Автореферат и диссертация по медицине (14.00.27) на тему:Значение феномена транслокации бактерий из желудочно-кишечного тракта в патогенезе хирургической инфекции при повреждениях (экспериментально-клиническое исследование)

На правах рукописи в/%/.

Копылов Вадим Анатольевич

Значение феномена транслокации бактерий из желудочно-кишечного тракта в патогенезе хирургической инфекции при повреждениях

(экспериментально-клиническое исследование)

14.00.27 Хирургия 03.00.25 Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Оренбург, 2005

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Оренбургская государственная медицинская академия Министерства здравоохранения Российской Федерации».

Научные руководители:

Заслуженный изобретатель РФ,

доктор медицинских наук,

профессор Никитенко Вячеслав Иванович

доктор биологических наук,

профессор Стадников Александр Абрамович

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук,

Слепых Николай Иванович

доктор биологических наук,

профессор Завалеева Светлана Михайловна

Ведущая организация Челябинская государственная медицинская академия.

Защита состоится «27» апреля 2005 года в 10 часов на заоедании диссертационного совета Д 208.066.02 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Оренбургская государственная медицинская академия Министерства здравоохранения Российской Федерации» (Россия, 460000, г.Оренбург, ул. Советская, д.6, зал заседаний диссертационного совета).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО ОрГМА Минздрава России.

Автореферат разослан » г<\ 2005 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования

Проблема хирургической инфекции при травмах является актуальной. Количество гнойно-воспалительных осложнений после травм варьирует от 5% до 50% (R.L. Nichols, S.Florman, 2001). Нагноения случайных ран мягких тканей встречаются в 12-25% (Х.А.Мусалатов с соавт., 1998). Частота гнойно-воспалительных осложнений области хирургического вмешательства колеблется от 2-3 до 22% (В.В. Агаджанян, 1987; Н.В. Корнилов с соавт., 1997; A.B. Кулаков с соавт., 2001; В.И. Ульянов с соавт.,2002; Т.Я.Пхакадзе, З.И.Уразгильдеев, 2002).

Можно выделить следующие направления в поиске действенных путей профилактики хирургической инфекции: совершенствование мероприятий по асептике, антисептике и технике хирургического вмешательства, воздействие на иммунную систему, устранение нарушений микроциркуляции, стимуляция репаративных процессов (В.М.Шаповалов с соавт., 1998; И.Ю.Клюквин с соавт., 1998; C.B. Лохвицкий с соавт., 2002; L. Ameziane et al., 2003). Основные усилия исследователей в настоящее время сосредоточены вокруг разработки и использования новых антибактериальных препаратов, прежде всего антибиотиков (G.V.Russell et al., 2001; F. de Lalla, 2002; C.B. Сергеев и соавт., 2003). Несмотря на огромные затраты, результаты антибиотикопрофилактики не всегда соответствуют ожиданиям (G.A.Franklin et al., 2002; М.А. Wilson, 2003). Появляются новые антибиотикорезистентные штаммы бактерий, развиваются аллергия на химиопрепараты, дисбактериоз и др. (Т. Франклин, Дж. Сноу, 1984; И.А.Ерюхин с соавт., 1997; T. Nakagawaet al., 1998). Наличие недавно обнаруженных механизмов «укрытия» и длительной персистенции стафилококков в тканях различного генеза (A.A. Стадников с соавт., 2003) также ставит под сомнение эффективность дальнейшего развития антибиотикопрофилактики.

Всё более очевидной становится необходимость раскрытия малоизученных аспектов патогенеза хирургической инфекции. До настоящего времени большинство хирургов и микробиологов уверены, что, в основном, бактерии попадают в рану непосредственно из внешней среды. Роль эндогенного

РОГ. I -'1лльиАЯ Ï '".-ütKA С "iupCx* 3

Mb/r-

г » ______

инфицирования явно недооценивается. В то же время доказан феномен транслокации бактерий из желудочно-кишечного тракта, описанный R.D. Berg (1985), В.И. Никитенко (1990). Экспериментальными исследованиями последних лет было установлено, что бактерии могут проникать через неповрежденную стенку желудочно-кишечного тракта во внутренние среды организма. Транслокация обнаружена при различных патологических состояниях (L.C.Lemaire, 1997; D. Adawi et al., 1998; D. Demetriades et al„ 1999), а также в условиях здорового организма (В.К. Есипов, 1999; B.C. Тарасенко, 2000).

Однако остаются неизученными многие механизмы этого явления. Неизвестно, регулируется ли транслокация макроорганизмом, зависит ли этот феномен от дозы и вида бактерий, попавших в желудочно-кишечный тракт, влияет ли характер повреждения на феномен бактериальной транслокации, возникает ли она только вследствие стресса или является защитным механизмом теплокровных, каковы методы блокирования данного пути распространения возбудителей хирургической инфекции. Всё вышеуказанное послужило основанием для выполнения данной работы.

Цель исследования

Целью настоящего исследования явилось изучение значения феномена транслокации в патогенезе хирургической инфекции при повреждениях и определение эффективности нового способа профилактики хирургической инфекции.

Задачи исследования

1. Определены минимальные дозы бактерий штаммов Staphylococcus aureus 209Р и Bacillus subtilis 534, при интрагастральном введении которых регистрируется феномен бактериальной транслокации у здоровых белых крыс.

2. Изучена динамика обсеменения тканей различных органов бактериями при различных дозах инфицирования желудка.

3. Исследовано влияние ранений мягких тканей и закрытых переломов трубчатых костей на транслокацию бактерий у животных.

4. Изучена реакция тканей и органов на транслокацию у здоровых и травмированных животных.

5. Определена эффективность живого бактериального препарата «споробакте-рин жидкий» в качестве средства профилактики хирургической инфекции у больных с ранениями мягких тканей.

Научная новизна исследования

Впервые установлено, что минимальная доза бактерий, при интрагаст-ральном введении которой регистрируется феномен транслокации у здоровых крыс, равна 106 микробных тел на 1 кг веса животного.

Впервые обнаружено, что при ранениях мягких тканей и закрытых переломах конечностей пороговая доза микроорганизмов штаммов Staphylococcus aureus 209Р и Bacillus subtilis 534 снижается и составляет 104 микробных тел на 1 кг веса животного.

Выявлено, что у здоровых и травмированных животных через 6 часов после интрагастрального введения жизнеспособные бактерии обнаруживаются в печени, селезенке, стенке желудка и тонкого отдела кишечника, с преимущественным накоплением в селезенке и печени. В тканях легких, почек, кожи, в крови микроорганизмы не наблюдаются.

Транслокация бактерий контролируется макроорганизмом. У здоровых белых крыс при увеличении числа интрагастрально введенных микроорганизмов в 10000 раз, количество меченых бактерий, обнаруживаемых во внутренних органах, возрастает всего в 1,3 - 5,8 раз.

Впервые установлено, что феномен транслокации микроорганизмов у здоровых животных при микробной нагрузке 104-1010 колониеобразующих единиц штаммов Staphylococcus aureus 209Р и Bacillus subtilis 534 не сопровождается стрессорными изменениями гистологических и цитологических структур гипоталамо-гипофизарной нейросекреторной системы и надпочечников.

Обнаружено, что тяжесть травмы влияет на феномен транслокации. У крыс с закрытыми переломами бедра количество проникающих в печень и селезенку бактерий выше, чем у животных с ранениями мягких тканей.

Установлено, что транслокация Bacillus subtilis 534 у здоровых и травмированных животных происходит интенсивнее, чем Staphylococcus aureus 209Р.

Количество бактерий сенной палочки превышает число стафилококков в тканях области раны в 1,6-2,8 раза, а в области закрытого перелома - в 4,6-5,1 раз.

Выявлено, что микроорганизмы, попадающие в желудочно-кишечный тракт, активно участвуют в течении раневого процесса. Бактерии сенной палочки, локализуясь в очагах травматизации мягких и костных тканей, создают условия для стимуляции репаративных гистогенезов (патент РФ №2202356, 20.04.2003г.). Микроорганизмы Staphylococcus aureus 209Р вызывают усугубление изменений альтеративного характера в области закрытого перелома.

