Автореферат и диссертация по медицине (14.01.01) на тему:Значение генов системы детоксикации и фолатного обмена в патогенезе лейомиомы матки

На правах рукописи

ДЮЖЕВ ЖАН АЛЕКСАНДРОВИЧ

I

ЗНАЧЕНИЕ ГЕНОВ СИСТЕМЫ ДЕТОКСИКАЦИИ И ФОЛАТНОГО ОБМЕНА В ПАТОГЕНЕЗЕ ЛЕЙОМИОМЫ МАТКИ

14.01.01 - акушерство и гинекология 03.02.07 - генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 [.¡АР Ш

005015133

Иваново-2012

005015133

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства им. В.Н. Городкова» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научные руководители: доктор медицинских наук доктор медицинских наук

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор (ГБОУ ВПО «Ижевская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России)

Малышкина Анна Ивановна Фетисова Ирина Николаевна

Тетелютина Фаина Константиновна

доктор медицинских наук, профессор Мутовин Геннадий Романович

(ГБОУ ВПО «Российский национальный

исследовательский медицинский

университет им. Н.И. Пирогова»

Минздравсоцразвития России)

Ведущая организация:

Государственное бюджетное учреждение высшего профессионального образования «Московский государственный медико-стоматологический университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита диссертации состоится «_»_2012 г. в_часов на заседании диссертационного совета Д 208.028.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства имени В.Н. Городкова» Минздравсоцразвития России по адресу: 153045, г. Иваново, ул. Победы, д. 20.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства имени В.Н. Городкова» Минздравсоцразвития России по адресу: 153045, г. Иваново, ул. Победы, д. 20.

Автореферат разослан «___»_2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук

И.А. Панова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования

Лейомиома матки является наиболее распространённым невоспалительным заболеванием в гинекологической практике. Частота её у женщин старше 30 лет составляет по данным разных авторов от 30 до 77% [Вихляева Е.М., 2004; Сидорова И.С., 2006]. При развитии быстрого роста миомы матки до сих пор основным методом лечения остается хирургический, что в ряде случаев приводит к снижению качества жизни пациентки [Кулаков В.И., 2005].

В настоящее время лейомиома матки рассматривается как мультифакго-риальное заболевание, являющееся результатом совместного действия средо-вых и генетических факторов. Причиной формирования клетки-предшественницы миоматозного узла является соматическая мутация [Тихомиров A.J1. и соавт., 2006]. В качестве генов-кандидатов рассматриваются с-fos, с-jun, с-туе [Lessl М. et al., 1997], CUTL1 [Zeng W.R. et al., 1997], HMGIC и HMGIY [Morton C.C., 1998], RAD51B [Schoenmakers E.F. et al., 1999], FH [Gross K.L. et al., 2004]. До настоящего времени не определены факторы, способствующие возникновению мутаций в генах-кандидатах [Тихомиров A.JI. и соавт., 2006]; недостаточно изучены факторы, способствующие быстрому и множественному росту миоматозных узлов.

Выраженным генотоксическим эффектом на клетки миометрия могут обладать ксенобиотики, продукты перекисного окисления и гомоцистеин [Tsai J. et al., 1996; Bhat H.K. et al., 2003]. Тем не менее, данных о значении генов системы детоксикации и фолатного обмена, которые участвуют в антиоксидантной защите и метаболизме гомоцистеина, у больных с лейомиомой матки в доступной литературе мало [Egorova O.V. et al., 2006: Кулагина Н.В., 2008].

Изучение полиморфизма генов системы детоксикации и фолатного обмена у женщин с лейомиомой матки позволит уточнить системные механизмы, определяющие развитие заболевания, а также разработать новые прогностиче-

ские критерии различных вариантов клинического течения лейомиомы матки, что имеет большое значение для практической гинекологии. Цель исследования

На основании комплексного клинико-генетического обследования женщин с лейомиомой матки оценить значение полиморфных вариантов генов системы детоксикации и фолатного обмена при различных вариантах течения заболевания и разработать новый метод прогнозирования быстрого роста опухоли.

Задачи исследования

1. Оценить клинико-анамнестические характеристики больных с лейомиомой матки, на основании чего выделить факторы риска различных вариантов течения заболевания.

2. Изучить особенности полиморфизма генов системы детоксикации (глута-тион-Б-трансферазы М1 и 77) и фолатного обмена (5,10-метилентетрагидрафолат-редуктазы, метионин-синтазы-редуктазы и ме-тионин-синтазы) у женщин с различными клиническими вариантами течения лейомиомы матки.

3. Изучить состояние про- и антиоксидантных систем организма, а также уровень гомоцистеина в крови у женщин с различными клиническими вариантами течения лейомиомы матки.

4. Изучить взаимосвязь между особенностями генотипа в генах GSTM1, GSTT1, MTHFR, MTRR, MTR и состоянием про-, антиоксидантных систем организма, уровнем гомоцистеина в крови у женщин с различными клиническими вариантами течения лейомиомы матки.

5. Определить маркеры наследственной предрасположенности к различным клиническим вариантам лейомиомы матки и разработать новый метод прогнозирования быстрого роста опухоли.

Научная новизна исследования

Впервые изучен полиморфизм генов системы детоксикации (GSTM1, GSTT1) и фолатного обмена (MTR, MTRR, MTHFR) у женщин с различным клиническим течением лейомиомы матки.

Установлена ассоциация между наличием в генотипе женщины низкофункциональных аллелей в генах GSTM1 и MTRR и развитием быстрорастущей лейомиомы матки.

Установлена ассоциация между наличием в генотипе женщины делеци-онного варианта гена GSTM1 и развитием множественной лейомиомы матки.

