Автореферат и диссертация по медицине (14.01.25) на тему:Значение исследования морфофункционального статуса циркулирующих моноцитов у больных саркоидозом

На правах рукописи

Эль Зенн Билал Амине

ЗНАЧЕНИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНОГО СТАТУСА ЦИРКУЛИРУЮЩИХ МОНОЦИТОВ У БОЛЬНЫХ САРКОИДОЗОМ

14.01.25 - пульмонология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

г я ноя 2013

005540192

Москва 2013 1

005540192

Работа выполнена на кафедре пульмонологии Первого московского государственного медицинского университета имени И.М.Сеченова

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН Палеев Николай Романович

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, начальник пульмонологического отделения ФГКУ главный военный клинический госпиталь им. H.H. Бурденко МО РФ

Зайцев Андрей Алексеевич

Доктор медицинских наук, профессор, профессор кафедры фтизиатрии ГБОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образования» Минздрава России Борисов Сергей Евгеньевич

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет имени А.И. Евдокимова».

Защита диссертации состоится «16» декабря 2013 года в 14.00 на заседании диссертационного совета (Д 121.001.01) при ФГБУ «Учебно-научный медицинский центр» Управления делами Президента Российской Федерации по адресу: 109012, Москва, Б. Черкасский пер., 11.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «Учебно-научный медицинский центр» Управления делами Президента Российской Федерации по адресу: Москва, 121359, ул. Маршала Тимошенко, д. 21.

Автореферат разослан «15» ноября 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук

профессор М.Д. Ардатская

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АПФ - Ангиотензинпревращающий фермент

БАЛ - Бронхоальвеолярный лаваж

ГКС - Глюкокортикостероиды

Группа А - Группа пациентов с активным течением саркоидоза

Группа Н - Группа пациентов с неактивным течением саркоидоза

жБАЛ - Жидкость бронхоальвеолярного лаважа

ЖЕЛ - Жизненная емкость легких

ИЛ - Интерлейкин

ИРИ - Иммунорегуляторный индекс

ИТ - Индекс Тиффно

ИФН -у - Интерферон -у

КТВР - Компьютерная томография высокого разрешения НЗ - Статистически незначимая разница НК - клетки Натуральные киллеры ОЕЛ -Общая ёмкость легких ОЛ - Остаточный объём легких ОФВ1 - Объём форсированного выдоха за 1 секунду ТНК - Т - лимфоциты, экспрессирующие маркеры натуральных киллеров ФЖЕЛ - Форсированная жизненная емкость легких ФНО-а - Фактор некроза опухоли альфа ФРН - Функциональная респираторная недостаточность ЭКГ - Электрокардиография Эхо-КГ -Эхокардиография СО - Кластеры дифференцировки лимфоцитов ОЬсо - Диффузионная способность легких

ОМ-СЙР - Гранулоцитарно - макрофагальный колониестимулирующий фактор НЬА-ВК+ - Маркер активности клеток крови Ра - Фазовая площадь Рс1 - Фазовый диаметр РЬ - Фазовая высота

РН|. процентное содержание клеток с фазовой высотой >2 мкм,-РНг. процентное содержание клеток с фазовой высотой <2 мкм Рр - Фазовый периметр Ру - Фазовый объём

УЬА-1- Ранний антиген адгезии и активации клеток крови из подсемейства интегрина.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Саркоидоз - воспалительное заболевание неизвестной этиологии, характеризующееся образованием неказеозных гранулем с последующим их рассасыванием или формированием фиброза (Борисов С.Е., 1995, Визель A.A., 2010). С наибольшей частотой вовлекаются в патологический процесс внутригрудные лимфатические узлы и легочная паренхима, что определяет актуальность разработки способов диагностики, оценки течения и прогноза внутригрудного саркоидоза (Борисов С.Е., 2006, Визель И. Ю., 2012).

Активность системного воспаления и степень его выраженности - важные характеристики саркоидоза; их оценка позволяет решать задачи контроля за течением болезни и определять показания к патогенетической терапии. Многочисленные попытки выявить универсальные критерии активности воспалительного процесса при саркоидозе не увенчались успехом. В настоящее время ведущую роль в инициации, формировании и поддержании хронического воспаления при саркоидозе отводят клеткам системы мононуклеарных фагоцитов (в частности, моноцитам и образующимся из них макрофагам).

При саркоидозе эти клетки обладают высокой антигенпрезентирующей активностью, способны синтезировать значительное количество различных цитокинов, молекул адгезии, факторов клеточного роста (Rossol М., 2012, Heron М., 2008, Салина Т.Ю., 2010, Terao et al., 1993). В отличие от здоровых доноров и больных другими гранулематозными заболеваниями, моноциты периферической крови больных саркоидозом обладают выраженной способностью к формированию многоядерных гигантских клеток in vitro под действием факторов воспаления (гамма интерферона, ИЛ-3, ГМ-КСФ) (van Maarsseveen Т.С., 2009, Minuno К. et al., 2001). Циркулирующие моноциты способны экспрессировать на своей поверхности маркеры их активности (CD16/CD69/VLA-1) (Heron et al., 2008). Кроме того, эти клетки синтезируют большое количество ИЛ-12, который является одним из важных факторов, определяющих дифференцировку Т-лимфоцитов (Moller et al., 2001). Изучение мононуклеарных фагоцитов оказывается важным и вследствие наличия у них большого количества глюкокортикостероидных рецепторов.

В литературе встречаются противоречивые результаты о степени активности моноцитов периферической крови при внутригрудном саркоидозе. Также отсутствуют данные об использовании морфологических характеристик клеток мононуклеаров периферической крови, как с целью определения активности воспалительного процесса, так и прогнозирования течения болезни и эффективности противовоспалительной терапии при саркоидозе легких и внутригрудных лимфатически узлов. В последние годы для изучения морфо -функциональных характеристик моноцитов периферической крови используется метод прижизненной фазово-интерференционной микроскопии (Терпигорев С.А., 2003, Василенко И.А., 2009). Данное исследование у больных саркоидозом легких и внутригрудных лимфатических узлов до настоящего времени не

проводилось. Таким образом, исследование фазового портрета циркулирующих мононуклеарных фагоцитов с определением их чувствительности к глюкокортикостероидам может быть полезной для оценки активности системного воспалительного процесса и для прогнозирования эффективности стероидной терапии при таких хронических воспалительных заболеваниях как саркоидоз. Вышеизложенное определило цель и задачи исследования.

