/ml. при низкодифференцированных).

На фоне лечения больных КРР не обнаружили изменений в уровне ростового фактора ЕвРЯ (таблица 5).

Таблица 5

Уровень экспрессии ростового фактора ЕСИ1 в сыворотке крови в зависимости от морфологической дифференцировкой опухоли

Степень дифференцировки опухоли EGFR (N=0-9,5 fmol/ml) до лечения EGFR (N=0-9,5 fmol/ml) FOLFIRI EGFR (N=0-9,5 fmol/ml) FOLFIRI+ цетуксимаб EGFR (N=0-9,5 fmol/ml) FOLFIRI+ бевацизумаб

Высокая 10,8 9,8 9,6 9,3

Умеренная 36,7 34,9 34,6 34,3

Низкая 15,4 13,8 13,7 13,3

С другой стороны, ростовой фактор УЕС\Т1 статистически значимо снижался в группе низкодифференцированных опухолей при лечении РСОТШ+бевацизумаб (таблица 6).

Таблица 6

Уровень экспрессии ростового фактора УЕСР11 в сыворотке крови в зависимости от морфологической дифференцировкой опухоли

Степень дифференцировки опухоли hVEGFR-165 (N=0-120 pg/ml) до лечения hVEGFR-165 (N=0-120 pg/ml) FOLFIRI hVEGFR-165 (N=0-120 pg/ml) FOLFIRI+ цетуксимаб hVEGFR-165 (N=0-120 pg/ml) FOLFIRI+ бевацизумаб

Высокая 130,0 129,0 128,0 125,9

Умеренная 168,0 164,0 165,0 161,3

Низкая 174,7 140,9 143,9 139,2

Анализ экспрессии других молекулярно-генетических маркеров показал тенденцию к снижению количества мутаций по сравнению с долечебным уровнем при комбинации схемы FOLFIRI с таргетными препаратами, которое было статистически не значимо. После лечения стандартной схемой химиотерапии FOLFIRI, количество молекулярно-генетических мутаций несколько повышалось. С применением таргетных препаратов картина меняется. Отмечается стойкая тенденция к снижению уровня мутации гена р53 в 6,7,8 экзонах, АРС, Е-кадхерина. Однако, эти изменения также статистически не

значимы. Но при анализе общего количества мутаций обнаружили статистически значимые различия между группой больных получавших РОЬР1Ш+ бевацгоумаб и другими группами (р<0,05). При анализе среднего количества мутаций на одного пациента отмечено снижение с 2,78 до 1,5 (таблица 7).

Таблица 7

Изменения молекулярно-генетических маркеров у больных КРР на фоне лечения по разным схемам

Исследуемые гены ДНК Общее

Количество мутаций р53 5 эк- 3011 р53 б эк- 3011 pS3 7 эк- 3011 р53 8 эк-зон C-kit 12 К0Д011 B-raf 15 кодон APC E-cad-herin pl6 количество мутаций

до лечения (п-150) '42 68 109 59 21 1 35 47 35 •"417

% "28 45,3 72,7 39,3 14 0,7 23,3 31,3 23,3 2,78

FOLFIRI (п-50) 15 26 43 21 7 1 13 18 14 158

% 30 52 86 42 14 2 26 36 28 3,16

FOLFIRI + цепуксимаб (п-50) И 19 24 17 6 - 8 12 9 106

% 22 38 48 34 12 - 16 24 18 2,12

FOLFIRI + беващвумаб (п-50) 7 12 21 13 3 - 6 9 5 76 1,5

% 14 ' 24 42 26 6 - 12 18 10

* - количество больных с данной мутацией;

- процент больных с данной мутацией;

- общее количество мутаций;

- количество мутаций на 1 больного.

Анализ генетических мутаций в зависимости от степени дифференцировки опухоли.

Следующим этапом исследования стало изучение молекулярно-генетических изменений в зависимости от гистологической дифференцировки опухоли.

В группе больных, обследованных до лечения видно, что наибольшее количество мутаций выявлено у больных КРР с умеренной и низкой степенью дифференцировки опухоли. При этом преобладает мутация гена р53 в 7ех. Количество мутаций на 1 больного в группе с низкодифференцированной АТК составляет 4, тогда, как при умеренно-дифференцированной и высокодифференцированной АТК 2,9 и 2,5 соответственно (таблица 8).

Таблица 8

Молекулярно-генетический статус больных КРР в зависимости от дифференцировки опухоли до лечения (п=150)

Степень Исследуемые гены ДНК

дифференцировки опухолевых клеток (п - кол-во пациентов)

р53 5 эк-зон р53 6 эк- 3011 р53 7 эк-зон р53 8 эк-зон C-kit 12 ко-дон B-raf 15 КОДОВ АРС K-ras 12,13 кодо-II ы Е- cad- herin р16 Общее количество мутаций

Высокая 4 4 9 8 2 0 3 0 4 1 35

(п-12) •33 33 75 67 17 25 33 8 **2,9

Умеренная (п-115) 27 24 54 47 79 69 42 37 12 10 0 18 16 0 32 28 26 23 290 2,5

Низкая И 10 21 9 7 1 14 0 П 8 92

(п-23) 48 44 91 39 30 4 61 48 35 4

* - процент мутации в группе; - количество мутаций на 1 больного.

Далее мы провели анализ изменения молекулярно-генетических маркеров до лечения и после лечения по группам.

Было обнаружено, что у 50 больных, подвергшихся в последствии терапии ГОЬНШ, в процессе лечения, произошли изменения. Общее количество мутации на 1 пациента увеличилось (таблицы 9,10), особенно в группе низкодифференцированных опухолей.

