Автореферат и диссертация по медицине (14.01.13) на тему:Методы ядерной медицины в излучении патогенеза бактериальной транслокации абдоминального происхождения

/ На правах рукопт,..

ГАЛЕЕВ Юрий Маратович

МЕТОДЫ ЯДЕРНОЙ МЕДИЦИНЫ В ИЗУЧЕНИИ ПАТОГЕНЕЗА БАКТЕРИАЛЬНОЙ ТРАНСЛОКАЦИИ АБДОМИНАЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ

14.01.13 - лучевая диагностика, лучевая терапия 14.03.03 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

1 2 ЯН8 2072

Томск-2011

005007341

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Научном центре реконструктивной и восстановительной хирургии Сибирского отделения РАМН (г. Иркутск)

Научные консультанты:

доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАМН доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор, НИИ онкологии СО РАМН, главный научный сотрудник отделения радиологии доктор медицинских наук, ФГБУ «Российский научный центр радиологии и хирургических технологий» Минздравсоцразвития России, заместитель директора по образовательной деятельности доктор медицинских наук, профессор, НИИ кардиологии СО РАМН, руководитель лаборатории экспериментальной кардиологии

Лиишанов Юрий Борисович Апарцин Константин Анатольевич

Мусабаева Людмила Ивановна

Рыжкова Дарья Викторовна Маслов Леонид Николаевич

Ведущая организация:

Федеральное государственное учреждение «Федеральный медицинский биофизический центр имени А.И. Бурназяна» (ФМБЦ им. А.И. Бурназяна ФМБА

России), г. Москва

Защита состоится «_»_20_г. в_00 часов на заседании диссертационного совета Д 001.036.01 при Учреждении РАМН Научно-исследовательском институте кардиологии СО РАМН по адресу: 634012, г. Томск, ул. Киевская, 111а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учрезвдения РАМН Научно-исследовательского института кардиологии СО РАМН (634012, г. Томск, ул. Киевская, 111а).

Автореферат разослан «2^» _

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

Ворожцова И.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы

Методы ядерной медицины достаточно широко применяются в диагностике инфекционных и воспалительных процессов (Winter W. et al., 2001; Rypins E.B. et al., 2000), в том числе абдоминальной локализации (Colak T. et al., 2001; Uslu H. et al., 2001).

Однако способы прямой оценки процессов бактериальной транслокации (БТ) микроорганизмов и перитонеальной резорбции (ПР) токсинов в процессе формирования абдоминального сепсиса при острой хирургической патологии живота и последствиях хирургических вмешательств (программированная релапаротомия, назоинтестинальная интубация, спленэктомия) на сегодня отсутствуют. Вместе с тем, процесс перемещения облигатной микрофлоры за пределы кишечной стенки является ключевым звеном в патогенезе указанной патологии (Ергохин И.Л. и соавт., 1999; Есипов Д.В. и соавт., 2004; Samel S. et al., 2002). Источником интоксикации при этом является кишка, находящаяся в состоянии пареза (Курыгин А. А. и соавт., 2001; Багненко С.Ф., 2004).

Следует отметить, что многие вопросы патогенеза распространенного гнойного перитонита, гипоспленизма и острой кишечной непроходимости, связанные, прежде всего, с механизмами эндотоксикоза, остаются до конца не изученными и дис-кутабельными (Чернов В.Н., Велик Б.М., 2002; Жидовинов Г.И., 2005; Kocdor M. А. et al., 2002; Koratzanis G. et al., 2002). Во многом, это связано с тем, что диагностика феномена БТ в настоящее время основана на бактериологическом исследовании биологических жидкостей и тканей, а также на выявлении косвенных признаков миграции бактерий по результатам водородного дыхательного теста (Schiller L.R., 2007), определения липополисахаридсвязывающего белка (Albillos A. et al., 2004) и бактериальной ДНК в крови (Guamer С. et al., 2006).

Перспективным подходом к изучению патогенеза септических состояний при острой хирургической патологии живота является, с нашей точки зрения, использование методов ядерной медицины. Так, в последние годы были предприняты попытки выявления косвенных признаков БТ с применением радионуклидного исследования гепатобилиарной системы (Петухов В.А., 2002). Однако специфичность получаемых при этом результатов представляется, с нашей точки зрения, спорной, что требует разработки прямого метода бактериальной сцинтиграфии, предоставляющего возможность непрерывного наблюдения транслокации инфекционного фактора, синхронной оценки процессов на локальном и системном уровнях, а также анализа качественной и количественной информации в реальном масштабе времени.

Таким образом, разработка сцинтиграфических методов прямого исследования БТ, основанных на визуальной оценке перемещения меченных радионуклидом микроорганизмов, является актуальной проблемой патофизиологии септических состояний абдоминального происхождения.

Цель работы

Разработать технологию бактериальной сцинтиграфии и на ее основе исследовать механизмы развития и течения БТ абдоминального происхождения.

Задачи исследования

1. Определить диагностические возможности динамической сцинтиграфии гепатобилиарной системы (гепатобилисцинтиграфии) в оценке косвенных признаков БТ абдоминального происхождения.

2. Создать бактериальный радионуклидный препарат (БРП) - меченные технецием-99ш живые бактерии Е. coli с максимальной степенью поглощения радионуклидной метки внутриклеточными структурами кишечной палочки, и разработать оптимальный способ его очистки от несвязанного радионуклида.

3. Разработать метод бактериальной сцинтиграфии и предложить алгоритм обработки получаемых данных для определения индекса транслокации (ИТ) или индекса резорбции (ИР) с учетом распада радиоактивного маркера.

4. С помощью метода бактериальной сцинтиграфии выявить закономерности БТ и ПР меченных технецием-99ш Е. coli в условиях экспериментального перитонита и определить степень влияния операционной травмы кишечной трубки на характер миграции бактерий.

5. Методом бактериальной сцинтиграфии изучить динамику БТ в процессе формирования постспленэктомического гипоспленизма.

6. Предложить методологию сцинтиграфического исследования для раскрытия механизмов БТ при странгуляционной и обтурационной кишечной непроходимости.

Научная новизна

Создан БРП (меченные технецием-99ш живые бактерии Е. coli), отвечающий условиям применения методов ядерной медицины для изучения процессов БТ и ПР при моделировании любых инфекционных воспалительных процессов на крупных и мелких лабораторных животных.

Разработан радионуклидный метод исследования (бактериальная сцинтигра-фия), позволяющий визуально оценивать процессы микробной транслокации и резорбции, а также определять их временные и количественные характеристики.

С помощью метода бактериальной сцинтиграфии выявлены закономерности интестиногенного распространения инфекционного процесса на регионарный (портальная система) и системный (генерализация бактериемии) уровни в динамике экспериментального перитонита.

Подробно изучено патогенетическое звено эндотоксемии, обусловленное транслокацией микроорганизмов из просвета кишечника и дальнейшей их резорбцией из брюшной полости на ранних стадиях гнойного перитонита.

Установлено влияние хирургического вмешательства при перитоните на параметры транслокации условно патогенной микрофлоры через кишечный барьер.

Подтверждена роль БТ в патогенезе печеночной недостаточности в условиях гипоспленизма.

С помощью методов ядерной медицины изучены различия в механизмах формирования абдоминального сепсиса при странгуляционной и обтурационной кишечной непроходимости.

Доказана ведущая патогенетическая роль ишемии ущемленного отдела тонкой кишки в развитии эндотоксемии при странгуляционной кишечной непроходимости.

Установлена роль БТ в генезе бактериемии при обтурационной непроходимости кишечника.

Практическая значимость

Разработана технология получения бактериального радионуклидного препарата, перспективного для сцинтиграфической визуализации процессов БТ и резорбции при различных формах абдоминального сепсиса.

Результаты, раскрывающие механизмы развития абдоминального сепсиса при распространенном перитоните, спленэктомии и различных видах механической непроходимости кишечника на всех этапах развития патологии, позволяют экспериментально обосновать целесообразность применения сорбционных технологий и модификации хирургической тактики при этих заболеваниях.

Внедрение в практику

Полученный БРП используется в Учреждении Российской академии медицинских наук Научном центре реконструктивной и восстановительной хирургии Сибирского отделения РАМН (НЦРВХ СО РАМН) для сцинтиграфической визуализации миграции бактерий в организме лабораторных животных при различной патологии.

Разработанная методика оценки распространения бактериальных клеток при перитоните используется в НЦРВХ СО РАМН для экспериментальной апробации предлагаемых методов детоксикации.

Результаты диссертационного исследования используются в учебном процессе госпитальной хирургической клиники Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Иркутский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (ГБОУ ВПО ИГМУ Минздравсоц-развития России) и в НЦРВХ СО РАМН.

По результатам разработанной технологии получены патенты РФ:

1. Способ приготовления бактериального радиофармпрепарата: Пат. 2255748 Рос. Федерация: МПК7 А 61 К 35/74,51/00 / А.Г. Кувшинов, Е. А. Ильичева, С. А. Ле-пехова, А.Ю. Шамеев, Е.В. Коваль, Т.В. Фадеева, Д.И. Максиков, Ю.М. Галеев, М.В. Попов (Рос. Федерация). Заявлено 26.05.03; Опубл. 10.07.05, Бюл. № 19.

2. Способ оценки бактериемии перитонеального происхождения в эксперименте: Пат. 2275859 Рос. Федерация: МПК7 А 61 В 6/00 / Ю.М. Галеев, М.В. Попов, О.В. Салато, К.А. Апарцин, Е.В. Коваль (Рос. Федерация). Заявлено 09.12.04; Опубл. 10.05.06, Бюл. № 13.

3. Способ радионуклидной маркировки бактерий кишечной палочки для сцинтиграфических исследований: Пат. 2290643 Рос. Федерация:

МПК7 G Ol N 33/60; G 12 N 1/20 / O.B. Салато, Ю.М. Галеев, M.B. Попов, E.B. Коваль, C.A. Лепехова, T.B. Фадеева (Рос! Федерация). Заявлено 12.07.05; Опубл. 27.12.06, Бюл. № 36.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Сцинтиграфический метод, основанный на использовании БРП, полученного с помощью витальной внутриклеточной маркировки Е. coli технецием-99ш, позволяет визуализировать процесс БТ и изучать его закономерности на моделях абдоминального воспаления у различных видов лабораторных животных.

2. В процессе развития перитонита БТ из просвета кишечника становится доминирующим путем системного распространения патогенов, резко усиливаясь после хирургического вмешательства, сопровождаемого манипуляциями на кишечнике.

3. Гипоспленизм индуцирует транслокацию бактерий из желудочно-кишечного тракта.

4. В процессе развития странгуляционной непроходимости кишечника происходит миграция бактерий из просвета ущемленного отдела тонкой кишки в брюшную полость, после чего микрофлора указанного отдела кишечника становится источником развития системной бактериемии за счет ПР, а микрофлора тонкой кишки выше уровня странгуляции приобретает роль патогенетического фактора портальной бактериемии, за счет миграции микроорганизмов. При обтурационной непроходимости микрофлора тонкой кишки становится источником портальной бактериемии только в терминальной фазе патологического процесса.

Апробация основных положений работы

Материалы исследования представлены на Невском радиологическом форуме (Санкт-Петербург, 2003), на Всероссийской научно-практической конференции «Избранные вопросы ядерной медицины» (Дубна, 2004), на международной конференции «Сепсис: патогенез, диагностика и терапия» (Харьков, 2004), на научно-практической конференции «Новое в реконструктивной хирургии» (Москва, 2004), на Всероссийском научном форуме «Достижения и перспективы современной лучевой диагностики» (Москва, 2004), на Всероссийской научно-практической конференции хирургов «Сложные и нерешенные вопросы диагностики и лечения острого аппендицита, острой кишечной непроходимости и сочетанной травмы» (Санкт-Петербург, 2004), на международном конгрессе молодых ученых и специалистов «Наука о человеке» (Томск, 2004), на научно-практической конференции хирургов Иркутской области (Иркутск, 2004), на научно-практической конференции «Актуальные проблемы клинической медицины» (Иркутск, 2004), на научно-практической конференции «Актуальные вопросы хирургии» (Челябинск, 2004), на международной дистанционной научно-практической конференции «Новые технологии в медицине» (Санкт-Петербург, 2005), на международном хирургическом конгрессе «Новые технологии в хирургии» (Ростов-на-Дону, 2005), на научно-практической конференции с участием специалистов стран ближнего и дальнего зарубежья «Новые технологии в диагностике, интервенционной радиологии, хирургии печени и поджелудочной железы» (Санкт-Петербург, 2005), на Всероссийской научно-практической конференции «Современные 6

методы диагностики и лечения заболеваний в клинике и в эксперименте» (Москва, 2005), на международной дистанционной научно-практической конференции «Новые технолог ии в медицине» (Санкт-Петербург, 2006), на Всероссийском форуме «Радиология 2006» (Москва, 2006), на международной конференции «Сепсис проблемы диагностики, терапии и профилактики» (Харьков, 2006), на Всероссийской научно-практической конференции «Многопрофильная больница: проблемы и решения» (Ленинск-Кузнецкий, 2006), на научно-практической конференции «Актуальные вопросы хирургии» (Челябинск, 2006), в материалах 12-й Российской гастроэнтерологической недели (Москва, 2006), на Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы флебологии. Распространенный перитонит» (Барнаул, 2007), на международной медицинской научной конференции между Автономной Республикой Внутренней Монголии, КНР и Республикой Бурятии РФ (Китай, Маньчжурия, 2007), на Всероссийской научно-практической конференции «Современные аспекты кишечной непроходимости» (Анапа, 2007), в материалах 14-й Российской гастроэнтерологической недели (Москва, 2009), на 56-м ежегодном съезде Общества ядерной медицины (Канада, Торонто, 2009), на ежегодном конгрессе Европейской ассоциации ядерной медицины (Испания, Барселона, 2009).

Публикации

Основные положения диссертационного исследования опубликованы в 54 работах, в том числе в 14 статьях из списка журналов, рекомендованных ВАК РФ для опубликования материалов докторских диссертаций, в 2 монографиях (в соавторстве) и 3 патентах Российской Федерации.

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы о материалах и методах исследования, семи глав собственных наблюдений, заключения, выводов, практических рекомендаций, указателя литературы.

Текст изложен на 254 страницах, иллюстрирован 21 таблицей и 43 рисунками. Библиография включает 498 источников, из них 124 отечественных и 374 иностранных.

Личный вклад автора

Дизайн исследования, постановка цели и задач диссертационной работы, методический подход к их выполнению разработаны лично автором. Весь материал, представленный в диссертации, получен, обработан и проанализирован лично автором.

КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Настоящее исследование состоит из двух разделов - клинического и экспериментального.

Клинический раздел включает материалы радионуклидных исследований (ге-патобилисцинтиграфии), направленных на выявление косвенных признаков Б'Г у 30

пациентов (3 группы наблюдений) с воспалительными процессами в гепатодуоде-нальной области и 10 добровольцев группы клинического сравнения.

Экспериментальный раздел, в свою очередь, состоит из двух подразделов: подраздел по созданию БРП, состоящий из 196 стендовых экспериментов in vitro (17 групп опытов) выполненных с использованием энтеропатогенных штаммов Е. coli Ol 11 и 020; подраздел с материалами радионуклидных исследований in vivo (бактериальная сцинтиграфия), выполненных на 48 беспородных собаках (8 групп опытов) и 102 белых крысах (8 групп опытов).

Общая характеристика клинических групп

В исследование включены 30 пациентов с воспалительными процессами в гепа-тодуоденальной области и 10 добровольцев группы клинического сравнения.

Распределение пациентов на клинические группы показано в табл. 1.

Таблица 1

Распределение пациентов на клинические группы

№ группы Основной диагноз Число пациентов

1 Дисфункция желчного пузыря (ДЖП) по гипокинетическому типу 10

2 Хронический некалькулезный холецистит (ХНХ) с гипомоторной дискинезией желчного пузыря 10

3 Хронический калькулезный холецистит (ХКХ) в стадии обострения 10

Мужчин было 11, женщин - 19, средний возраст пациентов составил 56,7 ±3,7 года.

Длительность заболевания у всех пациентов была свыше 5 лет. Больные предъявляли жалобы на тяжесть и боли в правом подреберье (23 %) приступообразного (10 %) или ноющего (48 %) характера, тошноту (25 %), изжогу (24 %), рвоту (3 %), горечь во рту (34 %) и запоры (31 %).

При физикальном обследовании определялись болезненность в правом подреберье (80 %); положительные симптомы Кера (56 %), Василенко (48 %); болезненность в зоне Шофера (10 %), Губергрица (29 %), в точке Мейо-Робсона (17 %), в точке Губергрица (18 %). Диагнозы ДЖП по гипокинетическому типу были поставлены в соответствии с Римскими критериями II (1999 г.), ХНХ с гипомоторной дискинезией желчного пузыря и ХКХ в стадии обострения - в соответствии с рекомендациями, изложенными в «Стандартах (протоколах) диагностики и лечения болезней органов пищеварения», утвержденных Приказом Министерства здравоохранения Российской Федерации от 17.04.1998 г. № 125, пересмотренных и дополненных в 2002 г.

Исследование добровольцев группы клинического сравнения было основано на положениях Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации «Этические принципы проведения медицинских исследований с участием людей в качестве субъектов исследования» 1964 г. и ее пересмотренного варианта 2000 г. Участвовавшие в обследовании лица подписывали форму информированного согласия. Мужчин было 4, женщин - 6. Средний возраст составил 49,2 ± 2,5 года.

