Автореферат и диссертация по медицине (14.00.27) на тему:Транслокация бактерий - как фактор инфицирования ран при металлоостеосинтезе закрытых переломов костей конечностей и обоснование нового принципа антибактериальной терапии (экспериментальное исследование)

) ;) и . 1

2 4 МЛР /.9:17

Ни мр;ша\ рукописи

/КНГАПЛОВ Александр Владимирович

ТРАНСЛОКАЦИЯ БАКТЕРИЙ - КАК ФАКТОР ИНФИЦИРОВАНИЯ РАН ПРИ МЕТАЛЛООСТЕОСИНТЕЗЕ ЗАКРЫТЫХ ПЕРЕЛОМОВ КОСТЕЙ КОНЕЧНОСТЕЙ И ОБОСНОВАНИЕ НОВОГО ПРИНЦИПА

АНТИБАКТЕРИАЛЬНОЙ ТЕРАПИИ (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)

14.09.27 - хирургия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медншшскн.х наук

Оренбург - 1996

Работа выполнена в Оренбургской государственной медицинской академии

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор

И.К. Никитенко

Научные консультанты: доктор медицинских наук, профессор

В.И. Никитенко доктор медицинских наук, профессор A.A. Стадннков

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор A.A. Чумаков доктор медицинских наук A.A. Сафронов

Ведущая организация:

Пермская государственная медицинская академия

Защита состоится " $( 1997 г. в ча-

сов на заседании днссертационного/совета К 084.51.01. Оренбургской государственной медицинской академии (460000, г. Оренбург, ул. Советская, 6. Зал заседаний диссертационного совета).

С диссертацией можно ознакомиться в библиочеке Оренбургской государственной медицинской академии.

Автореферат разослан "_"_ 1996 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор

H.A. Алешин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ АКТУАЛЬНОСТЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Проблема хирургической инфекции при металлоостеосинте-зе закрытых переломов длинных трубчатых костей продолжает оставаться чрезвычайно актуальной. Это связано с возрастанием частоты и тяжести повреждений опорно-двигательного аппарата, снижением эффективности антибиотикотерапии, ростом числа послеоперационных осложнений, повышением хирургической активности с использованием металлоконструкций, значительно увеличивающих потенциальные возможности внедрения возбудителя и развития инфекции (А. В. Каплан с соавт., 1985, Ю.Г.Шапошников, 1991; В.В.Ключевский с соавт., 1993; W. Беп51 е1 а!., 1981; И. Маай,1983).

В настоящее время общепризнанным считается , что бактерии, вызывающие нагноение, в основном попадают в рану непосредственно из внешней среды. Поэтому все современные способы профилактики направлены прежде всего на прерывание экзогенных путей инфицирования. Все лучше очищается воздух операционных, обрабатывается операционное поле, руки хирурга и др. (В.И.Стручков с соавт.,1984; В.М.Мельникова с соавт.,1993;

A.У.Ро11оск,1982). Однако даже выполнение операций в условиях гнотобиологической изоляции не приводит к желаемому эффекту полного исключения возникновения гнойно-воспалительных осложнений. По-видимому, эндогенный путь инфицирования ран явно недооценивается (В.И.Ннкитенко,1995).

В последние годы получены дополнительные сведения о том, что живые бактерии различных видов из внешней среды могут попадать в ткани организма через слизистую оболочку желудочно-кишечного тракта гематогенным и лимфогснным путем. '

Таким образом, возможна комбинация экзогенного и эндогенного путей инфицирования, которая ранее совершенно не учитывалась в клинической практике. Данный феномен получил название транслокацнн бактерии (В.И.Никитенко, 1985;

B.В.Смирнов с соавт., 1988; Б.А.Берднчевскнй с соавт., 1993; А.Оо^аБ а1., 1986). Однако все еще остаются неизученными частота и степень бактериальной обсемененности различных тканей, механизмы транслокации, реакция гистоструктур макроорганизма на бактерии.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

ЦЕЛЬ РАБОТЫ: экспериментальное изучение механизмов транслокации патогенной и непатогенной микробной флоры, определение бактериальной обсемененностн тканей при металлоос-теосинтезе закрытых переломов трубчатых костей и разработка нового принципа антибактериальной терапии.

Для достижения этой цели поставлены следующие задачи:

1. Разработать модель эндогенного обсеменения ран бактериями золотистого стафилококка при металлоостеосинтезе закрытых переломов конечностей.

2. Определить характер и степень бактериальной обсемененностн тканей желудка, кишечника, селезенки, печени, соединительной ткани кожи, мышц, кости при интрамедуллярном остео-синтезе.

3. Установить пути миграции сенной палочки и характер взаимодействия ее с гистоструктурами макроорганизма.

4. При эндогенном инфицировании ран золотистым стафилококком оценить профилактическую эффективность различных групп препаратов антибиотика - клафорана и бактериального препарата споробактерина.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Впервые установлено, что живые бактерии золотистого стафилококка, введенные интрагастрально, проникают через слизистые оболочки желудочно-кишечного тракта в кровь, лимфу и в область операционной раны. Обнаружено, что количество проникающих бактерий золотистого стафилококка в органах и тканях животных с переломами достоверно больше, чем у здоровых. Введенный интрагастрально золотистый стафилококк даже при отсутствии нагноения вызывает в органах и тканях животных умеренные структурные изменения альтеративно-экссудатив-ного характера.

