Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Значение фармакокинетических исследований 6-меркаптопурина в лечении острого лимфобластного лейкоза у детей

V» ь V«

1Н

На правах рукописи

ЖЕРДЕВ Андрей Владимирович

ЗНАЧЕНИЕ ФАРМАКОКИНЕТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ

6-МЕРКАПТОПУРИНА В ЛЕЧЕНИИ ОСТРОГО ЛИМФОБЛАСТНОГО ЛЕЙКОЗА У

ДЕТЕЙ

14.00.25 - фармакология 14.00.29 - гематология и переливание крови

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 2000

Работа выполнена в НИИ фармакологии РАМН (директор - академик РАМН, профессор С.Б. Середенин) и НИИ детской гематологии Минздрава РФ (директор - профессор А.Г. Румянцев)

Научные руководители:

Доктор медицинских наук, профессор А.Г. Румянцев Кандидат фармацевтических наук A.A. Литвин

Официальные оппоненты:

Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Т.А. Воронина

Доктор медицинских наук, профессор В.А. Макаров Ведущая организация:

Московский медицинский стоматологический институт им. H.A. Семашко

Защита диссертации состоится "_"_2000 г.

в_час на заседании диссертационного совета Д 001.25.01 в Научно-исследовательском институте фармакологии РАМН по адресу: 125315, Москва, ул. Балтийская, д. 8.

С диссертацией можно ознакомиться в Ученой части НИИ фармакологии РАМН.

Автореферат разослан "_"_2000 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат медицинских наук Е. А. Вальдман

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования

В настоящее время острый лимфобластный лейкоз (ОЛЛ) является одним из основных заболеваний, приводящих к смертельному исходу у детей в возрасте между 1-15 годами ( В.В. Двойрин, Е.М. Аксель, J1.A Дурнов, 1997). Основной проблемой в лечении OJIJI у детей является поддержание больных в состоянии ремиссии.

В течение последнего десятилетия достигнут значительный прогресс в лечении ОЛЛ. Показано, что ремиссия может быть получена более чем для 90% детей с ОЛЛ. При этом современные программы лечения, включающие в себя адекватную сопроводительную терапию, направленную на борьбу с высокой токсичностью химиотерапии привели к изменению патоморфоза и течения этого заболевания: в настоящее время при ОЛЛ выздоравливают 70-75% детей [Е.Б.Владимирская, Н.С. Кисляк, А.Г. Румянцев 1998; А.Г. Румянцев, Е.В. Самочатова, Н.М. Жесткова и соавт., 1994; A.C. Сингин, 1998; А.Г. Румянцев, Е.В. Самочатова, 1994; В.М.Чернов и соавт., 1997;L. Lennard, J.S. Lilleyman, 1996]. Вместе с тем, приблизительно для 30% пациентов со стандартным риском и для 80 % с высоким риском ОЛЛ возможен рецидив после полной ремиссии. По сравнению с результатами лечения первичных больных с ОЛЛ выживаемость детей с рецидивами ОЛЛ остается крайне низкой [ А.И.Карачунский и соавт., 1997, 1998]; 5-летняя выживаемость этих пациентов не превышает 35-40%.

Существенным элементом практически всех современных вариантов химиотерапии при ОЛЛ является использование 6-меркаптопурина (6МП). 6МП в организме больных подвергается многочисленным превращениям по пути образования как активных, так и неактивных метаболитов [ L. Lennard et al., 1991, 1994, 1998].

К катаболическому пути превращения 6МП в настоящее время принято относить образование таких метаболитов , как 6-метилмеркаптопурин, тиомочевая кислота, тиоксантин, метштгиомочевая кислота и недавно идентифицированный метаболит 6-меркапто-8-гидроксипурин. Все эти метаболиты являются неактивными и в основном определяются в моче больных.

К анаболическому пути превращения 6МП относят образование так называемых активных продуктов биотрансформации - бМП-нуклеозидов и нуклеотидов, 6-тиогуаниновых (ТГ) нуклеозидов и нуклеотидов, а также их

метилированных аналогов [ В. Bostrom, G.R.Erdmann, 1993; L. Lennard, J.S. Lilleyman,1997].