Методы исследования в клинических группах

Для диагностики функционального состояния печени, желчного пузыря и желчевыводящих путей, а также лабораторных признаков холестаза использовали данные общего и биохимического анализа крови (содержание глюкозы, билирубина, общего белка, активность трансаминаз, тимоловая проба), выполненных на аппарате Synhron-5 (Beckman Coulter, Inc., США).

Для оценки структуры печени, желчного пузыря и желчевыводящих путей, а также функционального состояния желчного пузыря и внепеченочных желчных протоков применяли ультрасонографию, которую проводили на цифровом ультразвуковом сканирующем комплексе Aloka SSD-4000 (Hitachi Aloka Medical, Ltd., Япония) с использованием секторных датчиков с углом сканирования 115° и мультичастотным датчиком 2,5-6,5 МГц.

Для оценки поглотительно-выделительной функции гепатоцитов, проходимости желчных путей, накопительной и двигательной функции желчного пузыря проводили гепатобилисцинтиграфию. Сканирование проводили натощак без предварительной медикаментозной подготовки пациентов. Исследование старались выполнять в первой половине дня для исключения длительного голодания, способного повлиять на сократительную функцию желчных сфинктеров и, тем самым, затруднить интерпретацию результатов. По этой же причине не выполняли гепатобилисцинтиграфию в первые сутки после проведения эндоскопических и рентгеноконтрастных исследований желудочно-кишечного тракта.

Исследование проводили на одно- и двухдетекторной томографических гамма-камерах DIACAM и MULTISPECT-II (Siemens AG, Германия) с компьютерной системой обработки данных ICON 6.0 в передней прямой проекции. Пациент при этом находился в положении «лежа на спине». Детектор гамма-камеры проецировали таким образом, чтобы в его поле зрения попадали сердце, печень, селезенка и верхние отделы тонкого кишечника. У пациенток с большим размером молочных желез при укладке старались отвести их вверх, чтобы избежать экранирования печени. Радиофармпрепарат (РФП) «Бромезида, 99тТс» с активностью радионуклида 37 МБк вводили внутривенно в момент начала исследования. Регистрацию сцинтиграмм проводили при следующих параметрах: 60 кадров, продолжительность 1 кадра - 60 с, матрица 64 х 64, коллиматор для низких (140 Кэв) энергий гамма-излучения с использованием окна дифференциального дискриминатора ±15 %. Желчегонный завтрак давали на 20-й мин исследования.

По завершении исследования проводили визуальный анализ сцинтиграмм, выделение зон интереса «печень», «желчный пузырь» и «кишечник» с построением кривых «активность - время» и расчетом следующих показателей: Тшах печени - время максимального накопления РФП печенью, Т1/2 печени - время полувыведения РФП из печени, Т0 желчного пузыря - время начала поступления препарата в желчный пузырь, Тшах желчного пузыря - время максимального наполнения желчного пузыря, Т|/2 желчного пузыря - время полувыведения РФП из желчного пузыря, Ткиш - время начала поступления препарата в кишечник. Также рассчитывали объем сокращения желчного пузыря после желчегонного завтрака

9

(эвакуаторную функцию) в процентах с помощью программы Gall Bladder Ejection Fraction компьютерной системы обработки данных ICON 6.0.

В случаях превышения отдельными показателями (Т0 желчного пузыря и Т]/2 желчного пузыря) временного интервала проведения гепатобилисцинтиграфии -60 мин., использовали значения, полученные в результате экстраполяционных вычислений компьютерной системы обработки данных ICON 6.0.

Общая характеристика экспериментального материала

Радионуклидные исследования in vivo были выполнены на собаках обоего пола, возрастом не менее 1 года, массой тела 8-10 кг, длиной тела 60-70 см и на крысах самцах породы Вистар возрастом не менее 6 месяцев, массой тела 200-250 г. Животных содержали в условиях вивария при свободном доступе к воде и пище соответственно нормативам ГОСТа «Содержание экспериментальных животных в питомниках НИИ», все документы, регламентирующие работу вивариев, имелись на протяжении всего времени исследования (виварий I категории, вет. удостоверение 238 № 0015220 от 25 марта 2009 г., служба ветеринарии Иркутской области). Опыты на животных выполнялись в соответствии с принципами гуманного обращения с животными, которые регламентированы «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных», утвержденных Приказом МЗ СССР № 742 от 13.11.84 г. «Об утверждении правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» и № 48 от 23.01.85 г. «О контроле за проведением работ с использованием экспериментальных животных».

Распределение на группы в пяти сериях опытов in vitro и ход эксперимента представлены в табл. 2.

Все манипуляции, связанные с использованием радиоактивных веществ, выполняли с учетом норм радиационной безопасности.

Исследования на животных предусматривали получение и оценку сцинтигра-фической картины распределения меченной технецием-99ш Е. coli из просвета дистального отдела тонкой кишки у здоровых животных (группа 1.1, (и = 6) - собаки; группа 2.1 (« = 6) и группа 3.1 (и = 10) - крысы).

Исследования in vivo, выполненные на собаках, предусматривали получение и оценку сцинтиграфического изображения транслокации кишечной палочки из просвета дистального отдела тонкой кишки (группа 1.2, п - 6) и из брюшной полости (группа 1.3, и = 6) при моделированном распространенном гнойном перитоните в первые 6 часов после его индукции. Далее на протяжении 6-12 часов аналогично оценивали сцинтиграфическую картину распространения БРП из просвета дистального отдела тонкой кишки (группа 1.4, п = 6) и из брюшной полости (группа

1.5, п = 6). Дополнительно исследовали особенности транслокации кишечной палочки из просвета дистального отдела тонкой кишки после релапаротомии с манипуляциями на кишечнике через 6 часов после индукции перитонита (группа

1.6, и = 6).

Таблица 2

Общая характеристика выполненных экспериментов in vitro, п = 196

Серия опытов in vitro Ход эксперимента

Инкубация Способ ОЧИСТКИ

№ Мель опыта Группа № Анаэробные условия Время инкубации Кол-во реагента «Пирфотех,98тТс», мг Активность технеция-99т, МБк Мембранная фильтрация* Центрифугирование

Оценка накопления радионуклида технеция-99т в ходе естественного 1.1 - 24 - 740 1 -

1 1.2 - 24 - 740 3 -

метаболизма бактериальной клетки Е. coli 1.3 - 48 - 740 3 -

2 Определение локализации технеция-99т по отношению к клеточной мембране Е. coli 2.1 - 48 - 740 3 -

Оценка эффективности 3.1 - 48 - 740 5 -

3 способов очистки взвеси меченой технецием-99т Е. coli от несвязанного 3.2 - 48 - 740 - +

3.3 + 48 - 740 5 -

радионуклида 3.4 + 48 - 740 - +

4.1 - 48 - 74 - +

Оценка влияния количества реагента «Пирфотех, 99тТс» 4.2 - 48 29,3 74 - +

4 4.3 - 48 9,8 74 - +

на связывание технеция-99т клетками Е. coli 4.4 - 48 7,3 74 - +

4.5 - 48 3,7 74 - +

4.6 - 48 1,8 74 - +

Оценка влияния количества радиоактивной метки (активности технеция-99т) 5.1 - 48 3,7 37 - +

5 5.2 - 48 3,7 74 - +

на связывание радионуклида клетками Е. coli 5.3 - • 48 3,7 148 - +

Примечание: * - с указанием количества этапов мембранной фильтрации.

Исследования in vivo, выполненные на крысах, предусматривали получение и оценку сцинтиграфического изображения у спленэктомированных животных на 6-е сутки после аспленизации (и = 42). Также проводили оценку сцинтиграфического изображения при моделированной странгуляционной непроходимости тонкой кишки, на протяжении 0-4 часов после ее индукции (группа 3.1 ,п = 10), при введении БРП в просвет ущемленного отдела тонкой кишки (группа 3.2, п = 10) и в приводящий отдел тонкой кишки (группа 3.3, п = 10). Кроме этого, оценка сцинтиграфи-

ческого изображения выполнялась у животных с обтурационной непроходимостью кишечника на протяжении 12-16 часов (группа 3.4, п = 10), 24-28 часов (группа 3.5, п = 10) и 36—40 часов (группа 3.6, п = 10) от момента ее индукции.

Методы исследования in vitro

Оценка накопления радионуклида технеция-99т в ходе

естественного метаболизма бактериальной клетки Е. coli

В первой серии опытов in vitro (и = 30) оценивали накопление радионуклида технеция-99т в ходе естественного метаболизма бактериальной клетки. В первых 10 наблюдениях маркировку бактериальных клеток радионуклидом проводили по методу A.B. Шелехова и соавт. (1998). Фракционирование меченых бактериальных клеток от несвязанного радионуклида выполняли путем мембранной фильтрации. Использовали гемодиализатор HG-100 (Cobe, Германия). Взвесь меченых бактерий диализировали 0,9% водным раствором NaCl со скоростью подачи диализирующе-го раствора 40-50 мл/мин, на протяжении 15 мин. В следующих 10 наблюдениях маркировку проводили аналогично, но продолжительность очистки от несвязанного с бактериальными клетками технеция-99т путем мембранной фильтрации была увеличена до 45 мин. (три этапа по 15 мин.). Далее, в последующих 10 наблюдениях были изменены условия время инкубации. После посева культуры Е. coli на твердую питательную среду (агар-агар) бактериальные клетки инкубировали в аэробных условиях при температуре 37 °С в течение 24 часов, а после внесения технеция-99ш (генератор технеция-99т ГТ-2М, Обнинск, Россия), из расчета 92,5 МБк на 1 мл среды в 5 мл физиологического раствора, инкубировали в аэробных условиях при температуре 37 °С еще в течение 24 часов. Очистку от несвязанного с бактериальными клетками технеция-99ш выполняли путем мембранной фильтрации на протяжении 45 мин. (три этапа по 15 мин.).

После каждого этапа мембранной фильтрации с помощью дозкалибратора колодезного типа CRS-5 (Capintec, Inc., США) определяли активность технеция-99m (MBq) во взвеси меченых бактерий и диализирующем растворе, содержащем несвязанный технеций-99ш.

Определение локализации технеция-99т по отношению

к клеточной мембране Е. coli

Во второй серии опытов in vitro (и = 10) исследовали количество радиоактивной метки, фиксированной на фрагментах клеточной мембраны £ coli и во внутренних структурах бактерии (протопластах), которые получали посредством деструкции меченых бактериальных клеток лизоцимом в слабом гипертоническом растворе (0,2 М) сахарозы и разделяли на фракции с помощью центрифуги FP-510 (Thermo Labsystems, Финляндия) при 3000 об/мин в течение 10 мин. После отделения супер-натанта, содержащего фрагменты клеточных стенок бактерий, от осадка, включающего протопласты (бактериальные клетки лишенные клеточной стенки), проводили подсчет количества импульсов в образцах супернатанта и осадка под детектором гамма-камеры в течение 5 мин на расстоянии 10 см от пробирок с последующей оценкой линейных профилей распределения активности радионуклида.

Оценка эффективности различных способов очистки взвеси меченных технецием-99т бактерий Е. coli от несвязанного радионуклида

В третьей серии опытов in vitro (п = 48) исследовали эффективность очистки бактерий Е. coli, меченых технецием-99ш, от несвязанного радионуклида методом мембранной фильтрации и методом центрифугирования.

В первых 12 наблюдениях взвесь бактериальных клеток Е. coli, меченных технецием-99т, в растворе радионуклида получали по методу A.B. Шелехова и соавт. (1998). Фракционирование меченых бактерий от несвязанного радионуклида проводили путем мембранной фильтрации с последующей оценкой эффективности очистки. В следующих 12 наблюдениях взвесь бактериальных клеток Е. coli, меченных технецием-99т, в растворе радионуклида получали аналогичным способом, а фракционирование от несвязанного радионуклида проводили путем центрифугирования с последующей оценкой эффективности очистки.

Далее в 12 наблюдениях получали взвесь бактериальных клеток Е. coli, меченных технецием-99т, в растворе радионуклида по способу, описанному А.Г. Кувшиновым и соавт. (2003). Фракционирование меченых бактериальных клеток и несвязанного радионуклида проводили путем мембранной фильтрации, а в следующих 12 наблюдениях-путем центрифугирования. Эффективность очистки контролировали вышеуказанным способом.

Для фракционирования меченых бактериальных клеток от несвязанного радионуклида путем мембранной фильтрации использовали гемодиализатор HG-100 (Cobe, Германия). Взвесь меченых бактерий диализировали 0,9% водным раствором натрия хлорида со скоростью подачи диализирующего раствора 40-50 мл/мин, в пять этапов по 15 мин. каждый. После каждого этапа мембранной фильтрации с помощью дозкалибратора колодезного типа CRS-5 (Capintec, Inc., США) определяли активность технеция-99т (MBq) во взвеси меченых бактерий и диализирующем растворе, содержащем несвязанный радионуклид.

Очистку центрифугированием проводили на рефрижераторной центрифуге CR-412 (Jouan, Франция) со скоростью 4000 об/мин в течение 30 мин. при температуре 4 °С. По завершении центрифугирования супернатант, содержащий несвязанный технеций-99т, удаляли, а осадок, содержащий маркированные радионуклидом бактериальные клетки, ресуспензировали в 10 мл физиологического раствора. Центрифугирование повторяли еще трижды (всего 4 этапа). После каждого этапа центрифугирования также определяли активность технеция-99т (MBq) в осадке и супернатанте с использованием дозкалибратора колодезного типа CRS-5 (Capintec, Inc., США). На завершающем этапе центрифугирования осадок ресуспензировали в 1 мл физиологического раствора.

Эффективность способов очистки оценивали путем расчета содержания несвязанного технеция-99т во взвеси меченых бактериальных клеток после каждого этапа мембранной фильтрации или центрифугирования.

Оценка влияния реагента «Пирфотех, 99тТс» на связывание

технеция-99т клетками Е. coli

В четвертой серии опытов in vitro (и = 72) оценивали влияние реагента «Пирфотех, "тТс» на связывание технеция-99т клетками Е. coli.

В двухсуточную культуру Е. coli в каждой серии опытов, состоящей из 12 наблюдений, вносили растворенный в 5,0 мл 0,9% раствора натрия хлорида «Пирфотех, 99тТс» в количестве 29,3 мг, 9,8 мг, 7,3 мг, 3,7 мг и 1,8 мг (соответствует 1,1/3,1/4, 1/8 и 1/16 части лиофилизата во флаконе). Далее инкубировали в аэробных условиях при температуре 37 °С в течение 1 часа. Затем добавляли 74 МБк технеция-99ш объемом 5,0 мл и продолжали инкубацию в тех же условиях еще в течение 1 часа. Очистку взвеси меченых бактерий от несвязанного радионуклида проводили путем центрифугирования и затем определяли активность радионуклида во взвеси меченных технецием-99т бактерий Е. coli. В контрольной группе вместо раствора реагента «Пирфотех, 99тТс» вносили 5,0 мл физиологического раствора.

Оценка влияния количества радиоактивной метки (активности

технеция-99т) на связывание данного радионуклида клетками Е. coli

В пятой серии опытов in vitro (и = 36) оценивали влияние количества радиоактивной метки (активности технеция-99ш) на связывание данного радионуклида клетками Е. coli.

В двусуточную культуру Е. coli вносили «Пирфотех, 99тТс» в количестве 3,7 мг (соответствует 1/8 части лиофилизата во флаконе), растворенный в 5,0 мл 0,9% раствора натрия хлорида, и полученную смесь инкубировали в аэробных условиях при температуре 37 °С в течение 1 часа. Затем в каждой серии опытов из 12 наблюдений добавляли технеций-99т активностью 37,74 и 148 МБк, соответственно, объемом 5,0 мл, и продолжали инкубацию в тех же условиях еще в течение 1 часа. По окончании времени инкубации с радионуклидом выполняли очистку взвеси меченых бактерий от несвязанного радионуклида путем центрифугирования. По завершении очистки в исследуемых группах определяли активность радионуклида во взвеси меченных технецием-99ш бактерий Е. coli.

Методы исследования in vivo (эксперименты на животных)

Все оперативные вмешательства на лабораторных животных проводили в асептических условиях операционной под общим обезболиванием: у крупных лабораторных животных - тиопенталом из расчета 20 мг/кг массы тела, а у мелких - калипсолом, введенным в скакательную мышцу из расчета 5 мг/100 г массы тела. После фиксации подопытного животного на столике А.И. Сеченова и обработки операционного поля раствором первомура трижды и спиртом выполняли срединную лапаротомию. Распределение животных на группы в зависимости от проведенных манипуляций и методы исследования в первой серии экспериментов in vivo (собаки) представлены в табл. 3, второй и третьей серии экспериментов (крысы) - в табл. 4 и 5.