Сенная палочка также способна мигрировать из желудочно-кишечного тракта в органы и ткани внутренней среды макроорганизма, однако при этом видимой альтератнвной реакции тканей не наблюдается.

Впервые проведен количественный анализ транслокации бактерий. Показано, что живые бактериальные препараты при

J

профилактике хирургической инфекции могут быть более эффективными, чем антибиотики.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ

Разработан новый способ профилактики н лечения хирургической инфекции, основанный на введении через рот живых бактерий сенной палочки (патент СССР на изобретение № 1790409 от 22.09.199-2 г.).

Предложена модель эндогенного обсеменения тканей макроорганизма, позволяющая обоснованно контролировать эффективность действия различных препаратов.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1.Живые бактерии из внешней среды через желудочно-кишечный тракт систематически проникают в кровь, лимфу и ткани области повреждения.

2.Микроорганизмы рода Bacillus могут блокировать транслокацию золотистого стафилококка, что позволяет использовать живые бактериальные препараты для профилактики хирургической инфекции.

АПРОБАЦИЯ ДИССЕРТАЦИИ

Результаты диссертации были доложены и обсуждены на ХХП Пленуме правления Всесоюзного- научного общества травматологов-ортопедов (г.Иркутск, 1991), Всероссийской научно-практической конференции (г.Москва, 1994), III Межрегиональной научно-практической конференции патологоанатомов Урала и Западной Сибири (г.Челябинск, 1996), Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 100-летию основания МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского (г. Москва, 1996), заседаниях областного общества травматологов-ортопедов (г.Оренбург, 1993, 1994, 1995), областных научно-практических конференциях (г.Оренбург, 1991, 1992, 1993, 1994).

По материалам диссертации опубликовано 10 научных работ. Получен патент СССР на изобретение.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация изложена на 104 страницах машинописного текста, включая 32 рисунка и 7 таблиц, состоит из введения, обзора литературы, 4х глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы, включающего 217 источников, из них 113 отечественных и 104 иностранных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты выполнены на 120 лабораторных белых крысах линии "Август" массой 180-200 г.

В условиях радиоизотопной лаборатории в пробирки с 1,5% стерильным расплавленным мясопептонным агаром вносили радионуклид 3Н тимидцн в дозе по 1 МКБ на одну пробирку. Петлей на косячки агара раздельно засевали бактерии штаммов St. aureus 209Р, и Bacillus subtilis 534. Инкубацию проводили при температуре +37°С в течение 24 часов. Меченые микроорганизмы смывали стерильным 0,9% раствором натрия хлорида по 2 см3 в каждую пробирку. Количество микроорганизмов во взвеси определяли с помощьН) оптического стандарта мутности (ГИСК им. Л.А.Тарасевича). Путем добавления 0,9% раствора натрия хлорида готовили взвесь с концентрацией 1 млрд.- микробных клеток в 1 см3.

В первой серии опытов в условиях экспериментальной операционной с соблюдением правил асептики 20 крысам под внут-рибрюшинным тиопёнталовым наркозом (10% раствор тиопен-тала натрия из расчета 0,02 г/кг массы тела животного) наносили закрытые. переломы бедренной кости. Отломки фиксировали спицами из нержавеющей стали. Раны ушивались послойно наглухо шелком и покрывались слоем, клея БФ-6. Сразу после операции животным внутригастрально при -помощи зонда вводили по 5 млрд. клеток бактерий золотистого стафилококка, меченных радионуклидом 3Н тимидином. Контролем служили 20 крыс, которым внутригастрально вводили золотистый стафилококк, меченный этим же радионуклидом, но при этом переломы не осуществляли.

Во второй серии в аналогичных условиях 20 крысам под внутрибрюшинным тиопёнталовым наркозом наносили закрытые переломы бедренной кости и сразу же выполняли интраме-дуллярный остеосинтез спицами. После операции животным внутригастрально вводили по 5 млрд. клеток бактерий штамма

Bacillus subtilis 534, меченные 3H тимидином. Контролем служили 20 крыс, которым внутригастралъно вводили меченые бактерии сенной палочки, без нанесения костных переломов.

В третьей серии опытов 20 крысам под внутрибрюшинным тиопенталовым наркозом также наносили закрытые переломы конечностей с последующим ннтрамедуллярным осТеосннтезом. После операции животным внутригастрально вводили бактерии золотистого стафилококка, меченные радионуклидом 3Н тимидином, в дозе по 5 млрд. микробных клеток. Затем одной группе из 10 крыс вводили антибиотик клафоран по 0,006 граммов в сутки. Другим 10 крысам внутригастрально через зонд вводили бактериальный препарат рпоробактерин в дозе 200 млн. живых клеток. Контролем служили 20 здоровых крыс из первой серии опытов.

Животных выводили из опыта путем введения им летальной дозы наркотического препар'ата через 1, 3, 6, 12, 24 часа с момента начала опыта.