До конца роль всех метаболитов 6МП в настоящее время неизвестна. Однако большинство авторов считает, что в механизме действия 6МП основную роль играют 6МП и 6ТГ нухлеотиды, которые могут встраиваться в ДНК и РНК клетки, в том числе и опухолевой, с одной стороны, а также блокировать синтез пуриновью оснований de novo - с другой. Оба эти направления приводят к гибели клетки, Однако эти предварительные данные и предположения требуют серьезногс экспериментального подтверждения. В настоящее время ясно, что 6МП можнс отнести к группе, так называемых пролекарств, т.к. сам этот препарат непосредственно не оказывает противоопухолевого действия, и основную роль i проявлении лечебного эффекта играют его многочисленные продукть превращения.

В последние годы значительное внимание уделяется метилированным 6МГ нуклеозидам и нуклеотидам, образование которых в основном зависит о: активности фермента тиопурин-8-метилтрансферазы (ТПМТ). В отличие от друга ферментов, участвующих в образовании различных метаболитов 6МП, ТПМТ значительно отличается прежде всего большой вариабельностью в содержании i активности его у больных детей с OJ1JI. Этот выраженный генетически] полиморфизм в активности ТПМТ может в значительной степени влиять hi образование различных метилированных продуктов превращения 6МП и такш образом на его цитотоксичность и терапевтическое действие у больных с OJ1JI.

В связи с этим исследование фармакохинегаки (ФК) и биотрансформации 6МП выяснение роли неизмененного 6МП, продуктов его превращения в организме, также значение ТПМТ в реализации клинического эффекта препарата являете крайне актуальной проблемой, направленной на оптимизацию его применения клинической практике при комплексной терапии с другими лекарственным) препаратами при лечении детей с OJIJI.

Работа выполнялась в рамках целевой, федеральной программы "Детска гематология/онкология" на 1996 - 2001г.г.

Целью исследования явилось изучение фармакокинетических закономерносте неизмененного 6МП и ряда продуктов его превращения в плазме и эритроцита детей с OJIJI, а также выяснение их роли в проявлениях клинического эффект препарата.

Задачи исследования:

1. Разработать высокочувствительные и селективные методы количественного определения 6МП и его отдельных метаболитов на основе высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), позволяющие определять их в биологическом материале (плазме, эритроцитах) детей с ОЛЛ.

2. Изучить кинетику неизмененного 6МП в плазме и эритроцитах детей с ОЛЛ после первого приема препарата, а также в процессе комплексной терапии по стандартному протоколу лечения.

3. Изучить кинетику 6-метилмеркаптопуриновых (ММПН), 6-тиогуаниновых (ТГН) и 6-метилтиогуаниновых (МТГН) нуклеотидов в эритроцитах крови больных.

4. Провести корреляционный анализ между ФК параметрами 6МП и его метаболитов в плазме и эритроцитах крови детей с ОЛЛ.

5. Исследовать активность фермента ТПМТ у больных в сопоставлении с ФК данными 6МП и его внутриклеточных метаболитов.

6. Выяснить значение ФК характеристик неизмененного 6МП и его метаболитов в эффективности лечения больных детей с ОЛЛ.

Научная новизна работы

- Впервые с использованием ферментативного превращения нуклеотидов в нуклеозиды и ВЭЖХ разработан метод экстракции и количественного определения ММПН, ТГН и МТГН в эритроцитах крови детей с ОЛЛ;

- Установлены значительные Индивидуальные колебания в концентрациях и основных ФК параметрах неизмененного 6МП в плазме и эритроцитах крови, в постоянных уровнях концентраций ММПН и ТГН и активности ТПМТ в эритроцитах крови детей с ОЛЛ. При этом впервые установлены четкие взаимосвязи между Стал, А11С неизмененного 6МП, С» ММПН и некоторыми фармакодинамическими характеристиками: низкие показатели этих ФК параметров связаны с возникновением ранних или поздних рецидивов, а высокие - с цитотоксическим действием 6МП у детей с ОЛЛ;

- Впервые на 30 больных детях с ОЛЛ показано, что кинетика неизмененного 6МП подчиняется полиному 2-ой степени. Установленная зависимость дает возможность прогнозировать концентрации 6МП в более отдаленные интерва-

лы времени после приема препарата, что может оказаться важным для разработки оптимальных схем фармакотерапии 6МП;