Цель исследования - Выявить особенности морфофункциональных характеристик моноцитов периферической крови при саркоидозе легких и внутригрудных лимфатических узлов и определить их значение в оценке активности и прогноза заболевания.

Задачи исследования

1. Изучить морфофункциональные характеристики моноцитов периферической крови больных саркоидозом с различной степенью активности текущего воспаления.

2. Сопоставить изменения популяционного состава циркулирующих лимфоцитов с морфофункциональными характеристиками моноцитов периферической крови при внутригрудном саркоидозе.

3. Определить прогностическую значимость морфофункциональных характеристик моноцитов периферической крови при саркоидозе.

4. Сравнить морфофункциональные параметры циркулирующих моноцитов со степенью нарушений функциональных параметров дыхания в оценке прогнозировании противовоспалительной терапии у больных саркоидозом.

5. Сопоставить чувствительность циркулирующих моноцитов больных внутригрудным саркоидозом к преднизолону in vitro с результатами терапии системными глюкокортикостероидами.

Научная новизна

• Впервые у больных саркоидозом проведено исследование морфофункционального состояния циркулирующих моноцитов методом прижизненной компьютерной морфометрии. Установлено, что снижение фазовой высоты периферических моноцитов и смещение их популяционного состава в сторону преобладания клеток с малой фазовой высотой характеризуют больных с активным течением воспалительного процесса при саркоидозе легких.

• Изучена связь между исходными параметрами морфометрии циркулирующих моноцитов и эффективностью терапии преднизолоном. Выявлено, что благоприятный результат лечения наблюдался у пациентов, моноциты которых имели больший фазовый диаметр, фазовый периметр и фазовую площадь.

• В ходе клиничекого исследования проведен анализ динамики функциональных параметров дыхания и чувствительности к терапии ГКС. Установлено, что диффузионная способность легких является наиболее динамичным функциональным показателем в оценке динамики заболевания (как прогрессирования, так регрессирования) и эффективности противовоспалительной терапии.

• Впервые сопоставлена чувствительность моноцитов периферической крови к преднизолону in vitro в концентрации 10"4 ммоль/л с эффективностью стероидной терапии у больных саркоидозом легких и внутригрудных лимфоузлов. Установлено, что при инкубации моноцитов периферической крови с преднизолоном больных саркоидозом, увеличение фазовых высот моноцитов сочеталось с благоприятным результатом терапии ГКС.

Практическая значимость.

С учётом отсутствия универсального маркера активности и прогностических критериев эфффективности противовоспалительной терапии больных саркоидозом доказана необходимость внедрения в практику исследования морфофункционального статуса циркулирующих моноцитов методом компьютерной морфометрии.

Доказано, что снижение фазовой высоты моноцитов и смещение популяции моноцитов в сторону преобладания клеток с малой фазовой высотой может рассматриваться в качестве дополнительного маркера активности саркоидоза.

Показано, что изменение исходных фазовых параметров моноцитов периферической крови и фазовой высоты этих клеток после инкубации их с преднизолоном in vitro у больных со сниженной диффузионной способностью легких может быть использованы как предикторы эффективности противовоспалительной терапии.

Положения, выносимые на защиту

1. У больных с клинико-рентгенологическими и функциональными признаками активности воспалительного процесса выявляются лимфоцитоз жБАЛ, повышенный уровень неоптерина крови, повышение относительного количества CD3+CD16+CD56+, снижение числа CD3-CD16+CD56+, лимфоцитоз жидкости БАЛ и увелчение уровня неоптерина крови.

2. При изучении морфофункциональных параметров циркулирующих моноцитов, больные саркоидозом отличались снижением фазовых показателей по сравнению с группой здоровых доноров. Больные с признаками активности системного воспалительного процесса при саркоидозе характеризовались сниженным значением фазовых высот моноцитов периферической крови.

3. При исследовании морфометрических показателей моноцитов периферической крови при саркоидозе, благоприятное течение заболевания сочеталось с повышенными фазовыми размерами (в частности, периметр, диаметр, и площадь) этих клеток.

4. Положительный эффект терапии ГКС больных саркоидозом сопровождается более высокими фазовыми параметрами циркулирующих

моноцитов и пониженным значением диффузионной способности легких (менее 69%), и связан с чувствительностью моноцитов к преднизолону in vitro. Тогда как резистентность к терапии сочетается с отсутствием динамики морфофункциональных параметров этих клеток при инкубации их с преднизолоном.

Внедрение результатов исследования. Основные положения диссертации внедрены в практику отделения кардиопульмонологии ГБУЗ МО МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского. Полученные данные используются в учебном процессе кафедры пульмонологии первого МГМУ им. И.М. Сеченова и кафедры терапии ГБУЗ МО МОНИКИ им. М.Ф.Владимирского.

Апробация работы состоялась 16 января 2013 на совместной конференции кафедры пульмонологии ФППОВ ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И. М. Сеченова и кафедры терапии ГБУЗ МО Московского Областного Научно - Исследовательского Клинического Института им. М.Ф.Владимирского.

Публикации по теме диссертации - По материалам диссертации опубликовано 14 научных работ, из них 4 - в журналах, рекомендованных ВАК. В ходе клинического исследования получен патент на изобретение № 2382364 "Способ прогнозирования эффективности лечения глюкокортикостероидами".

Структура и объём диссертации - Диссертация изложена на 143 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, 4 глав собственных исследований, выводов, практических рекомендаций, библиографического указателя использованной литературы, который содержит 51 отечественных и 153 иностранных источников. Работа иллюстрирована 31 рисунками и 30 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование проходило на базе отделения кардиопульмонологии ГБУЗ МО МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского. Исследование проводилось в 3 этапа.

Этап 1. Оценивалась рентгенологическая стадия болезни, активность текущего воспалительного процесса, степень выраженности кинических и функциональных нарушений и определялась дальнейшая тактика ведения пациента (п=120).

Этап 2. Проводился морфометрический анализ моноцитов периферической крови методом фазовой прижизненной компьютерной морфометрии у 52 пациентов саркоидозом (41 женщина и 11 мужчин). Повторное исследование проводилось через 3-6 месяцев.