Для гистологического исследования у животных>брал»г ткани желудка, тонкого и толстого кишечника, печени, селезенки, кожу, мышцы, бедренную кость. Ткани для фиксации помещали в 10% водный раствор формалина.

Полученные ткани животных обезвоживали в спиртах возрастающей крепости н заливали в парафин по традиционной методике. Срезы толщиной 4-6 мкм после депарафинирования окрашивали гематоксилшюм Манера н эозином. Изучение гис-топрепаратов проводили в световом микроскопе "Биолам Р". Изготовление гистоавтографов проводили по методике, предложенной Л.Н.Жинкиным (1959). При этом »на депарафинированные срезы гистопрепаратов наносили жидкую фотоэмульсию с последующим экспонированием в течение 3 недель, Гистоавтографы окрашивали гематоксилином и эозином. Подсчет количества меченных радионуклидом бактерий в тканях органов животных проведен в условных полях зрения (окулярная вставка микроскопа 25 мм2, объектив 90, окуляр 10).

Для электронно-микроскопических исследований материал фиксировали в 2,5% растворе глютарового альдегида, с последующей постфиксацней в четырехокисй осьмия и заливали в смолу ЭПОН-812. Ультратонкие срезы подвергали двойному контрастированию в растворе уронил-ацетата и цитрата свинца и анализировали в электронном микроскопе ЭВМ-100АК. Фотографировали ультраструктуры при увеличениях от х 6700 до х 30 ООО.

Для культивирования бактерий золотистого стафилококка и сенной палочки использовался метод ЬаиМа в модификации Ро-домана.

Взятые ткани помещали в стерильную посуду, затем проводили измельчение и растирание в ступке. Полученную взвесь распределяли по поверхности мясопептонного агара. В дальнейшем выделяли чистые культуры и проводили их видовую идентификацию по Берджи (1984).

Полученные нами в работе количественные данные статистически обработаны в соответствии с рекомендациями .Рокиц-кого (1973). Для характеристики вариационных рядов использовалась средняя величина (М), ошибка средней величины (м), достоверность (р) и число исследований (п). Достоверным считалось изменение при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Изучение некоторых особенностей патогенеза стафилококковой инфекции у животных при повреждении трубчатых костей

Исследованиями Остановлено, что введенный животным интрагастрально золотистый стафилококк проникает из желудочно-кишечного тракта в органы и ткани хозяина и обнаруживается в области операционной раны. При изучении гистологических срезов установлено, что у животных с переломами костей и внутригастрально введенным золотистым стафилококком меченые бактерии через 1 час регистрировались в слизистой оболочке желудка, крови, селезенке. В желудке меченые стафилококки в количестве (2,63 + 0,22) определялись в просвете желудочных ямок, в проекции клеток фундальных желез, и в собственной пластинке слизистой оболочки.. При этом необходимо отметить, что количество микроорганизмов в просвете желудочных ямок во много раз превышало таковое в проекции срезов желез, а также в соединительнотканных элементах подстилающих эпителиоцитов. В подслизистой оболочке желудка меченые микроорганизмы регистрировались очень редко. Чаще всего единичные радиометки определялись в перивоскулярных зонах. В мышечной н серозной оболочках бактерии не выявлялись. В крови количество меченых стафилококков определялось в количестве 0,42 + 0,30. В селезенке меченые стафилококки регистрировались через 1 час ( 1,42 + 0,02) в красной пульпе. Они накап-

лизались в проекции синусондных капилляров. Через 3 часа в слизистой оболочке желудка количество стафилококков увеличилось и составило 10,8 + 0,06, в крови 3,96 + 1,8, в селезенке количество бактерии уменьшилось до 0,44 + 0,03 (р < 0,001). Через 6 часов в слизистой оболочке желудка количество стафилококков уменьшилось и составило 2,75 + 0,009 . В крови на 6 часов также произошло снижение числа бактерий до 1,6 + 0,60. В селезенке к шести часам количество бактерий, напротив, увеличилось до 0,56 + 0,05 (р < 0,005). Обращает на себя внимание факт появления меченых стафилококков не только в красой пульпе, но и в лнмфондных фолликулах селезенки. Бактерии располагались среди лимфоцитов в периартериальной муфте, а также в стенке центральной артерии. Через 12 часов в слизистой желудка количество бактерий ешё снизилось и составило 1,41 + 0,06. В тонком кишечнике через 12 часов меченые стафилококки регистрировались в покровном эпителии и собственной пластинке слизистой оболочки. Количество здесь составило 1,24 + 0,41. В подслнзистон основе тонкого кишечника радиометки были единичными, а в мышечной и серозной оболочках они не определялись. В толстом кишечнике бактерии регистрировались в количестве 0,5 + 0,25 в криптах и собственной пластннке слизистой оболочки. В крови количество бактерий несколько увеличилось и составило 2,0 + 1,0. В печени через 12 часов количество меченых стафилококков составило 0,54 + 0,04. Бактерии регистрировались в гепатоцитах и синусоидных капиллярах. Через 12 часов меченые стафилококки обнаруживались в соединительной ткани кожи 1,83 + 0,06, среди мышечных волокон 0,7 + 0,21, в трубчатых костях 2,23 + 0,06 по ходу кровеносных сосудов, в надкостнице и Гаверсовых каналах. Через сутки в слизистой оболочке желудка количество бактерий увеличилось и составило 2,23 + 0,24 (р < 0,001), в толстом кишечнике количество радиометок увеличилось до 1,25 + 0,75, крови - до 1,0 + 0,98, печени - до 1,63 + 0,22 (р < 0,001), в соединительной ткани кожи - до 2,32+0,04, мышцах - до 0,9 + 0,77, костной ткани- до 2,94 + 0,04 (р< 0,001).