- Впервые установлена высокая степень корреляции между ФК параметрами неизмененного 6МП.(Сшм и AUC) в плазме и эритроцитах крови и Css ММПН (положительная корреляция) и Css ТГН (отрицательная корреляция) в эритроцитах крови детей с ОЛЛ. Между двумя последними группами внутриклеточных метаболитов выявлен высокий уровень отрицательной корреляции;

- Показано, что у детей с ОЛЛ с высокой активностью ТПМТ в эритроцитах регистрируются значительные количества ММПН и низкие - ТГН и, наоборот, низкая активность ТПМТ сопровождается низкими показателями Css ММПН и ВЫСОКИМИ ДЛЯ Css ТГН.

Практическая значимость работы

Показано, что такие ФК параметры неизмененного 6МП, как Стад и ATJC могут рассматриваться в качестве прогностических критериев эффективности препарата при лечении детей с ОЛЛ. Низкие уровни этих параметров (значительно ниже средних показателей) указывают на возможность возникновения рецидива у больных, а высокие - на возможность проявления выраженной ней-тропении.

В соответствии с этими данными можно корректировать дозировки 6МП у каждого конкретного больного, у которого показатели Сти и AUC 6МП в значительной степени отклоняются от средних показателей соответствующего параметра. Причем, большее предпочтение следует отдать показателю Сти , а не AUC, так как для определения этого параметра не требуется большого количества забора проб крови у больного, тем более, что выявлена высокая степень корреляции между этими ФК параметрами. Показано также, что Css ММПН и активность ТПМТ могут также рассматриваться в качестве детерминант эффективности терапии детей с ОЛЛ 6МП. Низкие показатели Css ММПН и активности ТПМТ сопровождаются недостаточной эффективностью терапии 6МП, а высокие - проявлением цитотоксического действия 6МП. Таким образом, огтре-делены основные ФК детерминанты (как для неизмененного 6МП, так и для его внутриклеточного метаболита ММПН) проявления терапевтического и побочного действия 6МП у детей с ОЛЛ, которые наряду с ТПМТ могут играть важную роль в оптимизации применения 6МП у больных детей с ОЛЛ.

Положения, выносимые на защиту

' 1. Метод экстракции и количественного определения нуклеотидных метаболитов 6МП на основе ВЭЖХ и их предварительного ферментативного расщепления.

2. Кинетика неизмененного 6МП в плазме и эритроцитах крови детей с OJIJI подчиняется полиному 2-ой степени.

3. Высокая степень достоверной корреляции между С мах и AUC неизмененного 6МП в плазме и эритроцитах крови детей с ОЛЛ.

4. Концентрации нуклеотидных метаболитов 6МП в эритроцитах (ММПН, ТГН, МТГН) больных с ОЛЛ на фоне поддерживающей терапии устанавливаются на постоянном уровне и не зависят от времени определения их содержания до или после приема 6МП.

5. Высокая степень достоверной корреляции между ФК параметрами (AUC И Lmax ) неизмененного 6МП и Ск его внутриклеточных метаболитов (ММПН - положительная корреляция, ТГН - отрицательная корреляция) в эритроцитах крови больных. Между Ся ММПН и Css ТГН выявлена высокая степень отрицательной корреляции.

6. Повышенная активность ТПМТ у детей с ОЛЛ сопровождается увеличенным образованием ММПН и снижением при этом содержания ТГН.

7. ММПН, наряду с ТГН, играют важную роль в механизме действия 6МП. Выявлена зависимость между содержанием ММПН в эритроцитах крови на фоне поддерживающей терапии и возникновением рецидивов (низкие концентрации ММПН) и проявлением цитотоксического действия 6МП у детей с ОЛЛ (высокие концентрации ММПН).

8. На основе установленных закономерностей между фармакокинетиче-скими характеристиками как неизмененного 6МП, так и его внутриклеточных метаболитов и различными проявлениями действия препарата представляется возможным оптимизировать применение 6МП у детей с ОЛЛ.