Этап 3. Проводилась динамическая оценка активности и тяжести болезни у всех пациентов, фиксировалась её текущая рентгенологическая стадия и определялся вариант ее течения за прошедший период (прогрессирующий, регрессирующий и стабильный). Дальнейшее наблюдение за больными проводилось в течение 6-36 месяцев.

Этап 4. Оценивался исход заболевания и эффективность проведенного лечения. Использовались те же методы исследования, что и на 1 этапе.

Клиническая характеристика больных. Для решения поставленных задач обследовано 120 больных внутригрудным саркоидозом (средний возраст 46,5 лет ± 12.1) и 20 здоровых лиц. Среди больных саркоидозом были 25 (20,9%) мужчин и 95 (79,1 %) женщин. Для разделения больных на группы использовалась международная классификация, основанная на результатах лучевых исследований (De Remee, 1983), согласно которой при первичном обращении I стадия была выявлена у 21,7%, II стадия - у 64,1%, III стадия - у 11%, IV стадия - у 5,1% больных.

По критерию активности заболевания пациенты были разделены на группу активного (группа А, 85 человек) и неактивного (группа Н, 35 человек) течения. На основании результатов динамической оценки клинических, рентгенологических и функциональных характеристик болезни каждая группа была разделена на подгруппы. В группу А вошли больные острой формой (синдром Лефгренна - 15 пациентов) и больные с активным стабильным (при наличии функциональных маркеров активности заболевания) и при ухудшении функциональной и рентгенологической симптоматики - прогрессирующего течения (15, 31, 39 пациентов, соответственно), группу неактивного течения (Н) составили больные с регрессирующим (при регрессии клинических, функциональных и рентгенологических признаков) и стабильным течением (при отсутствии лабораторных маркеров активности) (10 и 25 пациентов, соответственно).

Критерии включения в исследование: Больные обоего пола старше 18 лет; с установленным диагнозом саркоидоза с поражением легких и внутригрудных лимфоузлов, письменное информированное согласие больного на участие в клиническом эксперименте.

Критерии исключения: возраст менее 18 лет, сопутствующие заболевания в стадии обострения; беременность и кормление грудью.

Критериями начала терапии системными стероидами были: значимое прогрессирование клинических, рентгенологических симптомов и функциональных нарушений (снижение ФЖЕЛ, ОФВ1, ЖЕЛ, Dlco) в течение 36 месяцев наблюдения, клинически значимое повышение уровня кальция крови выше 3 ммоль/л. Назначалось иммуносупрессивное лечение (системные глюкокортикостериоды в начальной дозе 20-30 мг/сутки, поддерживающая доза (10-12.5 мг/сутки в пересчете на преднизолон), или гидроксихлорохин в дозе 400 мг/сутки).

Контрольная группа была сформирована для изучения морфометрических характеристики циркулирующих моноцитов в здровой популяции и составила 20 человек. Возраст обследованных варьировал от 21 до 32 лет.

Обследование включало в себя общий анализ крови и мочи, биохимический анализ крови. Производилась рентгенография и компьютерная томография высокого разрешения (КТВР) органов грудной клетки, ультразвуковое исследование органов брюшной полости, забрюшинного пространства и периферических лимфоузлов, электрокардиография в

двенадцати стандартных отведениях (при необходимости регистрировались дополнительные отведения V1-V5 на 2 межреберья ниже обычного уровня) и ЭХО КГ.

Состояние функции внешнего дыхания изучали методами спирометрии и общей плетизмографии. Исследовали диффузионную способность легких (DLco) методом одиночного вдоха с задержкой дыхания.

Для морфологической верификации диагноза проводились исследования биоптатов, полученных методом трансбронхиальной фибробронхоскопической биопсии, биоптатов кожи, и периферических лимфоузлов. Выполнялся бронхоальвеолярный лаваж по общепринятой методике. Клеточный осадок окращивали по Романовскому - Гимзе.

Иммунофенотипироваиие лимфоцитов периферической крови проводилось методом проточной цитометрии у 52 пациентов. В результате иммунофенотипирования выделяли следующие подтипы клеток: CD3+ зрелые Т-лимфоциты; CD3+CD4+ (Т-хелперы); CD3+CD8+ - Т - цитотоксические лимфоциты; CD4/CD8 - иммунорегуляторный индекс (ИРИ); CD3+CD (16+56) Т-лимфоциты, экспрессирующие маркеры НК-клеток (Т- натуральные киллеры ТНК); CD3-CD16+CD56 - естественные киллеры - НК-клетки; CD19+ - В-лимфоциты; CD3+HLA-DR+ (Т-лимфоциты активированные); CD3-HLA-DR+ (активированные В-лимфоциты и НК-клетки).

Для определения активности клеток моноцитарно - макрофагольной системы проводилось определение уровня неоптерина в сыворотке крови методом конкурентного иммуноферментного анализа.

Впервые проводилось изучение прижизненных морфометрических параметров циркулирующих моноцитов (использовался компьютерный фазово-интерференционный микроскоп «Цитоскан» МГИРЭА, Москва). Результаты расчётов выводились на дисплей в виде таблицы параметров каждого объекта и серии графиков. При этом определялись следующие параметры: Фазовая высота (Ph), Фазовый диаметр (Pd), Фазовый периметр (Рр), Фазовый объём (Pv), и Фазовая полщадь (Ра) до и после инкубации клеток с преднизолоном в концентрации 10"4mmol/l in vitro.

Статистический анализ: Количественные переменные обрабатывали методами описательной статистики (даны как средние ± стандартное отклонение, медианы и 1,3 квартили). Количественные переменные в независимых группах сравнивали с помощью непарного t-критерия Стьюдента, или критерия Манна-Уитни, в зависимости от распределения данных; качественные переменные - с помощью теста %2 и точного теста Фишера. Анализ корреляций между переменными проводили по методу Спирмэна. Результаты сравнительного исследования анксиолитиков анализировали у больных, закончивших исследование по протоколу (п=47). За уровень статистической значимости брали а = 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Морфометрические показатели моноцитов периферичечкой крови в оценке активности саркоидоза.

Наличие признаков активности воспаления и степени ее выраженности -важные характеристики саркоидоза. Под «активностью» саркоидоза понимают наличие клинико-рентгенологических, функциональных и лабораторных проявлений воспалительного процесса, связанного с формированием гранулем, либо признаки текущего фиброзообразования. У 25 пациентов на момент включения в исследование выявлялась одышка при физической нагрузке. Значимой корреляции между выраженностью одышки в баллах (по шкале ММЯС) и рентгенологической стадией болезни не было найдено. Одышка отсутствовала у 66,7% больных с IV стадией болезни и у 62,5% пациентов с КТВР признаками легочного фиброза.