Впервые показано, что у женщин с быстрорастущей миомой матки присутствие в генотипе низкофункциональных аллелей в генах GSTM1, GSTT1, MTRR и MTHFR имеет более высокую степень корреляции с биохимическими параметрами активности ПОЛ и уровнем гомоцистеина, чем у женщин с лейо-миомой матки стабильных размеров.

Практическая значимость работы

В клиническую практику предложен способ выявления наследственной предрасположенности к быстрому росту миомы матки (приоритетная справка № 2011139007 от 26.09.2011) и множественному росту миоматозных узлов. Применение данного метода будет способствовать вторичной профилактике заболевания, снижению числа органоуносящих операций и сохранению репродуктивной функции женщин с лейомиомой матки.

Основные положения, выносимые на защиту

• Присутствие в генотипе женщины делеционного варианта гена глутати-он-Б-трансферазы М1 и низкофункционального аллеля 66G гена метионин-синтазы-редуктазы является фактором риска быстрого роста лейомиомы матки.

• Присутствие в генотипе женщины делеционного варианта гена глутати-он-Б-трансферазы М1 является фактором риска развития множественной лейомиомы матки.

• Присутствие в генотипе женщины с лейомиомой матки низкофункциональных аллелей в генах глутатион-8-транфераз М1, Т1, 5,10-метилентетрагидрафолат-редуктазы и метионин-синтазы-редуктазы ассоциировано с повышением активности перекисного окисления и уровня го-моцистеина в крови; максимальная степень корреляции имеет место при быстрорастущей лейомиоме матки.

Внедрение результатов в практику

Разработанный способ выявления наследственной предрасположенности к быстрому росту миомы матки прошел предрегистрационное испытание в гинекологической клинике Федерального государственного бюджетного учреждения «Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства им. В.Н. Городкова» Минздравсоразвития России. В настоящее время метод внедряется в гинекологической клинике и амбулаторных подразделениях Ивановского НИИ материнства и детства им В.Н. Городкова. Результаты работы используются в учебном процессе на кафедре акушерства и гинекологии, медицинской генетики лечебного факультета ГБОУ ВПО «Ивановская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России.

Апробация работы

Основные результаты работы доложены на межкафедральной междисциплинарной конференции молодых ученых «Философские чтения: актуальные вопросы современной медицины» (Иваново, 2008); ежегодной научно-практической конференции студентов и молодых ученых ИвГМА «Неделя науки -2009» (Иваново, 2009); научно-практической конференции молодых ученых, посвященной 30-летию со дня основания ФГУ "Ив НИИ М и Д им. В.Н. Городкова" Минздравсоцразвития России (Иваново, 2010); ежегодной научно-практической конференции студентов и молодых ученых ИвГМА «Неделя науки -2010» (Иваново, 2010); VI Съезде Российского общества медицинских генетиков (Ростов-на-Дону, 2010); ежегодной научно-практической конференции студентов и молодых ученых ИвГМА «Неделя науки - 2011» (Иваново, 2011); на-

учных чтениях, посвященных памяти академика В.И. Кулакова (Москва, 2011); V Международном конгрессе по репродуктивной медицине (Москва, 2011); Всероссийском конгрессе с международным участием «Амбулаторно-поликли-ническая практика; проблемы и перспективы» (Москва, 2011); XII Всероссийском научном форуме «Мать и дитя» (Москва, 2011).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 15 печатных работ, из них 1 в журнале, включенном в перечень изданий, рекомендованных ВАК РФ.

Личное участие автора

Диссертационная работа представляет собой самостоятельный труд автора. Автор участвовал в клиническом ведении больных, включая обследование, клиническое динамическое наблюдение, консервативное и оперативное лечение пациенток. Автором лично выполнено молекулярно-генетическое обследование женщин, статистическая обработка полученных результатов.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 122 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, двух глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и практических рекомендаций, иллюстрирована 21 таблицами, 8 рисунками. Библиография содержит 190 источников: 41 отечественных и 149 иностранных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал и методы исследования

Работа выполнена на базе гинекологической клиники, клинико-диагностической поликлиники, центра здоровья семьи ФГБУ «Ивановский НИИ материнства и детства им. В.Н. Городкова» Минздравсоцразвития России. Под наблюдением находились 150 женщин в возрасте от 20 до 50 лет.

Основную группу составили 100 женщин с миомой матки. В зависимости от размеров миоматозных узлов и темпов роста они были разделены на 2 клинические группы. Первую клиническую группу составили 50

женщин с миомой матки стабильно малых размеров (общие размеры матки не более 9 недельного срока беременности, отсутствие роста миомы за год наблюдения). Во вторую группу вошли 50 женщин с быстрорастущей миомой матки больших размеров (размеры матки свыше 10 недель беременности, увеличение размеров матки за год наблюдения на 4-5 недель беременности и более). У всех пациенток миома матки была выявлена не более чем за 5 лет до исследования.

Контрольную группу составили 50 фертильных женщин без клинических и ультразвуковых признаков лейомиомы матки, обратившихся к гинекологу с целью подбора метода контрацепции или на профилактический осмотр.

Материалом исследования служили венозная кровь из локтевой вены, биоптаты эндометрия, миометрия и миоматозных узлов и маточных труб.

Общеклиническое обследование включало сбор анамнеза, осмотр, наружное и внутреннее гинекологическое исследование, электрокардиографию, полное клинико-лабораторное обследование.

Функциональное обследование включало трансабдоминальное и трансвагинальное ультразвуковое исследование.

Патоморфологические методы включали обзорную гистологию, окраску гематоксилином и эозином.