Научно-практическая значимость работы

Транслокация бактерий из желудочно-кишечного тракта может быть механизмом эндогенного инфицирования очагов повреждения, что следует учитывать в клинической практике, в том числе при осуществлении мероприятий по предупреждению госпитальной инфекции. Транслокации подвергаются как условно-патогенные бактерии, так и сапрофиты. Обоснована возможность селективного использования микрофлоры, попадающей в желудочно-кишечный тракт, для регуляции раневого процесса и профилактики хирургической инфекции.

Доказана более высокая эффективность живого бактериального препарата, по сравнению с антибиотиком цефазолином. Использование живого бактериального препарата «споробактерин жидкий» у больных с ранениями мягких тканей способствует снижению частоты хирургической инфекции и более быстрой нормализации клинико-лабораторных показателей.

Положения, выносимые на защиту

1. Транслокация бактерий из желудочно-кишечного тракта - механизм систематического инфицирования очагов повреждения и естественной защиты человека и животных от инфекции. Она регулируется макроорганизмом и зависит от дозы, вида бактерий, характера повреждения.

2. Использование живого бактериального препарата «споробактерин жидкий» у больных с ранениями мягких тканей способствует снижению частоты хирургической инфекции и улучшает течение посттравматического периода.

Апробация результатов исследования

Материалы диссертации доложены и обсуждены на межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные вопросы урологии» (Тюмень, 2001), научной конференции «Актуальные проблемы травматологии и ортопедии» (Нижний Новгород, 2001), на международной научно-практической конференции памяти Г.И. Гончаровой «Пробиотические микроорганизмы - современное состояние вопроса и перспективы использования» (Москва, 2002), 3-й Всеармейской научно-практической конференции с международным участием «Инфекция в хирургии - проблема современной медицины» (Москва, 2002), Ш научно-практической конференции врачей Приволжско-Уральского военного округа (Оренбург, 2002), на 5-ом Славяно-Балтийском научном форуме «Санкт-Петербург - Гастро-2003» (Санкт-Петербург, 2003), Санкт-Петербургской Медицинской Ассамблее «Врач-Провизор-Пациент» (Санкт-Петербург, 2003), на IV научно-практической конференции врачей Приволжско-Уральского военного округа (Оренбург, 2003), на областной научно-практической конференции врачей «Актуальные проблемы хирургии повреждений» (Оренбург, 2003), на 6-ом Славяно-Балтийском научном форуме «Санкт-Петербург - Гастро-2004» (Санкт-Петербург, 2004), международной научно-практической конференции «Морфофункциональные аспекты регенерации и адаптационной дифференци-ровки структурных компонентов опорно-двигательного аппарата в условиях механических воздействий» (Курган, 2004), международном конгрессе «Современные технологии в травматологии, ортопедии: ошибки и осложнения - профилактика, лечение» (Москва, 2004), на Российской научно-практической конференции «Узловые вопросы борьбы с инфекцией» (Санкт-Петербург, 2004), научной конференции «Фундаментальные и прикладные проблемы гистологии. Гистогенез и регенерация тканей» (Санкт-Петербург, 2004), на областной конференции хирургов «Актуальные вопросы хирургии: проблемы и пути решения» (Оренбург, 2004).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 19 печатных работ, в том числе патент РФ на изобретение №2202356,20.04.2003г.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 141 странице машинописного текста. Она состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием материалов и методов исследования, 3 глав, в которых изложены результаты собственных исследований, главы обсуждения результатов, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы, включающего 216 источников, в том числе 117 работ отечественных и 99 работ зарубежных авторов.

В диссертации имеется 17 рисунков и 25 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы и методы экспериментальных исследований.

Эксперименты по транслокации бактерий выполнены на 96 лабораторных белых крысах-самцах линии «Август» массой 180-230 г. Все животные были получены из питомников лабораторных животных «Столбовая» и «Рапполово».

В условиях радиоизотопной лаборатории Оренбургской государственной медицинской академии в пробирки с 0,75% стерильным расплавленным мясо-пептонным агаром вносили радионуклид 3Н-лейцин в дозе 1 МБК на одну пробирку. Петлей на косячки агара засевали бактерии штаммов Staphylococcus aureus 209Р или Bacillus subtilis 534. Инкубацию проводили при температуре +37 °С в течение 24 часов. Меченые микроорганизмы смывали стерильным 0,9% раствором натрия хлорида по 2 см3 в каждую пробирку. Путем добавления 0,9% раствора натрия хлорида готовили взвесь с различными концентрациями микробных клеток в 1 см3 . Количество микроорганизмов во взвеси определяли с помощью оптических стандартов мутности на 10 и 20 ЕД (ГИСК им. Л.А.Тарасевича).

В первой серии опытов 42 здоровым крысам интрагастрально вводили различные количества меченых бактерий штаммов Staphylococcus aureus 209Р и Bacillus subtilis 534. Животные были разделены на группы по три крысы в каждой. Каждой группе крыс через рот при помощи тупой толстой иглы вводили определенное количество бактерий: 104, 105, 10б, 107, 108, 109, 1010 микробных тел на 1 кг массы тела животного соответственно (по 0,2 см3).

Всех животных, задействованных в данной серии, выводили из опыта через 6 часов путем ингаляционного введения летальной дозы фторотана. При помощи стерильного инструментария после трехкратной обработки кожи 1% раствором йодопирона забиралась селезенка, печень, ткани желудка и тонкой кишки для бактериологического исследования.

Для гистологического и гистоавторадиографического, морфометрическо-го исследования у животных брали кусочки печени, селезенки, желудка, тонкой, толстой кишки, легких, гипоталамуса, нейрогипофиза, надпочечников, кожи, делали мазки крови.

Во второй серии экспериментов изучалось влияние повреждений мягких тканей на феномен транслокации бактерий. 27 крысам под ингаляционным фторотановым наркозом в области наружной поверхности бедра наносили резаные раны кожи и подкожной жировой клетчатки длиной 1 см. Животных разделили на девять групп по 3 крысы в каждой. Четырем группам вводили через рот меченый штамм Staphylococcus aureus 209Р в количестве 1х103, 1x104, lxlO5, lxlO6 на 1 кг массы тела соответственно. Четырем группам крыс вводили через рот в таких же количествах меченые бактерии штамма Bacillus subtilis 534. Ещё одна группа служила контролем. Животных выводили из опыта путем ингаляционного введения летальной дозы фторотана через 6 часов после введения бактерий. Для гистологического и гистоавторадиографического, морфо-метрического, бактериологического исследования у животных брали те же ткани, что и в первой серии экспериментов, и ткани области раны. Образцы обрабатывались по тем же методикам, что и в первой серии опытов.

В третьей серии экспериментов изучали влияние закрытых переломов трубчатых костей на феномен транслокации бактерий. 27 крысам под ингаляционным фторотановым наркозом наносили закрытые переломы диафиза бедренной кости. Животных разделили на девять групп по 3 крысы в каждой. Четырем группам вводили через рот меченые бактерии штамма Staphylococcus aureus 209Р в количестве 1x103, lxlO4, lxlO5, lxlO6 на 1 кг массы тела соответственно. Четырем группам крыс вводили через рот в таких же количествах меченые Bacillus subtilis 534. Ещё одна группа служила контролем. Животных

выводили из опыта путем ингаляционного введения летальной дозы фторотана через 6 часов после введения бактерий. Выполнялись те же исследования, что и в предыдущих сериях экспериментов. Кроме этого, для гистологического и гис-тоавторадиографического, морфометрического, бактериологического исследований у животных брали ткани области перелома.

Взятые для морфологических исследований органы от животных (опытных и контрольных групп) были подвергнуты однотипной гистологической обработке. При этом кусочки органов фиксировали в 10% водном растворе нейтрального формалина. Мазки крови для высушивания обрабатывали метанолом (стекла с мазками экспонировали 5-6 мин в стаканчике с притертой пробкой, наполненном метанолом). Фиксированные кусочки органов в последующем дегидрировались в спиртах возрастающей концентрации и запивали в парафин -целлоидин.

С каждого объекта на ротационном микротоме изготавливали серийные парафиновые срезы толщиной 6-8 мкм (по 20 стекол). Каждое третье стекло с гистологическими срезами окрашивали гематоксилином Майера и эозином. Остальные гистопрепараты служили для целей гистоавторадиографии.