Средние исходные значения ЖЕЛ, ФЖЕЛ, ОФВ1, ИТ, ОЕЛ, ООЛ в группах активного и неактивного течения находились в рамках нормального диапазона. Значимых различий между группами по функциональным параметрам обнаружено не было (табл.1).

Таблица 1

Общая группа, п=120 Группа А, п=85 Группа Н, п=35

ЖЕЛ 87,0 (76,0-92,1) 84,7±12,1 87,0 (78,5-91,5)

ФЖЕЛ 88,0 (80,1-94,0) 87,0 (79,0-97,0) 88,0 (82,5-90,0)

ОФВ1 87,1 (80,8-94,0) 87,7 ±14,9 89,5 (83,0-92,0)

ИТ 88,0 (82,8-98,0) 88,0 (81,0-98,0) 87,2 (83,6-91,0)

Шсо 74,1±14,3 73,6±14,6 75,2±13,4

Больные с клинико-рентгенологическими признаками активности саркоидоза отличались повышением содержания лимфоцитов жидкости бронхоальвеолярного лаважа (жБАЛ) [17,0 (10,0-26,0) и 9,0 (8,0-11,0), соответственно, р<0,0001] и увеличением неоптерина крови (17,1±8,8 и 6,9±3,5, соответственно, р<0,0001) (табл.2).

Полученные данные подтверждают положение о том, что лимфоцитозом жБАЛ и повышенный уровень неоптерина крови являются маркерами активности воспалительного процесса.

Таблица 2

Уровень лимфоцитов и нейтрофилов жидкости БАЛ в зависимости от

активности саркоидоза и рентгенологической стадии болезни

% лимфоцитов жБАЛ, п=106 % нейтрофилов жБАЛ, п=106 Неоптерин крови (нмоль/л), п=103

Все больные. 13,0(8,0-20,0) 6,5 (2,0-11,0) 11,6 (7,1-17,8)

Группа А, п=73 17,0(10,0-26,0) * 7,0 (2,0-11,0) 17,1±8,8 *

Группа Н, п=32 9,0 (8,0-11,0) 5,0 (2,5 -9,0) 6,9±3,5

Примечание: * - р <0,0001 с группой Н

В таблице 3 представлены результаты чувствительности и специфичности лимфоцитоза жБАЛ и неоптерина крови в оценке активности саркоидоза легких и внутригрудных лимфатических узлов.

Таблица 3

Чувствительность и специфичность лимфоцитоза жБАЛ и неоптерина крови в

оценке активности саркоидоза легких

Неоптерин крови >10 ммоль/л Лимфоцитоз жБАЛ (>10%)

Специфичность 73,5 47

Чувствительность 82,6 78

Как видно из рис.1 высокий уровень неоптерина крови сочетался с лимфоцитозом жидкости БАЛ за счёт доли больных группы активного течения (г=0,33,р<0,0001).

С? 85

1.2 4,7 9,0 12,4 16,0 19,5 23,4 26,9 32,9 38,0 41,9

уровень неоптерина (шкш)

Рисунок 1. Корреляционная зависимость уровня неоптерина крови с количеством лимфоцитов жидкости БАЛ при саркоидозе.

Компьютерная прижизненная морфометрия моноцитов периферической крови проводилась у 52 больных саркоидозом легких и внутригрудных лимфоузлов (41 женщина и 11 мужчин).

У 11 больных (21,2%) выявлялись признаки неактивного течения саркоидоза, а у 41 пациента (78,8%) были обнаружены клинические либо лабораторные (лимфоцитоз жБАЛ в сочетании с высоким уровнем неоптерина, гиперкальциемия) признаки воспалительной активности в сочетании с изменением легочной паренхимы на КТ по типу множественных очаговых затемнений с участками «матового стекла».

Синдром Леффгрена наблюдался в 6 случаях. Сравнение морфофункциональных параметров циркулирующих моноцитов больных саркоидозом и здоровых доноров позволило выявить их достоверное различие по диаметру (8,8±0,9 и 9,5±0,4, соответственно, р<0,0001), периметру (25,6±2,6 и 27,8±1,3, соответственно, р<0,0001) и площади (46,3±8,9 и 52,4±4,2,

соответственно, р<0,0001) (табл. 4).

Таблица 4

Морфометрические параметры моноцитов периферической крови больных

Параметры морфометрии Больные саркоидозом, п=52 Доноры, п=20 Р

Фазовый диаметр (Рё) (мкм) 8,8±0,9 9,5±0,4 <0,0001

Фазовый периметр (Рр)(мкм) 25,6±2,6 27,8±1,3 р<0,0001

Фазовая высота (РЬ) (мкм) 2,1 ±0,3 2,0±0,1 нз

Фазовая площадь (Ра) (мкм2) 46,3±8,9 52,4±4,2 р<0,0001

Фазовый объём (Ру) (мкм3' 47,2±12,1 44,5±4,9 нз

Как видно из таблице 5, фазовая высота циркулирующих моноцитов больных группы активного течения достоверно различались от пациентов группы неактивного течения (2,1±0,3 и 23±0,3, соответственно, р<0,01).

Таблица 5

Морфометрические параметры моноцитов периферической крови у больных _саркоидозом в зависимости от активности воспаления. _

Параметры морфометрии Группа А, п=41 Группа Н, п=11 Р

Фазовый диаметр (РсГ) (мкм) 8,8±1,0 8,9±0,6 НЗ

Фазовый периметр (Рр)(мкм) 25,5±2,8 26,0±2,0 нз

Фазовая высота (РЬ) (мкм) 2,1 ±0,3 2,3±0,3 <0,01

Фазовая площадь (Ра) (мкм^ 45,8±8,6 48,2±10,0 нз

Фазовый объём (Ру) (мкм3' 45,7±11,0 52,7±14,9 нз

Морфометрические показатели моноцитов периферической крови достоверно не различались по полу, возрасту, и по продолжительности заболевания (р>0,05). Выраженности одышки тоже не влияла на значение фазовых параметров этих клеток (р>0,05).