Биохимические методы включали определение уровня общего гомоцистеина в сыворотке крови и биохемилюминесценцию сыворотки крови. Определение уровня общего L-гомоцистеина (Нсу) в сыворотке венозной крови проводилось методом твердофазного иммуноферментного анализа на автоматическом фотометре EL 808 (Bio-Tec Instruments, США) с использованием наборов реактивов фирмы Axis-Shield (Норвегия) согласно протоколу фирмы-производителя. Интенсивность процессов перекисного окисления липидов оценивалась методом индуцированной хемилюминесценции (XJI) сыворотки крови на биохемилюминометре БХЛ-06

(ООО «Медозонс», Россия). Оценивали светосумму свечения (S), максимальную амплитуду (Imax), тангенс угла наклона кривой ХЛ (Ig а), результаты выражали в импульсах в секунду.

Молекулярно-генетическое исследование включало выделение геномной ДНК из лейкоцитов периферической крови, полимеразную цепную реакцию фрагментов изучаемых генов, анализ полиморфизма длины амплификационных/рестрикционных фрагментов (ЦЦАФ/ПДРФ-анализ), электрофорез в полиакриламидном геле. Выделение геномной ДНК из лимфоцитов периферической крови выполняли с помощью набора реактивов для выделения DIAtom DNA Prep 100 («ИзоГен», Россия) по протоколу производителя. Амплификацию всех исследуемых фрагментов ДНК проводили методом ПЦР на программируемом термоциклере «Терцик» («ДНК-технология», Россия).

Полиморфизмы, которые представляли собой однонуклеотидные замены, выявлялись методом ПДРФ-анализа по наличию или отсутствию сайта рестрикции специфической эндонуклеазы. Делеционные полиморфизмы определялись с помощью метода ПДАФ-анализа. Использовались наборы реактивов для полимеразной цепной реакции ООО «Центр молекулярной генетики» (Россия), Taq-полимераза («БиоМастер», Россия), эндонуклеазы Hinf I, Bsu RI, Fau NDI (Fermentas, Латвия).

Результаты ПДАФ- и ПДРФ-анализа оценивали в 7% полиакриламидном геле в ультрафиолетовом свете с помощью трансиллюминатора ТСР-15М (Vilber Lourmat, Франция) и системы гель-документирования Gel Imager 1.0 («Хеликон», Россия).

Статистическая обработка данных производилась с помощью программ Statistica 8.0 и OpenEpi 2.3. После проверки рядов данных на нормальность распределении использовались параметрические (критерий Стьюдента) и непараметрические методы (критерий Манна-Уитни, хи-квадрат, точный критерий Фишера) [Животовский Л.А., 1991]. Для оценки влияния отдельных

факторов на риски развития заболевания осуществлялся расчет отношения шансов (ОШ), скорректированного методом условной оценки максимального подобия, с 95%-ным доверительным интервалом (ДИ) [Martin D., Austin H., 1991]. Общий объем проведенных исследований составил 1170.

Результаты исследования и их обсуждение

Исследуемые группы были сопоставимы по возрасту: средний возраст в контрольной группе составил 39,6±0,9 лет, в основной - 40,7±0,4 лет. Отягощение родословной указанием на наличие миомы матки у родственников первой степени родства у пациенток основной группы отмечалось достоверно чаще, чем у здоровых женщин (36,0 и 18,0% в основной и контрольной группах соответственно, р<0,05, ОШ=2,54, ДИ: 1,01-6,66).

У пациенток основной группы по сравнению с контрольной достоверно чаще встречались указания в анамнезе на частые респираторные инфекции (71,0 и 25,0% соответственно, р<0,01, 0111=2,43, ДИ: 1,20-4,96); гепатит А (11,0 и 2,0% соответственно, р<0,05, 0111=6,01, ДИ: 1,01-134,0); оперативные вмешательства (20,0 и 8,0% соответственно, р<0,05, 0111=2,86, ДИ: 1,01-10,29); воспалительные заболевания органов малого таза (38,0 и 16,0% соответственно, р<0,01, ОШ=3,19, ДИ: 1,39-7,98).

Соматическая патология на момент обследования у женщин с миомой матки диагностировалась достоверно чаще, чем у здоровых женщин (72,0 и 16,0% соответственно, р<0,001, 0111=4,15, ДИ: 2,03-8,66). Железодефицитная анемия в основной и контрольной группах была отмечена соответственно в 32,0 и 4,0% (р<0,001, ОШ=11,16, ДИ: 2,95-72,14), артериальная гипертензия - в 21,0 и 4,0% (р<0,01, 0111=6,26, ДИ: 1,10-146,90), нейроциркуляторная дистония - в 31,0 и 16,0% (р<0,01, ОШ=2,35, ДИ: 1,01-5,91), избыточная массатела-в 12,0 и 2,0% (р<0,05, 0111=6,62, ДИ: 1,10-146,90), хронический рецидивирующий герпес - в 28,0 и 12,0% (р<0,05,0111=2,84, ДИ: 1,12-8,05).

На момент обследования 51,0% женщин основной и 8,0% женщин контрольной групп имели сопутствующую гинекологическую патологию

(р<0,001, ОШ=1,79, ДИ: 4,22-41,06), в структуре которой доминировали воспалительные заболевания. Хронический эндометрит в основной и контрольной группах наблюдался соответственно в 21,0 и 6,0% (р<0,05, 0111=4,13, ДИ: 1,27-18,23), хронический сальпингоофорит - в 38,0 и 2,0% (р<0,001, 0111=29,6, ДИ: 5,38-626,90).