При приготовлении гистоавтографов использовали жидкую эмульсию типа «М» (производства НИИХИМфото) по методике, предложенной Л.Н.Жинкиным (1959). Эмульсию экспонировали 4 недели с последующим проявлением в амидоловом проявителе. Гистоавтографы окрашивали гематоксилином-эозином. Подсчет треков 3Н-лейцина (зерен восстановленного серебра) осуществляли в полях зрения микроскопа (окулярная вставка 5x5 мм., об. 100, ок. 15). При этом в каждом гистологическом срезе того или иного органа анализировали не менее 100 полей зрения. В мазках крови подсчет гистоавтографов проводили в аналогичных полях зрения (не менее 100 полей для каждого животного).

Для целей электронной микроскопии объекты (крупноклеточные ядра гипоталамуса и нейрогипофиз) последовательно фиксировали в 2,5% растворе глютарового альдегида на 8-колединовом буфере (рН=7,3) и четырехокиси осмия. После дегидратации кусочков в ацетоне возрастающей крепости

проводили их заливку в смолу ЭПОН-812. Ультратонкие срезы, изготовленные на ультратоме LKB-5, подвергали контрастированию в уранилацетате и ацетате свинца с последующем изучением и фотографированием в электронном микроскопе ЭМВ100АК (увеличение хбООО - 40000). Все методики ультраструктурного анализа выполнены в соответствии с рекомендациями M. Hayat (1979).

Морфометрические исследования и анализ количественных параметров проводили с помощью винтового окуляр-микрометра МОВ 4У и измерительных сеток Г. Г. Автандилова (1990).

Для бактериологических исследований взятый материал (ткань печени, селезенки, желудка, тонкой кишки) по 1 г помещали в стерильную посуду, затем проводили измельчение и растирание в фарфоровой ступке со стерильным песком с последующим добавлением 10 см3 0, 9% раствора хлорида натрия. Полученную взвесь стерильной петлей переносили на чашку Петри и распределяли по поверхности 1,5% мясо-пептонного агара после чего инкубировали в термостате при температуре +37 °С в течение 24 часов. Видовую принадлежность бактерий определяли по Берджи (1997). Идентичность выделенных из материалов культур, использованных в эксперименте, подтверждали на основании одинаковых морфологических, тинкториальных, культуральных и биохимических свойств.

Характеристика хирургических больных.

В клинике под нашим наблюдением 60 пациентов со случайными ранениями мягких тканей, получавших лечение в ММУЗ ГКБ №4 г.Оренбурга (главный врач - C.B. Никитин) в 2002-2003 г.г. Мужчин было 44 человека, женщин - 16. Возраст больных был от 16 до 55 лет.

По характеру получения травм бытовых было 42 случая (70%), производственных - 18 случаев (30%). Алкогольное опьянение при поступлении было зафиксировано у 39 человек (65%). По локализации на долю ранений головы приходилось 22 (36,7%) случая. У 12 (20%) больных были раны области нижней конечности. С ранениями верхней конечности наблюдалось 26 (43,3%) пациентов, из них 14 (23,3%) - с ранениями кисти. С колотыми и резаными ранами поступило 20 (33,3%) человек, у 21 (35%) больных были ушибленные раны,

у 19 (31,7%) пациентов наблюдались рвано-скальпированные раны. Больные с размозжениями мягких тканей в исследование не включались.

При поступлении всем исследуемым выполнялась первичная хирургическая обработка ран, экстренная профилактика столбняка. Пациентам с повреждениями конечностей осуществлялась гипсовая иммобилизация. Больные получали ежедневные перевязки с 1% раствором йодопирона, антиагреганты, анти-окиданты, симптоматическую терапию.

Все больные были разделены на три рандомизированные группы по 20 человек, сопоставимые по полу, возрасту, характеру патологии. Пациентам первой группы назначали пробиотик «споробактерин жидкий» в стандартной дозировке по 1 мл два раза в сутки в течение 5 дней. Антибиотики не назначались. Вторая группа получала цефазолин в дозе 1 г внутривенно перед первичной хирургической обработкой раны и затем внутримышечно в течение 48 часов по 1 г три раза в сутки. Третьей группе больных не назначали ни антибиотиков, ни пробиотиков.

Клинические наблюдения включали оценку общего состояния, сроки и качество заживления ран, динамику температуры тела, количества лейкоцитов, эритроцитов и гемоглобина периферической крови, лейкоцитарный индекс интоксикации (Я.Я. Кальф-Калиф, 1941). Показатель нормы составил 1,0+0,06.

Методы статистического анализа результатов.

Статистическая обработка полученных результатов исследования проводились на ПЭВМ IBM PC с помощью программного комплекса Windows, Word и Excel. Использовался метод вариационной статистики с определением достоверности с помощью критерия Стьюдента, а при количестве наблюдений менее 20 - непараметрический метод Вилкоксона для независимых совокупностей (JI.C. Каминский, 1964). В ряде случаев для оценки статистической значимости различий использован критерий знаков.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Экспериментальные исследования Анализ результатов экспериментов позволил установить ряд закономерностей, касающихся механизмов транслокации бактерий штаммов Staphylococcus

Staphylococcus aureus 209P и Bacillus subtilis 534 у здоровых животных и при механических повреждениях, описании структурных феноменов, возникающих в барьерных эпителиальных тканях слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта, паренхиме, строме печени и селезенки, тканях области повреждения.

Установлено, что у экспериментальных животных бактерии через 6 часов после интрагастрального введения обнаруживаются в стенке желудка, тонкой кишки, в печени, селезенке (рис. 1, 2). В тканях легких, почек, кожи, в крови микроорганизмы не наблюдались. Выявлено, в печени и селезенке здоровых животных количество радиометок бактерий в условных полях зрения светового микроскопа было в 1,6-3,3 раза выше (р<0,005), чем в тканях полых органов гастроинтестинального тракта. У крыс с закрытыми переломами бедра число радиометок в печени и селезенке было в 2,1-4,2 раза выше, чем в других органах. У животных с ранениями мягких тканей число бактерий в селезенке было либо меньше, либо не отличалось от количества радиометок в стенке желудка и тонкого отдела кишечника.

Установлено, что в тканях микроорганизмы сохраняют свою жизнеспособность На это указывают результаты бактериологических исследований. Живые бактерии штамма Staphylococcus aureus 209Р обнаружены в 76 (50%) из 152 высевов, штамма Bacillus subtilis 534 выявлены в 84 (53,8%) из 156 высевов.

Впервые выявлено, что транслокация Bacillus subtilis 534 и Staphylococcus aureus 209Р у здоровых лабораторных крыс начинается при введении бактерий в количестве 106 микробных тел на 1 кг массы тела животного и выше. Можно предположить, что транслокация контролируется макроорганизмом, ибо при увеличении дозы интрагастрально введенных бактерий с 1х106 до 1 х 1010 на 1 кг массы тела, то есть в 10000 раз, число радиометок повышалось в среднем в 1,3 - 8,2 раз.

Таким образом, нашими исследованиями установлено, что транслокация происходит в условиях здорового организма. Это согласуется с данными В.К.Есипова (1999), B.C. Тарасенко (2000), но противоречит публикациям большинства зарубежных исследователей. Последние считают, что

тг^

Рис. 1. Селезенка крысы. Б — скопления стафилококков. Количество введенных бактерий - 1x107 на 1 кг массы тела крысы.

Гистоавтограф, ув.об.40, ок.10

Рис. 2. Участок печени крысы. А - Bacillus subtilis 534. Количество введенных бактерий - 1x106 на 1 кг массы тела крысы.

Гистоавтограф, ув.об.90, ок.10

бактериальная транслокация встречается только при патологических состояниях, сопровождаемых стрессом. Она возникает вследствие механической травмы, ожогов, при геморрагическом шоке, кишечной непроходимости, полиорганной недостаточности, механической желтухе, остром панкреатите, токсических гепатитах и др. (Л.Я. Эберт с соавт., 1979; Е.А. ОексЬ, 1994; Ь.С. Ьегтшге, 1997; О. Ас1а\у1 е1 а1., 1998; О.Бете1пас1ез а а1„ 1999).

Было установлено, что бактерии проникали в кровь и лимфу на участках в основном неповрежденной слизистой оболочки желудка и тонкого отдела кишечника. Это происходило через межклеточные щели и зоны локальной, наблюдаемой и в физиологических условиях десквамации ямочного эпителия желудка и энтероцитов кишки. Вышеизложенное подтверждает обнаружение микроорганизмов в межклеточных пространствах эпителиоцитов желудка и энтероцитов тонкого кишечника, а также электронно-микроскопическое обнаружение микробных клеток внутри эпителиоцитов. Эти результаты

согласуются с данными A.A. Стадникова (2001). Было также выявлено, что у данных животных не происходит транслокации микробов через эпителиальные барьеры толстого отдела кишечника.