У здоровых животных (без переломов) меченые стафилококки через один час регистрировались в слизистой оболочке желудка 2,61 ¿0,22 , в крови 0,34+ 0,38, в селезенке 0,27 + 0,01. Через 3 часа количество бактерий в желудке уменьшилось и составило 0,65 + 0,03, в крови 0,34 + 0,38, селезенке 0,21 + 0,02. Через 6 часов в слизистой оболочке желудке количество бактерий уменьшилось и составило 0,52 + 0,01, в крови произошло увеличение бактерий до 0,58 + 0,85. В селезенке количество бактерий

также увеличилось и составило 0,33 + 0,03 (р < 0,01). На 12 часов в желудке происходило снижение числа бактерий- до 0,27 + 0,03. В слизистой оболочке тонкого кишечника количество меченых бактерий составило 0,81 + 0,03, в толстом кишечнике - 0,66 + 0,21. В крови произошло снижение числа бактерий до 0,32 + 0,34, в печени - до 0,31 + 0,04. Через сутки в слизистой желудка количество бактерий ещё снизилось и составило 0,17 + 0,01. Уменьшилось число бактерий и в слизистой толстого кишечника (0,44 + 0,47). В крови количество бактерий несколько увеличивалось до 0,44 + 0,47 (р < 0,001), в печени также произошло увеличение стафилококков до 0,91 + 0,03 (р< 0,001). У здоровых животных меченые стафилококки в соединительной ткани кожи, скелетных мышцах и кости не обнаружены.

Установлено, что стафилококки, как у здоровых животных, так и в условиях моделируемого перелома, проникают через слизистые оболочки желудка, тонкого кишечника, в селезенку и печень. Однако у животных с переломами количество стафилококков в органах и тканях было значительно большим, чем у здоровых. В соединительной ткани кожи, мышцах, кости из области перелома бактерии накапливались, тогда как у здоровых живот-пых стафилококки в этих тканях не обнаружены.

Для установления жизнеспособности золотистого стафилококка нами выполнялись посевы из тканей животных. Обнаруженные на агаре золотистые пигментирующие колонии стафилококка идентифицировались по Берджи. Всего выполнено 92 посева. Живые бактерии штамма (St. aureus 209Р) регистрировались в 65 высевах.

Учитывая, что в изучении патогенеза различных инфекций важную роль играет взаимодействие бактерий с клетками микроорганизма, мы акцентировали особое внимание на этом аспекте проблемы. Установлено, что в желудке после ведения культуры микробов в цитоплазме поверхностного эпителия отмечалось значительная эозпнофнльнан зернистость, увеличивалось число дефектов эпителия. В слизистой оболочке тонкого и толстого кишечника происходило скопление слизи, слущиванпе эпите-лпоцитов. В селезенке наблюдалось умеренное расширение просвета кровеносных сосудов, частичный распад спленоцитов, увеличивалось количество детрита. В печени несколько возрастало количество эозннофильных гепатоцитов, наблюдалась их вакуольная дистрофия, усиливался отек стромы органа с формированием расширенных "пространств Диссе", встречались отдельные микроочаги некроза. Гепатоциты инфильтрировались макрофа-

гально-лнмфоцптарными клетками. В костномозговом и Гавер-совых каналах наблюдались инфильтрация сегментоядерными лейкоцитами, глыбчатый распад и цитолиз тканей в очаге перелома. В мягких тканях области перелома происходили усиление отека и клеточная инфильтрация их мононуклеарами.

У здоровых животных меченые стафилококки в органах и тканях вызывали незначительные транзиторные изменения, а в кости, соединительной ткани кожи, мышцах при этом структурные изменения повреждающего характера отсутствовали.

Обнаружение меченых стафилококков в мазках крови, снну-сондных капиллярах селезенки и печени, трубчатых костях и околососудистых пространств Гаверсовых каналов, соединительной ткани кожи области перелома указывают на гемато-лимфогенное проннкновенне их в печень, селезенку и область перелома.

Нами впервые высказано предположение о том, что ведущим путем проникновения, бактерий из желудка и тонкого кишечника в кровь и лимфу является транслокация их через расширенные межклеточные пространства эпителиальных покровов слизистых оболочек. Это подтверждает наличие стафилококков в межклеточных пространствах поверхностных эпителиоци-тов желудка и энтероцитов тонкого кишечника. Возможно проникновение бактерий через дефекты поверхностного эпителия желудка и тонкого кишечника. Нельзя исключить и трансцел-люлярный механизм миграции микробов, т.е. транслокацию через цитоплазму эпителиальных клеток путем эндоцитоза или через участки разрушений клеточных мембран. Данное предложение основывается на электронномикроскопическом обнаружении микробных тел внутри эпителиоцнтов, эндотелиоцитов и клеток соединительной ткани.