У женщин с миомой матки достоверно чаще, чем у здоровых женщин имели место обильные menses (41,0 и 0,0% соответственно, р<0,001, ОШ=34,21, ДИ: 6,23-723,70) и альгодисменорея (17,0 и 4,0% соответственно, р<0,05, ОШ=4,88, ДИ: 1,23-32,42). Средняя продолжительность менструального кровотечения в основной и контрольной группах составила 6,5±0,2 и 4,5±0,1 дней соответственно (р<0,05).

Практически все женщины на момент обследования реализовали свою репродуктивную функцию и имели детей (98,0 и 86,0% в основной и контрольной группах соответственно). Количество беременностей на одну женщину в основной группе составило 4,5±0,1, что было достоверно выше, чем в контрольной (3,5±0,2, р<0,05). Указание в анамнезе на произведенные медицинские аборты у женщин обеих групп встречалось приблизительно в одинаковом проценте случаев (71,0 и 64,0% в основной и контрольной группах соответственно). Однако нарушение репродуктивной функции отмечалось только у больных с миомой матки при отсутствии такового в контроле: невынашивание беременности имело место в 16,0% случаев (р<0,01, 0111=9,42, ДИ: 1,62-205,50), эктопическая беременность - в 8,0% случаев (р<0,05, ОШ=4,40, ДИ: 0,68-101,00).

Анализ используемых методов контрацепции выявил следующие особенности. Больные с миомой матки достоверно чаще, чем здоровые женщины использовали внутриматочные средства (47,0 и 18,0% соответственно, р<0,001, 0111=4,00, ДИ: 1,80-9,56). В то же время доля женщин основной группы, использующих комбинированные оральные контрацептивы (КОК), была достоверно ниже, чем в контроле (13,0 и 28,0% соответственно,

р<0,05, 0111=0,39, ДИ: 0,16-0,91). К барьерным методам контрацепции в основной и контрольной группах прибегали соответственно 18,0 и 32,0% обследованных (р<0,05; 01И=0,47, ДИ: 0,21-1,04).

Анализ клинико-анамнестических данных, проведенный в пределах двух клинических групп показал следующее. У женщин обеих клинических групп по сравнению со здоровыми женщинами достоверно чаще отмечалось наличие в анамнезе семейной отягощенности по миоме матки, указаний на перенесенные гепатит А, оперативные вмешательства на органах брюшной полости, воспалительные заболевания органов малого таза, использование средств внутриматочной контрацепции. Достоверное накопление указанных анамнестических характеристик у пациенток с разным клиническим течением заболевания по сравнению со здоровыми женщинами позволяет рассматривать эти показатели как факторы риска развития лейомиомы матки.

Во второй клинической группе по сравнению с первой достоверно больший процент пациенток был подвержен частым респираторным инфекциям (80,0 и 62,0% соответственно, р<0,05, ОШ=2,45, ДИ: 1,01-6,18) и хроническому назолабиальному герпесу (38,0 и 18,0% соответственно, р<0,05, 0111=2,76, ДИ: 1,11-7,23). При быстрорастущей миоме матки достоверно чаще отмечался хронический сальпингоофорит (48,0 и 28,0% соответственно, р<0,05, 0111=2,35, ДИ: 1,03-5,52). Характер используемой контрацепции у пациенток с быстрорастущей миомой матки также имел свои особенности: они значительно реже, чем женщины с миомой малых размеров использовали КОК (6,0 и 20,0% соответственно, р<0,05, 0111=0,26, ДИ: 0,05-0,96). Отсутствие контрацепции отмечалось только у больных с быстрым ростом миомы матки (12,0%, р<0,05; 0111=6,71, ДИ: 0,94-160,80).

У женщин с быстрорастущей миомой матки достоверно чаще, чем у пациенток с миомой матки стабильно малых размеров отмечались болезненные менструации (30,0 и 16,0% соответственно, р<0,05, 0111=3,81, ДИ: 1,29-12,71), боли в области живота, не связанные с менструацией (32,0 и 8,0% соответст-

венно, р<0,01, ОШ=5,32, ДИ: 1,70-20,02), дизурические явления (18,0 и 0,0% соответственно, р<0,01, 0111=10,55, ДИ: 1,64-242,10).

У большинства пациенток обеих клинических групп имела место интер-стициально-субсерозная локализация миоматозных узлов. Наличие деформации полости матки опухолевыми узлами было отмечено у 8,0% женщин первой группы и у 20,0% - второй. Количество пациенток, у которых было диагностировано наличие двух и более миоматозных узлов, в первой клинической группе составило 54,0%, а во второй - 80,0% (р<0,05). Среднее количество узлов на пациентку в первой клинической группе составило 1,68±0,10, во второй -2,44±0,16 (р<0,05).

Таким образом, женщины с быстрорастущей миомой матки по сравнению с пациентками с миомой матки стабильно малых размеров достоверно чаще болели острыми респираторными заболеваниями, имели рецидивирующую герпетическую инфекцию, нарушение менструальной функции, проявляющееся в увеличении длительности, обильности и болезненности менструального кровотечения, болевой синдром в межменструальный период, нарушения мочеиспускания, хронический сальпингит и сальпингоофорит в анамнезе; они реже применяли комбинированные оральные контрацептивы. Обращает на себя внимание преобладание во второй клинической группе пациенток с множественной миомой матки, что подтверждает высокую интенсивность пролиферативных процессов у этих пациенток. Полученные нами данные подтверждают имеющиеся в литературе сведения о роли травматического, воспалительного, вирусного и гормонального факторов в формировании и быстром росте миоматозных узлов, а также протективные свойства КОК [Тихомиров А.Л., 2004; Малышки-на А.И., 2006; Тихомиров А.Л., 2006].