Таблица 3

Распределение животных на группы и методы исследования в первой серии экспериментов in vivo (собаки)

№ группы Характер воздействия Кол-во животных Методы исследования

Предварительные эксперименты 1 Катетеризация тонкой кишки, индукция перитонита, через 6 ч. введение 1-6 мл/кг БРП 6 ДС на протяжении 3 ч. морфология внутренних органов

2 Катетеризация левого подциафрагмального пространства, индукция перитонита, через 6 ч. введение 1-6 мл/кг БРП 6

1.1 Катетеризация тонкой кишки. 6 ДС на протяжении 0-6 ч. от момента индукции перитонита,с расчетом ИТ и ИР, проведение СС в течение 15 мин. в группах 1.1,1.2

1.2 Катетеризация тонкой кишки, индукция перитонита 6

1.3 Катетеризация левого подциафрагмального пространства, индукция перитонита 6

1.4 Катетеризация тонкой кишки, индукция перитонита 6 ДС на протяжении 6-12 ч. от момента индукции перитонита, с расчетом ИТ и ИР, проведение СС в течение 15 мин. в группе 1.4

1.5 Катетеризация левого подциафрагмального пространства, индукция перитонита 6

1.6 Катетеризация тонкой кишки, индукция перитонита, релапаротомия через 6 ч. 6

Всего: 48

Таблица 4

Распределение животных на группы и методы исследования во второй серии экспериментов in vivo (крысы)

№ группы Характер воздействия Кол-во животных Методы исследования

Операция Время исследования

Контроль 2.1 Ложная операция Через 6 сут. релапаротомия, катетеризация тонкой кишки 6 Тот час после введения БРП - ДС на протяжении 4 ч. и СС в течение 15 мин.

Опыт 2.2 Спленэктомия Через 6 сут. релапаротомия, катетеризация тонкой кишки 6

Спленэктомия Забор материала 2 сут. 10 Морфологическое и морфометрическое исследование печени

Забор материала 5 сут. 10

Забор материала 7 сут. 10

Всего: 42

Таблица 5

Распределение животных на группы и методы исследования в третьей серии экспериментов in vivo (крысы)

№ группы Характер воздействия Кол-во животных Методы исследования

3.1 Катетеризация тонкой кишки 10

3.2 Моделирование странгуляционной непроходимости кишечника. Катетеризация ущемленного отдела тонкой кишки 10

3.3 Моделирование странгуляционной непроходимости кишечника. Катетеризация тонкой кишки выше уровня странгуляции 10 ДС на протяжении 4 ч. с расчетом ИТ и СС в течение 15 мин.,

3.4 Моделирование обтурационной непроходимости кишечника 12-16 ч. Катетеризация тонкой кишки 10 морфология, бактериология внутренних органов

3.5 Моделирование обтурационной непроходимости кишечника 24-28 ч. Катетеризация тонкой кишки 10

3.6 Моделирование обтурационной непроходимости кишечника 36-40 ч. Катетеризация тонкой кишки 10

Всего 60

Сцинтиграфия

Сциктиграфию проводили на двухдетекторной томографической гамма-камере MULTTSPECT-II (Siemens AG, Германия) с компьютерной системой обработки данных ICON 6.0. Регистрацию сцинтиграмм в динамическом режиме проводили в течение 6 часов у собак и 4 часов - у крыс, с продолжительностью одного кадра - 60 е., в матрицу 64x64, в передней прямой проекции, уложив животное таким образом, чтобы оно полностью попадало в поле зрения детектора. Сцинтиграфию в статическом режиме выполняли в течение 15 мин., в матрицу 128х 128, в передней прямой проекции, уложив животное таким образом, чтобы оно полностью попадало в поле зрения детектора. Использовали коллиматор для низких (140 Кэв) энергий гамма-излучения ультравысокого разрешения с использованием окна дифференциального дискриминатора ±15 %.

Бактериологические и патоморфологические исследования

На этапе исследований in vitro жизнеспособность и концентрацию бактерий Е. coli контролировали путем бактериологического исследования БРП методом секторных посевов по Gould в модификации Рябинского - Родомана не позже 6 часов с момента забора материала. Во второй серии исследований in vivo (крысы) транслокацию Е. coli контролировали бактериологическим исследованием тканей органов и жидких сред организма лабораторного животного (печень, селезенка, портальная кровь, системная кровь, почка, диафрагма, легкое, сердце, брыжейка, моча, экссудат (при наличии)). Число КОЕ в 1 г ткани определяли по специальной таблице учета результатов метода секторного посева по Gould. В первой и третьей сериях исследований in vivo для определения характера интраабдоминального воспаления (перитонита),

а также характера странгуляционной и обтурационной непроходимости кишечника и контроля транслокации бактерий Е. coli, выполнено патоморфологическое исследование различных отделов стенки тонкой кишки, брыжейки, сердца, легких, печени, почек, брюшины. Во второй серии исследований in vivo для определения характера воспалительного повреждения печени после спленэкгомии выполнено морфологическое и морфометрическое исследование на 2-е, 5-е и 7-е сутки после аспленизации. На моделях острой непроходимости кишечника для ориентировочной количественной оценки степени морфологических изменений слизистой тонкой кишки использовали метод, предложенный C.J. Chiu et al. (1970).

Методы статистической обработки результатов

Величины анализируемых показателей в группах представляли в виде медианы с нижним и верхним квартилями (25-й и 75-й процентили). Значимость различий (р) количественных показателей определяли по критериям Манна - Уитни (U), Ньюмена - Кейлса (N-K), Даннета (D), Вилкоксона (W), Краскела - Уоллиса (K-W). Для определен™ корреляционных зависимостей использовали непараметрический критерий Спирмена (г).

Статистическая обработка результатов проведена с помощью стандартного пакета статистических программ Statistica for Windows.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В третье главе предпринята попытка определения роли стандартных радио-нуклидных методов исследования в выявлении косвенных признаков БТ, где был применен метод гепатобилисцинтиграфии у пациентов с воспалительными процессами в гепатодуоденальной области.

Применение гепатобилисцинтиграфии для выявления косвенной сцинтиграфи-ческой семиотики бактериальной транслокации у пациентов с воспалительными процессами в гепатодуоденальной области

Поскольку визуальный анализ серий динамических гепатобилисцинтиграмм не представлял данных, которые можно было бы использовать для поиска косвенных признаков БТ, наши исследования в этом разделе работы были направлены на оценку количественных показателей поглотительно-выделительной функции печени, а также накопительной и эвакуаторной функции желчного пузыря.

Оценка поглотительной функции печени показала, что время максимального накопления РФП в печени было увеличено во всех группах пациентов с воспалительными процессами в гепатодуоденальной области, по сравнению с группой клинического сравнения (нормой). Наиболее выраженное увеличение было зарегистрировано в группе пациентов, страдающих ХНХ с гипомоторной дискинезией желчного пузыря, где этот показатель составил 15,0 мин. (12,0-17,0) -рп = 0,004. В группах пациентов с ДЖП по гипокинетическому типу и с ХКХ в стадии обострения Тгпах печени было также статистически значимо увеличено до 12,0 мин. (12,0-16,0) -pD = 0,03 и 12,0 мин. (12,0-18,0) -pD = 0,01, соответственно.

Выделительная функция печени имела отчетливую тенденцию к ослаблению, что выражалось статистически значимым увеличением времени полувыведения РФП из

печени. Так показатель 1у2 печени в большей степени был увеличен в группах пациентов с ХКХ в стадии обострения и ДЖП по гипокинетическому типу и составил 45,5 мин. (42,0-49,0)-ро=0,00003 и43,0 мин. (33,0-47,0)-/>о=0,0006 соответственно. У пациентов с ХНХ с гипомоторной дискинезией желчного пузыря Т1/2 печени также было статистически значимо увеличено до 38,0 мин. (30,0-54,0) -ри = 0,001.

Межгрупповых статистических различий по показателям Ттах печени и Т,/2 печени у пациентов с воспалительными процессами в гепатодуоденальной области не было -рК№=0,7 и рк_у[=0,3 соответственно.

Нарушения накопительной функции желчного пузыря были зарегистрированы во всех клинических группах. При этом Т0 желчного пузыря у пациентов с ХНХ с гипомоторной дискинезией желчного пузыря, составившее 16,0 мин. (15,0-22,0), не превышало аналогичный показатель в группе клинического сравнения (ри=0,6). У пациентов с ДЖП по гипокинетическому типу Т0 имело тенденцию к достоверному увеличению (р0= 0,06) по сравнению с нормой и составило 26,0 мин. (16,0-40,0). Статистически значимое увеличение Т0 до 20,0 мин. (16,0-75,0)-рп=0,003, было зарегистрировано только у пациентов с ХКХ в стадии обострения. Показатель Ттах желчного пузыря во всех клинических группах был достоверно выше значений группы клинического сравнения. Так, у пациентов с ДЖП по гипокинетическому типу он составил 37,0 мин. (28,0-47,0)-р0= 0,0004; у пациентов с ХНХ с гипомоторной дискинезией желчного пузыря - 30,0 мин. (26,0-47,0) -р0 = 0,008; у пациентов с ХКХ в стадии обострения - 33,0 мин. (29,0-42,0) -р0 = 0,004.

Анализ межгрупповых статистических различий у пациентов с воспалительными процессами в гепатодуоденальной области продемонстрировал, что показатель Ттах желчного пузыря достоверных различий не имел = 0,4), а для Т0 желчного пузыря намечалась тенденция к значимым различиям (рклу = 0,09).

Нарушения эвакуаторной функции желчного пузыря также были зарегистрированы во всех трех группах клинических наблюдений. Так у пациентов с ДЖП по гипокинетическому типу показатель Т|/2 желчного пузыря был статистически значимо (ри = 0,00009) повышен - 66,0 мин. (53,0-73,0), а показатель эвакуаторной функции желчного пузыря достоверно {ра = 0,00002) снижен - 32,0 % (13,0-35,0). Аналогичные результаты были зарегистрированы у пациентов с ХНХ с гипомоторной дискинезией желчного пузыря и ХКХ в стадии обострения, где показатель Т1/2 желчного пузыря увеличивался до 72,0 мин. (58,0-87,0) -р0 = 0,00002 и 60,0 мин. (59,0-70,0) -р0 = 0,0002, соответственно, а показатель эвакуаторной функции желчного пузыря снижался до 26,0 % (11,0-33,0) -р0 = 0,00002 и 37,0 % (25,0-48,0)-ръ = 0,00002, соответственно.

Между клиническими группами пациентов с воспалительными процессами в гепатодуоденальной области не было выявлено статистически значимых различий по показателям Т1/2 желчного пузыря и эвакуаторной функции желчного пузыря -Рк-ч/ ~ и =0,1 соответственно.

Из полученных данных следует, что поглотительно-выделительная функция печени, а также накопительная и эвакуаторная функции желчного пузыря были нарушены при всех рассмотренных вариантах воспалительных процессов в гепатодуоденальной

области, как функциональных - ДЖП по гипокинетическому типу, так и органических - ХНХ с гипомоторной дискинезией желчного пузыря и ХКХ в стадии обострения. С наибольшей вероятностью эти результаты свидетельствуют о наличии хронического внутрипеченочного и внугрипузырного «мягкого» холестаза, который, в свою очередь, может быть связан с развитием БТ. Тем не менее, проанализированные данные в большей степени характеризуют именно холестатические изменения в гепатобилиарной системе. Предположение о том, что они косвенным образом могут характеризовать и процессы БТ, и аргументы в пользу патогенетической роли последней в развитии поражений гепатобилиарной системы, остаются достаточно умозрительными.

Именно поэтому в дальнейшем наши исследования этой важной проблемы были направлены на разработку радионуклидного метода, направленного на регистрацию прямых признаков БТ, а именно позволяющего визуализировать миграцию меченных радионуклидом бактерий и рассчитывать количественные показатели, характеризующие этот процесс. Безусловно, реализовать поставленные задачи можно было только в условиях эксперимента. Обратимся к результатам экспериментальной части исследования.

Технология получения бактериального радионуклидного препарата для исследования микробной транслокации методом сцинтиграфии В четвертой главе изложены результаты этапа работы по созданию БРП, адаптированного для проведения сцинтиграфического исследования на мелких лабораторных животных (крысах), так как такие экспериментальные исследования максимально отвечают требованиям стандартизированных. Для этого мы разработали технологию мечения бактериальных клеток Е. coli технецием-99ш. При этом стремились к получению БРП, максимально свободного от несвязанного с бактериями радионуклида и имеющего высокую удельную активность. Мы разработали принципиально отличную от используемых в нашем научном центре технологию маркировки кишечной палочки радионуклидом. Рассмотрим эти результаты.

Оценка накопления радионуклида технеция-99т входе естественного метаболизма бактериальной клетки Установлено, что в группах, где маркировку бактерий Е. coli выполняли при одинаковых условиях, а очистку взвеси бактериальных клеток Е. coli, меченных технецием-99т, от несвязанного радионуклида выполняли путем мембранной фильтрации (диализа) в один этап и три этапа соответственно, удельная активность БРП была значимо больше (pNK = 0,0001) при одноэтапной очистке - 0,2 (0,17-0,22) МБк/ мл, против 0,07 (0,067-0,085) МБк/мл при трехэтапной очистке. Последующий анализ показал, что в группе одноэтапной очистки достоверно более высокая активность БРП была обусловлена высоким содержанием несвязанного с бактериями радионуклида 21,7 % (21,4-64,3) и была статистически значимо выше (pN_K = 0,0001), чем в группе трехэтапной очистки 4,5 % (4,2-5,0). Таким образом, исследования первого этапа показали, что бактериальный препарат Е. coli, который метился технецием-99т по описанной ранее методике, не обладает достаточной степенью очистки.

Детальный поэтапный анализ процесса мембранной фильтрации продемонстрировал следующие результаты. При экстракции несвязанного с бактериями технеция-99т

на первом этапе получали БРП с активностью 10,4 (8,5-10,7) МБк. После повторного этапа мембранной фильтрации активность БРП, оставшегося на мембране, значительно снижалась - 4,4 (4,1-5,2) МБк, (pw=0,005), с соответствующим повышением ее в диа-лизирукнцем растворе. Последующие этапы мембранной фильтрации (с обязательным радиометрическим контролем взвеси меченых бактерий и диализирующеш раствора) значимо не изменяли активность меченных технецием-99ш бактерий Е. coli (pw> 0,05), а активность диализирующеш раствора значимо не нарастала (pw> 0,05).

Таким образом, установлено, что продолжительность диализа должна составлять 3 этапа, за первые 2 этапа (30 мин.) происходит очистка получаемого препарата от свободного технеция-99ш, 3-й этап является контрольным - в течение него активность БРП существенно не меняется. В наших исследованиях необходимо было максимально повысить удельную активность препарата, поскольку предполагалось его введение в небольшом объеме в полость кишечника и подциафрагмальное пространство мелких лабораторных животных. В этой связи мы увеличили время инкубации бактериальных клеток до 48 ч.

В группах, где процесс маркировки бактерий Е. coli, длящийся 24 часа, начинали, соответственно, сразу после посева бактериальных клеток на питательную среду или спустя 24 часа. Удельная активность БРП 48-часовой культуры бактериальных клеток Е. coli была значимо выше pNK = 0,0001, чем 24-часовой культуры и составила 0,39 (0,34-0,43) МБк/мл против 0,07 (0,067-0,085) МБк/мл, при этом содержание несвязанного радионуклида во взвеси бактериальных клеток, меченных технецием-99ш, значимо не отличалось (pNK = 0,9) и составило 5,0 % (4,1-5,1) и 4,5 % (4,2-5,0), соответственно.

Полученные данные послужили основанием использования в качестве исходного материала для радионуклидной маркировки именно двухсуточной культуры бактериальных клеток Е. coli, а также выбора способа поэтапной мембранной фильтрации для очистки готового БРП от несвязанного с бактериями радионуклида.

При количественном исследовании взвеси меченых бактериальных клеток нами определено, что содержание бактерий в материале составляет 107-108 КОЕ. Формирующиеся колонии маркированной технецием-99т Е. coli по форме, размерам, консистенции, цвету не отличались от колоний не маркированной Е. coli, что подтверждало сохранность свойств и жизнеспособности меченных радионуклидом бактерий.

В ходе исследований закономерно возник вопрос о месте расположении радиоактивной метки в бактериальной клетке. В связи с чем, следующим этапом работы явилось определение локализации радиоактивного маркера в структурах Е. coli.

Определение локализации радионуклида по отношению

к клеточным структурам

Количественное исследование радиоактивной метки фиксированной на фрагментах клеточной мембраны Е. coli и во внутренних структурах бактерии (протопластах продемонстрировало, что активность радионуклида в протопластах составила 107,5 имп/пиксель (106-110), что было существенно выше (pv = 0,0004) по сравнению с активностью радионуклида, содержащегося во фрагментах клеточной мембраны Е. coli - 6,0 имп/пиксель (5,0-9,0). Полученные данные свидетельствуют

о преимущественно внутриклеточном расположении радиоактивной метки. Таким образом, в настоящем разделе работы показано распределение технеция-99т во внутриклеточных структурах Е. coli после введения радионуклида в культуру, что позволило нам рассматривать в дальнейшем изложении кишечную палочку, меченную вышеуказанным способом, как БРП.

Оценка эффективности различных способов очистки взвеси бактерий Е. coli, меченных технецием-99т, от несвязанного радионуклида Установлено, что в группах, где маркировку бактерий Е. coli выполняли при одинаковых условиях, а очистку взвеси бактерий Е. coli, меченных технецием-99ш, выполняли путем мембранной фильтрации (диализа) или центрифугирования, содержание несвязанного радионуклида во взвеси статистически значимо (ри = 0,00003) различалось: при центрифугировании оно составило 0,2 % (0,05-0,35), а при использовании мембранной фильтрации - 6,8 % (3,1-7,6).