Через 6 часов после интрагастрального введения бактерии были обнаружены в клетках фундальных желез, покровном эпителии и собственной пластинке слизистой оболочки желудка и тонкого отдела кишечника. В селезенке меченые бактерии определялись, в основном, в красной пульпе, в синусоидных капиллярах, а также в периартериальной зоне лимфоидных фолликулов. В печени радиометки находились, главным образом, в синусоидальных и желчных капиллярах и перихолангиолярной соединительной ткани. Это закономерность была справедлива как для стафилококка, так и для сенной палочки. Характер распределения меченых бактерий в гистоструктурах желудка, кишечника, обнаружение радиометок бактерий в периваскулярных зонах паренхиматозных органов, в просвете и структурах стенок, в центральных и периферических органах иммуногенеза является доказательством лимфо-гематогенного распространения микроорганизмов. Проведенное нами исследование подтверждает ранее сформулированное положение В. И. Никитенко (1990) о едином механизме транслокации из желудочно-кишечного тракта патогенной и непатогенной микрофлоры.

При микробной нагрузке Ю6-Ю10 колониеобразующих единиц у здоровых крыс гистоструктура печени и селезенки в целом соответствовала той морфологической картине, которая укладывается в общеизвестный стереотип компенсаторно-приспособительных реакций иммунокомпетентных органов, возникающих при антигенной стимуляции. В тканях других органов мы не наблюдали отклонений от обычного строения после введения различных количеств меченых бактерий.

Впервые установлено, что транслокация бактерий у здоровых животных не сопровождается развитием стресса. Морфологический анализ гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальной системы показал, что феномен транслокации микроорганизмов через эпителиальные барьеры слизистых оболочек пищеварительного тракта после введения 104-108 бактерий на 1 кг веса животного не

сопровождается стрессорной реакцией. Цитологические изменения в гипотала-мо-гипофизарной нейросекреторной системе, наблюдаемые нами при интрага-стральном введении 109 - 1010 бактерий на 1 кг массы тела животного укладывались в картину умеренной адаптивной активизации экскреции нейропептидов на уровне аксовазальных компонентов нейрогипофиза.

Нашими исследованиями установлено, что транслокация бактерий происходит и у животных с повреждениями, а именно с ранениями мягких тканей и закрытыми переломами бедра. Выявлено, что Staphylococcus aureus 209Р и Bacillus subtilis 534, через 6 часов после интрагастрального введения, проникают в область раны и зону перелома. Это согласуется с данными ряда авторов (В.И. Никитенко с соавт., 1988; В.В.Смирнов с соавт., 1988; В.И. Никитенко, 1990; С.Г. Кудашев, 2000), которые указывали на попадание микроорганизмов в очаг повреждения.

Нами впервые установлено, что в условиях повреждения мягких и костных тканей порог транслокации Staphylococcus aureus 209Р и Bacillus subtilis 534 снижался до 104 вводимых перорально бактерий на 1 кг массы тела животного. Можно предположить, что тяжесть травмы влияет на феномен транслокации. У крыс с закрытыми переломами бедра количество проникающих в печень и селезенку бактерий в среднем было выше в 1,27 раз, чем у животных с ранениями мягких тканей.

При сравнительной оценке распределения стафилококков и сенной палочки у здоровых животных и на моделях повреждений были выявлены следующие закономерности. Через 6 часов после интрагастрального введения меченых бактерий здоровым животным в слизистой оболочке желудка, тонкого кишечника преобладала сенная палочка, количество которой было в 1,5-2,6 раза больше, чем стафилококков (р<0,001) в условных полях зрения светового микроскопа. В органах с элементами моноцитарно-макрофагальной системы (печень, селезенка) характер преимущественно выделяемой микрофлоры из тканей несколько отличался. Также преобладала сенная палочка, но количество радиометок последней превышало число стафилококков уже в 1,8-4,7 раз (р<0,001). После введения Ю10 бактерий на 1 кг массы тела животного число радиометок

Bacillus subtilis 534 было выше, чем Staphylococcus aureus 534 в 19,2 раза. В стенке толстой кишки бактерии обоих видов обнаруживались лишь при введении Ю10 микробных тел на 1 кг, а их количество достоверно не различалось (р>0,5) [табл.1].

У животных после нанесения резаных ран наблюдалось примерно такое же соотношение распределения сенной палочки и стафилококка в тканях желудка и кишечника. Напротив, в печени количество Bacillus subtilis 534 резко уменьшилось по сравнению с числом стафилококков, и различия в количестве микроорганизмов не обладали достаточной достоверностью (р>0,1) [табл.2].

После нанесения закрытых переломов наблюдалась похожая картина распределения бактерий. После введения микроорганизмов штамма Bacillus subtilis 534 их количество в слизистой оболочке желудка, тонкого кишечника было в 1,4-1,8 раз больше, чем радиометок стафилококка после введения Staphylococcus aureus 209Р (р<0,001). В селезенке число радиометок Bacillus subtilis 534 было выше лишь в 1,5-2,3 раза. В печени количество сенной палочки превышало число стафилококков в среднем в 1,65 раза. Показатели порога бактериальной транслокации не различались (табл.3). Следует отметить, что количество бактерий сенной палочки превышало число стафилококков в тканях области раны в 1,6-2,8 раза, а в области закрытого перелома - в 4,6-5,1 раз (р<0,001).

Таким образом, у интактных крыс в целом из исследуемых органов преимущественно выделялась меченая культура сенной палочки в количествах, значительно превышающих содержание стафилококка (р<0,001). У животных с повреждениями, наряду со значительным увеличением, в сравнении с показателями стафилококка, содержания сенной палочки в области раны и перелома, отмечено достоверное снижение ее количества, по сравнению со стафилококком, в печени и селезенке (р<0,001). Можно предположить, что в условиях повреждения мягких и костной тканей происходило перераспределение бактерий из печени и селезенки в очаг повреждения, выраженное у животных, получавших микроорганизмы штамма Bacillus subtilis 534.

Таблица 1.

Сравнительные данные о распределении радиоактивных меток в тканях здоровых животных при различных дозах введенных бактерий штаммов

81арЬу1ососсш аигеиБ 209Р и ВасШив виЫШв 534.

№ Кол-во бактерий* Стат. показатели Виды тканей **

селезенка печень желудок тонкая кишка толстая кишка

в. аигеи$ В.8иЬ-Ш: в. аигеш В.зиЬ- в. аигеиз В.яиЬ-йНз в. аигеиз В.виЬ-ННв в. аигеиз В.5иЬ-(11)5

1 1х 104 М± м Не обнар Не обнар Не обнар Не обнар Не обнар Не обнар Не обнар Не обнар Не обнар Не обнар

2 1х 105 М± м Не обнар Не обнар Не обнар Не обнар Не обнар Не обнар Не обнар Не обнар Не обнар Не обнар

3 1х 106 М± м 0,17± 0,03 0,8± 0,09 0,48± 0,05 0,92± 0,03 Не обнар Не обнар Не обнар Не обнар Не обнар Не обнар.

Р р<0,001 р<0,001

4 1x10' М± м 0,86± 0,04 1,52± 0,2 0,51± 0,07 1,24± 0,08 0,34± 0,09 0,68± 0,05 0,4± 0,03 0,95± 0,07 Не обнар Не обнар

Р р<0,001 р<0,001 р<0,001 р<0,001

5 1x10* М± м 1,01± 0,07 1,89± 0,12 0,62± 0,05 1,88± 0,04 0,41± 0,05 0,89± 0,06 0,43± 0,07 1,1± 0,03 Не обнар Не обнар

Р р<0,001 р<0,001 р<0,001 р<0,001

6 1х 10' М± м 1,01± 0,15 2,79± 0,1 0,83±0, 02 1,95± 0,08 0,56± 0,06 0,85± 0,09 0,45± 0,04 0,95± 0,07 Не обнар Не обнар

Р р<0,001 р<0,001 р<0,001 р<0,001

7 1х 10'° М± м 1,40± 0,1 4,78± 0,54 0,41± 0,06 7,86± 0,6 0,75± 0,1 1,52± 0,12 0,9± 0,12 1,64± 0,11 0,72± 0,32 0,74± 0,1

Р р<0,001 р<0,001 р<0,001 р<0,001 р>0,5

* - Количество интрагастрально введенных микробных тел на 1 кг массы экспериментального животного.