Для оценки ядерного полиморфизма моноциты дискриминировали по величине их фазовой высоты (РН): РН]>2 мкм, РН2<2 мкм. У здоровых добровольцев и больных саркоидозом процентное содержание клеток в циркулирующей популяции с соответствующими значениями фазовой высоты составило 32,7±9,2 и 49,2±24,8 (РНО, 67,3±9,4 и 50,8±24,8 (РН2), соответственно, р<0,004). При этом, моноциты больных саркоидозом имели малые значения таких фазовых показателей как диаметр, периметр и площадь, по сравнению со здоровыми донорами (табл.6).

Пациентов с признаками активности саркоидного воспаления выявлялось достоверно большее количество моноцитов с малой (менее 2 мкм) фазовой высотой, чем у больных группы Н (55,4±23,4% и 31,2±15,8%, соответственно, р<0,003) (табл. 6).

Таблица 6

Содержание моноцитов с различной фазовой высотой в крови больных _саркоидозом и здоровых доноров.

Фазовая высота моноцитов (мкм) Количество моноцитов (%) в группах

Общая группа, п=52 Группа А, п=41 Группа Н, п—11 Донор, п=20

< 2 мкм 50,8±24,8| 55,4±23,4* 31,2±15,8| 67,3±9,4

>2 мкм 49,2±24,8+ 45,6±23,5 * 68,8±15,8| 32,7±9,2

Примечание: * - р<0,05 со группой Н; ■[■ - отличается от контрольной группы.

Корреляционный анализ полученных данных показал, что у больных саркоидозом имелась положительная зависимость между процентным содержанием циркулирующих моноцитов с фазовой высотой менее 2 мкм и относительным количеством лимфоцитов жидкости БАЛ (г=0,34, р=0,03) и уровнем неоптерина (г=0,54, р=0,0006).

Уровень неоптерина обратно коррелировал как со значением фазовой высоты и фазового объёма моноцитов (г=-0,42, р<0,001), так и с относительным количеством моноцитов, имеющих фазовую высоту 2 мкм и более (г=-0,54; р<0,008) (табл.7). После инкубации клеток с преднизолоном (10"4 ммоль/л) эти корреляции становились незначимыми.

Таблица 7

Корреляционные связи маркеров активности с исходными морфометрическими

параметрами циркулирующих моноцитов при саркоидозе в общей группе.

Относительное количество моноцитов, разделенных по фазовой высоте Корреляционная зависимость (г)

Лимфоцитоз жБАЛ (%) Неоптерин крови нмоль/л

< 2 мкм 0,34, р=0,03 0,54, р=0,0006

>2 мкм НЗ - 0,54, р=0,008

Чувствительность определения фазовой высоты моноцитов периферической крови (РЬ<2,1 мкм) в качестве маркера активности воспалительного процесса при саркоидозе оказалась низкой (42,9%), её специфичность составила (90%). Поскольку фазовая высота клетки отражает ее функциональную активность и связана с плотностью ядерного хроматина, можно предположить, что при саркоидозе активного течения количество циркулирующих моноцитов с высокой функциональной активностью (фазовой высотой менее 2 мкм) возрастает.

Таким образом, полученные данные указывают на возможность использования морфометрических характеристик моноцитов периферической крови для интегральной оценки активности системного воспалительного процесса у больных саркоидозом. При активном течении саркоидоза количество

моноцитов с малой фазовой высотой (менее 2 мкм) было значительно больше, чем при неактивном течении болезни.

Оценка лимфоцитарно - моноцитарной взаимосвязи при внутригрудном

саркоидозе

Начало воспалительного процесса сопряжено с появлением в легочном интерстиции большого количества СБ4+ Т-клеток, интенсивно синтезирующих множество провоспалительных цитокинов. Активность гранулематозного воспаления при саркоидозе является результатом взаимодействия между клетками макрофагально - моноцитарной системами и различными фенотипами лимфоцитов.

Иммунофенотипирование лимфоцитов периферической крови показало что, Пациенты с признаками активности системного воспалительного процесса по сравнению с больными неактивного течения отличались тенденцией к повышению числа В - лимфоцитов [13,0 (9,3-17,0) и 10,0 (7,313,8), соответственно, р<0,03], доствернным снженнием натуральных киллеров [СЭЗ-СО16+СБ56+] (15,6±5,6, и 21,2±9,8, соответственно, р=0,038), и повышением значения Т-лимфоцитов, экспрессирующих маркеры натуральных киллеров (ТНК) [С03+СБ16+С056+] (9,4±5,1 и 2,7±2,5, соответственно, р=0,002) в периферической крови (табл.8).

Таблица 8

Содержание лимфоцитов в периферической крови у больных саркоидозом

Показатель Норма, % Вся группа, п=52 Группа А, п=34 Группа Н, п=18

СБЗ+ 55-80 65,5 (57,5- 72,0) 66,5 (59,3-71,5) 63,5 (54,3-71,5)

СБЗ+С04+ 31-51 32,5 (26,8- 45,3) 34,5 (26,8-46,0) 31,0 (27,0-39,5)

СБЗ+С08+ 19-37 24,5 (18,0- 34,0) 26,0(18,5-33,8) 23,5 (18,0-36,3)

СБ4/С08 1,0-2,5 1,6 (0,8- 2,0) 1,7 (0,9-2,1) 1,5 (0,7-2,0)

СО 19+ 5-19 12,0 (8,0- 16,3) 13,0 (9,3-17,0)* 10,0 (7,3-13,8)

СБЗ-СШ6+С056+ 5-20 17,5 (12,8-20,0) 15,6 ±5,6* 21,2 ±9,8

СБЗ+СШ6+С056+ 0-10 7,0 (2,0- 10,0) 9,4±5,1 * 2,7±2,5

СОЗ+/НЬА-БК+ 5-20 12,0 (9,0-20,0) 17,0(8,8 20,5) 12,0(11,0-14,0)

*- р<0,05 с группой больных неактивного течения.

Уменьшение фазовой высоты моноцитов периферической крови в общей группе больных саркоидозом сопровождалось как СБ4+ лимфопенией (1=0,45, р=0,03), так и С08+лимфоцитозом (г=-0,4, р=0,05) (рис.2). Процентное содержание моноцитов с малой фазовой высотой (менее 2 мкм) коррелировало с числом С04+ и С08+ лимфоцитов (г^0,35, р=0,09 и г=0,5, р<0,009, соответственно).