Достоверного увеличения частоты встречаемости делеционных вариантов генов СБТМ] и С/57Т/ у пациенток основной группы по сравнению со здоровыми женщинами выявлено не было. Следует отметить, что выявленные нами частоты низкофункциональных аллелей в данных генах в группе

здоровых фертильных женщин, сопоставимы с данными, полученными И.Н. Фетисовой (2007) в популяции Ивановской области. Подобные результаты отмечались и в других работах [Еяогоуа О.У. еі аі., 2006; сіє Оііуеіга Е. еґ аі., 2009].

Генотип ЄБТМІ 0/0 среди пациенток с быстрорастущей миомой матки выявлялся достоверно чаще, чем среди здоровых женщин (62,0 и 42,0% соответственно, р<0,05, 0111=2,23, ДИ=1,01-5,06) (табл. 1). Достоверных особенностей в распределении частот полиморфизмов по гену 65777 в зависимости от темпов роста миомы матки выявлено не было.

Таблица 1

Частоты генотипов по генам семейства глутатион-Б-трансфераз М1 и Т1 у __женщин с лейомиомой матки и в контроле _

Аллель Контрольная Женщины с Женщины с мио- Женщины с бы-

Генотип группа миомой матки мой стабильных строрастущей

размеров миомои матки

<35ТІШ + 29(58,0) 42 (42,0) 23 (46,0) 19 (38,0) *

взтмі 0/0 21 (42,0) 58 (58,0) 27 (54,0) 31 (62,0) *

ОЗТТІ + 42 (84,0) 90 (90,0) 46 (92,0) 44 (88,0)

ОіТП о/о 8 (16,0) 10(10,0) 4 (8,0) 6 (12,0)

* - различия достоверны по сравнению с контрольной группой (* - р<0,05).

Сравнительный анализ данных молекулярно-генетического обследования женщин с миомой матки и особенностей клинического течения заболевания показал, что у женщин-носительниц делеционного варианта гена С8ТМ1 достоверно чаще, чем у женщин-носительниц аллеля «дикого» типа гена С5ГМ7, диагностировалась множественная миома матки. Так, у пациенток основной группы при наличии генотипа С£7М/ 0/0 миоматозные узлы в количестве двух и более были отмечены в 77,6% случаев; в то время как, среди женщин-носительниц аллеля «дикого» типа гена ОБТМ1 процент выявленной множественной миомы матки составил лишь 52,4% (р<0,01, 0111=3,11, ДИ: 1,31-7,57). Среднее количество миоматозных узлов у женщин с генотипом йЗТМ! 0/0 составило 2,28±0,15, в то время как у женщин-носительниц аллеля «дикого» типа гена <75ТА// среднее количество узлов составило лишь 1,76±0,13 (р<0.05). Из 100 пациенток с миомой матки десять женщин имели в

пораженном органе 4-5 узлов, причем, все эти женщины за единственным исключением являлись носительницами делеционного варианта гена СБТМ!. Таким образом, наличие генотипа СБТМ1 0/0 можно рассматривать как фактор риска не только быстрого, но и множественного роста миоматозных узлов.

Изучение полиморфизма генов фолатного обмена не выявило достоверного отличия генных частот в основной и контрольной группах. Наши данные согласуются с данными О.В. Егоровой и соавт. (2006), которым не удалось установить ассоциации низкофункциональных аллелей генов фолатного обмена с развитием миомы матки. Однако, проведенное нами изучение полиморфизма генов фолатного цикла у женщин с различным клиническим течением заболевания, показало, что у пациенток с быстрорастущей миомой матки достоверно чаще, чем у здоровых женщин встречается низкофункциональный аллель МТИЯ 66С (частота 0,640, р<0,05; ОШ=1,77, ДИ: 1,01-3,14) (табл. 2). Генотипы МТЯЯ 66СЮ или АЮ среди больных с быстрорастущей миомой матки были отмечены в 90,0% случаев; в контрольной группе - в 76,0% случаев (р<0,05; ОШ=2,81, ДИ: 0,92-9,60).

Таблица 2

Частоты аллелей в генах фолатного обмена А4ТЯ, МТЯЯ, МТ1ШК у жен-

щин с лейомиомой матки и в контроле

Ген Аллель Контрольная группа Женщины с миомой матки Женщины с миомой стабильных размеров Женщины с быстрорастущей миомой матки

А/77? 2756А 0,840 0,810 0,820 0,800

2756G 0,160 0,190 0,180 j 0,200

МТЯП 66А 0,500 0,435 0,510 0,360 *

66G 0,500 0,565 0,490 0,640 *

мпш 1298А 0,720 0,695 0,700 0,690

1298С ! 0,280 0,305 0,300 0,310

677С I 0,720 0,795 0,790 0,800

677Т | 0,280 0,205 0,210 0,200

* - различия достоверны по сравнению с контрольной группой (* - р<0,05).

Таким образом, анализ результатов молекулярно-генетического обследования позволяет предположить, что наличие низкофункциональных полиморфных вариантов генов С8ТМ1 и МТЯК является фактором, предрасполагающим к развитию быстрорастущей миомы матки.

Нами был проведен анализ накопления низкофункциональных полиморфных аллелей в генах С8ТМ1 и МГШ у здоровых женщин и пациенток с различным клиническим течением миомы матки по методике, предложенной Т.С. Бескоровайной (2005). Оценивали суммарный вклад тех аллелей, для которых была установлена ассоциация с развитием быстрорастущей и множественной миомы матки. Гетерозиготному состоянию мутантного аллеля у индивидуума присваивалось значение 1, гомозиготному - 2, аллель дикого типа обозначался как 0. Так как гетерозиготные особи по делеционному полиморфизму в гене С5ТМ1 в данном исследовании не выявлялись, то нулевому аллелю этих генов присваивалось значение 1. Суммарное накопление низкофункциональных аллелей в выборке определялось частотой негативных факторов, которая рассчитывалась как отношение суммы всех выявленных негативных факторов в группе к общему числу аллелей в рассматриваемых генах.