** - Подсчет производился в условных полях зрения микроскопа (окулярная вставка 0,25 мм2, об.90, ок. 15).

- J

Таблица 2.

Сравнительные данные о распределении радиоактивных меток в тканях при различных дозах введенных бактерий штаммов Staphylococcus aureus 209Р и Bacillus subtihs 534 у животных с резаными ранами

№ Кол-во бактерий* Стят. показатели Виды тканей **

селезенка печень желудок тонкая кишка область раны

S.aureus B.subtilis S.aureus B.subtilis S.aureus B.subtilis S.aureus B.subtilis S.aureus B.subtilis

1 1х10э М±м Не обнар Не обнар Не обнар Не обнар Не обнар Не обнар Не обнар Не обнар Не обнар Не обнар

2 lx 104 М±м Р 0,19*0,08 р<0 0,54±0,13 001 0,76±0,19 рХ 0,81±0,21 Не обнар Не обнар Не обнар Не обнар. 0,95±0,8 р<0 1,5±0,07 001

3 lx 105 М±м Р 0,16±0,04 | 0,75±0,09 р<0,001 0,68±0,09 | 1,21 ±0,1 р<0,001 0,22±0,06 р<0 0,55±0,06 001 0,42±0,04 р<0 0,45±0,04 001 0,82±0,07 | 2,1±0,14 р<0,001

4 1х 10® М±м Р 0,43±0,87 | 1,12±0,09 р<0,001 1,63±0,3 | 1,7±0,24 р>0,1 0,34±0,05 | 0,95±0,07 р<0,001 0,56±0,07 | 0,78±0,05 р<0,001 0,8±0,03 | 2,23±0,19 р<0,001

Таблица 3.

Сравнительные данные о распределении радиоактивных меток в тканях при различных дозах введенных бактерий штаммов _Staphylococcus aureus 209Р и Bacillus subtihs 534 у животных с закрытыми переломами._

№ Кол-во бактерий* Стат. показатели Виды тканей **

селезенка печень желудок тонкая кишка область перелома

S.aureus B.subtilis S.aureus B.subtilis S.aureus B.subtilis S.aureus B.subtilis S.aureus B.subtilis

1 lx 103 М±м Не обнар Не обнар Не обнар Не обнар Не обнар Не обнар Не обнар Не обнар Не обнар Не обнар.

2 lx 104 М±м P 0,34±0,08 р<0 0,52±0,05 001 1,2±0,09 р<0 0,49±0,03 001 0,35±0,04 р<0 Не обнар. 001 Не обнар р<0 0,42±0,03 001 0,41 ±0,05 р<0, 1,9±0,05 001

3 lx 105 М±м P 1,77±0,1 | 1,9±0,12 р<0,001 0,9±0,06 | 2,03±0,4 р<0,001 0,57±0,0б | 0,82db0,06 р<0,001 0,42±0,05 | 0,73±0,05 р<0,001 0,45±0,02 | 2,32±0,1 р<0,001

4 1 х 10® М±м P 0,82±0,05 | 1,85±0,21 р<0,001 1,18±0,09 | 1,95±0,06 р<0,001 0,72±0.07 | 0,85±0,04 р<0,001 0,39±0,05 | 0,69±0,04 р<0,001 0,47±0,05 | 2,41 ±0,3 р<0,001

* - Количество интрагастрально введенных микробных тел на 1 кг массы экспериментального животного ** - Подсчет производился в условных полях зрения микроскопа (окулярная вставка 0,25 мм2, об.90, ок. 15)

По нашим данным, транслокация сенной палочки не вызывало усугубления структурных изменений альтеративного характера в тканях области раны, в костной ткани и окружающих место перелома мягких тканях. Согласно результатам гистологического анализа, у животных, получавших бактерии штамма Bacillus subtilis 534, создавались условия для стимуляции репаративных гистогенезов. Так, например, в перинекротической зоне была более отчетливо выражена макрофагальная реакция: отмечены клетки на стадии активного фагоцитоза, численность макрофагов была на 20% выше. Существенно уменьшались признаки кариопикноза и кариолизиса клеток соединительной ткани. Эти материалы использованы при разработке способа стимуляции репаративных процессов длительно незаживающих ран и трофических язв (патент РФ № 2202356).

Напротив, через 6 часов после введения стафилококка гистологическая картина области раны соответствовала обычной картине альтерации и экссудации. В области перелома наблюдалось некоторое усугубление изменений альтеративного характера. Вероятно, транслокация условно-патогенных бактерий может вызвать развитие хирургической инфекции при повреждениях.

Можно предположить, что макроорганизм селективно использует бакте-рии-сапрофиты (сенную палочку) в репаративных процессах. Однако остаются неизвестными механизмы, с помощью которых организм распознает необходимые бактерии и доставляет жизнеспособные микроорганизмы в область повреждения. Это может стать направлением дальнейших исследований. Вышеперечисленные факты согласуются с данными В.И. Никитенко и соавт. (1986, 1990), которые трактуют бактериальную транслокацию, как естественный защитный механизм макроорганизма. Согласно положениям этих ученых, при возникновении повреждения бактерии достигают патологического очага, где локализуются в жизнеспособных тканях, в основном, соединительной, костной и вокруг сосудов. В зоне повреждения микробы выделяют широкий набор антибиотиков, протеолитических ферментов, иммуномодуляторов, фактор роста фиброб-ластов, чем способствуют очищению от некроза и ускорению регенерации.

Клинические исследования

В клинической части работы проведено изучение эффективности живого бактериального препарата «споробактерин жидкий» в качестве средства профилактики хирургической инфекции у больных с ранениями мягких тканей. Лекарственный препарат «споробактерин жидкий» содержит живые бактерии штамма Bacillus subtilis 534, рекомендован МЗ РФ для применения в клинической практике с 1992 года (ВФС 42-371 ВС-92).

Мы сравнивали эффективность профилактики с помощью антибиотика цефазолина и пробиотика «споробактерин жидкий». Первая группа из 20 больных получала препарат «споробактерин жидкий» в стандартной дозировке по 1 мл два раза в сутки в течение 5 дней. Антибактериальные препараты не применялись. Пациентам второй группы (20 человек) назначали цефазолин в дозе 1 г внутривенно перед первичной хирургической обработкой раны и затем внутримышечно в течение 48 часов по 1 г три раза в сутки. Третьей группе, состоящей из 20 больных, не назначали ни антибиотиков, ни пробиотиков. Всем исследуемым выполнялась первичная хирургическая обработка ран. Пациенты получали ежедневные перевязки с 1% раствором йодопирона, антиагреганты, антиокси-данты, симптоматическую терапию.

В результате нашей работы было установлено снижение частоты гнойно-воспалительных осложнений при назначении «споробактерина жидкого». В группе, получавшей цефазолин, осложнения развились у 2 больных (10%), в группе контроля - у 3 человек (15%), после применения пробиотика явлений хирургической инфекции не было. При приеме «споробактерина жидкого» статистически достоверно в более ранние сроки нормализовались температура тела, число лейкоцитов, показатель лейкоцитарного индекса интоксикации. Значительно снизился срок пребывания больных в стационаре. Так, при назначении «споробактерина жидкого» он был равен 6,5 + 1,1; у больных, получавших антибиотик - 8,6 + 0,4; в группе сравнения - 9,4+ 0,3 (р < 0,001).

«Споробактерин жидкий» успешно применялся ранее при лечении холан-гитов, панкреатита, аппендицита (A.A. Третьяков, 1998; В.К. Есипов, 1999; B.C. Тарасенко, 2000). Однако данных в литературе об эффективности этого

пробиотика для профилактики хирургической инфекции при ранениях мягких тканей мы не обнаружили. В настоящее время для профилактики хирургической инфекции при травмах и, в частности, ранениях мягких тканей назначают антибиотики на срок не более 48 часов (S. Esposito et al., 2002; C.B. Сергеев и соавт., 2003; В.М. Simpson et al., 2003; B.D. Adams 2003). Однако пероральное назначение живого бактериального препарата «споробактерин жидкий» может быть методом выбора профилактики гнойно-воспалительных осложнений у больных с ранениями мягких тканей. Лекарственный препарат «споробактерин жидкий» практически не дает нежелательных побочных реакций, относительно дешев, не требует парентерального введения. Все вышеперечисленное обосновывает целесообразность более широкого использования в хирургической практике данного пробиотика, а также, возможно, других живых бактериальных препаратов для профилактики различных форм хирургической инфекции.