В группах, где маркировку бактерий Е coli выполняли при одинаковых условиях с использованием анаэробных условий, очистку взвеси бактерий Е. coli, меченных технецием-99т, выполняли также или путем мембранной фильтрации (диализа), или центрифугирования. Содержание несвязанного радионуклида во взвеси было значимо меньше (ри = 0,00003) при центрифугировании: 0,1 % (0-0,5), чем при использовании мембранной фильтрации 5,5 % (5,2-5,8).

Полученные данные послужили основанием для выбора центрифугирования в качестве метода очистки при проведении дальнейших экспериментов по разработке способа маркировки бактерий Е. coliтехнецием-99т для сцинтиграфической оценки БТ. Кроме того, исследования, выполненные в этой серии экспериментов, позволили сделать заключение о том, что маркировка бактериальных клеток Е. coli технецием-99ш одинаково эффективна у различных штаммов кишечной палочки, т.к. значимых различий в накоплении радионуклида бактериями Е. coli штамма Olli и Е. coli штамма 020 не было (ри = 0,4).

Влияние реагента «Пирфотех, 99тТс» на связывание технеция-99т клетками Е. coli

В группах, где в процессе маркировки бактериальных клеток радионуклидом использовали реагент «Пирфотех, 99шТс», радиоактивность взвеси меченных технецием-99т бактерий Е. coli была значимо выше (pD = 0,000008) по сравнению с группой контроля. Сравнительный анализ групп, в которых применяли «Пирфотех, "■"Тс», показал, что радиоактивность взвеси меченых бактерий зависит от количества данного реагента. Было установлено, что в группах, где «Пирфотех, 99шТс» использовали, соответственно, в количестве 29,3 мг и 9,8 мг (т.е. 1 и 1/3 части лиофилизата во флаконе), радиоактивность взвеси меченых бактерий статистически значимо не различалась друг от друга (pN к = 0,3). При этом указанные значения были значимо ниже (/>N K<< 0,001), по сравнению с группами, где применяли более низкие концентрации реагента-7,3,3,7 и 1,8мг (т.е. 1/4,1/8 и 1/16 части лиофилизата во флаконе). Наибольшее влияние на процесс связывания технеция-99ш бактериями Е. coli реагент «Пирфотех, 99шТс» оказывал в количестве 3,7 мг (соответствует 1/8 части лиофилизата во флаконе). В группах, где данный реагент применяли в количестве 7,3 и 1,8 мг (т.е.

1/4 и 1/16 части лиофилизата во флаконе) значения радиоактивности взвеси меченых бактерий статистически значимо не отличались друг от друга (pN_K = 0,6), но при этом были значимо ниже (pN к < 0,001), чем при использовании 3,7 мг «Пирфотеха, 99тТс», что соответствует 1/8 части лиофилизата во флаконе.

Таким образом, было установлено, что «Пирфотех, 99тТс» в количестве 3,7 мг (т.е. 1/8 части лиофилизата во флаконе) позволяет обеспечить максимальное повышение связывания технеция-99ш бактериями Е. coli.

Влияние количества радиоактивной метки (активности технеция-

99т) на связывание данного радионуклида клетками Е. coli

В группе, где в процессе маркировки использовали 37 МБк технеция-99ш, радиоактивность взвеси меченых бактерий составила 15,9 (15,5-17,1) МБк. В группах, где маркировку бактерий проводили с использованием 74 МБк и 148 МБк технеция-99т, радиоактивность взвеси меченых бактериальных клеток равнялась, соответственно, 24,0 (20,8-25,9) и 23,4 (20,8-26,9) МБк, что не имело статистически значимых различий (pN K = 0,9), но были значимо выше по сравнению с использованием 37 МБк технеция-99т (pN_K < 0,001).

Таким образом, оптимальная радиоактивность технеция-99т для маркировки бактерий Е. coli в присутствии реагента «Пирфотех, 99тТс» составила 74 МБк. В дальнейшем процесс маркировки бактерий Е. coli мы проводили с использованием технеция-99ш радиоактивностью 74 МБк.

По результатам этих серий опытов нами были определены оптимальные условия, которые составили основу разработанного способа маркировки бактерий Е. coli технецием-99ш для сцинтиграфической оценки БТ в эксперименте. Было установлено, что для достижения максимального выхода меченых радионуклидом бактериальных клеток необходимо в процессе маркировки использовать 3,7 мг реагента «Пирфотех, 99тТс» (соответствует 1/8 части лиофилизата во флаконе) и технеций-99ш радиоактивностью 74 МБк, а очистку взвеси меченых бактерий от несвязанного радионуклида проводить путем четырехкратного центрифугирования с определением радиоактивности осадка, содержащего меченные технецием-99т бактерии Е. coli, и супернатанта, содержащего несвязанный технеций-99т.

При соблюдении указанных условий предложенный способ позволяет получить взвесь маркированных технецием-99т бактерий Е. coli радиоактивностью 24,0 (20,8-25,9) МБк/мл.

При бактериологическом количественном исследовании взвеси меченых бактериальных клеток нами определено содержание бактерий 107-108 КОЕ. Формирующиеся колонии маркированной технецием-99ш Е. coli по форме, размерам, консистенции, цвету не отличались от колоний не маркированной Е. coli. Таким образом, меченные радионуклидом бактерии сохраняли свои свойства и жизнеспособность.

Полученная по разработанному способу взвесь маркированных технецием-99т бактерий Е. coli использована нами в дальнейших исследованиях по сцинтиграфической оценке БТ в эксперименте. Радиоактивность взвеси меченных технецием-99т бактерий Е. coli, составляющая 24,0 (20,8-25,9) МБк в 1 мл, является достаточной для регистрации процессов БТ в ходе динамической сцин-22

тиграфии и построения кривых «активность - время». Кроме того, малый объем взвеси меченых бактерий (1 мл), является абсолютно необходимым условием для создания моделей патологических процессов на мелких лабораторных животных (т.е. на крысах, как наиболее распространенных лабораторных животных).

Обработка данных сцинтиграфии

Дополнительно к существующим методикам обработки данных, основанных на построении кривых «активность - время» с зон интереса, мы рассчитывали:

ИТ - поступление бактерий Е. coli, меченных технецием-99ш, из тонкой кишки (области введения) в кровоток, с учетом распада короткоживущего изотопа; или

ИР - поступление бактерий Е. coli, меченных технецием-99т, из брюшной полости (области введения) в кровоток, с учетом распада радионуклида.

Принцип расчета ИТ или ИР представлен на рис. 1.

Рис. 1. Расчет индекса транслокации (или резорбции) по кривым «активность - время» с области введения БРП: 1 - кривая отражающая снижение активности радионуклида технеция-99т за счет радиоактивного распада; 2 -кривая убывания активности радионуклида технеция-99т в области введения меченых бактерий в тонкую кишку (или брюшную полость).

Проводили анализ кривых «активность - время»: кривая 1 — процесс распада технеция-99т, кривая 2 отображает процесс поступление меченых бактерий из зоны интереса «кишечник» или «брюшная по- сцинтилляционный счет с области введения БРП в момент начала исследования, Ct - сцинтилляционный счет с области введения БРП в момент времени t, С0 х к, - сцинтилляционный счет с области введения БРП в момент времени t с учетом поправки на распад технеция-99т.

Для расчета примем величину С0 за 100 %, тогда ИТ (ИР) = 100 % - X, где X - выраженная в процентах величина С( т.е. величина снижения кривой «активность - время» за счет поступления меченых радионуклидом бактерий в кровоток с учетом распада технеция-99т в момент времени t по отношению к величине С0 х к( т.е. к величине снижения кривой «активность - время» только за счет распада технеция-99ш в момент времени t.

Пропорция:

С0 х Ц - 100 %

С( - X %, отсюда:

X = 100%х——— т.е. #Г(#Р)=100%-100%х—,т.е. т{ИР)=\ 1--5l-]x100% c0xk,, С0 х k, I C0xk,J

Tim« Activity Curves

лость» и процесс распада технеция-99т, где С0

Таким образом, нами анализирован параметр, характеризующий убывание активности радионуклидной метки за счет перемещения меченой кишечной палочки за пределы области введения (кишечник или брюшная полость) и свободный от погрешностей оценки, обусловленных распадом технеция-99ш.

Транслокация Е. coli из просвета кишечника в норме

у крупных (собаки) и мелких (крысы) лабораторных животных

В пятой главе изложены результаты количественного исследования БТ у различных видов (мелкие, крупные) лабораторных животных в норме с использованием метода бактериальной сцинтиграфии.

Дли применения метода бактериальной сцинтиграфии в оценке патогенетической роли кишечной микрофлоры в условиях моделированной патологии у крупных и мелких лабораторных животных, предстояло выяснить, происходит ли перемещение Е. coli из просвета кишечника в норме у крупных (собаки) и мелких (крысы) лабораторных животных. С этой целью в серии экспериментов на собаках через 3 суток после катетеризации подвздошной кишки была проведена ДС в течение 6 часов с продолжительностью одного кадра - 60 с. в передней прямой проекции, уложив животное таким образом, чтобы оно полностью попадало в поле зрения детектора. Аналогичным образом в серии экспериментов на крысах через 2 суток после катетеризации подвздошной кишки была проведена ДС в течение 4 часов. Сроки радионуклидного исследования были обусловлены полной нормализацией состояния животного и восстановлением пассажа по желудочно-кишечному тракту. По завершении ДС и эвтаназии животного с последующей экстирпацией кишечника проведена 15-минутная СС.

Рис. 2. Результаты исследования БТ меченой кишечной палочки, введенной в тонкую кишку через 3 суток после ее катетеризации, методом бактериальной сцинтиграфии у собак: а - суммационная сцинтиграмма за 6 часов динамического исследования с обозначенной областью интереса кишечник - 1 (место введения БРП). Ь - статическая сцинтиграмма после эвтаназии животного и экстирпации кишечника: экстраинтестинальных очагов накопления БРП не зарегистрировано, с - кривая «активность - время» с области кишечника: 1 - на последних минутах бактериальной сцинтиграфии убывание активности радионуклида технеция-99т происходит только за счет радиоактивного распада. БТ нет.

На суммационной сцинтиграмме, полученной за 6 ч. динамического исследования (рис. 2а), определяется очаг активности только в области введения БРП, т.е. кишечнике (1). Экстраинтестинальных очагов не выявлялось, что говорит об отсутствии

а Ь

Time Activity Curves

транслокации меченых бактерий. Это было подтверждено и результатами статической сцинтиграфии выполненной после эвтаназии животного и экстирпации участка кишечника с введенным БРП (рис. 2Ь). Очагов накопления меченых бактерий при этом не было зарегистрировано, что свидетельствует в пользу отсутствия БТ. Анализ кривой «активность - время» на рис. 2с демонстрирует снижение сцинтил-ляционного счета в области введения БРП только за счет распада технеция-99ш.

Аналогичные данные были получены и у мелких лабораторных животных (рис. 3). При контрольном бактериологическом исследовании ни в одном из наблюдений роста бактерий в ткани печени, селезенки, почек, легких, сердца, брыжейки, диафрагмы, портальной и системной крови, моче не обнаружено.

Рис. 3. Результаты исследования БТ меченой кишечной палочки из просвета тонкой кишки у здоровых животных (крысы) методом бактериальной сцинтиграфии. а - суммационная сцинтиграмма за 4 часа динамического исследования с обозначенной областью интереса «кишечник» -1 (место введения БРП). Ь - статическая сцинтиграмма после эвтаназии животного и экстирпации кишечника: экстраинтести-нальных очагов накопления БРП не зарегистрировано. с - кривая «активность - время» с области кишечника: 1 - на последних минутах бактериальной сцинтиграфии снижение сцинтилляционного счета в области введения БРП происходиттолько за счет распада технеция-99т. БТ нет.

Представленные данные свидетельствуют об отсутствии транслокации энтеропатогенной кишечной палочки из кишечника в норме, как у крупных, так и у мелких лабораторных животных.

Шестая глава посвящена результатам определения характера индуцированного перитонита, сцинтиграфическому исследованию и определению количественных параметров БТ и ПР в условиях моделированного перитонита на сроках 0-6 и 6-12 часов от начала эксперимента, а также оценке БТ после релапаротомии и манипуляций на кишечнике в условиях распространенного гнойного перитонита.

Характер индуцированного перитонита

Выбранная модель перфоративного перитонита предполагала ушивание созданного дефекта толстой кишки, чтобы исключить затекание БРП в полость брюшины. Во время аутопсии по окончании 6-часовой ДС (перитонит 0-6 ч.) регистрировали явления гнойно-фибринозного перитонита с выраженной гиперемией брюшины, эктазией кишечных петель, небольшим количеством желеобразного фибрина между петлями кишечника, мутным зловонным экссудатом в брюшинной полости. При перитоните 6-12 ч. явления перитонита нарастали, брюшина становилась тусклой, матовой, увеличивалась эктазия кишечных петель, выпадало большее количество

25

фибрина. Патоморфологическое исследование париетальной брюшины подтверждало наличие распространенного гнойно-деструктивного воспалительного процесса. В исследованных тканях тонкой и толстой кишок, пристеночной брюшины, диафрагмы выявлено наличие лейкоцитарной инфильтрации субсерозных отделов и лейкоциты с небольшим количеством фибрина на поверхности. Периваскулярно в толще мышечного слоя диафрагмы и брюшной стенки обнаружены скопления лейкоцитов. Пато-морфологическая картина соответствовала лейкоцитарно-фибринозному перитониту.

Таким образом, было подтверждено, что исследование БТ и ПР проведено нами в условиях распространенного перитонита с гнойным характером экссудата. Сравнительная оценка параметров бактериальной транслокации до 6 часов после индукции перитонита При исследовании БТ в первые 6 часов перитонита на сцинтиграмме (рис. 4а) визуализировали характерное распределение радиоактивности, где максимальный очаг регистрируется в области кишечника (место введения БРП).

ж

■шМ I В

шт

Рис. 4. Сцинтиграфическое исследование БТ меченой кишечной палочки из полости тонкой кишки у собак: а -суммационная сцинтиграмма за 6 часов динамического исследования с обозначенными областями интереса: 1 - кишечник (место введения БРП), 2 - печень, 3 - сердце и легкие, b - статическая сцинтиграмма после эвтаназии животного и экстирпации кишечника: 1 - печень, 2 - почки, 3 - мочевой пузырь, с - кривая «активность - время» с области кишечника: снижение количества импульсов происходит не только за счет убывания активности радионуклида технеция-99т вследствие радиоактивного распада, но и за счет поступления меченых бактерий за пределы кишечной трубки, d - кривая «активность - время» с области печени: монотонное нарастание количества импульсов в результате поступления меченых бактерий в портальную циркуляцию за счет БТ. Поступление БРП в область сердца и легких не поддается компьютерному анализу в связи с низкими значениями сцинтилляционного счета.

Очаг накопления радиоактивности, свидетельствующий о накоплении бактерий, регистрировался в проекции печени. Минимальное накопление бактерий Е. coli, меченных радионуклидом, регистрировали в проекции сердца и мягких тканей. Кривая «активность - время» с области кишечника показывала убывание сцинтилляционного счета с большей скоростью, чем распад технеция-99т (рис. 4с), а кривая с

области печени (рис. 4d), напротив, демонстрировала его накопление на протяжении всего исследования.

ИТ на протяжении 6-часового исследования составил 32,8 % (31,4-33,7)/ Проникновение бактерий в кровоток происходило с первых минут от начала моделирования патологии.

На статической сцинтиграмме (рис. 4Ь), выполненной после эвтаназии животного и экстирпации кишечника с введенным БРП, визуализировали накопление меченых бактерий в печени, почках и мочевом пузыре.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о начале транслокации Е. coli через кишечный барьер уже с первых минут воспалительного процесса в брюшине. На ранних этапах распространенного гнойного перитонита микрофлора тонкой кишки становится источником формирования портальной бактериемии, которая в эти сроки заболевания ограничивается, главным образом, печеночным барьером. Системное распространение бактерий Е. coli в это время почти не происходит, на что указывает достоверно более низкий уровень радиоактивности в области сердца и мягких тканях, по сравнению с кишечником и печенью.

Результаты статической сцинтиграфии позволили установить, что бактериальные клетки, миновавшие печеночный барьер, задерживаются и выводятся органами мочевыделительной системы.

В ходе оценки ПР в те же сроки распространенного перитонита на динамической сцинтиграмме (рис. 5а) визуализировали распределение БРП из левого поддиафрагмального пространства, где и регистрировался максимальный очаг радиоактивности (место введения БРП). Очаги радиоактивности, свидетельствующие о накоплении бактерий, регистрировались в проекции сердца и мягких тканей. Кривая «активность - время» с области левого поддиафрагмального пространства показывала убывание сцинтилляционного счета с большей скоростью, чем распад технеция-99т (рис. 5Ь), а кривая с области сердца (рис. 5с), напротив, демонстрировала его накопление. Отчетливая визуализация контуров животного и формирование очага накопления в проекции сердца при отсутствии активности в проекции печени свидетельствуют о перемещении бактерий, меченных радионуклидом, из брюшинной полости в системный кровоток (минуя при этом печеночный барьер). Возрастание активности в проекции сердца совпадало по времени с наиболее интенсивным всасыванием препарата из полости брюшины.

ИР на протяжении 6-часового исследования составил 59,2 % (58,4-63,3). При этом более половины бактерий, меченных радионуклидом, поступило в системный кровоток в течение первых 2 ч. исследования.