Показано, что суммарное накопление указанных аллелей у женщин основной группы достоверно выше, чем в контроле (57,3 и 46,7% соответственно, р<0,05). В группе женщин с быстрорастущей миомой матки данный показатель составил 63,3% (р<0,05). Наличие в генотипе трех неблагоприятных факторов у женщин с миомой матки стабильно малых размеров встречалось чаще, чем у здоровых женщин, но отличие не достигало уровня статистической значимости (16,0 и 8,0% соответственно, р>0,05). У больных с быстрорастущей миомой этот показатель соответствовал 26,0% случаев, что было достоверно выше, чем в контрольной группе (р<0,01, ОШ=3,99, ДИ: 1,24-15,24).

Согласно мнению ряда авторов, присутствие в генотипе низкофункциональных аллелей в генах системы детоксикации и фолатного

цикла может способствовать усилению процесса перекисного окисления липидов и развитию гипергомоцистеинемии [Bestor Т.Н. et al., 1996], что в свою очередь является фактором риска роста миоматозного узла [Tsai J. et al., 1996; Bhat H.K. et al., 2003].

Проведенная нами оценка интенсивности ПОЛ выявила достоверное увеличение максимальной интенсивности свечения Imax, тангенса угла максимального наклона кривой к оси времени tg а, и коэффициента К (Imax/S) у больных миомой матки, максимально выраженное при быстром росте опухоли (табл. 3).

Таблица 3

Показатели хемилюминесценции и уровень гомоцистеина в сыворотке крови у

женщин с лейомиомой матки и в контроле

Показатель Контрольная группа Женщины с миомой матки Женщины с миомой стабильных размеров Женщины с быстрорастущей миомой матки

S, имп*с 26,4 Ш, 95 28,18±0,б1 26,30±0,91 29,49±0,78 * лл

Imax, имп 1,97±0,06 2,27±0,06 ** 2,18±0,09 2,32±0,07 **

tg а 0,369±0,015 0,480±0,014 *** 0,448±0,021 ** 0,503±0,020 ***

К (Imax/S) 0,075±0,001 0,080±0,001 ** 0,081±0,001 *** 0,079±0,001

Hey, мкмоль/л 7,35±0,78 9,98±0,46 ** 8,54±0,66 10,93±0,59 *** лл

* - различия достоверны по сравнению с контрольной группой (* - р<0,05, ** - р<0,01, *** -р<0,001); л - различия достоверны между первой и второй клиническими группами (ЛЛ -р<0,01).

Характерно, что и в основной и в контрольной группах достоверно более высокие показатели хемилюминесценции были отмечены у женщин с генотипом СБТМІ 0/0 (табл. 4).

Корреляционный анализ показал положительную связь между присутствием в генотипе женщины делеционных вариантов генов глутатион-Б-трансфераз М1 и Т1 и интенсивностью ПОЛ, при этом наибольшие коэффициенты корреляции были выявлены в группе пациенток с быстрорастущей миомой матки (табл.5).

Таблица 4

Показатели ХЛ в зависимости от генотипа по гену С5ТМ1_

Показатель Контрольная группа Основная группа

Аллель Генотип GSTM1 + GSTM1 0/0 GSTM1 + GSTM1 0/0

Б, имп*с 23,69±0,74 28,95±1,43 * 26,02±0,91 29,61±0,75 *

1тах, имп 1,79±0,07 2,14±0,08 * 2,10±0,08 2,37±0,07 *

0,337±0,018 0,398±0,020 * 0,459±0,023 0,495±0,020

К (¡шах/Б) 0,0075±0,002 0,075±0,002 0,081±0,002 0,080±0,001

* - различия достоверны по сравнению с носителями аллеля й8ТМ1 + в той же группе (* - р<0,05)

Таблица 5

Коэффициенты корреляции Спирмена для связи генотипа и показателей ПОЛ и

уровня гомоцистеина у обследованных

Корреляционная пара Контрольная группа Основная группа Женщины с миомой стабильных размеров Женщины с быстрорастущей миомой матки

GSTMJ-S 0.261 * 0.394 * 0.296 * 0.577 * А

GSTMl-lmax 0.187 0.264 * 0.274 0.287 *

GSTT!-Ітях 0.150 0.196 -0.035 0.320 * л

GSTT1-tga 0.163 0.227 * 0.091 0.307 *

MTRR66- Hcy 0.154 0.445 * 0.348 * 0.483 *

MTHFR677-Hcy 0.185 0.289 * 0.108 0.504 *

* - достоверные коэффициенты корреляции (р<0.05); л - различия достоверны по сравнению с первой клинической группой (р<0.05)

Таким образом, результаты настоящего исследования подтверждают тот факт, что при миоме матки, особенно при быстром росте миоматозного узла, имеет место усиление процессов перекисного окисления липидов. Уровень ПОЛ определяется наряду с другими факторами качеством антиоксидантной защиты, в частности, системой детоксикации. Присутствие в генотипе делеционных аллелей в генах глутатион-Б-трансфераз М1 и 77 обусловливает неполноценность ферментных систем, участвующих в инактивации свободных радикалов, что, вероятно, способствует возникновению миомы матки и, главное, неблагоприятному течению заболевания, то есть быстрому и множественному росту миоматозных узлов.