Таким образом, можно сделать заключение о том, что феномен транслокации играет гораздо более значительную роль в целостной реакции организма на травму, чем это представлялось ранее. Установлено, что транслокация бактерий жестко регулируется макроорганизмом. Это явление происходит у здоровых животных и не сопровождается стрессорной реакцией, то есть является физиологическим феноменом. При возникновении повреждения проникновение бактерий из желудочно-кишечного тракта во внутреннюю среду организма усиливается. Сапрофитные микроорганизмы подвергаются транслокации в несколько раз интенсивнее, чем условно-патогенные, особенно при травме. Накопление бактерий-сапрофитов в области повреждения также происходит интенсивнее, чем условно-патогенной флоры. Микрофлора желудочно-кишечного тракта активно участвует в раневом процессе и развитии хирургической инфекции. Использование живого бактериального препарата для профилактики гнойно-воспалительных осложнений значительно снижает частоту последних, в том числе и по сравнению с антибиотиками. Применение пробиотика при лечении ранений улучшает течение посттравматического периода.

выводы

1. Транслокация бактерий штаммов Staphylococcus aureus 209Р и Bacillus subtilis 534 у здоровых белых крыс происходит через неповрежденные слизистые оболочки желудка и тонкого отдела кишечника. Феномен транслокации наблюдается при интрагастральном введении микроорганизмов в количестве 106 микробных тел на 1 кг веса животного и выше.

2. У здоровых и травмированных животных после перорального введения жизнеспособные бактерии штаммов Staphylococcus aureus 209Р и Bacillus subtilis 534 обнаруживаются в печени, селезенке, стенке желудка и тонкого отдела кишечника. В тканях легких, почек, кожи, в крови микроорганизмы не регистрируются. В стенке толстой кишки бактерии наблюдаются только после введения Ю10 микробных тел на 1 кг веса крысы.

3. Транслокация сенной палочки, так же как и золотистого стафилококка, жестко контролируется макроорганизмом. У здоровых белых крыс при увеличении дозы интрагастрально введенных микроорганизмов в 10000 раз количество меченых бактерий, обнаруживаемых во внутренних органах, возрастает всего в 1,3 - 8,5 раз. В печени и селезенке здоровых животных число радиометок бактерий в условных полях зрения светового микроскопа в 1,6-3,3 раза выше, а у крыс с переломами - в 2,1- 4,2 раза выше, чем в тканях полых органов гастроинтестинального тракта.

4. У животных с ранениями мягких тканей и закрытыми переломами бедра пороговая доза бактерий, после интрагастрального введения которой возникает транслокация Staphylococcus aureus 209Р и Bacillus subtilis 534, снижается и составляет 104 микробных тел на 1 кг массы тела. При закрытых переломах бедра количество проникающих в печень и селезенку бактерий выше, чем при ранениях мягких тканей.

5. Феномен транслокации микроорганизмов у здоровых животных при микробной нагрузке Ю4-Ю10 колониеобразующих единиц штаммов Staphylococcus aureus 209Р и Bacillus subtilis 534 не сопровождается стрессорными изменениями гистологических и цитологических структур гипотапамо-гипофизарной ней-росекреторной системы и надпочечников.

6. Транслокация Bacillus subtilis 534 у здоровых и травмированных животных происходит интенсивнее, чем Staphylococcus aureus 209Р. Количество бактерий сенной палочки превышает число стафилококков в тканях области раны в 1,6-2,8 раза, а в области закрытого перелома - в 4,6-5,1 раз.

7. Микрофлора, попадающая в очаг повреждения через желудочно-кишечный тракт, во многом определяют течение раневого процесса. Бактерии сенной палочки, локализуясь в очагах травматизации мягких и костных тканей, создают условия для стимуляции репаративных гистогенезов. Микроорганизмы штамма Staphylococcus aureus 209Р вызывают усугубление изменений альтера-тивного характера в области закрытого перелома.

8. Использование живого бактериального препарата «споробактерин жидкий» у больных с ранениями мягких тканей способствует снижению частоты хирургической инфекции и более быстрой нормализации клинико-лабораторных показателей.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

При выборе лечебной тактики у больных с ранениями мягких тканей следует учитывать, что транслокация бактерий может быть механизмом эндогенного инфицирования. Возможным путем профилактики может быть использование живых бактериальных препаратов (пробиотиков). При ранениях мягких тканей методом выбора профилактики хирургической инфекции может быть назначение вместо антибиотиков лекарственного препарата «споробактерин жидкий». Срок применения препарата - 5 суток, он назначается внутрь по 1 мл два раза в сутки за 15 - 30 минут до еды.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ

ДИССЕРТАЦИИ

1. Никитенко В.И., Полякова B.C., Никитенко М.В., Симоненко Е.В., Бородин

B.А., Копылов В.А., Фомина М.В. Препарат споробактерин. Новые данные о механизме действия этого и других живых бактериальных препаратов. // Научный вестник Тюменской медицинской академии.-2001.-№2(10).-с.70-72.

2. Кудашев С.Г., Никитенко В.И., Бородин A.B., Копылов В.А. Новый способ профилактики хирургической инфекции при боевых огнестрельных повреждениях. // Материалы научн. конф. «Актуальные проблемы травматологии и ортопедии», в рамках международного форума «Человек и травма».-Нижний Новгород, 2001.-с. 168-169.

3. Медведкин В.М., Копылов В.А., Воронов О.В. и соавт. Профилактика хирургической инфекции у больных с термической травмой. // Анналы травматологии и ортопедии.-Самара,2001.-№2.-с.47-49.

4. Никитенко В.И., Копылов В.А., Никитенко М.В. Препарат «споробактерин». Новые данные о механизме действия этого и других живых бактериальных препаратов. // Пробиотические микроорганизмы - современное состояние вопроса и перспективы использования. Международная научн.-прак. конф. памяти Г.И.Гончаровой.-Сб. материалов конференции.-М.,2002.-с.51-52.

5. Никитенко В.И., Стадников A.A., Кудашев С.Г., Никитенко М.В., Никитин

C.B., Копылов В.А. Некоторые новые данные о патогенезе, профилактике и лечении хирургической инфекции. // Инфекция в хирургии - проблема современной медицины.-Сб. тезисов 3-й Всеармейской научн.-прак. конф. с международным участием.-М.,2002.-с.49.

6. Никитенко М.В., Копылов В.А. Разработка и испытание новой формы препарата споробактерина - споробактерина жидкого. // Актуальные вопросы военной и практической медицины.-Сб. трудов Ш научн.-прак. конф. врачей Приволжско-Уральского военного округа.-0ренбург,2002.-с.211-213.

7. Ткаченко Е.И., Никитенко В.И., Копылов В.А. Учение о трофологии. Новые итоги и пути развития. // Материалы Санкт-Петербургской медицинской ассамблеи - 2003 «Врач-провизор-пациент».-Санкт-Петербург,2003.-с.76.

8. Чевычалов A.M., Копылов В.А., Исаев С.Ж. и соавт. Применение споробактерина в травматологии. // Материалы Санкт-Петербургской медицинской ассамблеи - 2003 «Врач-провизор-пациент» .-Санкт-Петербург,2003.-с.86.

9. Никитенко В.И., Стадников A.A., Никитенко М.В., Копылов В.А. Новые данные о механизме действия пробиотиков. // Гастроэнтерология Санкт-Петербурга.-2003 .-№2-3 .-с. 115-116.

10. Никитенко В.И., Копылов В.А. Транслокация бактерий - механизм защиты организма от инфекции при повреждениях. // Актуальные проблемы хирургии повреждений.-Материалы областной научн.-прак. конф. врачей.-0ренбург,2003.-с.6-10.

П.Никитенко В.И., Кудашев С.Г., Копылов В.А. Новые принципы профилактики и лечения хирургической инфекции при огнестрельных и неогнестрельных ранениях конечностей. // Актуальные вопросы военной и практической медицины.-Сб. трудов IV научн.-прак. конф. врачей Приволжско-Уральского военного округа.-0ренбург,2003.-с.204-206.