Сравнительный анализ темпов поступления меченых бактерий из просвета кишечной трубки и из брюшной полости в эти сроки распространенного перитонита выявил следующее: на десятой минуте исследования различия ИТ и ИР из кишечника и полости брюшины соответственно были статистически незначимыми - 2,5 % (1,7-3,9) против 4,0 % (3,2-6,1); p{J = 0,6. С двадцатой минуты после индукции перитонита ИР был существенно (рц = 0,004) выше, чем ИТ, на всем протяжении ДС.

Рис. 5. Сцинтиграфическое исследование ПР меченой кишечной палочки из левого поддиафраг-мального пространства у собак: а - суммационная сцинтиграмма за 6 часов динамического исследования с обозначенными областями интереса: 1 - полость брюшины - левое поддиафрагмальное пространство (область введения БРП), 2 - сердце. Ь - кривая «активность - время» с области левого подциафрагмального пространства: снижение количества импульсов происходит не только за счет убывания активности радионуклида технеция-99т вследствие радиоактивного распада, но и за счет поступления меченых бактерий за пределы брюшной полости, с - кривая «активность - время» с области сердца: нарастание количества импульсов с первых минут исследования за счет генерализации инфекционного процесса. Поступление БРП в мягкиеткани не поддается компьютерному анализу в связи с низкими значениями сцинтилляционного счета.

Учитывая полученные результаты, можно сказать, что источником развития бактериемии в раннем (до 6 часов) периоде развития распространенного гнойного воспаления брюшины является как микрофлора тонкой кишки (за счет БТ), так и микрофлора брюшной полости (за счет ПР). При этом процесс ПР следует рассматривать в качестве доминирующего источника абдоминального сепсиса.

Сравнительная оценка параметров бактериальной транслокации

при 6-12-часовом перитоните

При исследовании БТ за период 6-12 часов после индукции перитонита максимальный счет импульсов был зарегистрирован в области кишечника (место введения БРП). Очаги повышенной радиоактивности, свидетельствующие о накоплении бактерий, регистрировались в проекции печени, сердца, мягких тканей (рис. 6а). По кривой «активность - время» с области кишечника можно судить о том, что убывание сцинтилляционного счета в этой зоне происходило с большей скоростью, чем распад технеция-99т (рис. 6с), а кривые с области печени (рис. 6(1) и сердца (рис. бе), демонстрировали волнообразное нарастание активности на протяжении всего исследования, за счет транзита меченых бактерий.

ИТ на протяжении 6-насового исследования составил 35,0 % (30,9-36,4). Проникновение бактерий в системный кровоток происходило с первых минут от начала исследования.

На статической сцинтиграмме (рис. 6Ь), выполненной после эвтаназии животного и экстирпации кишечника с введенным БРП, выявлено накопление меченых бактерий в печени и зарегистрировано наличие БРП в почках и мочевом пузыре.

При анализе ИТ в двух последовательных временных интервалах (0-6 ч. и 6-12 ч.) установлено, что количество меченных радионуклидом бактерий, поступивших из просвета тонкой кишки в кровоток в эти отрезки времени, значимо не отличалось {ри = 0,5). В первые 6 ч. распространенного перитонита ИТ составил 32,8 % (31,4-33,7), в последующие 6 ч,- 35,0 % (30,9-36,4).

а ь ■ ■■■

У : -

Рис. 6. Сцинтиграфическое исследование БТ меченой кишечной палочки из полости тонкой кишки у собак: при 6-12-часовом перитоните, а - сум-мационная сцинтиграмма за 6 часов динамического исследования (6-12 часов после индукции перитонита) с обозначенными областями интереса:

1 - кишечник (место введения БРП),

2 - печень, 3 - сердце. Ь - статическая сцинтиграмма после эвтаназии животного и экстирпации кишечника: 1 - печень, 2 - почки, 3 - мочевой пузырь, с - кривая «активность - время» с области кишечника: интенсивное снижение количества импульсов за счет БТ. с! -кривая «активность - время» с области печени: волнообразное нарастание количества импульсов вследствие БТ. е - кривая «активность - время» с области сердца: волнообразное нарастание количества импульсов за счет транзита меченых бактерий.

Следовательно, темп транслокации бактерий из просвета тонкой кишки на протяжении первых 12 часов от начала распространенного инфекционно-воспалительного поражения брюшины имеет по- стоянный характер.

При оценке ПР в 6-12-ти часовом интервале развития распространенного перитонита на динамической сцинтиграмме (рис. 7а) определяли распределение БРП из левого поддиафрагмального пространства, где регистрировался максимальный очаг радиоактивности (место введения БРП). Очаги накопления радиоактивности, свидетельствующие о накоплении бактерий, регистрировались минимально в проекции сердца и мягких тканей. При этом следует обратить внимание, что контуры сцинтиграфического изображения животного были неотчетливы. Кривая «активность - время» с области кишечника показывала убывание сцинтилляционного счета с большей скоростью, чем распад технеция-99т (рис. 7Ь), а кривая с области сердца (рис. 7с) напротив, демонстрировала его накопление. Неотчетливая визуализация контуров животного и формирование очага накопления в проекции сердца при отсутствии активности в области печени свидетельствовали о существенно сниженном, но сохраняющемся поступлении бактерий меченных радионуклидом в системный кровоток из брюшинной полости, минуя печеночный барьер. В эти сроки наблюдения не удалось количественно оценить процесс поступления и накопления бактерий, меченных радионуклидом в области сердца и мягких тканей в связи с его минимальной величиной.

Рис. 7. Сцинтиграфическое исследование ПР меченой кишечной палочки методом бактериальной сцинтиграфии при 6-12-часовом перитоните у собак: а - суммационная сцинтиграмма за 6 часов динамического исследования (6-12 часов после индукции перитонита) с обозначенными областями интереса: 1 - полость брюшины (место введения БРП), 2 - сердце, b - кривая «активность - время» с области введения БРП: снижение количества импульсов за счет ПР менее интенсивное, чем при 0-6-часовом перитоните, с - кривая «активность - время» с области сердца: волнообразное нарастание количества импульсов за счет транзита меченой £ coli. Поступление БРП в мягкие ткани не поддается компьютерному анализу всвязи с низкими значениями сцинтил-ляционного счета.

Расчет ИР документировал результаты визуальной оценки сцинтиграмм - существенное снижение темпов поступления бактерий, меченных радионуклидом, за счет процесса ПР в промежутке 6-12 часов, количественный показатель составил 10,9 % (9,3-14,7). Сравнительный анализ темпов поступления меченых бактерий из просвета кишечной трубки и из брюшной полости на отрезке 6-12 часов от начала распространенного перитонита выявил, что уже на десятой минуте и далее на протяжении всего исследования значение ИТ бактерий из просвета тонкой кишки значимо превышало значение ИР бактерий из брюшной полости (р{] = 0,004).

Рис. 8. Сравнительная оценка темпов БТи ПР меченой кишечной палочки в интервалах 0-6 и 6-12 часов после индукции перитонита (медиана, нижний и верхний квартили). Смена приоритета очагов бактериальной интоксикации.

Учитывая полученные результаты, можно сказать, что источником развития бактериемии в 6-12-часовом временном интервале развития распространенного гнойного воспаления брюшины является как микрофлора тонкой кишки, за счет БТ, так и микрофлора брюшной полости, за счет ПР, равно как и в 0-6-часовом временном интервале.

Однако, в отличие от ранних сроков распространенного перитонита 0-6 ч., ще в качестве доминирующего источника формирования абдоминального сепсиса выступает процесс поступления микрофлоры брюшной полости, за счет процесса ПР, во временном интервале 6-12 ч. доминирующим источником экстраабдоминального распространения бактерий оказывается микрофлора тонкой кишки, за счет процесса БТ.

Сравнительный анализ темпов БТ и ПР в интервалах 0-6 и 6-12 часов после индукции перитонита, представленный на рис. 8, продемонстрировал, что различия индекса транслокации бактерий из просвета кишки и индекса резорбции бактерий из брюшной полости незначимы на 10-й и 720-й мин. исследования. На 10-й мин. исследования ИТ составил 2,5 % (1,7-3,9) против ИР -4,0 % (3,2-6,1),^ = 0,06. На 720-й мин. ИТ и ИР составили 67,8 % (63,8-69,1) и 70,4 % (68,6-74,6) соответственно,^ = 0,2.

Полученные данные документируют, что формирование бактериемии в условиях абдоминального сепсиса обусловлено как процессом транслокации бактерий из просвета тонкой кишки, так и поступлением патогенов из брюшной полости. Однако на определенном этапе течения исследуемого патологического процесса нами зарегистрирована смена приоритетности очагов бактериальной интоксикации. Полученные данные позволили нам рассматривать процесс БТ в качестве важного источника бактериальной эндотоксинемии при распространенном перитоните. Параметры бактериальной транслокации при релапаротомии и манипуляциях на кишечнике в условиях распространенного гнойного перитонита

При исследовании БТ в условиях релапаротомии с пальпацией кишечника, имитирующей установку назоинтестинального зонда, через 6 ч. после индукции перитонита БРП вводили после завершения хирургических манипуляций и тотчас начинали сканирование. Длительность динамического радионуклидного исследования была обусловлена, в отличие от всех предыдущих групп, продолжительностью жизни животных после данной, повторной, операции (первая - моделирование перитонита). Смерть животных наступала на 180 мин. (160-200) от начала сканирования. Контролем служили неоперированные повторно животные с перитонитом той же длительности, результаты исследования которых представлены в предыдущем разделе.

На динамической сцинтиграмме (рис. 9а) представлено распределение БРП из просвета тонкой кишки, после манипуляций на кишечнике. Регистрировали максимальный очаг активности радионуклида в области кишечника (место введения БРП). Очаги накопления активности радионуклида выявляли в проекции печени, сердца, а также отчетливо контурировались мягкие ткани животного, что свидетельствовало о массивном распространении меченной технецием-99ш Е. coli из просвета кишечника в мягкие ткани, т.е. развитии интестиногенной бактериемии. Кривая «активность - время» с области кишечника показывала резкое убывание сцинтилляционного счета на протяжении 20-25 мин. после манипуляции на кишечнике (рис. 9Ь), а кривые с области сердца и печени (рис. 9с) напротив, демонстрировала массивное поступление БРП в первые 22-25 мин. исследования. Следует отметить, что поступление бактерий меченных радионуклидом в эти органы происходило практически одновременно.

Рис. 9. Сцинтиграфическое исследование БТ меченой кишечной палочки из просвета тонкой кишки у собак методом бактериальной сцинтиграфии. а - суммационная сцинтиграмма за 3 часа динамического исследования с обозначенными областями интереса:

1 - кишечник (место введения БРП),

2 - печень, 3 - сердце. Ь - кривая «активность - время» с области кишечника: резкое снижение счета импульсов в течение первых 20 минут исследования за счет индуцированной хирургическим вмешательством БТ с - кривые «активность - время» с области печени (1) и сердца (2) с указанием времени максимального накопления БРП (Tmax): значительное нарастание счета импульсов в начале исследования, обусловленное БТ.

В данной группе наблюдений показатели Tmax с проекции печени - 20,0 мин. (19,0-24,0) и с проекции сердца - 23,5 мин. (21,0-25,0) не имели статистически значимых различий {pv = 0,1), что показывает практически синхронное поступление меченых бактерий из кишечника как в печень, так и в сердце. Связано это, скорее всего, с несостоятельностью как кишечного, так и печеночного барьеров, развившейся тотчас после операции.

Сравнительный анализ темпов БТ продемонстрировал, что ИТ после релапарото-мии значимо возрастал по сравнению с контролем (ри = 0,004), особенно на протяжении первых 30 мин. и составил 37,5 % (35,9-38,6) против 13,2% (10,9-13,8) соответственно. Различия ИТ оставались значимыми (рц<0,05) на протяжении всего периода ДС. Детальный внутригрупповой анализ количественного показателя транслокации бактерий после релапаротомии и манипуляции на кишечнике позволил установить существенное, по сравнению с контролем, повышение ИТ в первые 90 мин. эксперимента (pw < 0,03). Затем в интервале 100-130 мин. статистически значимого прироста ИТ не происходило. Далее ИТ значимо возрастал в сравнении с предыдущими значениями в интервале 140-160 мин. (ру^ < 0,03), после чего изменялся уже незначимо.

Следует отметить, что уже на 150 мин. исследования была отмечена гибель животных основной группы, а на 220 мин. не осталось в живых ни одной собаки (средняя продолжительность жизни составила 180 мин. (160-200). В контрольной группе гибели животных не наблюдалось. На 180-й мин. исследования индекс транслокации у животных с распространенным перитонитом после релапаротомии и манипуляций на кишечнике и у животных с распространенным перитонитом, не подвергавшихся релапаротомии, значимо различался (pv = 0,01) и составил 38,8 % (37,2-40,3) и 25,2 % (22,2-26,1) соответственно.

Сравнивая результаты у животных после релапаротомии с данными контрольной группы, установлено, что на сцинтиграмме, представленной на рис. 9а, печень, сердце, мягкие ткани животного визуализировались более отчетливо, чем на сцинтиграмме, представленной на рис. 6а, что свидетельствует о большем поступлении бактерий, меченных радионуклидом, в данные органы и ткани. Указанный факт количественно 32

документируется кривыми «активность - время»: на рис. 6с кривая «активность - время» с области кишечника демонстрирует равномерное, монотонное снижение числа импульсов, в то время, как на рис. 9Ь на кривой «активность - время» регистрируется «провал», что свидетельствует о значительном увеличении скорости поступления бактерий меченных радионуклидом за пределы просвета кишечника. Сравнительный анализ кривых «активность - время» с области печени и сердца демонстрирует, что в контроле (рис. 66, е) поступление БРП в указанные органы происходило волнообразно, с малой амплитудой и небольшим углом подъема, напротив, у животных с релапаротомией (рис. 9с) происходило массивное поступление БРП - амплшуца представленных кривых значительно выше, угол подъема близок к прямому.

Полученные результаты иллюстрируют существенное повышение интенсивности процессов БТ при перитоните под влиянием релапаротомии и манипуляций на кишечнике. При этом более 95 % транслоцированных из полости кишечника меченых бактерий поступают в кровоток на протяжении 20-30 мин. после повторной операции. Однотипное изменение активности в проекциях печени и сердца подтверждает исключительно энгерогепатический маршрут транслокации бактерий. Несостоятельность печеночного барьера в этой ситуации закономерно приводит к развитию системной бактериемии с последующей быстрой (в течение 3 часов) и неотвратимой гибелью животного.

В седьмой главе проанализированы результаты исследования характера структурного повреждения печени у аспленизированных животных посредством морфологического исследования (в динамике эксперимента до 7 сут.) и роли БТ в раннем послеоперационном периоде после спленэктомии с использованием метода бактериальной сцинтиграфии.

Морфологическая характеристика состояния печеночного

барьера в условиях аспленизации

Морфологическая картина печени аспленизированных животных подтверждала наличие грубых изменений в ее структуре: очаги коагуляциопного некроза, лейкоцитарная инфильтрация зон некрозов и портальных трактов, загруженность Купферовских клеток гранулами гемосидерина. Морфометрическое исследование показало снижение количества гепатоцитов и увеличение непаренхиматозных клеток в 2 раза, а клеток Купфера с эритрофагоцитозом - до 12 клеток при нулевой норме. Выявленные изменения в печени несовместимы с нормальной функцией поврежденного органа. Кроме того, активация маркеров цитолиза свидетельствует о воспалительном генезе печеночной недостаточности при аспленизации животных. Морфологические изменения печени свидетельствовали о развитии гипоспленизма, что подтверждало соответствие моделируемой патологии.

Оценка параметров бактериальной транслокации в условиях

индуцированного гипоспленизма

При исследовании БТ в условиях индуцированного гипосленизма введение БРП и сканирование начинали через 6 сут. после ложной операции и аспленизации, соответственно.

У ложнооперированных животных на суммационной сцинтиграмме, полученной за 4 часа динамического исследования (рис. 10а) определялся только один очаг

радиоактивности в области введения БРП, т.е. кишечник (1). Экстраинтестинальных очагов накопления БРП не выявлялось, что говорит об отсутствии БТ из просвета тонкой кишки. Это подтверждает и статическая сцинтиграфия выполненная после эвтаназии животного и экстирпации кишечника с введенным БРП (рис. 10Ь), где очагов накопления БРП не регистрировалось. Анализ кривой «активность - время» с области введения БРП (рис. Юс), показывал снижение радиоактивности только за счет распада технеция-99т. Полученные данные сопоставимы с результатами, представленными в главе 4 и полученными при исследовании БТ у здоровых животных.

Рис. 10. Сцинтиграфическое исследование БТ меченой кишечной палочки у крыс на 6-е сутки после ложной операции (контроль) методом бактериальной сцинтиграфии. а - суммационная сцинтиграмма за 4 часа динамического исследования с указанными областями интереса: 1 - кишечник (место введения БРП); Ь - статическая сцинтиграмма после эвтаназии животного и экстирпации кишечника: экстраинтестинальных очагов накопления БРП не зарегистрировано. с - кривая «активность - время» с области кишечника: 1 - снижение количества импульсов происходит только за счет убывания активности радионуклида технеция-99т вследствие радиоактивного распада.