Результаты настоящего исследования свидетельствуют о том, что уровень гомоцистеина в крови женщин с миомой матки (основная группа) достоверно

повышен по сравнению со здоровыми женщинами (см. табл. 4). Примечательно, что нами было отмечено также достоверное увеличение содержания гомоцистеина у пациенток с быстрорастущей миомой по сравнению с больными с миомой стабильно малых размеров. Сравнительный анализ данных молекулярно-генетического и биохимического обследований показал достоверное увеличение содержания гомоцистеина в крови больных, имеющих в генотипе аллели МТШ1 660 и МТНРЛ 667Т, по сравнению с лицами, гомозиготными по аллелям «дикого» типа в генах МТЯЯ и МТНРЯ: 10,18+0,49 и 8,95±0,23 мкмоль/л для гена МШ соответственно (р<0,05) и 11,29±0,76 и 9,02±0,53 мкмоль/л для гена МТНРЛ соответственно (р<0,05).

Корреляционный анализ показал положительную связь между носительством низкофункциональных аллелей МТЯЯ 660 и ¡\fTHFR 667Т и уровнем гомоцистеина в крови, при этом наибольшие коэффициенты корреляции были выявлены в группе пациенток с быстрорастущей миомой матки (см. табл. 5).

Таким образом, результаты настоящего исследования подтверждают тот факт, что миома матки является полиэтиологичным заболеванием с существенным наследственным компонентом; при этом особенности генотипа женщины причастны не только к риску возникновения заболевания, но и к особенностям его клинического течения. Определенную роль в генезе миомы матки играют низкофункциональные аллельные полиморфизмы генов системы детоксикации и фолатного обмена, для которых в настоящем исследовании выявлена ассоциативная связь с возникновением и негативным течением патологического процесса. Вероятно, возникновению миоматозного узла вследствие нарушения пролиферации и дифференцировки гладкомышечных клеток, способствует неблагоприятный преморбидный фон, воздействие острой и часто рецидивирующей инфекции, травматизация эндометрия. Указанные факторы риска определяют активацию процессов перекисного окисления липидов, что усугубляет возникшее нарушение. Наличие генетически

детерминированных функционально полноценных ферментативных систем в определенной степени способствует защищенности организма от действия неблагоприятных факторов и препятствует возникновению патологического процесса или обусловливает минимальную степень его выраженности. Накопление в генотипе неблагоприятных аллелей генов системы детоксикации и фолатного цикла благоприятствует с одной стороны ослаблению защиты организма от перекисных процессов, с другой - увеличению уровня гомоцистеина, обладающего самостоятельным мутагенным и прооксидантным действием, что в свою очередь способствует дальнейшему повреждению миометрия, быстрому росту имеющегося узла, а также формированию новых зачатков активной пролиферации. Установленные особенности генотипа пациенток с лейомиомой матки могут использоваться как генетические маркеры предрасположенности к развитию заболевания и быстрому и множественному росту миоматозных узлов.

ВЫВОДЫ

1. Клинико-анамнестическими факторами риска развития лейомиомы являются гепатит А (01Н=6,0), использование средств внутриматочной контрацепции (ОШ=4,0) оперативные вмешательства на органах брюшной полости (0111=2,9), воспалительные заболевания органов малого таза (0111=3,2), наличие миомы у родственников первой степени родства (ОШ=2,6). Клинико-анамнестическими факторами риска быстрого роста лейомиомы матки являются рецидивирующий назолабиальный герпес (ОШ=2,7), частые острые респираторные вирусные заболевания (ОШ=2,5), хронический сальпингоофорит (0111=2,4). Фактором, снижающим риск быстрого роста миомы матки, является использование КОК (01И=0,3).

2. Фактором риска быстрого и множественного роста лейомиомы матки является наличие в генотипе женщины делеционного варианта гена С5'7М/. Связи между особенностями полиморфизма генов семейства глутатион-Б-трансфераз и развитием миомы матки стабильно малых размеров не выявлено.

3. Фактором риска развития быстрорастущей лейомиомой матки является наличие в генотипе женщины низкофункционального аллеля MTRR 66G. Роль генов фолатного цикла в развитии миомы матки стабильно малых размеров не подтверждена.

4. У женщин с лейомиомой матки имеют место усиление процессов пере-кисного окисления липидов и повышение уровня гомоцистеина в крови, наиболее выраженные при быстром росте опухоли.

5. Наличие в генотипе женщины с лейомиомой матки делеционных вариантов генов GSTM1 и GSTT1 ассоциировано с усилением процессов перекисно-го окисления; наибольшие коэффициенты корреляции имеют место при быстрорастущей лейомиоме. Наличие в генотипе женщины с лейомиомой матки низкофункциональных аллелей в генах MTR и MTHFR ассоциировано с повышением уровня гомоцистеинемии; наибольшие коэффициенты корреляции имеют место при быстрорастущей лейомиоме.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Выявленные в настоящем исследовании ассоциации можно использовать в качестве генетических маркеров предрасположенности к неблагоприятному клиническому течению миомы матки. Генетическому тестированию подлежат все женщины, у которых впервые диагностировано заболевание. Указанные особенности генотипа пациентки являются генетическими маркерами предрасположенности:

- к быстрому росту миоматозного узла в течение 5 лет с момента его появления - генотипы GSTM1 0/0 (ОШ=2,2); MTRR 66G/G или MTRR 66A/G (ОШ=1,8);

- к множественному росту миоматозных узлов в течение 5 лет с момента появления - генотип GSTM1 0/0 (ОШ=3,11).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Публикации в журналах, включенных в перечень изданий, рекомендованных ВАК РФ:

1. Дюжев Ж.А., Фетисова И.Н., Малышкина А.И., Ситникова О.Г., Кузь-менко Г.Н. Полиморфизм генов фолатного обмена у женщин с лейомио-мой матки //Мать и дитя в Кузбассе. - 2011. -№1. -С.215-219.