Таблица 9

Молекулярно-генетический статус больных КРР до лечения группа ГОШИ (п=50)

Исследуемые гены ДНК

Степень дифферен- цировки

р53 р5 3 р5 3 р5 3 С-кИ В-raf К- ras Общее

опухолевых клеток (п - кол-во пациентов) 5 эк-3011 6 эк- 30 ■1 7 эк- 30 н 8 эк- 30 II 12 КО- до II 15 КО-ДО н АРС 12, 13 К0- до-II ы Е- cad- herin р16 количество мутаций

Высокая I 1 3 3 1 1 2 0 12

(п=4) »25 25 75 75 25 25 50 *»3

Умеренная (п=38) 9 24 18 47 26 68 14 37 4 11 0 6 16 0 10 26 9 24 96 2,5

Низкая 4 3 7 3 2 I 5 0 4 2 31

(ч=8) 50 38 88 38 25 13 63 50 25 3,9

*- процент мутации в группе; - количество мутаций на 1 больного. .

Таблица 10

Молекулярно-генетический статус больных КРР после 6-ти курсов ТОЬПМ (п=50)

Степень Исследуемые гены ДНК

днфферен-цировки

р53 р53 р53 р53 C-kit B-raf К-ras 12,13 ко доны Общее

опухолевых клеток (в - КОЛВО пациентов) 5 эк- 30II 6 эк-зон 7 ЭК-3011 8 эк-зон 12 кодой 15 ко- дон АРС Е- cad- herin Pi 6 количество мутаций

Высокая 1 1 3 2 0 0 1 2 0 10

(п=4) ♦25 25 75 50 25 50 **2,5

Умеренная (п=38) 9 "'2 4 2) 55 32 84 15 40 4 11 0 8 21 0 12 32 10 26 111 2,9

Низкая 5 4 8 4 3 1 4 0 4 4 37

(п=8) 63 50 100 50 38 13 50 50 50 4,6

*- процент мутации в группе;

- количество мутаций на 1 больного;

- статистически достоверно, р<0,05.

В группе больных, получавших РОШМ + цетуксимаб, общее количество мутации на 1 пациента снизилось: 2,8 до 2 в группе высокодифференцированных; с 2,6 и 2,1 в группе умеренно-дифференцированных; с 3,9 до 2,3 в группе низкодифференцированных АТК (таблицы 11,12).

Таблица 11

Молекулярно-генетический статус больных КРР до лечения ГОЬПМ + цетуксимаб (п=50)

Степень Исследуемые гены ДНК

дифферен- цировки опухолевых клеток (п - кол-во пациентов)

р53 5 эк-зон р53 6 эк-зон р53 7 эк-зон р53 8 эк-зон С-кИ 12 КО-дон В-гаГ 15 КОДОМ АРС К-гаэ 12,13 кодо -ны Е- сас1- Ьепп р16 Общее количество мутаций

Высокая (п=4) 1 »25 2 50 3 75 2 50 I 25 0 1 25 0 1 25 0 11 "2,8

Умеренная (п=38) 9 24 и 47 26 68 И 37 4 11 0 6 16 0 11 29 9 24 97 2,6

Низкая (п=8) 4 50 3 36 7 88 3 36 3 36 0 4 50 0 4 50 3 36 31 3,9

*- процент мутации в группе; - количество мутаций на 1 больного.

Таблица 12

Молекулярно-генетический статус больных КРР после 6-ти курсов РОЬПШ + цетуксимаб (п=50)

Степень дифферен- цировки опухолевых клеток (п - кол-во пациентов) Исследуемые гены ДНК

р53 5 эк-зон р53 6 эк-зон р53 7 эк-зон р53 8 эк-зон с- кИ 12 КОДО н В-гаГ 15 КО-дон АРС к- гаэ 12,13 кодо -ны Е- сас!- Ьспп р16 Общее количество мутаций

Высокая (п=4) 1 »25 0 3 75 2 50 0 0 1 25 0 1 25 0 8 »'2

Умеренная (п=38) 7 18 16 42 20 53 12 32 3 8 0 4 II 0 9 24 7 18 78 2,1

Низкая (п=8) 3 38 3 38 5 63 3 38 3 38 0 4 50 0 3 38 2 25 26 2,3

*- процент мутации в группе; - количество мутаций на 1 больного.

В группе больных, получавших ГОШЩ + бевацизумаб, общее количество мутации на 1 пациента также снизилось: с 2,7 до 1,5 в груше высокодифференцированных; с 2,5 до 1,8 в группе умеренно-дифференцированных; с 43 до 3 в группе низкодифференцированных АТК (таблицы 13,14).

Молекулярно-генетический статус больных КРР до лечения группа Р01ЛШ + бевацизумаб (п=50)

Степень

днфферен-

цмровки

опухолевых

клеток

(п - кол-во

пациентов)

Исследуемые гены ДНК

р53 5

эк-

3011

р53

бэк-зон

р53 7

эк-зон

р53

8 эк-зон

С-кК

12

ко-дон

В-гаГ

15 коде II

АРС

К-

гав 12,13 кодо -ны

Е-

са<1-

Ьепп

р16

Общее количество мутаций

Высокая

(п=4)

2

«50

1

25

3

75

3

75

I

25

1

25

11

'«2,7

Умеренная (п=39)

9 23

18 46

27 69

И

36

4 10

6 15

11 28

21

97 2,5

Низкая (п=7)

3

43

4

57

7 100

3

43

2

29

5 71

3

43

3

43

30 4,3

- процент мутации в группе; - количество мутаций на 1 больного.