У аспленизированных животных зона максимальной радиоактивности оставалась в проекции кишечника, но наряду с этим при визуальной оценке регистрировалось распространение БРП с накоплением его в проекции печени (рис. 11а). Кривая «активность - время» с области введения БРП (рис. 11с) характеризовалась снижением числа импульсов с большей скоростью, чем просто при распаде технеция-99т. Анализ статической сцинтиграммы (рис. 11Ь), выполненной после эвтаназии животного и экстирпации кишечника, отчетливо подтвердил накопление меченых бактерий в области печени, кроме того, регистрировалось накопление БРП в проекции почек и мочевого пузыря.

ИТ в данной группе наблюдений на протяжении 4-часового исследования составил 2,1 % (1,8-2,2).

Полученные результаты свидетельствуют о том, что в случае несостоятельности кишечного и печеночного барьеров для кишечной палочки процесс транслокации меченых бактерий по портальной системе кровообращения не ограничивается накоплением меченых бактерий в печени, и те бактериальные клетки, которые миновали указанные барьеры, выводятся из системного кровотока органами мочевыделитель-ной системы. Полученные данные свидетельствует также о развитии у подопытных

а Ь

-

животных системной бактериемии. Таким образом, БТ можно рассматривать в качестве источника бактериальной эндотоксинемии у аспленизированных крыс. В совокупности с результатами морфологического исследования печени, позволившего установить локализацию некротически-воспалительных процессов преимущественно в зоне портальных трактов, и результатами, ранее полученными в нашем центре (Аюшинова Н.И., 2001; Прокопьев М.В., 2001; Апарцин К.А., 2001-2007; Лепехо-ва СЛ., 2010), можно утверждать, что в патогенезе воспалительного повреждения печени в условиях аспленизации одним из механизмов повреждения является БТ микрофлоры в систему воротной вены и далее в системный кровоток.

Рис. 11. Сцинтиграфическое исследование БТ меченой кишечной папочки у крыс на 6-е сутки после спленэктомии методом бактериальной сцинтиграфии. а - суммационная оцинтиграмма за 4 часа динамического исследования с указанными областями интереса:

1 - кишечник (место введения БРП);

2 - печень. Ь - статическая сцинти-грамма после эвтаназии животного и экстирпации кишечника: 1 - печень, 2 - почки, 3 - мочевой пузырь, с - кривая «активность - время» с области кишечника: снижение количества импульсов происходит не только за счет убывания активности радионуклида технеция-99т вследствие радиоактивного распада, но и за счет поступления меченых бактерий за пределы кишечной трубки.

В восьмой главе изложены результаты радионуклидного исследования и определению количественных параметров БТ при странгуляционной непроходимости кишечника с применением метода бактериальной сцинтиграфии, представляющий собой сочетание динамической сцинтиграфии с последующим визуальным контролем параметров БТ с помощью статической сцинтиграфии. Морфологическая характеристика странгуляционной непроходимости кишечника

Странгуляционную непроходимость кишечника моделировали путем полной перевязки 10 см подвздошной кишки с мезентериальными сосудами в виде петли. Во время аутопсии по окончании 4-часовой ДС наблюдали мутный геморрагический экссудат в брюшной полости небольшое количество желеобразного фибрина преимущественно в области ущемленной петли тонкой кишки. Патоморфологиче-ское исследование ущемленной петли тонкой кишки во всех случаях подтверждало некроз и деструкцию структур кишечной стенки. В отделе тонкой кишки прокси-мальнее уровня странгуляции на фоне сохраненных структур кишечной стенки регистрировали истончение мышечного слоя, выраженное уменьшение высоты

ворсин. С поверхности части ворсин отмечалось слущивание эпителия. Указанные изменения являются признаком дилатации кишечной стенки. В отводящем отделе тонкой кишки наблюдалась полная сохранность структур кишечной стенки. В исследованных тканях пристеночной брюшины, месте прилегания ущемленной петли тонкой кишки выявлено наличие лейкоцитарной инфильтрации, лейкоциты определялись в строме вокруг сосудов, среди мышечных волокон. При иммерсионной микроскопии определялись макрофаги с фагоцитированными бактериями. Патоморфологическая картина соответствовала лейкоцитарному перитониту.

Таким образом, исследование БТ проведено нами при морфологической картине характерной для непроходимости тонкой кишки с нарушением кровоснабжения участка тонкой кишки. Обратимся к результатам в этой части.

Оценка параметров бактериальной транслокации

при странгуляционной непроходимости кишечника

При исследовании БТ из ущемленного отдела тонкой кишки на динамической сцинтиграмме (рис. 12а) визуализировали характерное распределение БРП при странгуляционной непроходимости кишечника. Максимальный очаг радиоактивности был зарегистрирован в области кишечника (место введения БРП). Очаги накопления радиоактивности, свидетельствующие о накоплении бактерий, визуализировались также в проекции печени, сердца, мягких тканей, почек.

Мочевой пузырь на сцинтиграмме экранировался тонкой кишкой с введенным БРП. Кривая «активность - время» с области кишечника характеризовалась убыванием сцинтилляционного счета с большей скоростью, чем распад технеция-99ш (рис. 12с), а кривые с области сердца (рис. 12(1) и области печени (рис. 12е), напротив, демонстрировали накопление радиоактивности на протяжении всего исследования.

На протяжении 4-часового исследования ИТ составил 12,7 % (9,3-15,3). При анализе динамики ИТ установлено, что увеличение темпов проникновения бактерий в системный кровоток происходит после 20-40 минуты от начала моделирования патологии.

На статической сцинтиграмме (рис. 12Ь), выполненной после эвтаназии животного и экстирпации кишечника с введенным БРП, подтверждалось накопление меченых бактерий в печени, сердце, почках, мочевом пузыре, мягких тканях. Кроме того, на статической сцинтиграмме отмечалось накопление меченых бактерий в париетальной брюшине в месте прилегания ущемленной петли тонкой кишки. Во всех наблюдениях меченые бактерии были зафиксированы и в экссудате брюшной полости.

При оценке БТ из приводящего отдела к ущемленной петле тонкой кишки на динамической сцинтиграмме (рис. 13а) максимальный очаг радиоактивности регистрировали в области кишечника (место введения БРП). Кроме того, очаги накопления радиоактивности, свидетельствующие о накоплении бактерий, были отмечены в проекции печени, сердца, почек. Мочевой пузырь на сцинтиграмме экранировался тонкой кишкой с введенным БРП. Кривая «активность - время» с области кишечника характеризовалась убыванием сцинтилляционного счета с большей скоростью, чем распад технеция-99ш (рис. 13с), а кривая с области печени (рис. 13(1), напротив, свидетельствовала о его накоплении на протяжении всего исследования.

Рис. 12. Сцинтиграфическое исследование БТ из ущемленного отдела тонкой кишки при странгуляционной непроходимости кишечника методом бактериальной сцинтиграфии у крыс: а - суммационная сцинтиграмма за 4 часа динамического исследования с указанными областями интереса: 1 - ки-шечник(место введения БРП); 2 - печень; 3 - сердце; 4 - мягкие ткани; 5 - почки. Ь - статическая сцинтиграмма после эвтаназии животного и экстирпации кишечника: 1 - сердце; 2 - печень; 3 -почки; 4 - мочевой пузырь; 5 - мягкие ткани; 6 - париетальная брюшина (место прилегания ущемленной петли тонкой кишки с введенным БРП). с - кривая «активность - время» с области кишечника: снижение количества импульсов происходит не только за счет убывания активности радионуклида технеция-99т вследствие радиоактивного распада, но и вследствие поступления меченых бактерий за пределы кишечной трубки. «1 - кривая «активность - время» с области сердца: на первых минутах исследования кривая приближена к нулевой отметке, затем происходит монотонное нарастание количества импульсов в результате процесса поступления меченых бактерий в системный кровоток, е - кривая «активность - время» с области печени: на первых минутах исследования кривая приближена к нулевой отметке, затем происходит монотонное нарастание количества импульсов в результате попадания меченых бактерий в печень, в дальнейшем переход кривой на плато, что свидетельствует о равновесии процессов поступления и выведения меченых бактерий.

ИТ на протяжении 4-часового исследования составил 3,6 % (2,3-3,8).

На статической сцинтиграмме (рис. 13Ь), выполненной после эвтаназии животного и экстирпации кишечника с введенным БРП, подтверждалось накопление меченых бактерий в печени, почках, минимально в области сердца и мягких тканей. Кроме того, на статической сцинтиграмме регистрировалось наличие меченых бактерий в мочевом пузыре, который во время динамической сцинтиграфии экранировался кишкой с введенным БРП. Во всех наблюдениях этой группы меченые бактерии в экссудате брюшной полости не регистрировались, в то время как при бактериологическом исследовании кишечная палочка была выделена из перитонеального экссудата, крови и внутренних органов, что можно объяснить транслокацией бактерий из ущемленного отдела кишечника.

Рис. 13. Сцинтиграфическое исследование БТ из приводящего отдела тонкой кишки при странгуляционной непроходимости кишечника у крыс методом бактериальной сцинтиграфии. а - суммационная сцинтиграмма за 4 часа динамического исследования с указанными областями интереса:

1 - кишечник (место введения БРП);

2 - печень; 3 - сердце; 4 - почки, b - статическая сцинтиграмма после эвтаназии животного и экстирпации кишечника: 1 - печень; 2 - сердце; 3 -почки; 4 - мочевой пузырь, с - кривая «активность - время» с области кишечника: снижение количества импульсов происходит не только за счет убывания активности радионуклида технеция-99т вследствие радиоактивного распада, но и за счет поступления меченых бактерий за пределы кишечной трубки, d - кривая «активность - время» с области печени: нарастание количества импульсов в результате поступления меченых бактерий в печень.

При сопоставительном анализе установили, что темп БТ находился в положительной корреляционной зависимости от степени морфологических изменений слизистой тонкой кишки.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о перемещении Е. coli из ущемленного отдела тонкой кишки через кишечный барьер в брюшную полость уже с первых минут после развития странгуляционной непроходимости кишечника. Системная бактериемия при этом формируется, минуя портальную систему кровообращения. Накопление меченой Е. coli в почках указывает на то, что мочевыделительная система, наряду с печенью, служит при странгуляционной непроходимости кишечника защитным барьером, работа которого в условиях системной бактериемии направлена на изоляцию и выведение бактерий, находящихся в циркулирующей крови. Вместе с этим микрофлора из приводящего отдела ущемленной петли тонкой кишки приводит к формированию портальной бактериемии, которая в эти сроки заболевания ограничивается, большей частью, печеночным барьером. Миновавшие печеночный барьер бактерии задерживаются и выводятся органами мочевыделительной системы.

Сравнительный анализ темпов поступления меченых бактерий из просвета кишечной трубки продемонстрировал, что БТ из просвета тонкой кишки, выше уровня странгуляции, значимо ниже (р = 0,0003), чем из просвета ущемленной петли тонкой кишки (рис. 14).

Учитывая полученные результаты, следует сказать, что источником развития бактериемии при странгуляционной непроходимости тонкой кишки является как микрофлора ущемленной петли тонкой кишки, так и микрофлора тонкой кишки

выше уровня странгуляции, при этом микрофлора ущемленного отдела тонкой кишки становится основным источником развития системной бактериемии.

Рис. 14. Сравнительная оценка темпов БТ меченой кишечной палочки из ущемленного и приводящего отделов тонкой кишки при странгуляционной непроходимости кишечника за период 0-4 часа от момента индукции заболевания (медиана, нижний и верхний квартили).

В девятой главе представлены результаты радионуклидного исследования и определения количественных параметров БТ из кишечной трубки при обтурационной непроходимости кишечника с использованием метода бактериальной сцинтиграфии, подразумевающего выполнение динамической сцинтиграфии с последующим контролем параметров БТ с помощью статической сцинтиграфии.

Морфологическая характеристика обтурационной

непроходимости кишечника

Выбранная модель обтурационной непроходимости кишечника, подразумевающая перевязку и пересечение подвздошной кишки, наиболее полно обеспечивала выполнение условий эксперимента и его воспроизводимость. Во время аутопсии по окончании 4-часовой ДС регистрировали эктазию кишечных петель, небольшое количество мутного экссудата в брюшинной полости, степень выраженности указанных нарушений была прямо пропорциональна сроку заболевания. При патоморфологическом исследовании приводящей петли тонкой кишки в сроки до 24 часов во всех случаях на фоне сохраненных структур кишечной стенки регистрировали истончение мышечного слоя, выраженное уменьшение высоты ворсин. В отводящем отделе тонкой кишки наблюдалась полная сохранность структур кишечной стенки. В поздние сроки (36 часов) в приводящем отделе регистрировали более выраженное истончение мышечного слоя, значительное уменьшение высоты ворсин с разрушением их поверхностного отдела, расширение крипт. В отводящем отделе в эти сроки слои стенки тонкой кишки сохранены, крипты расширены. Морфологическая картина подтверждала наличие механической непроходимости тонкой кишки без нарушения мезентериального кровотока.

Таким образом, исследование БТ проведено нами в условиях морфологической картины механической обтурационной непроходимости кишечника. Обратимся к результатам в этой части.

Оценка параметров бактериальной транслокации

при обтурационной непроходимости кишечника

В ходе оценки БТ при 12-часовой обтурационной непроходимости кишечника на суммационной сцинтиграмме, полученной за 4 часа динамического исследования (рис. 15а) определялся только один очаг радиоактивности в области введения БРП,

Время, ч

т.е. кишечник (1). Экстраинтестинальных очагов накопления БРП не было выявлено, что говорило об отсутствии БТ из просвета тонкой кишки. Это подтверждало и отсутствие очагов накопления БРП по результатам статической сцинтиграфии, выполненной после эвтаназии животного и экстирпации кишечника с введенным БРП (рис. 15Ь). Анализ кривой «активность - время» с области введения БРП (рис. 15с), показывал снижение радиоактивности только за счет распада технеция-99т.

Рис. 15. Сцинтиграфическое исследование БТ меченой кишечной палочки, введенной в тонкую кишку через 12 часов после моделирования обтурацион-ной непроходимости кишечника у крыс методом бактериальной сцинтиграфии: а - суммационная сцинтиграмма за 4 часа динамического исследования с указанной областью интереса: 1 - кишечник (место введения БРП). Ь - статическая сцинтиграмма после эвтаназии животного и экстирпации кишечника: экстраинтестинальных очагов накопления БРП не зарегистрировано, с - кривая «активность - время» с области кишечника: снижение количества импульсов на протяжении всего исследования происходит только за счет радиоактивного распада радионуклида технеция-99т. БТ нет.

Полученные данные свидетельствуют об отсутствии транслокации энтеропатогенной кишечной палочки при 12-часовой непроходимости кишечника.

В ходе оценки БТ при 24-часовой обтурационной непроходимости кишечника на динамической сцинтиграмме (рис. 16а) определялся только один очаг радиоактивности - кишечник с введенным в его просвет БРП (1). Экстраинтестинальных очагов не выявлялось. Полученные результаты указывают на отсутствие транслокации бактерий через кишечную стенку во время проведения динамической сцинтиграфии. При проведении статической сцинтиграфии после эвтаназии животного и экстирпации кишечника с введенным БРП (рис. 16Ь), регистрировали накопление БРП в проекции печени, что свидетельствовало о транслокации меченых бактерий по портальной системе в печень. Количественный анализ кривой «активность - время» с области введения БРП (рис. 16с), показывал снижение сцинтилляционного счета со скоростью, превосходящей таковую при распаде технеция-99т.

Во всех наблюдениях меченые бактерии в экссудате брюшной полости не были обнаружены. Это связано, скорее всего, с тем, что, транслокация меченых бактерий из просвета тонкой кишки происходила в систему портального кровообращения. Попадая в портальный кровоток, меченые бактерии задерживались в печени, что свидетельствовало о состоятельности печеночного барьера в отношении бактерий.

Рис. 16. Сцинтиграфическое исследование БТ при 24-часовой обту-рационной непроходимости кишечника у крыс методом бактериальной сцинтиграфии: а - суммационная сцинтиграмма за 4 часа динамического исследования (24-28-й час течения заболевания) с указанными областями интереса: 1 - кишечник (место введения БРП). Ь - статическая сцинтиграмма после эвтаназии животного и экстирпации кишечника: 1 - накопление меченых бактерий в области печени, с - кривая «активность - время» с области кишечника: снижение количества импульсов происходит нетолько за счет убывания активности радионуклида технеция-99т вследствие радиоактивного распада, но и за счет поступления меченых бактерий за пределы кишечной трубки. Транслокация бактерий происходит по портальной системе с задержкой меченых бактерий в печени.

ИТ на протяжении 4-часового исследования (24—28 часов от момента индукции заболевания) составил 2,0 % (0,7-4,3).

В ходе исследования БТ при обтурационной непроходимости кишечника в более поздние сроки (36 часов) зона максимальной радиоактивности оставалась в проекции кишечника. Наряду с этим регистрировалось распространение БРП с накоплением его в проекции печени (рис. 17а). Кривая «активность - время» с области введения БРП (рис. 17с) снижалась со скоростью, превышающей физический распад технеция-99т, а кривая «активность - время» с проекции печени одновременно нарастала (рис. 17(1). Меченые бактерии в экссудате брюшной полости зарегистрированы не были. Данные показывают, что при обтурационной непроходимости кишечника происходит транслокация меченых бактерий по портальной системе кровообращения с накоплением их в печени. Анализ статической сцинтиграммы (рис. 17Ь), выполненной после эвтаназии животного и экстирпации кишечника, подтвердил накопление меченых бактерий в области печени, кроме этого регистрировалось накопление меченых бактерий в проекции почек, мочевого пузыря и мягких тканей. Полученные данные свидетельствует о несостоятельности печеночного барьера для кишечной палочки, развитии системной бактериемии и экскреции бактерий из системного кровотока органами мочевыделительной системы.