фазовая высота моноцитов периферической крови

Рисунок 2. Результаты корреляционной зависимости Т-лимфоцитов периферической крови с морфофункциональными параметрами в обшей группе.

Данная корреляционная зависимость отражает лимфоцитарно-моноцитарную взаимосвязь. В ряде исследований была показана способность моноцитов периферической крови продуцировать ИЛ-12, приводящий в свою очередь к индукции выработки ИФН-у Т-хелперами и натуральными киллерами.

Таким образом, изменение морфометрических показателей циркулирующих моноцитов сопровождает смешение популяционного состава лимфоцитов в периферической крови. Данная связь отражает содружественную взаимосвязь между клетками макрофагально - моноцитарной системы и лимфоцитами.

Влияние морфометрических параметров циркулирующих моноцитов на прогнозирование эффективности противовоспалительной терапии у больных саркоидозом

Для решения поставленной задачи больные разделялись на 2 группы в зависимости от исхода болезни в течение 12 месяцев. Среди 52 больных, которым проводилась компьютерная морфометрия циркулирующих моноцитов, через 12 месяцев от начала исследования у 41 пациента наблюдалось частичное или полное исчезновение симптомов заболевания на фоне терапии преднизолоном (в 18-и случаях) или спонтанно (у 23 больных).

У 11 больных, 7 из которых получали терапию ГКС, рентгенологические и функциональные симптомы болезни оказались стойкими или прогрессировали, что расценивалось как неблагоприятный исход саркоидоза.

В таблице 9 представлены результаты сравнительного анализа морфофункциональных показателей моноцитов периферической крови больных благоприятного (п=41) и неблагоприятного (п=11) исхода болезни.

Таблица 9

Прогностическая ценность морфофункциональных размеров циркулирующих

Параметр Больные с благоприятным исходом,п=41 Больные с неблагоприятным исходом заболевания, п=11 Р

Pd(мкм) 9,1±0,7 8,4±0,5 <0,008

Рр (мкм) 26,0±2,7 24,1±1,5 <0,002

Ph (мкм) 2,1 ±0,3 2,1±0,3 НЗ

Ра(мкм 47,8±9,5 41,5±4,5 <0,004

Pv (мкм3) 48,6±12,8 44,2±8,2 НЗ

Таким образом, увеличение исходных фазовых размеров периферических моноцитов крови может рассматриваться в качестве прогностического критерия благоприятного исхода противовоспалительной терапии при саркоидозе.

Преимущество исследования морфометрических параметров циркулирующих моноцитов перед DLco в прогнозировании эффективности противовоспалительной терапии ГКС при саркоидозе

Принято считать, что существенное (менее 80% должной) снижение диффузионной способности легких (DLco) и таких параметров спирометрии как ОФВ1 и ФЖЕЛ свидетельствуют о значительной тяжести заболевания (развитии т.н. «респираторной функциональной недостаточности») (Ors F., 2013, Subramanian I., et al., 2006). Прогрессирующее снижение функциональных параметров свидетельствует о нарастании тяжести болезни и является одним из показания к проведению патогенетической противовоспалительной терапии [Beegle S.H., 2013, Rothkrantz-Kos et al., 2003].

Появление признаков легочного фиброза на рентгенограмме легких сопровождается функциональной респираторной недостаточностью. При этом, значимое снижение функциональных параметров дыхание (ЖЕЛ, ФЖЕЛ, ОФВ1, DLco) наблюдалось у больных IV стадии болезни по сравнению с пациентами I и II-III стадиями (р<0,025) (Табл. 10).

Таблица10

Параметры функции внешнего дыхания у больных с саркоидозом различных

рентгенологических стадий

I стадия II-III стадия, п=88 IV стадия, п=6

ЖЕЛ 88,4±8,3 84,4±12,5 72,5±2,6 *

ФЖЕЛ 88,6±6,1 88,4±16,9 72,7±8,5 *

ОФВ1 87,0±8,1 88,4±15,9 60,7±19,7 *

ИТ 88,0±9,0 92,2±13,4 78,0±21,8

Dlco 79,8±9,6 73,4±14,2** 57,0±18,3 ***

Примечание: * - р<0,002 с больными других стадий саркоидоза ; ** - р=0,025 с больными IV стадии саркоидоза; *** - р=0,005 с больными I стадии саркоидоза.

У 87 (72,5%) из 120 пациентов наблюдалось частичное или полное исчезновение клинико - рентгенологических и функциональных признаков заболевания на фоне терапии ГКС (п=32) либо спонтанно (п=55).

У остальных 19 больных рентгенологические и функциональные симптомы болезни оказались стойкими или прогрессировали, несмотря на терапию преднизолоном.

Назначение системных глюкокортикостероидов больным саркоидозом с признаками активности системного воспаления в большинстве случаев (62,7%) привело к их выздоровлению в течение 6-12 месяцев. У 19 больных (37,3%) рентгенологические и функциональные проявления болезни после проведенного лечения сохранялись.

Низкая эффективность стероидов при саркоидозе могла быть связана с процессами фиброзирования легочной ткани. Однако у 16 из 19 больных, резистентных к терапии ГКС, по данным рентгенологического исследования выявлялась II или III стадии саркоидоза, и только у 3 пациентов отмечались признаки IV рентгенологической стадии болезни.

У существенной части гормонрезистентных пациентов исходное обследование не позволяло говорить о наличии легочного фиброза, и низкая чувствительность к терапии ГКС, возможно, была связана с особенностью текущего воспаления. Как видно из рис.3 положительная эффективность терапии ГКС сочеталась с повышенным значением ОЬсо [74.1 (69,0-83,0) и 66,0 (60,0-72,1), соответственно, р<0,016]. При прогрессировании рентгенологической симптоматики утрачивалась корреляционная зависимость между ЭЬсо и другими функциональными параметрами дыхания.

Рисунок 3.Диффузионная способность легких у больных с благоприятным (1) и неблагоприятным (2) результатом терапии преднизолоном.

Среди всех функциональных параметров дыхания наиболее динамичным в оценке как прогрессирования, так и регрессирования болезни оказывается диффузионная способность легких. В табл. 11 представлены результаты сравнительного анализа диффузионной способности легких (ОЬсо) у больных саркоидозом с различными формами течения.