Молекулярно-генетический статус больных КРР после 6-ти курсов ГОЬШШ + бевацизумаб (п=50)

Таблица 14

Степень

дифферен-

цировки

опухолевых

клеток

(п - кол-во

пациентов)

Исследуемые гены ДНК

р53

5 эк-зон

р53

6 эк-зон

р53

7 эк-зон

р53

8 эк-зо н

С-кН 12 ко-дон

В-гаГ 15 кодом

АРС

К-га$ 12,13 кодо ны

Е-

са<1-

Иепп

р16

Общее количество мутаций

Высокая (п=4)

3

75

2

50

1

25

6

«1,5

Умеренная (п-39)

6

«15

12 31

19 49

11 28

5

13

21

70 1,8

Низкая (п=7)

3

43

3

43

6 86

3

43

2

29

3

43

2

29

3

43

22 3

- процент мутации в группе; - количество мутаций на 1 больного.

Снижение общего числа мутаций в группе больных получавших ГОЬЕШ + бевацизумаб при низкодифференцированных опухолях было статистически значимым по сравнению с получавшими БСОТИ идо лечения.

Анализ выживаемости больных

В группе пациентов, получавших химиотерапию (ХТР) по схеме ГОЬИШ, частота объективных ответов составила 54%, время до прогрессирования - 10,9 месяцев и продолжительность жизни - 20,6 месяцев.

В группе пациентов, получавших ХТР по схеме РОЬРГОГ + цетуксимаб, частота объективных ответов составила 57%, время до прогрессирования - 11,4 месяцев и продолжительность жизни - 26,1 месяцев.

В группе пациентов, получавших ХТР по схеме РОЬПШ + бевацизумаб, частота объективных ответов - 57,9%, время до прогрессирования - 13,5 месяцев и продолжительность жизни - 27,7 месяцев (таблица 15).

Таблица 15

Показатели общей выживаемости (ОВ) и выживаемости без прогрессирования (ВВП)

Показатели выживаемости ЕОЬР1Ш (п=50) ЕОЬЕПИ + цетуксимаб (п=50) РОЬИШ + бевацизумаб (п=50)

ОВ, месяцы 20,6 26,1 27,7

ВБП, месяцы 10,9 11,4 13,5

Примечание: статистически достоверные отличия (р<0,05; тест Манна-Уитни).

При анализе данных по ОВ и ВБП выявлено, что схемы лечения больных КРР РОЬР1Ш + цетуксимаб и РОЬР1И + бевацизумаб увеличивают медиану времени до прогрессирования с 10,9 до 11,4 месяцев и с 10,9 до 13,5 месяцев; медиану ОВ - с 20,6 до 26,1 месяцев и с 20,6 до 27,7 месяцев по сравнению со схемой РОЫЧШ без добавления таргетных препаратов (см. диаграммы 1,2).

Диаграмма 1

Общая выживаемость больных КРР

Примечание: статистически достоверные отличия (р<0,05; тест Манна-Уитни)

Диаграмма 2

Выживаемость больных КРР без прогрессирования

Режим

Медиана выживаемости без прогрессирования (мес.)

Р01_Р1т +Эрбитукс Р01_Р1Ш + Авастин

10.9

(п-50) 11.4

О

10

12

Месяцы

и

Примечание: статистически достоверные отличия (р<0,05; тест Манна-Уитни)

Добавление бевацизумаба, цетуксимаба к химиотерапии достоверно улучшает время до прогрессирования, и продолжительность жизни больных.

Терапия моноклональными антителами должна проводиться максимально долго, до прогрессирования.

Анализ выживаемости показал, что лечение больных по схеме РОЬИШ менее эффективно, чем лечение с таргетными препаратами. Эффективность схемы ГОШЩ + бевацизумаб оказалась выше, чем БОПТЩ + цегуксимаб. Среди исследованных молекулярно-генетических маркеров, информативную значимость имеет К-67, ЕвЕИ и УЕСРИ, которые коррелируют с морфологической дифференцировкой опухоли, а также с общим количеством мутаций, выявленных по сыворотке крови.

При высокой пролиферативной активности опухоли, определенной по экспрессии Кл-67, отмечается уменьшение ОВ с 27,7 месяцев, до 21,8 месяцев в отличие от низкой степени пролиферативной активности и ВВП с 13,3 месяцев до 10,7 месяцев соответственно (таблица 16).

Таблица 16

Показатели общей выживаемости и выживаемости без прогрессирования в зависимости от значения индекса Кл-67

Показатели выживаемости Низкая пролиферативная активность < 20% (п=12) Умеренная пролиферативная активность 21-50% (п=105) Высокая пролиферативная активность > 50% (п=33)

ОВ, месяцы 27,7 24,9 21,8

ВБП, месяцы 13,3 11,8 10,7

Анализ ОВ и ВБП в зависимости от степени дифференцировки опухоли показал, что при более низкой степени дифференцировки опухоли ОВ уменьшается с 27,8 месяцев при высокой степени дифференцировки до 21,9 месяцев при низкой степени дифференцировки и ВБП с 13,1 месяцев до 10,8 месяцев соответственно (таблица 17). Таблица 17 Показатели общей выживаемости и выживаемости без прогрессирования в зависимости от степени дифференцировки опухоли

Показатели выживаемости Высокая (п=12) Умеренная (п=115) Низкая (п=23)

ОВ, месяцы 27,8 24,7 21,9

ВБП, месяцы 13,1 11,9 10,8

ОВ при гиперэкспрессии ЕбРЯ уменьшается с 27,6 месяцев до 20,6 месяцев при отсутствии экспрессии ЕвРЯ. ВВП при гиперэкспрессии Евт уменьшается с 13,3 месяцев до 10,7 месяцев, соответственно (таблица 18).