12.Никитенко В.И., Стадников A.A., Копылов В.А. и соавт. Новые данные о ) патогенезе, профилактике и лечении хирургической инфекции при травме. // Современные технологии в травматологии, ортопедии: ошибки и осложнения -профилактика и лечение. Международный конгресс.-Сб. тезисов.-М.,2004.- « с.117-118.

13. Стадников A.A., Копылов В.А. Влияние транслокации бактерий на регенерацию тканей опорно-двигательной системы при повреждениях. // Морфофункциональные аспекты регенерации и адаптационной дифференцировки структурных компонентов опорно-двигательного аппарата в условиях механических воздействий.-Материалы международной научн.-прак. конф.-Курган,2004 .-с.293-295.

14. Никитенко В.И., Стадников A.A., Копылов В.А., Захаров В.В. О ранее неизвестной регулирующей функции бактерий желудочно-кишечного тракта. // Гастроэнтерология Санкт-Петербурга.-2004.-№2-3.-с.М. 100.

15.Никитенко В.И., Копылов В.А., Никитенко М.В. Транслокация бактерий из желудочно-кишечного тракта - естественный защитный механизм. // Гастроэнтерология Санкт-Петербурга.-2004.-№2-3.-с.16-18.

16. Исаев С.Ж., Чевычалов A.M., Копылов В.А. Роль бактерий-сапрофитов в профилактике и лечении раневой инфекции. // Актуальные вопросы хирургии: проблемы и пути решения.-Сб. научн. работ областной конф. хирургов, посвященной 85-летию основания отделенческой клинической больницы ст. Оренбург.-Оренбург,2004-с.89-91.

П.Никитенко В.И., Стадников A.A., Копылов В.А. Новые данные о путях распространения госпитальной инфекции и методе её профилактике. // Узловые вопросы борьбы с инфекцией.-Материалы Российской научн.-прак. конференции.-Санкт-Петербург,2004.-с. 175-176.

18. Копылов В.А., Стадников A.A. Роль транслокации бактерий в регенерации тканей при повреждениях. // Фундаментальные и прикладные проблемы ' гистологии. Гистогенез и регенерация тканей.-Сб. тезисов научн. конф.-Санкт-Петербург,2004.-е.

19. Тарасенко B.C., Стадников A.A., Никитенко М.В., Щетинин А.К., 1 Симоненко Е.В., Стадников Б.А., Шеффер A.B., Аверкиев В.Л., Мельникова

O.A., Дибисова А.Б., Бородин A.B., Фомина М.В., Копылов В.А., Попов A.B., Есипов Д.В., Хотян А.Р. Способ стимуляции репаративных процессов длительно незаживающих ран и трофических язв. // Патент РФ на изобретение № 2202356, 20.04.2003г. (приоритет от 04.12.2000г.).- бюл..№11,2003г.

Подписано в печать 21 03 05 Гарнитура Тайме Тираж 150 экз Заказ № 271 Издательство Общий отдел ГОУ ВПО ОрГМА Минздрава России Лицензия № 021239 от 22 08 97

РНБ Русский фонд

2005-4 47521

( ¡¡ь<

V.J * i /

2 2 АПР 2005

Актуальность исследования.

Проблема хирургической инфекции при травмах является актуальной. Количество гнойно-воспалительных осложнений после травм варьирует от 5% до 50% (R.L. Nichols, S.Florman, 2001). Нагноения случайных ран мягких тканей встречаются в 12-25% (Х.А.Мусалатов с соавт., 1998). Частота гнойно-воспалительных осложнений области хирургического вмешательства колеблется от 2-3 до 22% (В.В. Агаджанян, 1987; Н.В. Корнилов с соавт., 1997; А.В. Кулаков с соавт., 2001; В.И. Ульянов с соавт.,2002; Т.Я.Пхакадзе, З.И.Уразгильдеев, 2002).

Можно выделить следующие направления в поиске действенных путей профилактики хирургической инфекции: совершенствование мероприятий по асептике, антисептике и технике хирургического вмешательства, воздействие на иммунную систему, устранение нарушений микроциркуляции, стимуляция репаративных процессов (В.М.Шаповалов с соавт., 1998; И.Ю.Клюквин с соавт., 1998; С.В. Лохвицкий с соавт., 2002; L. Ameziane et al., 2003). Основные усилия исследователей в настоящее время сосредоточены вокруг разработки и использования новых антибактериальных препаратов, прежде всего антибиотиков (G.V.Russell et al., 2001; F. de Lalla, 2002; С.В. Сергеев и соавт., 2003). Несмотря на огромные затраты, результаты антибиотикопрофилактики не всегда соответствуют ожиданиям (G.A.Franklin et al., 2002; М.А. Wilson, 2003). Появляются новые антибиотикорезистентные штаммы бактерий, развиваются аллергия на химиопрепараты, дисбактериоз и др. (Т.Франклин, Дж. Сноу, 1984; И.А.Ерюхин с соавт., 1997; Т. Nakagawa et al., 1998). Наличие недавно обнаруженных механизмов «укрытия» и длительной персистенции стафилококков в тканях различного генеза (А.А.Стадников с соавт., 2003) также ставит под сомнение эффективность дальнейшего развития антибиотикопрофилактики.

Всё более очевидной становится необходимость раскрытия малоизученных аспектов патогенеза хирургической инфекции. До настоящего времени большинство хирургов и микробиологов уверены, что, в основном, бактерии попадают в рану непосредственно из внешней среды. Роль эндогенного инфицирования явно недооценивается. В то же время доказан феномен транслокации бактерий из желудочно-кишечного тракта, описанный R.D. Berg (1985), В.И.Никитенко (1990). Экспериментальными исследованиями последних лет было установлено, что бактерии могут проникать через неповрежденную стенку желудочно-кишечного тракта во внутренние среды организма. Транслокация обнаружена при различных патологических состояниях (L.C. Lemaire, 1997; D.Adawi et al., 1998; D.Demetriades et al., 1999), а также в условиях здорового организма (В.К.Есипов, 1999; В.С.Тарасенко, 2000).

Однако остаются неизученными многие механизмы этого явления. Неизвестно, регулируется ли транслокация макроорганизмом, зависит ли этот феномен от дозы и вида бактерий, попавших в желудочно-кишечный тракт, влияет ли характер повреждения на феномен бактериальной транслокации, возникает ли она только вследствие стресса или является защитным механизмом теплокровных, каковы методы блокирования данного пути распространения возбудителей хирургической инфекции. Всё вышеуказанное послужило основанием для выполнения данной работы.

Цель исследования

Целью настоящего исследования явилось изучение значения феномена транслокации в патогенезе хирургической инфекции при повреждениях и определение эффективности нового способа профилактики хирургической инфекции.

Задачи исследования

1. Определены минимальные дозы бактерий штаммов Staphylococcus aureus 209Р и Bacillus subtilis 534, при интрагастральном введении которых регистрируется феномен бактериальной транслокации у здоровых белых крыс.

2. Изучена динамика обсеменения тканей различных органов бактериями при различных дозах инфицирования желудка.

3. Исследовано влияние ранений мягких тканей и закрытых переломов трубчатых костей на транслокацию бактерий у животных.

4. Изучена реакция тканей и органов на транслокацию у здоровых и травмированных животных.

5. Определена эффективность живого бактериального препарата «споробактерин жидкий» в качестве средства профилактики хирургической инфекции у больных с ранениями мягких тканей.

Научная новизна исследования

Впервые установлено, что минимальная доза бактерий, при интрагастральном введении которой регистрируется, . феномен транслокации у здоровых крыс, равна 10б микробных тел на 1 кг веса животного.

Впервые обнаружено, что при ранениях мягких тканей и закрытых переломах конечностей пороговая доза микроорганизмов штаммов Staphylococcus aureus 209Р и Bacillus subtilis 534 снижается и составляет 104 микробных тел на 1 кг веса животного.

Выявлено, что у здоровых и травмированных животных через 6 часов после интрагастрального введения жизнеспособные бактерии обнаруживаются в печени, селезенке, стенке желудка и тонкого отдела кишечника, с преимущественным накоплением в селезенке и печени. В тканях легких, почек, кожи, в крови микроорганизмы не наблюдаются.

Транслокация бактерий контролируется макроорганизмом. У здоровых белых крыс при увеличении дозы интрагастрально введенных микроорганизмов в 10000 раз, количество меченых бактерий, обнаруживаемых во внутренних органах, возрастает всего в 1,3 - 5,8 раз.