Таблица 11

Значение диффузионной способности легких (РЬсо) у больных саркоидозом

Группы больных БЬсо

Прогрессирующего течения, п=39 68,0±13,0

Регрессирующего течения, п-10 76,9±6,2*

Стабильного течения, п=56 77,0±15,1*

Острой формы, п=15 75,9±15,0

Примечание: * - р< 0,03 с группой саркоидоза прогрессирующего течения.

Сопоставление исходных данных морфометрии моноцитов с результатами последующей терапии системными ГКС 25 больных саркоидозом показало, что благоприятный результат лечения наблюдался у пациентов, моноциты которых имели больший фазовый диаметр, фазовый периметр и фазовую площадь (табл.12).

Таблица12

Морфофункциональные параметры циркулирующих моноцитов у больных с

благоприятным и неблагоприятным результатом терапии преднизолоном

Параметр Благоприятный исход, п=18 Неблагоприятный исход, п=7 Р

Р(1 (мкм) 9,1±0,7 * 8,3±0,4 <0,02

Рр(мкм) 26,5±2,0* 24,0±1,5 <0,02

Р11 (мкм) 2,1±0,3 2,1±0,3 нз

Ра (мкм2) 49,5±9,0 * 40,9±4,6 <0,02

Ру(мкм ) 51,0±16,1 42,6±8,5 нз

Согласно полученным данным, эффективность лечения ГКС была

тесно связана с исходными значениями диффузионной способности легких: в группе больных с неблагоприятным результатом лечения уровень БЬсо был значительно ниже, чем у больных с полным эффектом стероидной терапии. При этом значимое снижение 01со (<69%) обнаруживалось только у 9 из этих 16 больных (56,3%). Из 32 пациентов с благоприятным результатом лечения только у 10 больных исходный уровень ОЬсо был меньше 69%. Фазовые параметры (диаметр, периметр, и площадь) моноцитов этих 10 больных оказались значительно больше, чем у больных с неблагоприятным результатом терапии с низкой РЬсо (менее 69%) (табл. 13). При этом они не отличались от значений фазовых параметров моноцитов остальных больных этой группы.

Таблица 13

Исходные морфо - функциональные характеристики циркулирующих моноцитов у больных с низкой диффузионной способностью (< 69%) терапии

преднизолоном.

Параметр Благоприятный исход, п=10 Неблагоприятный исход, п=5 Р

Рс1 (мкм) 9,1±0,6 8,5±0,4 <0,04

Рр(мкм) 26,7±1,5 24,7±1,3 <0,04

РЬ(мкм) 2,2±0,3 2,1±0,3 нз

Ра (мкм2) 52,2±10,7 43,1±3,4 <0,006

Ру (мкм3) 53,7±18,4 42,6±8,5 нз

Чувствительность и специфичность исходного значения фазового диаметра циркулирующих моноцитов больных саркоидозом (больше 8,7 мкм) в прогнозировании благоприятного результата терапии ГКС составили соответственно, 72,7 % и 75 %.

Таким образом, повышение морфометрических параметров моноцитов периферической крови у больных с пониженной диффузионной способностью легких (менее 69% от должного) является предикторам благоприятного исхода противовоспалительной терапии при саркоидозе.

Прогностическая ценность фазовых размеров моноцитов периферической крови при саркоидозе

У 24 пациентов морфофункциональные характеристики циркулирующих моноцитов были получены как до, так и после инкубации клеток с преднизолоном в концентрации 1СГ4 ммоль/л. Из этой группы 15 больных получали терапию преднизлоном в поддерживающей дозе 10-15 мг/сутки в течение 6-12 месяцев.

У пациентов с благоприятным результатом терапии отмечалось достоверное (в среднем, на 14.5% и более) увеличение фазовой высоты циркулирующих моноцитов после инкубации клеток с преднизолоном в концентрациях 10 4 мкмоль/л in vitro, тогда как в группе гормонорезистентных больных достоверных изменений этого параметра после инкубации не наблюдалось. Значение параметра до и после инкубации 1,97±0,09 и 2,1±0,13 мкм, соответственно, р<0,03) (рис.4).

Рисунок 4

Трехмерное изображение фазово-интерференционного портрета моноцита периферической крови до и после инкубации клетки с преднизолоном in vitro в _концентрации 10"4 мкмоль/л._

Фазовая высота после инкубации

Фазовая высота до инкубации

Тогда как у резистентных к лечению пациентов существенной динамики морфофункциональных параметров моноцитов после инкубации с преднизолоном не наблюдалось (1,98±0,4 и 1,98±0,3, соответственно).

Таким образом, высокая эффективность стероидной терапии больных саркоидозом была связана с высокой чувствительностью циркулирующих

моноцитов к преднизолону in vitro, а резистентность к лечению сочеталась с отсутствием динамики морфофункциональных параметров этого типа клеток при инкубации их с преднизолоном.

Таким образом, представляется целесообразным для предварительной оценки результатов стероидной терапии больных саркоидозом проводить исследование морфофункциональных параметров циркулирующих моноцитов при выявленном снижении DLco менее 69 %. Исходное значение фазовых параметров моноцитов периферической крови (диаметра, периметр и площадь) более чем 8,7 мкм, 25,5 мкм, и 45.5 мкм , соответственно, и прирост фазовой высоты после инкубации с преднизолоном (10"4мкмоль/л) более чем на 14.5% от исходной величины свидетельствуют в пользу благоприятного результата проводимой противовоспалительной стероидной терапии.

ВЫВОДЫ

1. У больных саркоидозом легких и внутригрудных лимфатических узлов с клинико-рентгенологическими признаками активности гранулематозного воспаления отмечаются снижение фазовой высоты циркулирующих моноцитов (менее 2,1 мкм) и увеличение в периферической крови относительного количества моноцитов с фазовой высотой менее 2 мкм (более 55% от общей популяции).

2. При активном течении внутригрудного саркоидоза повышение функциональной активности клеток моноцитарно-макрофагальной системы сопровождается в периферической крови увеличением количества Т - киллеров и снижением числа естественных киллеров и СВ4+лимфоцитов.

3. Регрессирование клинико-рентгенологической симптоматики внутригрудного саркоидоза сочетается с повышением исходных морфофункциональных характеристик циркулирующих моноцитов (фазовый диаметр, фазовый периметр, фазовая площадь).

4. Повышение исходных фазовых параметров является более чувствительным предиктором, чем снижения диффузионной способности легких (<69%Д) в прогнозировании эффективности терапии ГКС у больных саркоидозом.