Таблица 18

Показатели общей выживаемости и выживаемости без прогрсссирования в зависимости от экспрессии ЕСР1*

Показатели выживаемости экспрессия ЕСЕИ

0 1+ 2+ 3+

ОВ, месяцы 27,6 25,1 24,5 20,6

ВБП, месяцы 13,3 11,8 П,1 10,7

ОВ при гиперэкспрессии УБОРЯ уменьшается с 27,8 месяцев до 20,4 месяцев при отсутствии экспрессии УЕОРЯ. ВБП при гиперэкспрессии УБОРЫ уменьшается с 13,4 месяцев до 10,6 месяцев, соответственно (таблица 19).

Таблица 19

Показатели общей выживаемости и выживаемости без прогрессировать в зависимости от экспрессии УЕСГО

Показатели выживаемости экспрессия УЕСР11

0 1+ 2+ 3+

ОВ, месяцы 27,8 25,2 24,4 20,4

ВБП, месяцы 13,4 11,7 11,2 10,6

выводы

1. Экспрессия в образцах опухоли рецепторов эпидермального (EGFR) и сосудисто-эндотелиального (VEGFR) факторов роста коррелирует со степенью морфологической дифференцировки опухоли. Чем ниже была степень дифференцировки опухоли, тем выше экспрессия рецепторов ростовых факторов.

2. Общая выживаемость больных при гиперэкспрессии EGFR уменьшается с 27, 6 месяцев, при отсутствии маркера, до 20,6 месяцев. Время без прогрессирования при гиперэкспрессии EGFR уменьшается с 13,3 месяцев, при отсутствии маркера, до 10,7 месяцев.

3. Общая выживаемость при гиперэкспрессии VEGFR уменьшается с 27,8 месяцев, при отсутствии VEGFR, до 24,4 месяцев. Время без прогрессирования при гиперэкспрессии VEGFR уменьшается с 13,4 месяцев, при отсутствии маркера, до 10,6 месяцев.

4. Экспрессия маркера пролиферации антигена Ki-67 зависит от степени морфологической дифференцировки опухоли. Чем ниже степень дифференцировки опухоли, тем выше экспрессия антигена Ki-67. Экспрессия антигена Ki-67 коррелирует с экспрессией рецепторов ростовых факторов. Высокая пролиферативная активность клеток аденокарциномы толстого кишечника, исследованная с помощью Ki-67, является достоверным фактором неблагоприятного прогноза общей выживаемости.

5. В сыворотке крови больных колоректальным раком до лечения и в процессе лечения обнаружены мутации в генах Р53, APC, B-raf, C-kit, Е-cadherin. При терапии таргетными препаратами общее количество мутаций снижается, а при схеме FOLFTRI-увеличивается.

6. У больных проходивших лечение с добавлением таргетных препаратов бевацизумаб и цетуксимаб наблюдалось увеличение показателей общей выживаемости и выживаемости без прогрессирования. При применении схемы химиотерапии FOLFIRI + цетуксимаб общая выживаемость составила 26,1 месяцев, ВПБ - 11,4 месяцев. При применении схемы химиотерапии FOLFIRI + бевацизумаб общая выживаемость составила 27,7 месяцев, ВПБ -

13.5 месяцев. При использовании схемы FOLFIRI общая выживаемость составила

20.6 месяцев, ВБП - 10,9 месяцев.

7. В процессе исследования, схема химиотерапии FOLFIRI + бевацизумаб показала себя более эффективной по сравнению с FOLFIRI + цетуксимаб. При сравнении этих схем медиана выживаемости на 1,7 месяца больше при применении FOLFIRI + бевацизумаб, чем при FOLFIRI+ цетуксимаб.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Барышников А.Ю., Сабиров А.Х., Федоров Н.М., Важенина A.A., Антонов М.В. Молекулярно-генетические изменения у больных с диффузными формами мастопатии и методы их коррекции // Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Биотерапия». - М.: Сборник тезисов -2008.-С. 56-57.

2. Шайн A.A., Сабиров А.Х., Федоров Н.М., Антонов М. В. О возможности молекулярно-генетического тестирования онкологических больных // Восьмой съезд онкологов Армении. Ереван. -2008.-С.85-87.

3. Сабиров А.Х., Федоров Н.М., Шайн A.A., Важенина A.A., Антонов М.В. Молекулярно-генетический статус больных с фиброзно-кистозными мастопатиями. Стратегические подходы превентивной онкологии. // Материалы Всероссийской научно-практической конференции по интервенционной маммологии. М.: «Сан-пресс». -2008.-С. 121-125.

4. Бычков В.Г., Шайн A.A., Сабиров А.Х., Федоров Н.М., Крылов Г.Г., Гадевич В.В., Антонов М. В. Молекулярно-генетические изменения у больных с диффузными формами мастопатий на фоне описторхоза в процессе лечения индинолом // Тюменский медицинский журнал.-2008.-№4. - С.39-41.

5. Сабиров А.Х., Шайн A.A., Федоров Н.М., Антонов М. В., Важенина A.A. Об использовании препарата «Промисан» в таргетной терапии онкологических больных. // Конференция онкологов Поволжья. Сборник тезисов. Казань. -2008.-С. 76-78.