Публикации в журналах, сборниках, материалах конференций и тезисы докладов:

1. Дюжев Ж.А., Фетисова И.Н., Малышкина А.И., Липин М.А. Полиморфизм генов фолатного обмена у женщин с быстрорастущей лейомиомой матки // Материалы научно-практической конференции Центрального федерального округа Российской Федерации с международным участием "Инновации и информационные технологии в диагностической, лечебно-профилактической и учебной работе клиник". - Тверь, 2009. - С.301-302.

2. Дюжев Ж.А., Фетисова И.Н., Малышкина А.И., Смольницкая М.Д. Полиморфизм генов глютатион-Б-трансфераз Ml и Т1 у женщин с лейомиомой матки больших размеров // Труды XXII международного конгресса "Новые технологии в диагностике и лечении гинекологических заболеваний". -Москва, 2009.-С.40.

3. Дюжев Ж.А. Гены системы детоксикации при лейомиоме матки // Материалы 90-й юбилейной научно-практической конференции студентов и молодых ученых ИвГМА "Неделя науки-2010", посвященной 80-летию Академии, ИвГМА. - Иваново, 2010. -С.37.

4. Дюжев Ж.А., Фетисова И.Н., Малышкина А.И., Кузьменко Г.Н. Ассоциация уровня гомоцистеина в крови с быстрым ростом лейомиомы матки // Тезисы конференции "От фундаментальных исследований к инновационным медицинским технологиям". - Санкт-Петербург, 2010. - С.28.

5. Дюжев Ж.А., Фетисова И.Н., Малышкина А.И. Липин М.А. Полиморфизм генов глютатион-Б-трансфераз у женщин с лейомиомой матки // Молекулярная диагностика-2010, т.Ш - С.57-59.

6. Дюжев Ж.А., Фетисова И.Н., Малышкина А.И., Ситникова О.Г. Перекис-ное окисление липидов как фактор быстрого роста лейомиомы матки // Материалы XI Всероссийского научного форума "Мать и дитя". - Москва, 2010.-С.636.

7. Дюжев Ж.А., Фетисова И.Н., Ратникова С. Ю., Сурикова H.A. Исследование полиморфизма генов фолатного обмена у женщин с быстрорастущей миомой матки // Репродуктивное здоровье нового поколения. Сб. науч. трудов / под ред. д.м.н. А.И. Малышкиной - Иваново, 2010.-С.172-174.

2. Дюжев Ж.А., Фетисова И.Н., Малышкина А.И., Липин М.А., Кузьменко, Г.Н. Смольницкая М.Д. Гены фолатного обмена и уровень гомоцистеина

у женщин с быстрорастущей миомой матки // Медицинская генетика (Специальный выпуск). - 2010. - С.58.

3. Дюжев Ж.А., Фетисова И.Н., Мальпикина А.И., Ситникова О.Г. Биохеми-люминесценция сыворотки крови у женщин с лейомиомой матки // Проблемы репродукции (Специальный выпуск). - 2010. - С.176.

8. Дюжев Ж.А., Фетисова И.Н., Малышкина А.И. Делеции генов системы детоксикации и множественная миома матки // Проблемы репродукции (Специальный выпуск). - 2011. - С. 134.

9. Дюжев Ж.А., Малышкина А.И., Фетисова И.Н., Добрынина M.J1. Маркеры наследственной предрасположенности к быстрому росту лейо-миомы матки // Материалы Всероссийского конгресса с международным участием "Амбулаторно-поликлиническая практика: проблемы и перспективы". - Москва, 2011. - С.166-168.

10.Дюжев Ж.А., Смольницкая М.Д. Ассоциация полиморфизмов генов детоксикации и фолатного обмена с показателями перекисного окисления при миоме матки // Материалы 91-й научно-практической конференции студентов и молодых ученых ИвГМА "Неделя науки-2011". - Иваново, 2011.-С.30.

11.Малышкина А.И., Фетисова И.Н., Дюжев Ж.А., Ситникова О.Г. Делеции генов детоксикации и оксидативный стресс как факторы быстрого роста миомы матки // Актуальні питання педиатрії, акушерства та гінекології. -2011. -№1. - С.213-216.

12.Малышкина А.И., Фетисова И.Н., Дюжев Ж.А. Генетические маркеры предрасположенности к быстрому росту лейомиомы матки // Проблемы репродукции (Специальный выпуск). - 2012. - С.188-189.

СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ

GSTM1 — ген глутатион-Э-трансферазы Ml

GSTT1 — ген глутатион-Й-трансферазы Т1

Hey — гомоцистеин

MTHFR — ген 5,10-метилентетрагидролат-редуктазы

MIR — ген метионин-синтазы

MTRR — ген метионин-синтазы-редуктазы

ДИ — 95%-ный доверительный интервал

ДНК —- дезоксирибонуклеиновая кислота

КОК — комбинированный оральный контрацептив

пол — перекисное окисление липидов

ош — скорректированное отношение шансов (odds ratio)

хл — хемилюминесценция

ДЮЖЕВ ЖАН АЛЕКСАНДРОВИЧ

ЗНАЧЕНИЕ ГЕНОВ СИСТЕМЫ ДЕТОКСИКАЦИИ И ФОЛАТНОГО ОБМЕНА В ПАТОГЕНЕЗЕ ЛЕЙОМИОМЫ

МАТКИ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Подписано в печать 10.02.2012. Формат 60x84 1/16. Печать плоская. Усл. печ. л. 1,39 Тираж 100 экз. Заказ № 113. ГОУ ВПО «Ивановский государственный энергетический университет им. В.И. Ленина» 153003, Иваново, ул. Рабфаковская, 34.

Отпечатано в УИУНЛ ИГЭУ.