5. Увеличение фазовых размеров моноцитов периферической крови при их инкубации in vitro с преднизолоном в концентрации 10"4 мкмоль/л с эффективностью терапии глюкокортикостероидами у больных саркоидозом.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. В качестве дополнительного метода оценки активности воспалительного процесса при саркоидозе целесообразно применять компьютерную фазовую морфометрию: низкие значения фазовой высоты моноцитов и появление в периферической крови большого количества моноцитов с малой (менее 2 мкм) фазовой высотой являются критерием активности заболевания.

2. Для прогнозирования течения болезни целесообразно исследовать морфометрические параметры моноцитов периферической крови: увеличение исходных фазовых размеров (диаметр, периметр, и площадь, более 9,1 мкм, 26,0

мкм, 47,8 мкм2, соответственно) считается маркером благоприятного течения внутригрудного саркоидоза.

3. При сниженной диффузионной способности легких < 69% необходимо оценить ответ циркулирующих моноцитов при инкубации с преднизолоном (10"4 мкмоль/л) для определения более точного прогноза болезни в течение 6-12 месяцев: повышение исходных фазовых параметров [диаметр, периметр, и площадь, более 8,7 мкм, 25,5 мкм, 45,5 мкм, соответственно] и увеличение фазовой высоты после инкубации с преднизолоном в среднем на 14,5% указывает на благоприятный исход болезни.

4. Для предварительной оценки эффективности ГКС при саркоидозе целесообразно проводить исследование чувствительности циркулирующих моноцитов к преднизолону in vitro. Отсутствие прироста фазовой высоты моноцитов после инкубации с преднизолоном в концентрации 10"4 ммоль/л свидетельствует о низкой чувствительности клеток к стероидам, является предиктором снижения эффективности глюкокортикостероидной терапии при этом заболевании.

Публикации по теме диссертации

1. Терпигорев С.А., Василенко И.А., Кастрикина И.С., Эль Зейн Б.А. Оценка Морфофункционального статуса моноцитов периферической крови больных саркоидозом методом витальной компьютерной морфометрии. // Материалы I научно - практической конференции «цитометрия в медицине и биологии: фундаментальные и прикладные аспекты». - Москва. - 2008. — С. 66-67.

2. Ершова К.И., Терпигорев С.А., Эль Зейн Б.А., Кузьмичев В,А., и др. Верификация диагноза при саркоидозе. // Сборник трудов XVIII национального конгресса по болезням органов дыхания. - Екатеринбург. -2008. — С. 134-135.

3. Ершова К.И., Кузьмичев В,А., Прищепо М.И., Шабаров B.JL, Терпигорев С.А. Эль Зейн Б.А. Укрепление механического шва с помощью прокладка "SEAMGUARD" при диагностической биопсии легкого. // Сборник трудов XVIII национального конгресса по болезням органов дыхания. - Екатеринбург. -2008. — С. 182.

4. Терпигорев С.А., Василенко И.А., Кастрикина И.С., Эль Зейн Б.А. Влияние глюкокортикоетероидов на морфометрические параметры моноцитов периферические крови больных саркоидозом. // Материалы II московской региональной научно-практической конференции «цитометрия в медицине и биологии: фундаментальные и прикладные аспекты». - Москва. -2009. — С. 9091.

5. Верещагина В.М., Терпигорев С.А., Сукалина Б.А., Эль Зейн Б.А. Биохимическая оценка активности саркоидоза. // Больница №1: Медицинский Альфавит.-2010. - № 4. - С. 56-57.

6. Терпигорев С.А., Эль Зейн Б.А., Шабаров B.JI., Ершова К.И. Информативность различных методов биопсии при саркоидозе // Грудная и сердечно - сосудистая хирургия. - 2010. - № 2. - С 68-72.

7. Терпигорев С.А., Сташук Г.А., Дуброва С.Э., Горенков Р.В., Ершова К.И., Эль Зейн Б.А. Совершенствование методов диагностики и лечения различных форм саркоидоза // Пособие для врачей. -Москва. - 2011.

8.Терпигорев С.А., Эль Зейн Б.А. Верещагина В.М., Палеев Н.Р. Саркоидоз и проблемы его классификации. // Вестник РАМН. Актуальные вопросы внутренних болезней. - 2012. -№ 5. - С. 30-37.

9. Эль Зейн Б.А., Терпигорев С.А., Василенко И.А. и др. Значение морфометрических параметров циркулирующих моноцитов для предварительного прогноза внутригрудного саркоидоза. // Материалы V московской региональной научно-практической конференции «цитометрия в медицине и биологии: фундаментальные и прикладные аспекты». - Москва -2012, С. 149-150.

10. Эль Зейн Б.А., Терпигорев С.А., Василенко И.А. и др. Использование морфофункциональных характеристик моноцитов периферической крови в оценке активности саркоидоза. // Материалы V московской региональной научно-практической конференции «цитометрия в медицине и биологии: фундаментальные и прикладные аспекты». Москва - 2012, С. 151-152.

11. Эль Зейн Б.А., Терпигорев С. А., Василенко И.А., Метелин В.Б. Морфофункциональные характеристики моноцитов периферической крови при саркоидозе. // Иммунология. Москва. 2012. - № 6. С. 322-326

12. Терпигорев С.А., Эль Зейн Б.А., Москалец О.В., Чуксина Ю.Ю., Корсикова H.A. вопросы классификации саркоидоза. // Пособие для варча. Москва - 2012.

13. Терпигорев С.А., Новиков A.A., Эль Зейн Б.А., Александрова E.H., и др. Изменение спектра цитокинов крови у больных саркоидозом легких // Терапевтический архив. Москва. -2013. №3. -С. 23-27.

ПАТЕНТ

14. патент на изобретение № 2382364 Российская федерация, МПК7 G01N 33|49 (2006.01) RU 2 382 364 С1. "Способ прогнозирования эффективности лечения глюкокортикостероидами"; Василенко И.А., Палеев Н.Р., Тычинский В.П., Вышинская Т.В., Кретушев A.B. Терпигорев С.А., Кастрикина И.С., Эль Зейн Б.А.; заявитель и патентообладательГасударственное учереждение Московской областной научно-исследовательский клинический институт им. М.Ф. Владимирского; заявл.№ 2008151645 от 26.12.2008; опубл. 20.02.2010, Бюл. № 5 (II ч.). 6 с.