6. Сабиров А.Х., Шаназаров H.A., Федоров Н.М., Шайн A.A., Гадевич В.В., Важенина A.A., Барышников А.Ю., Бычков В.Г., Нечай E.H., Барышников А.П., Кислый Д.Г., Антонов М.В. Стратегические подходы превентивной онкологии // Радиология - наука и практика. Материалы 3-го Евразийского радиологического форума. Астана. -2009. - С.33-37.

7. Сабиров А.Х., Шаназаров H.A., Антонов М. В. Нанотехнологии в медицине. // Радиология - наука и практика. Материалы 3-го Евразийского радиологического форума. Астана. -2009. -С.51-59.

8. Сабиров А.Х., Налетов A.A., Важенина A.A., Антонов М.В., Симонов A.B., Велижанина О.С., Сироткина С.М. Современные методы диагностики злокачественной трансформации клетки // Вопросы онкологии. -2010. -Т.56. -

9. Важенина A.A., Антонов М.В., Сабиров А.Х. Изменение молекулярно-генетического статуса больных метастатическим раком молочной железы в процессе комплексного лечения // Медицинская наука и образование Урала. -2010. -№4-С.14-16

Ю.Антонов М.В., Сабиров А.Х. Таргетная терапия колоректального рака. // Медицинская наука и образование Урала. -2011. -№2. -С.44-47.

П.Антонов М.В., Сабиров А.Х., Сабиров Т.М., Уткин К.В., Решетникова В.В., Барышников А.Ю. Значение молекулярно-биологических маркеров при лечении больных колоректальным раком таргетными препаратами. // Российский Биотерапевтический Журнал. -2011,- №3. -

С.35

Подписано в печать 20.05.11 . Формат60x84/16. Бумага офисная «8уе1оСору». Тираж 100 экз. Заказ № 476 Отпечатано на УМТ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН 115478, г. Москва, Каширское ш., 24

Актуальность темы.

Актуальной проблемой современной онкологии и колопроктологии является колоректальный рак, занимающий третье место в структуре онкологической патологии. Как известно 99 % колоректальных раков являются адено-карциномами, и на сегодняшний день развитие толстокишечных аденокарци-ном считается хорошо изученной моделью онкогенеза [Keighley M.R.B., 2003]. Концепция онкогенеза слизистая оболочка-аденома-рак, предложенная Muto с соавторами (1975), в настоящее время подтверждена на эпидемиологическом [Заридзе Д. Г., 1989], клиническом [Paillot В., Czernichow P., Michel Р., 1999], морфологическом [Федоров В.Д., Капуллер JI.JL, Журавлев Н.В., 1988], молекулярно-биологическом и генетическом уровнях [Houlston. R.S., 2001].

Неуклонный рост числа больных колоректальным раком обусловливает актуальность исследований, связанных с поиском путей оптимизации алгоритмов хирургического и комбинированного лечения последних [Чиссов В.И., Старинский В.В., Аксель Е.М., 2005].

Колоректальный рак (КРР) — собирательное понятие для рака ободочной (толстой) и прямой кишки, является злокачественной эпителиальной опухолью. Длительное время может протекать бессимптомно, и лишь на относительно поздних стадиях появляются признаки кишечного кровотечения, запоры, а также боль в животе разной интенсивности.

В развитых странах рак толстой и прямой кишок (колоректальный рак) - второй по распространенности вид рака и вторая ведущая причина смерти от рака. Частота развития колоректального рака начинает повышаться в возрастной группе пациентов 40 лет и достигает пика между 60 и 75 годами. Рак толстой кишки чаще встречается у женщин; рак прямой кишки - у мужчин. Около 5% больных раком толстой или прямой кишок имеют несколько злокачественных опухолей колоректальной зоны одновременно.

В России ежегодно регистрируется 4Q тыс. случаев рака толстой кишки. Умирает 31 тыс. больных. Средний показатель заболеваемости колоректальным раком составляет примерно 13,1 на 100 тыс. населения. Прослеживается стойкая тенденция к росту частоты развития опухолей этой локализации во всех развитых станах, в том числе и России. При этом отмечается значительное число случаев с поздней стадией заболевания, когда существенно затрудняется* возможность выполнения радикального хирургического вмешательства и оказания полноценной медицинской помощи. Ведущей причиной поздней« диагностики новообразований кишечника является разнообразие клинических форм заболевания и скудность их появлений на ранних стадиях, а как следствие — несвоевременное обращение больных за медицинской помощью [Базин И.С., Гарин A.M., Жарков С.А., Нариманов М.Н., 2003].

КРР является одним из наиболее распространенных видов злокачественных новообразований человека, показатели заболеваемости и смертности от которого согласно статистическим данным последнего десятилетия неуклонном растут в России и экономически развитых странах мира [Давыдов М.И., Аксель Е.М., 2005; Барсуков Ю.А., Кныш В.И., 2006; Greenlee R.T. et al., 2000; Engstrom P.F., 2000].

Несмотря на то, что хирургическое лечение остается основным методом лечения злокачественных опухолей ЖКТ, позволяющим надеяться на увеличение продолжительности и качества жизни больных, неудовлетворительные результаты лечения колоректального рака заставляют онкологов I разных стран комбинировать хирургический метод с химиотерапией. Появление на фармацевтическом рынке большого количества новых противоопухолевых препаратов (разных по стоимости и эффективности), и как следствие, возможностей различных комбинаций химиотерапевтических и хирургических методов лечения колоректального рака (КРР) подтверждает актуальность разработки системных подходов к оптимизации алгоритмов лечения, позволяющих не только значительно продлить жизнь этого контингента больных, но и, что не менее важно, существенно улучшить качество их жизни [Переводчикова Н.И., 2007].