В литературе, за исключением публикаций В.И. Никитенко (1985), нами не встречено данных о том, что живые бактерии могут из желудочно-кишечного тракта с током крови и лимфы достигать области хирургической раны. Однако сам факт существования бессимптомной бактериемии при различных патологических состояниях (неинфекционной этиологии) признается многими авторами (В.В. Федоров с соавт., 1995); А. Dauglas а1.,1986).

Анализ результатов наших исследований позволил не только подтвердить существующее положение о возможности комбинации экзогенного и эндогенного распространения микроорганизмов, но и сделать обобщения, касающиеся закономерностей транслокации микробов через эпителиальные барьеры слизи-

стых оболочек желудочно-кишечного тракта, распространения их во внутренних средах организма « хозяина» взаимоотношений микробных агентов и тканевых структур микроорганизма, в том числе и в область хирургической раны.

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ МАКРООРГАНИЗМА ЖИВОТНЫХ И СЕННОЙ ПАЛОЧКИ В НОРМЕ И ПРИ ПОВРЕЖДЕНИИ

Особый интерес представляет изучение транслокации непатогенных микроорганизмов через слизистые оболочки желудочно-кишечного тракта в кровь и лимфу, а также взаимодействие сенпон палочки с клетками макроорганнзма.

Для экспериментов нами использовался штамм Bacillus sub-tilis 534, полученный В.И.Никитенко (1988), который является основой бактериального препарата споробактерина.

Установлено, что у животных с закрытыми переломами бедренной кости после интрагастрального введения сенной палочки меченые бактерии через 1 час регистрировались в покровном эпителии и собственной пластинке слизистой оболочки желудка в количестве 1,1 + 0,1, в криптах слизистой оболочки тонкого кишечника - 1,5 + 0,2. Особенно много их скапливалось в проекции цитоплазмы микрососудов собственной пластинки слизистой оболочки, гладких миоцитов и бокаловидных гландулоцитов. Радиометки бактерии обнаруживались также в крови (1,2 + 0,1), в селезенке ( 2,6 + 0,4). В последней микроорганизмы преимущественно накапливались в красной пульпе, в проекции сннусоидных капилляров. В печени количество сенной палочки через один час составило 0,6 + 0,1. Меченые бактерии обнаружены в проекции гепатоцптов, сннусоидных капилляров, сосудах микроциркуля-торного русла и в желчеотводящих протоках. Дольки печени у всех животных в основном имели нормальный характер строения как в периферических, так и в центральных отделах. Гепа-тоциты были гетероморфного характера строения и не имели признаков существенных повреждений ядер и цитоплазмы. В соединительной ткани кожи количество меченых бактерий через 1 час составило 1,6+ 0,6. Они определялись в микрососудах, в межклеточном матриксе дермы. Особенно часто бактерии локализовались вблизи гистиоцитов и функционально активных фиброб-ластов, а также вокруг волосяных фолликулов. Через три часа количество меченой сенной палочки в желудке увеличилось в четыре раза и составило 4,2 + 1,2 ( р < 0,05), в слизистой тонкого

кишечника - до 2,2 + 0,8. Bi слизистой толстого кишечника (1,4 + 0,6) бактерии находились в просветах крипт, между бокаловидными гландулоцнтами, в сосудах микроциркуляторного русла и межклеточном веществе собственной пластинки слизистой оболочки. В селезенке через три часа количество бактерий увеличилось и составило 6,4 _+ 0,8 ( р < 0,001), в печени - 2,3 + 1,1, соединительной тканн кожи - 3,2 + 0,4. К шести часам количество бактерий еще более возросло и составило в желудке 11,7 + 2,5 (р< 0,01), в тонком кишечнике - до 2,5 + 0,3 ( р < 0,05), в крови до 5,2 ± 1,4 ( р < 0,01), в селезенке - 15,6 + 3,2 ( р < 0,01), в печени - 6,3 +

I,7 ( р < 0,05). В соединительной тканн кожи количество сенной палочки уменьшилось до 1,5 + 0,3. Через 12 часов в слизистой оболочке желудка количество бактерий резко уменьшилось и составило 2,1 + 0,7, в тонком кишечнике количество сенной палочки увеличилось - до 4,5 + 0,5, также как и в толстом кишечнике - (3,6+ 0,8 ), и крови (6,1 + 1,1). В других исследованных органах и тканях количество бактерий уменьшилось и составило в селезенке 11,1 + 2,1, в печени- 3,5+ 0,5, в соединительной ткани кожи-0,5 + 0,1. К концу суток количество бактерий в органах и тканях увеличилось в слизистой оболочке желудка до 6,1+ 2,3, тонком кишечнике - до 7,0 + 2,8, толстом кишечнике - до 9,0 +1,2 ( р < 0,01). В селезенке, печени, соединительной ткани кожи количество меченых бактерий через сутки также увеличилось и составило соответственно 27,6 + 6,2, 23, 4 + 8,2, 6,0+ 2,2 ( р < 0,05). В кости области перелома впервые меченые бактерии зарегистрированы через 24 часа в количестве 1,5 + 0.8. Меченая сенная палочка обнаружена по ходу кровеносных сосудов, в надкостнице, Гаверсовых каналах.