Впервые установлено, что феномен транслокации микроорганизмов у здоровых животных при микробной нагрузке 104-10ш колониеобразующих единиц (КОЕ) не сопровождается стрессорными изменениями гистологических и цитологических структур гипоталамо-гипофизарной нейросекреторной системы и надпочечников.

Обнаружено, что тяжесть травмы влияет на феномен транслокации. У крыс с закрытыми переломами бедра количество проникающих в печень и селезенку бактерий выше, чем у животных с ранениями мягких тканей.

Установлено, что транслокация Bacillus subtilis 534 у здоровых и травмированных животных происходит интенсивнее, чем Staphylococcus aureus 209Р. Количество бактерий сенной палочки превышает число стафилококков в тканях области раны в 1,6-2,8 раза, а в области закрытого перелома - в 4,6-5,1 раз.

1 Выявлено, что микроорганизмы, попадающие в желудочно-кишечный тракт, активно участвуют в течении раневого процесса. Бактерии сенной палочки, локализуясь в очагах травматизации мягких и костных тканей, создают условия для стимуляции репаративных гистогенезов (патент РФ №2202356, 20.04.2003г.). Микроорганизмы Staphylococcus aureus 209Р вызывают усугубление изменений альтеративного характера в области закрытого перелома.

Научно-практическая значимость работы

Транслокация бактерий из желудочно-кишечного тракта может быть механизмом эндогенного инфицирования очагов повреждения, что следует учитывать в клинической практике, в том числе при осуществлении мероприятий по предупреждению госпитальной инфекции. Транслокации подвергаются как условно-патогенные бактерии, так и сапрофиты. Обоснована возможность селективного использования микрофлоры, попадающей в желудочно-кишечный тракт, для регуляции раневого процесса и профилактики хирургической инфекции.

Доказана более высокая эффективность живого бактериального препарата, по сравнению с антибиотиком цефазолином. Использование живого бактериального препарата «споробактерин жидкий» у больных с ранениями мягких тканей способствует снижению частоты хирургической инфекции и более быстрой нормализации клинико-лабораторных показателей.

Положения, выносимые на защиту

1. Транслокация бактерий из желудочно-кишечного тракта - механизм систематического инфицирования очагов повреждения и естественной защиты человека и животных от инфекции. Она регулируется макроорганизмом и зависит от дозы, вида бактерий, характера повреждения.

2. Использование живого бактериального препарата «споробактерин жидкий» у больных с ранениями мягких тканей способствует снижению частоты хирургической инфекции и улучшает течение посттравматического периода.

Апробация результатов исследования

Материалы диссертации доложены и обсуждены на межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные вопросы урологии» (Тюмень, 2001), научной конференции «Актуальные проблемы травматологии и ортопедии» (Нижний Новгород, 2001), на международной научно-практической конференции памяти Г.И. Гончаровой «Пробиотические микроорганизмы - современное состояние вопроса и перспективы использования» (Москва, 2002), 3-й Всеармейской научно-практической конференции с международным участием «Инфекция в хирургии - проблема современной медицины» (Москва, 2002), Ш научно-практической конференции врачей Приволжско-Уральского военного округа (Оренбург, 2002), на 5-ом Славяно-Балтийском научном форуме «Санкт-Петербург - Гастро-2003» (Санкт-Петербург, 2003), Санкт-Петербургской Медицинской Ассамблее «Врач-Провизор-Пациент» (Санкт-Петербург, 2003), на IV научно-практической конференции врачей Приволжско-Уральского военного округа (Оренбург, 2003), на областной научно-практической конференции врачей «Актуальные проблемы хирургии повреждений» (Оренбург, 2003), на 6-ом Славяно-Балтийском научном форуме «Санкт-Петербург - Гастро-2004» (Санкт-Петербург, 2004), международной научно-практической конференции «Морфофункциональные аспекты регенерации и адаптационной дифференцировки структурных компонентов опорно-двигательного аппарата в условиях механических воздействий» (Курган, 2004), международном конгрессе «Современные технологии в травматологии, ортопедии: ошибки и осложнения - профилактика, лечение» (Москва, 2004), на Российской научно-практической конференции «Узловые вопросы борьбы с инфекцией» (Санкт-Петербург, 2004), научной конференции «Фундаментальные и прикладные проблемы гистологии. Гистогенез и регенерация тканей» (Санкт-Петербург, 2004), на областной конференции хирургов «Актуальные вопросы хирургии: проблемы и пути решения» (Оренбург, 2004).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 19 печатных работ, в том числе патент РФ на изобретение №2202356, 20.04.2003г.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 141 странице машинописного текста. Она состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием материалов и методов исследования, 3 глав, в которых изложены результаты собственных исследований, главы обсуждения результатов, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы, включающего 216

выводы.

1. Транслокация бактерий штаммов Staphylococcus aureus 209Р и Bacillus subtilis 534 у здоровых белых крыс происходит через неповрежденные слизистые оболочки желудка и тонкого отдела кишечника. Феномен транслокации наблюдается при интрагастральном введении микроорганизмов в количестве 10б микробных тел на 1 кг веса животного и выше.

2. У здоровых и травмированных животных после перорального введения жизнеспособные бактерии штаммов Staphylococcus aureus 209Р и Bacillus subtilis 534 обнаруживаются в печени, селезенке, стенке желудка и тонкого отдела кишечника. В тканях легких, почек, кожи, в крови через 6 часов после введения микроорганизмы не регистрируются. В стенке толстой кишки бактерии наблюдаются только после введения Ю10 микробных тел на 1 кг веса крысы.

3. Транслокация сенной палочки, так же как и золотистого стафилококка, жестко контролируется макроорганизмом. У здоровых белых крыс при увеличении дозы интрагастрально введенных микроорганизмов в 10000 раз количество меченых бактерий, обнаруживаемых во внутренних органах, возрастает всего в 1,3 - 8,5 раз. В печени и селезенке здоровых животных число радиометок бактерий в условных полях зрения светового микроскопа в 1,6-3,3 раза выше, а у крыс с переломами - в 2,1- 4,2 раза выше, чем в тканях полых органов гастроинтестинального тракта.

4. У животных с ранениями мягких тканей и закрытыми переломами бедра пороговая доза бактерий, после интрагастрального введения которой возникает транслокация Staphylococcus aureus 209Р и Bacillus subtilis 534, снижается и составляет 104 микробных тел на 1 кг массы тела. При закрытых переломах бедра количество проникающих в печень и селезенку бактерий выше, чем при ранениях мягких тканей.

5. Феномен транслокации микроорганизмов у здоровых животных при микробной нагрузке 104-Ю10 колониеобразующих единиц штаммов Staphylococcus aureus 209Р и Bacillus subtilis 534 не сопровождается стрессорными изменениями гистологических и цитологических структур гипоталамо-гипофизарной нейросекреторной системы и надпочечников.

6. Транслокация Bacillus subtilis 534 у здоровых и травмированных животных происходит интенсивнее, чем Staphylococcus aureus 209Р. Количество бактерий сенной палочки превышает число стафилококков в тканях области раны в 1,6-2,8 раза, а в области закрытого перелома — в 4,6-5,1 раз.

7. Микрофлора, попадающая в очаг повреждения через желудочно-кишечный тракт, во многом определяют течение раневого процесса. Бактерии сенной палочки, локализуясь в очагах травматизации мягких и костных тканей, создают условия для стимуляции репаративных гистогенезов. Микроорганизмы штамма Staphylococcus aureus 209Р вызывают усугубление изменений альтеративного характера в области закрытого перелома.

8. Использование живого бактериального препарата «споробактерин жидкий» у больных с ранениями мягких тканей способствует снижению частоты хирургической инфекции и более быстрой нормализации клинико-лабораторных показателей.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.

При выборе лечебной тактики у больных с ранениями мягких тканей следует учитывать, что транслокация бактерий может быть механизмом эндогенного инфицирования. Возможным путем профилактики может быть использование живых бактериальных препаратов (пробиотиков). При ранениях мягких тканей методом выбора профилактики хирургической инфекции может быть назначение лекарственного препарата «споробактерин жидкий» вместо антибиотиков. Срок применения препарата - 5 суток, назначается внутрь по 1 мл два раза в сутки за 15 - 30 минут до еды.