Исходя из вышеизложенного, разработка единых подходов к оптимизации алгоритмов хирургического и комбинированного лечения колоректального рака с позиции комплексной оценки критериев эффективности проводимого лечения^ и клинико-экономического анализа является актуальной задачей современной онкологии, требующей решения.

Исследование особенностей биологического поведения опухоли является в настоящее время одной из наиболее актуальных проблем онкологии. Основой для выделения клинически значимых молекулярных факторов послужило открытие наблюдаемых в процессе развития и прогрессии опухоли структурных и функциональных изменения онкогенов и генов-супрессоров [Копнин Б.П., 2000; Pasche В. et al., 2003]. Особенности экспрессии кодируемых этими генами белков могут выявляться иммуногистохимическими методами в клетках КРР и служить специфическими показателями биологической активности раковых клеток. Кроме того, расширяются возможности для биохимического определения растворимых рецепторов антигенов в сыворотке крови больных КРР и в ткани опухоли с помощью иммуноферментных методов [Kahlenberg M.S. et al., 2003; Davies R.J. et al., 2005].

Большинство работ, посвященных изучению клинической значимости молекулярных маркеров при КРР, сосредоточено на факторах, ответственных за пролиферацию и апоптоз (Ki67, р53). Соотношение скорости клеточной пролиферации и активности индукторов и ингибиторов апоптоза обуславливает опухолевую прогрессию и влияет на развитие дополнительных компонентов зокачественного фенотипа клеток КРР [Houlston R.S. et al., 2001; Bendardaf R. et al., 2004; Arnold C.N., Blum H.E., 2005].

Несмотря на то, что в последние годы накапливается все больше данных о нарушениях нормальной» экспрессии и функционирования молекулярных факторов при КРР, их влияние на клиническое течение и прогноз заболевания изучено недостаточно. Многие вопросы, касающиеся корреляции клинико- морфологических характеристик опухоли и изменений биологических показателей, происходящих в процессе метастазирования КРР, нуждаются в уточнении. Необходимость поиска новых методов диагностики* и более точного прогнозирования течения заболевания определяет актуальность изучения молекулярных критериев, обусловливающих течение заболевание и его дальнейшее лечение [Имянитов E.H., 2005].

Неспецифичность воздействия химиотерапии на опухолевые и здоровые клетки обуславливает ее- высокую токсичность и непредсказуемость эффектов.

Скудная- клиническая картина ранних форм заболевания, сходство симптоматики КРР с проявлением различных патологических состояний толстой кишки, поздняя обращаемость пациентов за квалифицированной медицинской помощью являются причиной того, что только 30-40% больных в дальнейшем подвергаются радикальному лечению. При этом у лиц с локализованной формой болезни остается высокой вероятность наличия отдаленных субклинических микрометастазов. Пятилетняя выживаемость больных КРР едва достигает 40% [Кныш В.И., 1997].

Таким образом, неуклонный рост заболеваемости и чрезвычайно низкая выявляемость ранних форм КРР, а также малоутешительные результаты хирургического вмешательства заставляют искать новые и совершенствовать традиционные методы комбинированного и комплексного лечения с включением в лечебный план лучевой и химиотерапии. В столь сложной ситуации только успехи лекарственного лечения могут существенным образом улучшить отдаленные результаты и увеличить продолжительность жизни этой категории пациентов [Имянитов E.H., 2005].

Несмотря на имеющиеся успехи при лечении больных КРР, современная химиотерапия вообще, и с применением фторпиримидинов« в частности, обладает рядом недостатков. Главным из- них является эмпиричность назначений различных комбинаций цитостатиков. Как правило, выбор схемы лечения* основывается на достаточно косвенных показателях, таких как общее состояние пациента, клиническая картина заболевания, стадия процесса и морфологическая характеристика опухоли. Однако клиническое течение КРР различается даже в пределах однородной группы пациентов. Подобная гетерогенность течения* заболевания и, как следствие, ответа на терапию связана со сложностью внутриклеточных взаимодействий, мозаичностью новообразований толстой кишки, обусловленной поликлональностью с различными биологическими характеристиками и чувствительностью к лекарственным агентам.

По-видимому, под видом одного и того же морфологического* типа опухолей скрывается несколько разновидностей заболевания, отличающихся по своему молекулярному патогенезу [Имянитов E.H., 2005; Houlston R.S., 2001]. Поэтому, знание молекулярно-биологических и генетических особенностей КРР может способствовать оптимизации лекарственного лечения пациентов данной нозологической группы.

В последние годы активно развивается так называемая целевая (target) терапия злокачественных опухолей. В ее основе лежит точечное воздействие на определенные клеточные рецепторы или сигнальные пути, передающие информацию в ядро клетки. Наиболее перспективными мишенями представляются рецепторы ростовых факторов - эпидермального фактора роста (EGFR) и сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF), которые достаточно часто гиперэкспрессируются в опухолях. В настоящее время три таких препарата зарегистрированы для лечения рака толстой кишки (РТК) - цетуксимаб, панитумумаб и бевацизумаб. Результатом сочетания применения таргетных препаратов со своевременной диагностикой является продление жизней приговоренных пациентов на месяцы, а иногда - годы, что для лечения такого рода заболеваний -огромное достижение. Отмечены такие уникальные особенности таргетных препаратов, как зафиксированное троекратное увеличение медианы безрецидивной выживаемости больных раком, низкая токсичность, возможность амбулаторного применения для пациентов любого возраста [В.Б. Матвеев, 2009].