У здоровых животных через один час после внутригастраль-ного введения меченая сенная палочка регистрировалась в покровном эпителии и собственной пластинке слизистой оболочки желудка в количестве 44,3 + 3,8, в крови - 3,9 + 0,1, селезенке -

II,5 + 2,2, печени -14,6+ 1,8. В тонком и толстом кишечнике, соединительной ткани кожи и костной ткани в данный период времени бактерии не обнаружены. Через 3 часа количество бактерий в желудке уменьшилось до 10,5 + 1,1. В тонком кишечнике количество бактерий составило 12+2,7. В крови количество сенной палочки увеличилось до 17,2 + 0,2 ( р < 0,001), в селезенке - до 28,5 + 2,6 ( р < 0,001). В печени произошло уменьшение бактерий число их составило 10,4 + 2,2. В соединительной ткани кожи через 3 часа количество бактерий регистрировалось в количестве 0,6 + 0,1. В кости радиометки не обнаружены. К 6 часам

в слизистой оболочке желудка количество бактерий еще более возросло и составило 29,6 + 4,4 (р < 0,001). В тонком кишечнике произошло уменьшение числа бактерий до 1,5 + 0,4 , в толстом кишечнике - до 8,3 + 1,7. В крови к шести часам количество бактерий уменьшилось и составило 2,4+ 0,7. В селезенке продолжалось увеличение количества бактерий до 39,5 + 4,8 (р < 0,05). В печени число радиометок уменьшилось и составило 6, 6 + 1,4. В костной ткани через 6 часов количество меченых бактерий составило 8,2 + 1,4. В соединительной ткани кожи меченые бактерии не регистрировались. Через 12 часов в слизистой оболочке желудка количество сенной палочки уменьшилось и составило 13,5 + 2,2. В толстом кишечнике также произошло снижение числа бактерий до 1,7 + 1,9. В крови к 12 часам количество бактерий увеличилось до 12,6 + 1,4 ( р < 0,001). В селезенке произошло снижение числа бактерий до 11,0 + 1,4. Количество сенной палочки увеличилось, в печени до 16,5 + 2,8 (р <0,01), в соединительной ткани кожи области раны до 7,5 + 2,2 (р < 0,01), в костной ткани до 14,6 + 1,6 (р <0,01). Через сутки в слизистой оболочке желудка произошло снижение числа бактерий до 2,2 + 0,6. В тонком кишечнике количество сенной палочки увеличилось и составило 18,2 + 1,6 (р < 0,001). В толстом кишечнике число бактерий также увеличилось и составило 11,4 +3,2 (р <0,01). В селезенке количество бактерий через сутки составило 10,0 +2,0, а в печени количество сенной палочки уменьшилось до 10,5 +2,5. В соединительной ткани кожи произошло уменьшение числа бактерий до 2,0 +0,8, в костной ткани количество бактерий также снизилось до 4,5 +0,6.

Нами установлено, что общий характер транслокации и локализации сенной палочки у животных двух групп был сходным. Однако установлены и некоторые отличия в характере распространения бактерий. Так, количество меченых бактерий, выявленных на уровне гистологических структур желудочно-кишечного тракта у здоровых животных было значительно выше, нежели у животных с переломами. Кроме того, бактерии в костной ткани в условиях повреждения определяются через сутки, в то время как у контрольных животных они регистрировались только через 6 часов.

Для установления жизнеспособности сенной палочки из всех исследуемых тканей выделялась чистая культура сенной палочки. При росте на среде Гаузе (штамм Bacillus subtilis 534) растет в виде характерных колоний с фестончатыми краями и розовым пигментом. В последующем взвесь бактерий из типичной одной

колонии фиксировалась на предметном стекле и обрабатывалась по Л.Н.Жинкину (1959). Обнаружение радиометок подтверждало наличие живых бактерий в тканях. Всего выполнено 316 подобных исследований. Из них живые бактерии сенной палочки с радионуклидами обнаружены в 274 наблюдениях (87%).

Нами проведена оценка морфологического состояния органов и тканей животных прп их взаимодействии с сенной палочкой. Важно отметить, что у животных при введении бактерий сенной палочки в гистологических срезах тканей патологических изменений несмотря на наличие бактерий, не найдено. Исследования позволили сделать вывод, что непатогенные бактерии рода Bacillus могут из желудочно-кишечного тракта с током крови проникать в рану. Это согласуется с наблюдениями В.И.Ннкнтешсо (1995,1996).

Следует отметить, что в последние годы факт существования бессимптомной бактериемии у животных доказан и признается многими (В.В.Смирнов с соавт.,1988, И.И.Долгушин с со-авт.,1989). Причем признается, что под влиянием нормальной аутофлоры, лишенной патогенных свойств, возможна стимуляция неспецифической резистентности, а также специфического иммунитета (Л.Я.Эберт с соавт.,1979, И.И.Долгушин с соавт., 1982,1989).