ИТ на протяжении 4-часового исследования составил 11,6 % (6,0-13,7). Сравнительный анализ ИТ продемонстрировал, что при 36-часовой обтурационной непроходимости тонкой кишки ИТ был значимо выше, чем при 24-часовой; (р = 0,0003) (рис. 18).

3 /Ь,. . . ■

i —,л ".. 2

> , ЩГ: ■-".'А . •

Tim» Activity Curves

Рис. 17. Сцинтиграфическое исследование БТ при 36-часовой обтурацион-ной непроходимости кишечника у крыс методом бактериальной сцинтиграфии: а - суммационная сцинтиграмма за 4 часа динамического исследования (36-40-й часы течения заболевания) с указанными областями интереса: 1 - кишечник (место введения БРП); 2 -печень. Ь - статическая сцинтиграмма после эвтаназии животного и экстирпации кишечника: 1 - печень; 2 - почки; 3 - мочевой пузырь; 4 - мягкие ткани, с - кривая «активность - время» с области кишечника: снижение количества импульсов происходит не только за счет убывания активности радионуклида технеция-99т вследствие радиоактивного распада, но и за счет поступления меченых бактерий за пределы кишечной трубки, с) - кривая «активность -время» с области печени: нарастание сцинтилляционного счета в результате поступления меченых бактерий.

Через 12 часов от начала моделирования патологии во всех наблюдениях роста бактерий не обнаружено. При 24-часовой обтурационной непроходимости кишечника в 6 из 10 наблюдениях роста бактерий во внутренних органах и в крови не обнаружено. В 4 наблюдениях бактериологически установлена портальная бактериемия и рост бактерий при посеве брыжеечных лимфатических узлов. Полученные данные в этой группе свидетельствуют о транслокации энтеропатогенной кишечной палочки из просвета тонкой кишки при 24-часовой обтурационной непроходимости кишечника. При этом печеночный барьер состоятелен и меченые бактерии задерживаются в печени. При 36-часовой обтурационной непроходимости тонкой кишки при бактериологическом исследовании внутренних органов в ряде случаев регистрировали признаки как портальной, так и системной бактериемии.

1 ¡[Ниш

1 i! j i i. П1

xA^hlOJ ёж

Рис. 18. Сравнительная оценка темпов БТ меченой кишечной палочки при обтурационной непроходимости тонкой кишки за периоды 24-28 и 36-40 часов от момента индукции заболевания (медиана, нижний и верхний квартили).

Интенсивность БТ при обтурационной непроходимости тонкой кишки, так же, как и при странгуляционной, находилась в прямой корреляции со степенью морфологических изменений слизистой тонкой кишки.

Таким образом, в терминальной стадии обтурационной непроходимости кишечника кишечная микрофлора является причиной портальной и системной бактериемии, в этих условиях печень максимально реализует свою барьерную функцию. Бактерии, которые преодолели печеночный барьер, выводятся из системного кровотока мочевыделительной системой. Полученные данные позволили нам рассматривать БТ в качестве источника бактериальной эндотоксинемии при обтурационной непроходимости тонкой кишки.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В представленной работе продемонстрированы возможности метода бактериальной сцинтиграфии в качественной и количественной оценке процесса распространения бактерий в динамике развития различной патологии. Данный метод может быть использован применительно к моделям различных патологических процессов - объектам пристального внимания клиницистов.

Применение стандартных радионуклидных методов исследования в выявлении косвенных признаков БТ на примере гепатобилисцинтиграфии, в наших исследованиях продемонстрировало, что полученные данные с наибольшей вероятностью свидетельствуют о наличии хронического внутрипеченочного и внутрипузырного «мягкого» холестаза, который, в свою очередь, может быть связан с развитием БТ. Тем не менее, представленные данные в большей степени характеризуют именно холестатические изменения в гепатобилиарной системе. Предположение о том, что они косвенным образом могут характеризовать и процессы БТ, а, следовательно, и аргументы в пользу патогенетической роли последней в развитии поражений гепатобилиарной системы, остаются достаточно умозрительными. Таким образом, после выполнения клинического блока исследований вопрос о создании радионуклидного метода, позволяющего выявлять прямые признаки БТ, а именно - слежение за перемещением меченых бактерий в режиме реального времени, остался открытым. Достижение поставленной цели могло быть реализовано только в условиях эксперимента.

В результате серии экспериментов in vitro нами разработан способ получения БРП с высокой радиохимической чистотой, когда активность связанного радионуклида определяется в сочетании с отсутствием в его составе несвязанного радионуклида. Предложенная технология получения такого БРП позволяет контролировать его объем в процессе приготовления и получать взвесь меченных технецием-99ш бактерий в объеме не более 1 мл, что идеально подходит для введения в кишечник как крупным, так и мелким лабораторным животным. Вмешательство в процесс переноса и осаждения технеция-99ш внутри бактериальной клетки посредством реагента «Пирфотех-99гаТс» не повлияло на жизнеспособность и свойства бактерий, что было подтверждено результатами бактериологического исследования. Сочетание описанных свойств БРП для решения поставленных в работе задач, позволяют проанализировать дальнейшие эксперименты в этой области.

Применение метода бактериальной сцинтиграфии на модели абдоминального сепсиса инициированного распространенным гнойным перитонитом, асплениза-цией и механической кишечной непроходимостью, позволило определить новые закономерности формирования бактериального эндотоксикоза. Именно метод бактериальной сцинтиграфии позволил определить новые механизмы развития эндотоксикоза, поскольку остальные методы (бактериологические, патоморфоло-гические и др.) носят лишь вспомогательных характер и могут выступать лишь в качестве референтных методов исследования.

Полученные результаты позволяют нам сформулировать общие представления о патогенетической роли транслокации кишечной микрофлоры из просвета тонкой кишки при острой абдоминальной патологии (перитонит, спленэктомия, кишечная непроходимость). У разных видов лабораторных животных класса млекопитающих при нарушении проницаемости кишечного барьера для бактериальных клеток мы наблюдали активацию первоначально печеночного барьера, а впоследствии, выведение бактерий, миновавших печеночных барьер, органами мочевыделительной системы. Таким образом, печеночно-почечный механизм реализует противодействие формирующейся портальной и системной бактериемии. Органы этих систем одни из первых встречаются с разрушительным воздействием бактериальных клеток попавших в кровоток, вследствие чего, при рассмотрении методов лечения необходимо более внимательно акцентировать внимание на профилактике и коррекции печеночной и почечной недостаточности.

ВЫВОДЫ

1. Косвенные признаки БТ у больных с воспалительными процессами в гепатодуоденальной области, выявляемые в процессе гепатобилисцинтиграфии (нарушения поглотительно-выделительной функции гепатоцитов и накопительно-эвакуаторной функции желчного пузыря), носят неспецифический характер.

2. Предлагаемая технология маркировки бактерий Е, coli технецием-99ш позволяет получить БРП без потери жизнеспособности и активности использованных микроорганизмов. Произведенный индикатор предназначен для сцинтиграфической визуализации процессов распространения бактерий в организме при абдоминальной патологии.

3. Разработанный метод бактериальной сцинтиграфии с алгоритмом обработки результатов, включающим в себя визуальную оценку распространения меченых радионуклидом бактерий, построение кривых «активность - время» и расчет индекса транслокации/резорбции, в совокупности дают возможность не только качественно анализировать полученные данные, но и производить количественную оценку процессов микробной миграции.

4. Доминирующим источником поступления Е. coli в системную циркуляцию на ранних (0-6 часов) стадиях перитонита является полость брюшины, на что указывает высокий (59,2 % (58,4-63,3)) сцинтиграфический индекс транслокации/резорбции БРП. При этом микроорганизмы, поступающие в портальный кровоток из полости кишечника, эффективно задерживаются печеночным фильтром, в связи с чем, именно в области печени регистрируется максимальный уровень накопления радиоактивности.

5. В терминальной стадии экспериментального перитонита (6-12 часов) происходит смена приоритетов источников бактериальной токсинемии за счет резкого снижения ПР (ИР - 10,9 % (9,3-14,7)) и сохранения на прежнем уровне транслокации Е. coli из полости кишечника (ИР - 35 % (30,9-36,4)) с развитием несостоятельности печеночного барьера, сцинтиграфическими признаками чего являются снижение интенсивности накопления радиоактивности в печени и появление ее в мягких тканях.

6. Операционная травма во время релапаротомии с манипуляциями на кишечнике в условиях распространенного гнойного перитонита вызывает активацию процессов проникновения бактерий в кровоток из просвета кишечной трубки, а также их распространение в органах и тканях, о чем свидетельствует резкое убывание сцинтилляци-онного счета при построении кривой «активность - время» с области кишечника, в то время как кривые с области сердца и печени, напротив, демонстрируют массивное поступление меченой радионуклидом кишечной палочки в эти органы с током крови.

7. При использовании разработанного метода визуализации было зафиксировано, что при формировании постспленэктомического гипоспленизма происходит транслокация кишечной микрофлоры в портальный, а затем и в системный кровоток с развитием бактериемии, что подтверждало появление очагов радиоактивности в области печени, почек и мочевого пузыря.

8. Бактериальная сцинтиграфия позволяет выявить патогенетические закономерности развития бактериемии при странгуляционной кишечной непроходимости, связанные с особенностями транслокации Е. coli из просвета ущемленного отдела тонкой кишки в брюшную полость с последующей резорбцией в системный кровоток, а из приводящего отдела тонкой кишки - в портальную систему. Об этом свидетельствуют сцинтиграммы, на которых было зафиксировано характерное распределение БРП - появление очагов радиоактивности в месте прилегания ущемленной петли кишечника к париетальной брюшине, затем в проекции печени, сердца, мягких тканей, почек и мочевого пузыря. При этом микрофлора ущемленной петли тонкой кишки (ИТ-12,7 % (9,3-15,3)) становится основным, по отношению к приводящему отделу (ИТ - 3,6 % (2,3-3,8)) источником развития системной бактериемии.

9. Результаты бактериальной сцинтиграфии свидетельствуют о том, что на ранних (12-16 часов) сроках развития обтурационной тонкокишечной непроходимости активации механизмов БТ не происходит, поскольку экстраинтестинальных очагов радиоакгав-ности зарегистрировано не было. Закономерности перемещения бактерий из кишечной трубки в терминальной стад ии об1урационной тонкокишечной непроходимости сводятся к развитию портальной бактериемии (24-28 часов) - регистрация очагов радиоактивности в области печени; а затем и системной бактериемии (36-40 часов), ассоциированной с несостоятельностью печеночного барьера для Е. coli. - очаги радиоактивности в проекции печени, почек, мочевого пузыря и ее наличие в мягких тканях.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для сцинтиграфического изучения закономерностей развития БТ целесообразно использовать БРП на основе меченной технецием-99т Е. coli.

2. Лечебную тактику у пациентов с бактериемией абдоминального происхождения следует выбирать с учетом особенностей сцинтиграфической картины развития эндогенной интоксикации.

В раннем периоде развития патологического процесса визуализируется массивное поступление БРП в мягкие ткани с минимальным поступлением последнего в печень, почки, мочевой пузырь - это свидетельствует о том, что наиболее значимым источником бактериальной токсинемии является всасывание патогенного материала из полости брюшины.

В дальнейшем, по мере прогрессирования бактериемии на сцинтиграммах регистрируются очаги аккумуляции радиоактивного индикатора в печени, сердце, минимально в мягких тканях, что является показателем миграции меченых бактерий из просвета кишечной трубки в портальный кровоток и системную циркуляцию.

3. Манипуляции на кишечной трубке у больных перитонитом должны быть максимально щадящими в связи с возможностью развития инфекционно-токсического шока, обусловленного массивным поступлением микроорганизмов на системный уровень за счет БТ.

4. Профилактика постспленэктомических осложнений в раннем послеоперационном периоде должна включать антибактериальные компоненты, а также мероприятия, направленные на профилактику и коррекцию печеночной и почечной недостаточности.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в журналах

1. Галеев Ю.М. Закономерности развития бактериальной транслокации при остром прекращении магистрального кровотока в бассейне краниальных брыжеечных сосудов [текст] / Кувшинов А.Г., Ильичева Е.А., Рой Т.А., Максиков Д.И., Лепехова С.А., Коваль Е.В., Фадеева Т.В., Галеев Ю.М. и др. // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. - 2003. -№5.-С. 155-159.

2. Галеев Ю.М. Особенности функциональных изменений гепатобилиарной системы у больных с заболеваниями желчевыводящих путей [текст] /Козлова Н.М., Галеев Ю.М., Попов М.В. и др. // Сибирский медицинский журнал. - 2005. - Т. 52., № 3. - С. 53-56.

3. Галеев Ю.М. Роль резорбтивной функции брюшины в развитии бактериемии при перитоните и странгуляционной непроходимости кишечника [текст] / Галеев Ю.М., Попов М.В., Салато О.В. и др. // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. - 2006. - № 5. - С. 219-223.

4. Галеев Ю.М. Взаимосвязь функциональных показателей печени и желчного пузыря при билиарной патологии [текст] / Козлова Н.М., Тюрюмин Я.Л., Тюрюмина Е.Э., Галеев Ю.М. и др. // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. - 2006. - № 6. - С. 51-55.

5. Галеев Ю.М. Сравнительная характеристика функциональных изменений гепатобилиарной системы у больных с заболеваниями желчевыводящих путей по данным ультрасонографии и гепатобилисцинтиграфии [текст] / Козлова Н.М., Тюрюмин Я.Л., Тюрюмина Е.Э., Галеев Ю.М. и др. // Сибирский медицинский журнал. - 2006. - Т. 66., № 8. - С. 55-59.

6. Галеев Ю.М. Маркировка бактерий Escherichia coli технецием-99т для сцинтиграфической оценки бактериальной транслокации в эксперименте [текст] / Галеев Ю.М.,

Попов М.В., Салато O.B. и др. // Медицинская радиология и радиационная безопасность. - 2007. - Т. 52, № 2. - С. 23-30.

7. Галеев Ю.М. Морфофункциональная оценка тонкой кишки при механической непроходимости кишечника [текст] / Галеев Ю.М., Лишманов Ю.Б., Анарпин К.А. и др. // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. - 2008. -Т. 18, №5.-С. 45-53.

8. Галеев Ю.М. Воспалительное повреждение печени в раннем послеоперационном периоде на фоне аспленизации животных [текст] / Лепехова С.А., Апарцин К.А., Гольдберг O.A., Галеев Ю.М. и др. // Вестник Бурятской Государственной сельскохозяйственной академии им. В.Р. Филиппова. - 2009. - № 1. - С. 6-11.

9. Галеев Ю.М. Патофизиологические механизмы бактериального эндотоксикоза при распространенном перитоните [текст] / Григорьев Е.Г., Лишманов Ю.Б., Галеев Ю.М. и др. // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. - 2009. - № 2. - С. 33-36.

10. Галеев Ю.М. Бактериальная транслокация при релапаротомии в условиях распространенного перитонита [текст] / Апарцин К.А., Лишманов Ю.Б., Галеев Ю.М. и др. // Бюллетень СО РАМН. - 2009. - № 2. - С. 95-99.

11. Galeev Yu.M. Scintigraphic visualization of bacterial translocation in experimental strangulated intestinal obstruction [text] / Galeev Yu.M., Lishmanov Yu.B., Grigorev E.G. ct al. // Eur J Nucl Med Mol Imaging. - 2009. - Vol. 36, № 11. - P. 1822-1828.

12. Галеев Ю.М. Исследование закономерностей бактериальной транслокации при распространенном перитоните с применением меченной радионуклидом кишечной палочки [текст] / Григорьев Е.Г., Галеев Ю.М., Попов М.В. // Вестник хирургии им. И.И. Грекова. - 2010. - № 1. - С. 25-32.

13. Галеев Ю.М. Патофизиологические механизмы бактериального эндотоксикоза при странгуляционной кишечной непроходимости [текст] / Салато О.В., Попов М.В., Галеев Ю.М. // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. - 2010. - № 5. - С. 192-196.

14. Галеев Ю.М. Методы исследования распространения бактериальных клеток [текст] / Галеев Ю.М., Попов М.В., Салато О.В. // Сибирский медицинский журнал. -2011. -№ 3. - С. 18-23.

Патенты

1. Способ приготовления бактериального радиофармпрепарата [текст]: Пат. 2255748 Рос. Федерация: МПК7 А 61 К 35/74,51/00 / А.Г. Кувшинов, Е.А. Ильичева, С.А. Лепехова, А.Ю. Шамеев, Е.В. Коваль, Т.В. Фадеева, Д.И. Максиков, Ю.М. Галеев, М.В. Попов (Рос. Федерация). Заявлено 26.05.03; Опубл. 10.07.05, Бюл. № 19.

2. Способ оценки бактериемии перитонеального происхождения в эксперименте [текст]: Пат. 2275859 Рос. Федерация: МПК7 А 61 В 6/00 / Ю.М. Галеев, М.В. Попов, О.В. Салато, К.А. Апарцин, Е.В. Коваль (Рос. Федерация). Заявлено 09.12.04; Опубл. 10.05.06, Бюл. № 13.