Цель работы.

Определить значение молекулярно-биологических маркеров при лечении больных колоректальным раком (КРР) таргетными препаратами.

Задачи исследования.

1. Определить молекулярно-генетические маркеры в опухоли и сыворотке крови больных колоректальным раком до и в процессе лечения таргетными препаратами.

2. Определить клиническую значимость особенностей экспрессии молекулярно-генетических маркеров.

3. Оценить эффективность результатов лечения больных колоректальным раком с применением таргетных препаратов бевацизумаб и цетуксимаб.

Научная новизна.

Колоректальный рак (КРР) является одной из ведущих причин в структуре смертности от злокачественных новообразований. По оценкам экспертов, у 50% пациентов с этим заболеванием возникают метастазы, и в конечном итоге именно это заболевание становится непосредственной причиной их смерти.

До недавнего времени лечение метастатического колоректального рака основывалось на применении 5-фторурацила в режиме монотерапии; при этом* уровень терапевтического ответа составлял около 10%. Внедрение в клиническую практику инфузионного введения 5-фторурацила в сочетании с биомодуляцией фолиновой кислотой позволило повысить этот показатель до 17-32% и увеличить общую выживаемость до 12-16 мес. Современные режимы терапии предусматривают применение комбинации 5-фторурацила и фолиновой кислоты с иринотеканом (инфузионное введение этих препаратов, схема РОЬРШ!) или иринотекана в сочетании, с болюсным введением 5-фторурацила, фолиновой кислоты и лейковерина (1КЬ), а также инфузионное введение 5-фторурацила, фолиновой кислоты и оксалиплатина (РОЫЮХ). Как свидетельствуют результаты рандомизированных клинических исследований, уровни терапевтического ответа- при использовании указанных схем составляют 31-56%, время выживаемости больных без прогрессирования заболевания - 6,7-9 мес, общая выживаемость - 14,8-21,5 мес. Показано, что повысить показатели выживаемости пациентов с КРР позволяет комбинация режимов химиотерапии как первой, так и второй линий с препаратом бевацизумаб — гуманизированными моноклональными антителами, направленными против сосудистого эндотелиального фактора роста (УЕОР). В настоящее время перспективным путем повышения эффективности лечения пациентов данной категории считается внедрение в клиническую практику инновационных лекарственных препаратов биологического происхождения, прицельно блокирующих рецепторы эпидермального фактора роста (ЕОРЯ). Новый подход к диагностике и прогнозированию клинического течения КРР основан на использовании показателей экспрессии молекулярно-биологических маркеров, определяющих инвазивно-метастатический потенциал опухолевых клеток. Впервые проведен комплексный клиникоморфологический, иммуногистохимический, молекулярно-генетический и, биохимический анализ целого ряда, современных молекулярных факторов; таких как, белки- супрессоры метастазирования; факторы апоптоза, маркеры пролиферативной активности. Показана четкая взаимосвязь экспрессии!ряда-белков с развитием- метастазов?, и рецидивов КРР и,, как следствие, возможность использования данных маркеров для уточнения? диагноза и прогноза выживаемости. На; основании« исследованиям молекулярных, характеристик КРР разработаны фенотипические критерии, позволяющие идентифицировать случаи КРР с повышенным риском; развития отдаленных метастазов. Впервые при КРР изучена корреляция' между экспрессией; супрессоров метастазирования, белков межклеточных, контактов и БМ и активностью протеолитических ферментов и компонентов системы активации плазминогена. Изучение экспрессии белковых маркеров? в первичных опухолях и метастазах КРР позволило уточнить некоторые механизмы, обеспечивающие метастазирование опухолевых клеток [Ы. МооБшапп, V. Нететапп, 2007].

Практическая значимость.

Настоящая работа представляет практический интерес для; оценки прогноза больных КРР и выделения групп повышенного риска развития метастазов и рецидивов, требующих дополнительного лечения или? более тщательного динамического наблюдения. Проведенное исследование позволило на основании полученных данных выделить наиболее надежные признаки повышенного риска отдаленного метастазирования КРР, которые могут использоваться для индивидуального прогнозирования: течения заболевания у больных КРР. Принадлежность пациента по результатам оценки экспрессии маркеров к группе неблагоприятного, прогноза позволяет предложить более тщательную программу диагностических мероприятий, проведение расширенного объема обследований, планирование адъювантной химиотерапии на более ранних стадиях КРР.

На основе анализа молекулярных особенностей опухоли определены прогностические критерии для оценки предрасположенности больных КРР к развитию метастазов с использованием иммуногистохимических, электронно- микроскопических и биохимических методов. Результаты исследования будут внедрены в клиническую практику.

Апробация работы.

Основные положения работы были доложены и обсуждены на Всероссийской научно-практической конференции «Биотерапия» Москва, 2008.; конференции онкологов Поволжья. Казань, 2008; на 3-ем Евразийском радиологическом форуме Астана, 2009г.; II Всероссийской научной конференции с международным участием «Наноонкология» г. Тюмень 26-28 сентября 2010 г. и на региональной онкологической конференции ЯНАО март 2011 г.; совместной научной конференции кафедр: онкологии с курсом лучевой диагностики и лучевой терапии, хирургии ФПК и ППС, патанатомии, гистологии и эмбриологии, оперативной хирургии и топографической анатомии, социальной гигиены и организации здравоохранения ГОУ ВПО ТюмГМА Минздравсоцразвития РФ 12 апреля 2011 года.