Анализ и обобщение проведенных нами данных позволяют с новых позиций обосновать уже укрепившиеся в клинической хирургии представления о том, что подавляющее большинство хирургических ран является инфицированными. Общеизвестно, что микроорганизмы в той или нной степени не всегда извне проннкают в рану в момент операции. Но мы обращаем особое внимание па то обстоятельство, что большое число микробов может оказаться в ране за счет резидентной микрофлоры. И что особенно важно, вскрытые нами механизмы проникновения микробов из просвета желудочно-кишечного траста, их гематогенная, и лнмфогенпая транслокацня вплоть до хирургической раны, носят общий характер как для патогенной, так и непатогенной микрофлоры.

Изучение лечебного действия бактериального препарата «Споробактсрин» в условиях экспериментальной хирургической

инфекции

Исследованиями установлено, что у животных контрольной группы, когда споробактерин и клафорап не применялись, меченые стафилококки регистрировались через 12 часов в соединительной ткани кожи в количестве 1,45 + 0,04, в мышцах 0,5 +0,18, в бедренной кости 2,2 + 0,06. Через 24 часа численность микроорганизмов возросла и составила в соединительной ткани кожи 1,82 + 0,05, в мышцах 0,7 + 0,25, в бедренной кости 2,9 + 0,04 ( р < 0,001 ). Через 48 часов численность стафилококков еще более возросла. В соединительной ткани количество их составило 2,12 + 0,24, в мышцах 0,9 + 0,71, в бедренной кости 5,7 + 0,46 ( р < 0,001). А через 72 часа численность микроорганизмов возросла по сравнению со стадией на 12 часов опыта. В соединительной ткани кожи количество их составило 2,35 + 0,04, в скелетных мышцах 0,15 < 0,84, в бедренной кости 6,3 + 0,012 ( р < 0,01).

У животных с введенным антибиотиком - клафораном меченые стафилококки в области операционной раны регистрировались через 12 часов. Количество их составило в соединительной ткани кожи 0,9+0,16, в мышцах 0,6 + 0,14, в бедренной кости 1,6 + 0,06. Через сутки количество меченых бактерии несколько уменьшилось. В скелетных мышцах 0,5 + 0,22, в соединительной ткани кожи 1,2 + 0,14, в бедренной кости 1,1+ 0,12. Через 48 часов количество меченных стафилококков возросло н составляло в соединительной ткани кожи 1,4 + 0,06, в скелетных мышцах 0,6 + 0,08, в бедренной кости 3,8 + 0,22 ( р < 0,001). А через 72 часа количество микроорганизмов несколько уменьшилось. В соединительной ткани кожи количество их составило 0,8 + 0,06, в скелетных мышцах 0,2 + 0,04, в бедренной кости 3,6 + 0,32 ( р <0,001).

У животных при применении бактериального препарата споробактерина в качестве лечебного средства в сроки на 12 часов стафилококки в тканях не обнаруживались. По-видимому, бактерии сенной палочки блокировали механизмы транслокации стафилококка, а выделяемое сенной палочкой антибактериальное вещество приводило к быстрой гибели условно-патогенных бактерий. Через 48 часов меченые бактерии регистрировались в соединительной ткани кожи в количестве 1,1 + 0,02, в скелетных мышцах 0,5 + 0,01, в бедренной кости 2,1 + 0,07. Через 72 часа количество меченых стафилококков уменьшилось и составило, в

соединительной ткани кожи 0,2+0,1, в скелетных мышцах 0,3 + 0,2, в бедренной кости 0,9 + 0,227 Р < 0,001).

При оценке морфологического состояния тканей области перелома, установлено, что у животных с введенным споробак-терином и антибиотиком- клафораном в области операционной раны воспалительная реакция и клеточная инфильтрация кост-но-мозгового и Гаверсовых каналов носила умеренный характер.

Очаги некроза не определялись, инфильтрация от места перелома не распространялась. У животных контрольной группы в области перелома значительно усиливалась воспалительная реакция и инфильтрация сегментоядерными лейкоцитами, распространяющаяся по костно-мозговому каналу на значительном расстоянии. Эта воспалительная реакция захватывала очаги желтого костного мозга. В окружающих место перелома мягких тканых сохранялись очаги кровоизлияния. При этом наблюдалось усиление отека и инфильтрация сегментоядерными лейкоцитами и в меньшей степени - круглоклеточными мононуклеар-ными элементами.

Таким образом, вводимый интрагастрально споробактерин изменяет характер и сроки миграции, очевидно, обеспечивая значительное уменьшение числа патогенных микробов в области операционной раны. Это подтверждается, во-первых, более поздним появлением меченых стафилококков в раневой области (на сутки позже) по сравнению с сериями животных, которым стафилококк не вводился. Во-вторых, количество стафилококков, достигших области операционной раны, было достоверно меньшим, нежели в случаях, когда споробактерин не применялся. В третьих, у животных с введенным споробактерином и антибио-тиком-клафораном в области перелома воспалительная реакция и клеточная инфильтрация костномозгового и Гаверсовых каналов носила белее умеренный характер, чем у крыс контрольной группы. Таким образом, живые бактериальные препараты при профилактике хирургической инфекции могут быть более эффективными, чем антибиотики. Следует отметить, что наши данные совпадают с клиническими наблюдениями В.И.Никитен-ко (1990).