3. Способ радионуклидной маркировки бактерий кишечной палочки для сцинтиграфи-ческих исследований [текст]: Пэт. 2290643 Рос. Федерация: МПК7 G 01N 33/60; G 12 N 1/20 / О.В. Салато, Ю.М. Галеев, М.В. Попов, Е.В. Коваль, С.А. Лепехова, Т.В. Фадеева (Рос. Федерация). Заявлено 12.07.05; Опубл. 27.12.06, Бюл. № 36.

Монографии (в соавторстве)

1. Галеев Ю.М. Спленэкгомия и бактериальная транслокация [текст] / Галеев Ю.М., Апарцин К.А., Прокопьев М.В. // Органосохраняющая хирургия селезенки / Иод ред. Е.Г. Григорьева, К.А. Апарцина. - Новосибирск: Наука, 2001.-С. 140-154.

2. Галеев Ю.М. Роль бактериальной транслокации в патогенезе язвенно-некрсггического энтероколита [текст] / Григорьев Е.Г., Апарцин К.А., Галеев Ю.М. // Язвенно-некротический энтероколит у новорожденных / Под ред. В.В. Подкаменева, Е.Г. Григорьева. - М.: ОАО «Издательство «Медицина»; Иркутск: НЦРВХ СО РАМН, 2010. - С. 112-155.

Материалы конференций

1: Галеев Ю.М. Барьеры бактериальной транслокации патогенной микрофлоры в условиях перитонита [текст] / Галеев Ю.М., Лепехова С.А., Коваль Е.В., Апарцин К.А. И Бюлл. ВСНЦ СО РАМН. - 2001. - Т. 2, № 3 (17). - С. 104.

2. Галеев Ю.М. Сцинтиграфия с меченной 99гпТс кишечной палочкой в оценке бактериальной транслокации при спленэкгомии (экспериментальная работа) [текст] / Галеев Ю.М., Попов М.В., Апарцин К.А. II Невский радиологический форум: матер, форума, 9-12 апр. 2003 г. - СПб., 2003. - С. 252-253.

3. Галеев Ю.М. Оценка состояния кишечного барьера при обтурационной кишечной непроходимости с применением Е. coli, маркированной радиоактивной меткой [текст] / Салато О.В., Галеев Ю.М., Седова Е.Ю. // Новое в реконструктивной хирургии: тез. науч. конф. молодых ученых, посвящ. Дню основания РНЦХ РАМН, Москва, 19 марта 2004 г. - М„ 2004. - С. 117-118.

4. Галеев Ю.М. Бактериальная транслокация и системная бактериемия при странгу-ляционной непроходимости кишечника [текст] / Салато О.В., Галеев Ю.М., Апарцин К.А. и др. II Сепсис: патогенез, диагностика и терапия: матер, науч.-практ. конф. с междунар. участ., Харьков, 1-2 апр. 2004 г. -Харьков, 2004. - С. 197-198.

5. Галеев Ю.М. Барьеры бактериальной транслокации патогенной микрофлоры в условиях перитонеального сепсиса [текст] / Апарцин К.А., Галеев Ю.М. // Сепсис: патогенез, диагностика и терапия: матер, науч.-практ. конф. с междунар. участ., Харьков, 1-2 апр. 2004 г. - Харьков, 2004. - С. 37-38.

6. Галеев Ю.М. Методы ядерной медицины в оценке бактериальной транслокации при перитоните [текст] / Галеев Ю.М., Попов М.В., Салато О.В. // Достижения и перспективы современной лучевой диагностики: матер. Всерос. науч. форума, Москва, 18-21 мая 2004 г. - М., 2004. - С. 53-54.

7. Галеев Ю.М. Исследование бактериальной транслокации при странгуляционной непроходимости тонкой кишки [текст] / Салато О.В., Галеев Ю.М., Апарцин К.А. и др. // Науки о человеке: материалы V Междунар. конгр. молодых ученых и специалистов, Томск, 20-21 мая 2004 г. - Томск, 2004. - С. 179-180.

8. Галеев Ю.М. Пути развития бактериемии при странгуляционной кишечной непроходимости [текст] / Салато О.В., Галеев Ю.М., Апарцин К.А. и др. // Вестн. Ассоциации хирургов Иркут. обл. - 2004. Матер, совещания главных хирургов территорий Сиб. федер. окр., науч.-практ. конф. хирургов Иркут. обл. и XI съезда ОО Ассоциации хирургов Иркут. обл., Иркутск, 24-25 мая 2004 г. - Иркутск, 2004. - С. 108-109.

9. Галеев Ю.М. Исследование влияния санации кишечника на процессы бактериальной транслокации при перитоните [текст] / Галеев Ю.М., Салато О.В., Седова Е.Ю., Аюшинова Н.И. // Вестн. Ассоциации хирургов Иркут. обл. - 2004. Матер, совещания главных хирургов территорий Сиб. федер. окр., науч.-практ. конф. хирургов Иркут. обл. и XI съезда ОО Ассоциации хирургов Иркут. обл., Иркутск, 24-25 мая 2004 г. -Иркутск, 2004. - С. 110.

10. Галеев Ю.М. Радионуклидное исследование патогенетических механизмов развития эндотоксикоза при различных формах непроходимости кишечника [текст] / Григорьев Е.Г., Апарцин К.А., Галеев Ю.М. и др. // Скорая мед. помощь. - 2004. - Т. 5, 48

№ 3. Сложные и нерешенные вопросы диагностики и лечения острого аппендицита, острой кишечной непроходимости и сочетанной травмы: матер, науч.-практ. конф. хирургов Рос. Федерации, Санкт-Петербург, 3-4 июня 2004 г. - СПб., 2004. - С. 77-78.

11. Галеев Ю.М. Использование радионуклидных методов исследования в изучении бактериальной транслокации при кишечной непроходимости [текст] / Салато О.В., Га-леев Ю.М., Попов М.В. и др. // III съезд MOO «Общество ядерной медицины»; Всерос. науч.-практ. конф. «Актуальные вопросы ядерной медицины и радиофармацевтики»; школа «Избранные вопросы ядерной медицины»: тез. докл., Дубна, Ратмино, 20-26 июня 2004 г. - Дубна, 2004. - С. 188-191.

12. Галеев Ю.М. Роль бактериальной транслокации и резорбции в патогенезе распространенного перитонита [текст] / Салато О.В., Седова Е.Ю., Галеев Ю.М. // Актуальные проблемы клинической медицины: матер. XII науч.-практ. конф., посвящ. 25-летию Иркутского ГИУВа, Иркутск, 11 нояб. 2004 г. - Иркутск, 2004.-С. 140-141.

13. Галеев Ю.М. Бактериальная транслокация при обтурационной кишечной непроходимости в эксперименте [текст] / Салато О.В., СедоваЕ.Ю., Галеев Ю.М. // Актуальные проблемы клинической медицины: матер. XII науч.-практ. конф., посвящ. 25-летию Иркутского ГИУВа, Иркутск, 11 нояб. 2004 г. - Иркутск, 2004. - С. 141-142.

14. Галеев Ю.М. Портальная бактериемия при обтурационной непроходимости кишечника [текст] / Салато О.В., Галеев Ю.М., Попов М.В. и др. //Актуальные вопросы хирургии: сб. науч.-практ. работ по матер. Всерос. науч.-практ. конф., посвящ. 70-летию Юж.-Урал, желез, дороги и 60-летию Челяб. мед. акад., Челябинск, 10 дек. 2004 г. / М-во здравоохранения РФ, Врачеб.-сан.служба ЮУЖД, Челяб. гос. мед. акад. ; под ред. В.Н. Бордуновского. - Челябинск, 2004. - Вып. 5, Т. 1. - Челябинск, 2004. - С. 81-86.

15. Галеев Ю.М. Радионуклидные методы исследования транслокации кишечной микрофлоры при острой непроходимости кишечника в эксперименте [текст] / Галеев Ю.М., Попов М.В., Салато О.В. и др. // Новые технологии в медицине: сб. докл. Второй междунар. дистанцион. науч.-практ. конф., Санкт-Петербург, 15-30 марта 2005 г.-СПб., 2005.-С. 114-115.

16. Галеев Ю.М. Радионуклидная оценка барьерной функции печени при ин-траабдоминальной хирургической патологии в эксперименте [текст] / Салато О.В., Галеев Ю.М., Попов М.В., Апарцин К.А. // Новые технологии в диагностике, интервенционной радиологии, хирургии печени и поджелудочной железы: матер, науч. конф. (с участ. специалистов стран ближ. и дал. зарубежья), Санкт-Петербург, 8-10 июня 2005 г. - СПб., 2005. - С. 47-48.

17. Галеев Ю.М. Патогенетические механизмы развития бактериальной токсемии при распространенном гнойном перитоните [текст] / Апарцин К.А., Галеев Ю.М., Григорьев Е.Г. // Инфекция в хирургии. - 2005. - Прил. Абдоминальная хирургическая инфекция: матер. IV Всерос. науч.-практ. конф. РАСХИ, Москва, 29 июня -1 июля 2005 г. - М„ 2005. - С. 15, № публ. 6.

18. Галеев Ю.М. Закономерности развития абдоминального сепсиса при различных формах механической острой непроходимости кишечника [текст] / Салато О.В., Галеев Ю.М., Попов М.В. и др. // Новые технологии в хирургии: тр. междунар. хирург, конгр., Ростов-на-Дону, 5-7 окт. 2005 г. - Ростов-на-Дону, 2005. - С. 92.

19. Галеев Ю.М. Влияние релапаротомии и манипуляций на кишечнике на развитие бактериальной транслокации при распространенном перитоните [текст] / Галеев Ю.М., Попов М.В., Апарцин К.А. // Новые технологии в хирургии: тр. междунар. хирург, конгр., Ростов-на-Дону, 5-7 окт. 2005 г. - Ростов-на-Дону, 2005. - С. 116-117.

20. Галеев Ю.М. Радионуклидное исследование бактериальной транслокации при остром нарушении мезентериального кровообращения и реперфузии в эксперименте [текст] / Попов М.В., Галеев Ю.М., Ильичева Е. А., Кувшинов А.Г. // Новые технологии в хирургии: тр. междунар. хирург, конгр., Ростов-на-Дону, 5-7 окт. 2005 г. - Ростов-на-Дону, 2005.-С. 382-383.

21. Галеев Ю.М. Механизмы формирования абдоминального сепсиса при распространенном перитоните [текст] / Галеев Ю.М., Попов М.В., Салато О.В., Апарцин К.А. //Новые технологии в хирургии: тр. междунар. хирург, конгр., Ростов-на-Дону, 5-7 окт. 2005 г. - Ростов-на-Дону, 2005. - С. 58-59.

22. Галеев Ю.М. Сцинтиграфия с меченными 99тТс бактериями Е. coli в исследовании закономерностей течения бактериемии при странгуляционной непроходимости тонкой кишки в эксперименте [текст] / Салато О.В., Галеев Ю.М., Попов М.В. и др. // Bull. Int. Sei. Surg. Ass. - 2006. - T. 1, № 2. : Докл. Третьей междунар. дистанцион. науч.-практ. конф. «Новые технологии в медицине - 2006», 15-30 марта 2006 г. - СПб., 2006. - С. 55-56.

23. Галеев Ю.М. Механизмы развития сепсиса при странгуляционной непроходимости тонкой кишки [текст] / Салато О.В., Галеев Ю.М., Попов М.В., Апарцин К.А. // Сепсис: проблемы диагностики, терапии и профилактики: Материалы науч.-практ. конф. с междунар. участ., 29-30 марта 2006 г. - Харьков, 2006. - С. 207-208.

24. Галеев Ю.М. Методы ядерной медицины в оценке бактериальной транслокации при странгуляционной непроходимости тонкой кишки [текст] / Галеев Ю.М., Попов М.В., Салато О.В., Апарцин К. А. // Радиология-2006: матер. VII Всерос. форума, 25-28 апр. 2006 г. - Москва, 2006. - С. 57-58.

25. Галеев Ю.М. Исследование распространения Е. coli из просвета тонкой кишки при странгуляционной непроходимости кишечника в эксперименте [текст] / Салато О.В., Галеев Ю.М., Попов М.В., Апарцин К.А. // Многопрофильная больница: проблемы и решения: матер. II Всерос. научн.-практ. конф. Фед. Гос. лечебно-профилактического учреждения, 21-22 сент. 2006 г. - Новосибирск, 2006. - С. 151-152.

26. Галеев Ю.М. Роль бактериальной транслокации в патогенезе бактериемии при экспериментальной кишечной непроходимости [текст] / Салато О.В., Галеев Ю.М., Попов М.В., Апарцин К.А. //Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, коло-проктологии. - 2006. - Т. 16, № 5, прил. № 28. Матер. Двенадцатой Рос. гастроэнтерол. недели, Москва, 16-18 окт. 2006 г.-М., 2006.-С. 113, № публ. 423.

27. Галеев Ю.М. Исследоваение бактериальной транслокации при обтурационной непроходимости тонкой кишки методом сцинтиграфии [текст] / Салато О.В., Галеев Ю.М., Попов М.В., Лепехова С.А. //Актуальные вопросы хиругии: сб. науч.-практ. работ / М-во здравоохранения РФ, Врачеб.-сан.служба ЮУЖД, ГОУ ВПО «Челяб. гос. мед. акад. Росздрава»; под ред. В.Н. Бордуковского. - Челябинск, 2006. - Вып. 6. - Челябинск, 2006. - С. 52-53.

28. Галеев Ю.М. Экспериментальная оценка транслокации кишечной палочки при перитоните методом бактериальной сцинтиграфии [текст] / Апарцин К.А., Галеев Ю.М., Салато О.В., Попов М.В. И Пробл. клин. мед. - 2007. - Прил. Актуальные вопросы флебологии. Распространенный перитонит: матер. Всерос. науч.-практ. конф., Барнаул, 30-31 мая 2007 г. - Барнаул, 2007.-С. 140-141.

29. Галеев Ю.М. Исследование закономерностей развития бактериемии при острой хирургической патологии живота в эксперименте методами ядерной медицины [текст] /Галеев Ю.М., Попов М.В., Салато О.В., Апарцин К.А. //Международная медицинская научная конференция между Автономной Республикой Внутренней Монголии КНР и

Республикой Бурятии РФ: сб. науч. ст., Маньчжурия (Китай), 22-25 авт. 2007 г. - Маньчжурия (Китай), 2007. - С. 209-210.

30. Галеев Ю.М. Применение радионуклидных методов исследования в изучении механизмов развития инфекционно-воспалительных заболеваний [текст] / Салато О.В., Галеев Ю.М., Попов М.В., Апарцин К.А. // Пробл. клин. мед. - 2007. - Прил. Актуальные вопросы флебологии. Распространенный перитонит: матер. Всерос. науч.-иракт. конф., Барнаул, 30-31 мая 2007 г. - Барнаул, 2007. - С. 169-170.

31. Галеев Ю.М. Бактериальная транслокация в патогенезе механической кишечной непроходимости [текст] / Салато О.В., Галеев Ю.М., Попов М.В., Апарцин К.А. // Современные аспекты кишечной непроходимости: матер. Рос. науч.-практ. конф. с междунар. участ., Анапа, 18-19 окг. 2007 г. - Анапа, 2007. - С. 41-42.

32. Галеев Ю.М. Оценка барьерных функций тонкой кишки и печени при распространенном перитоните [текст] / Галеев Ю.М., Попов М.В., Салато О.В. // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. - 2008. -Т. 18, № 5, прил. № 32: матер. 14-ой Рос. гастроэнтерологической недели, 6-8 окг. 2008 г. - М., 2008. - С. 170.

33. Галеев Ю.М. Барьерная функция печени при транслокации кишечной микрофлоры в условиях хирургической патологии живота [текст] / Салато О.В., Галеев Ю.М., Попов М.В., Апарцин К.А. // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. - 2009. - Т. 19, № 1, прил. № 33: матер. 14-ой Рос. гастроэнтерологической недели, 16-18 марта 2009 г. - М„ 2009. - С. 108.

34. Galeev Yu. Bacterial scintigraphy at experimental intestinal obstruction [text] / Galeev Yu., Lishmanov Yu., Aparcin K. et al. // J Nucí Med. - 2009. - Vol. 50, Suppl. 2. - P. 1318.

35. Galeev Yu.M. Bacterial scintigraphy at experimental obstructive ileus [text] / Galeev Y.M., Lishmanov Y.B., Aparcin K.A. et al. // Eur J Nucl Med Mol Imaging. - 2009. -Vol. 36, № 9, Suppl. 2. - P. 194-233.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

БРП - бактериальный радионуклидный препарат

БТ - бактериальная транслокация

ДЖП - дисфункция желчного пузыря

ДС -динамическая сцинтиграфия

ИР - индекс резорбции (поступления меченых бактерий из брюшной полости)

ИТ - индекс транслокации (поступления меченых бактерий из просвета кишечника)

КОЕ - колониеобразующая единица

ПР - перитонеальная резорбция

РФП - радиофармпрепарат

СС - статическая сцинтиграфия

ХКХ - хронический калькулезный холецистит

ХНХ - хронический некалькулезный холецистит

Подписано в печать 27.10.2011. Бумага офсетная. Формат 60x84'/,6. Гарнитура Тайме. Усл. печ. л. 2,0 Тираж 100 экз. Заказ № 124-11._

РИО НЦРВХ СО РАМН (Иркутск, ул. Борцов Революции, 1. Тел 29-03-37. E-mail: arleon58@gmail.com)