Внедрение результатов исследования. Результаты исследования внедрены в практику ГУ Курганского областного онкологического диспансера, ГЛПУ Тюменского областного онкологического диспансера и в учебный процесс на кафедре хирургических болезней с курсами эндоскопии, урологии и рентгенологии ГОУ ВПО «Тюменской государственной медицинской академии» Минздравсоцразвития России.

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 11 научных работ, 3 из них, в рецензируемых ВАК журналах.

Структура и объем диссертации.

Диссертация изложена на 120 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, глав результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, практических рекомендаций и выводов. Текст иллюстрирован 20 таблицами, 2 диаграммами и 31 рисунком (в том числе микрофотографиями). Указатель литературы содержит 166 работ отечественных и зарубежных авторов.

выводы

1. Экспрессия в образцах опухоли рецепторов эпидермального (EGFR) и сосудисто-эндотелиального (VEGFR) факторов роста коррелирует со степенью морфологической дифференцировки опухоли. Чем ниже была степень дифференцировки опухоли, тем выше экспрессия, рецепторов ростовых факторов.

2. Общая выживаемость« больных при гиперэкспрессии EGFR уменьшается с 27, 6 месяцев, пр№ отсутствии маркера, до 20;6 месяцев. Время без прогрессирования при гиперэкспрессии EGFR уменьшается с 13,3 месяцев, при отсутствии маркера, до 10,7 месяцев:

3. Общая выживаемость при гиперэкспрессии VEGFR уменьшается^ 27,8 месяцев, при отсутствии VEGFR, до 24,4 месяцев. Время' без прогрессирования при гиперэкспрессии VEGFR уменьшается с 13,4 месяцев, при отсутствии маркера, до 10,6 месяцев.

4. Экспрессия маркера пролиферации антигена Ki-67 зависит от степени морфологической дифференцировки опухоли. Чем ниже степень дифференцировки опухоли, тем выше экспрессия антигена Ki-67. Экспрессия антигена Ki-67 коррелирует с экспрессией рецепторов ростовых факторов. Высокая пролиферативная активность, клеток аденокарциномы толстого кишечника, исследованная с помощью- Ki-67, является достоверным фактором неблагоприятного прогноза общей выживаемости.

5. В сыворотке крови больных колоректальным- раком до лечения и в процессе лечения обнаружены мутации в генах Р53, APC, B-raf, O-kit, E-cadherin. При терапии таргетными препаратами общее количество мутаций снижается.

6. У больных проходивших лечение с добавлением таргетных препаратов бевацизумаб и цетуксимаб наблюдалось увеличение показателей общей выживаемости и выживаемости без прогрессирования. При применении схемы химиотерапии FOLFIRI + цетуксимаб общая выживаемость составила 26,1 месяцев, ВПБ - 11,4 месяцев. При применении схемы химиотерапии FOLFIRI + бевацизумаб общая- выживаемость составила 27,7 месяцев, ВПБ — 13,5 месяцев. При использовании схемы FOLFIRI общая выживаемость составила 20,6 месяцев, ВБП — 10,9 месяцев.

7. В процессе исследования, схема химиотерапии FOLFIRI + бевацизумаб показала себя более эффективной по сравнению с FOLFIRI + цетуксимаб. При сравнении этих схем медиана выживаемости на 1,7 месяца больше при применении FOLFIRI+бевацизумаб, чем при FOLFIRI+ цетуксимаб.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Определена совокупность молекулярно-биологических маркеров, которые являются значимыми и независимымы факторами прогноза. БРВ больных КРР. На их основе выделены, наиболее надежные признаки повышенного риска развития КРР, которые могут использоваться' для' индивидуального прогнозирования различного течения опухолевого заболевания. Последние рекомендуются для внедрения в практику лечебных учреждений онкологического профиля, использующих методы иммуногистохимического исследования» в процессе морфологической диагностики опухолей человека. Оценка выявленных признаков неблагоприятного прогноза заболевания является одним из путей совершенствования лечения этой категории пациентов.

2. Использование результатов иммуногистохимического исследования содержания молекулярно-биологических маркеров в опухоли позволяет в зависимости от прогнозируемого исхода заболевания ^ больного предложить более тщательную программу диагностических мероприятий, проведение расширенного объема обследований, планирование адъювантной химиотерапии на более ранних стадиях КРР, а также стимулирует дальнейший поиск дополнительных молекулярно-биологических факторов прогноза для различных новообразований человека.

3. Рекомендуется внедрение иммуногистохимического и биохимического определения содержания маркеров в практику любого онкологического учреждения, как методов, позволяющих не только прогнозировать течение заболевания, но и служащих перспективной моделью для разработки препаратов направленного действия для противоопухолевой и антиметастатической терапии. Определение экспрессии ряда факторов может использоваться для оценки эффективности химиотерапии, а также для изучения механизмов канцерогенеза, обеспечивающих метастазирование опухолевых клеток.

4. Рекомендовано определение молекулярно-генетического статуса больных КРР по парафинированным образцам и по плазме крови в процессе лечения с целью определения эффективности проводимого специального лечения и полноты излеченности больных КРР. Считаем что, необходимым и патогенетически обоснованным является назначение таргетной терапии к схеме FOLFIRI блокаторов рецепторов эпидермального фактора роста (EGFR) цетуксимаба и сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) бевацизумаба, увеличивающие уровень общей выживаемости и выживаемости без прогрессирования КРР.