выводы

1. Золотистый стафилококк, являющийся одним из наиболее частых возбудителей хирургической инфекции, может проникать через эпителиальные барьеры слизистых оболочек желудочно-кишечного тракта в кровь, лимфу, лимфатические узлы, селезенку, печень и мигрировать в соединительную, мышечную и костную ткани области перелома. Подобный путь распространения госпитальной инфекции явно недооценивается.

2. Сапрофнты, одним из которых является сенная палочка, также способны мигрировать из желудочно-кишечного тракта в органы и ткани внутренней среды макроорганизма.

3. Феномен проникновения бактерий золотистого стафилококка и сенной палочки в лимфоидные ткани и печень из желудочно-кишечного тракта, получивший название транслокации, отмечается и у здоровых животных. По-видимому, при этом стимулируется иммунная система, а сами бактерии служат постоянным источником антигенов для поддержания уровня нормальных антител.

4. При светооптической и электронной микроскопии установлено, что золотистый стафилококк, даже при отсутствии нагноения, вызывает умеренные изменения альтеративно-экссудативного характера во всех тканях, где он присутствует. В то же время подобной реакции тканей на сенную палочку не отмечается. Это, вероятно, обусловлено сходством антигенов клеточной стенки сенной палочки и тканей.

5. Сенная палочка может блокировать транслокацию бактерий золотистого стафилококка в ткани макроорганизма.

6. Споробактерин, основой которого является живая культура штамма Bacillus subtilis 534, при профилактике хирургической инфекции после металлоостеосинтеза более эффективен, чем антибиотик широкого спектра действия клафоран.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Профилактика и лечение гнойных осложнений и травм новым препаратом из живых бактерий // Тезисы докладов 22 Пленума правления Всесоюзного научного общества травматологов-

ортопедов. Иркутск.- 1991г. -С.182-184 (в соавт. с В.И.Никитенко,

B. АЛ исковым, И.П.Рынковым).

2. Эндогенное инфицирование ран бактериями штамма St. aureus 209-Р после металлоостеосинтеза закрытых переломов конечностей в эксперименте // Тезисы докладов областной научно-практической конференции "Молодые ученые - здравоохранению". Оренбург, - 1992г. - C.40-4I.

3. Профилактика и лечение гнойно-воспалительных осложнений после металлоостеосинтеза закрытых переломов конечностей препаратом из живых бактерий //Тезисы докладов областной научно-практической конференции "Молодые ученые -здравоохранению". г.Оренбург, - 1992 - С.49-50 (в соавт. с

C.Н.Ивановым).

4. Патогенетические аспекты перитонита в эксперименте // Тезисы докладов научно-практической конференции хирургов. Оренбург,- 1992-С.74-75 (в соавт. с В.И.Никитенко, В.К.Есипо-вым, А.А.Стадниковым).

5. Профилактика и лечение гнойно-воспалительных осложнений после металлоостеосинтеза закрытых переломов конечностей препаратом - "Споробактерин"//Тезисы докладов научно-практической конференции травматологов "Актуальные вопросы травматологии". Оренбург, - 1993 - С.21-22 (в соавт. с В.И.Никитенко).

6. Патоморфология экспериментального перитонита // Тезисы докладов научно-практической конференции патологоанатомов Урала и Западной Сибири "Актуальные вопросы патологической анатомии". Курган,- 1993 - С. 82-84 (в соавт. с В.К.Есиповым, Г.И.Корнеевым, А.А.Стадниковым, В.И.Никитенко).

7. Лечение гнойно-воспалительных осложнений у травматологических больных препаратом из живых бактерий // Тезисы докладов региональной научно-практической конференции молодых ученых Урала и Поволжья. Оренбург,- 1994 - С.163-164 (в соавт. с С.Н.Ивановым).

8. О ранее неизвестном механизме защиты организмов человека и животных от инфекции при повреждениях // Тезисы докладов научно-практической конференции "Актуальные вопросы теоретической и клинической медицины". Оренбург,- 1994 -С.235-240 ( в соавт. с В.И.Никитенко, А.А.Сафроновым, В.АЛисковым, С.Н.Ивановым).

9. Морфологическое изучение органов и тканей при лечении антибактериальными препаратами переломов костей в эксперименте //Тезисы докладов 3 Межрегиональной научно-практической конференции патологоанатомов Урала и'Западной Сибири "Актуальные вопросы патологической анатомии". Челябинск,-1996 - С.146-148 (в соавт. с А.А.Стадниковым, В.А.Крнвонос).

10. Споробактерин - новый препарат для лечения дисбактерио-зов и гнойно-воспалительных процессов //Тезисы докладов Всероссийской научно-практической конференции "Днсбактериозы и эубиотики". Москва - 1996 - С.26 (в соавт. с В.И.Ннкитенко, Н.Н.Горбунковой). ......

Изобретение:

Способ лечения гнойно-воспалительных процессов живыми бактериальными препаратами. Патент СССР на изобретение N 1790409 от 22.09.1992 г. (в соавт. с И.К. Никитенко, В.К. Есиповым, В.А. Лисковым, И.П. Рынковым).