Основные сведения об апробации работы

Результаты работы доложены на VIII съезде педиатров России "Современные проблемы педиатрии" (Москва, 1998 г.), V Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 1998 г.), Всероссийской научной конференции "От Materia medica к современным медицинским технологи-

ям" (С.-Петербург, 1998 г.), Всероссийской научной конференции с международным участием "Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии" (С.-Петербург, 1999 г.), Национальных днях лабораторной медицины России (Москва, 1999 г.). Публикации

Основные материалы диссертации опубликованы в 7 печатных работах. Структура и объем работы

Диссертация изложена на 128 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, трех глав с результатами собственных исследований, заключения и выводов. Работа содержит 12 таблиц и 19 рисунков. Библиографический указатель включает1! отечественных и Ю7иностранных источников.

Материалы и методы исследования

Исследование проводилось в 1996-1999 г.г. на базе НИИ фармакологии РАМН, НИИ детской гематологии МЗ РФ и Memphis St.Jude Children Research Hospital (Tennessy, USA). В исследование были включены 30 детей со стандартным риском заболевания OJ1J1: из них 20 - мужского пола. Средний возраст пациентов составлял 5,45 лег (1,5 года - 12 лет). Кроме того, у 12 больных из всей выборки фармакокинетические исследования проводились после первого приема 6МП, т.е. до начала проведения поддерживающей терапии. Остальные пациенты находились в состоянии полной ремиссии и получали поддерживающую химиотерапию по протоколу ALL-BFM-90, которая включала ежедневную дозу 6МП перорально в дозах от 24,51 до 104,17 мг/м2 и один раз в неделю метотрек-сат.

Метод количественного определения неизмененного 6MI1 в биоматериале

Для осаждения белков к 1,0 мл плазмы или эритроцитов крови добавляли 2,0 мл ацетонитрила, смесь встряхивали и центрифугировали при 8000 об/мин в течение 10 минут. После центрифугирования надосадочную жидкость переносили в экстракционные пробирки, добавляли 6,0 мл хлороформа и встряхивали в течение 15 минут на электрическом встряхивателе. Отбирали водный слой и 200 мкл его вводили в инжектор хроматографической системы Perkin-Elmer-LC 290.

Для количественного определения 6МГТ в биологических образцах и расчета процента извлечения препарата были построены калибровочные кривые, которые имели линейный характер в диапазоне концентраций 6МП 10-500 нг/мл. Процент извлечения 6МП из плазмы крови составил 86,3±4,2%, а из эритроцитов - 82,6 ±4,6%.

Для разделения неизмененного 6МП с использованием ВЭЖХ применялась аналитическая колонка с обращенной фазой Силасорб С-18 (4,6(250 мм) с размером частиц 6 мкм. Скорость потока элюента (ацетонитрил : 0,1 M уксусная кислота; 4,0 мл: 96,0 мл) составляла 1,5 мл/мин; давление в этих условиях составило 2000 psi. Температура элюента была 22°С. УФ-детектирование проводилось при длине волны 325 ни. При этой длине волны регистрировался максимум поглощения раствора 6МП. Непосредственно перед использованием элюент дегазировали в ультрасонике в течение 5 минут и пропускали через фильтр с размером пор 5 мкм. В процессе хроматографирования элюент пропускали через стальной фильтр. Благодаря такой системе очистки достигалась высокая чистота и стабильность элюента, которая позволяла избежать дополнительных необъяснимых пиков во время анализа. Объем анализируемых проб, вводимых в инжектор хроматографа, был постоянен и составлял 200 мкл. Время удерживания для 6МП в разработанных условиях составляло 3 минуты 47 секунд. Минимально обнаруживаемая концентрация неизмененного 6МП при этом составила 5 нг/мл.

Метод экстракции и количественного определения основных метаболитов 6МП

Исследовались 3 группы нуклеотидных метаболитов 6МП метилмеркаптопуриновые нуклетиды (ММПН), тиогуаниновые нуклеотиды (ТГН) и металтиогуаниновые нуклеотиды (МТГН).

Для исследования использовали дважды отмытые физиологическим растворок эритроциты крови больных. Превращение ММПН, МТГН и ТГН в соответствующие нуклеозиды (6ММПР, 6МТГР и 6ТГР) осуществлялось с использованием щелочной фосфатазы ("Реанал", Венгрия), отщепляющей фосфатные группы от нуклеотидов.

Для проведения этой части исследования отмытые физ.раствором эритроциты крови лизировали добавлением 2-х кратного объема дистилли-

рованной воды. К 425 мкл лизата эритроцитов добавляли 50 мкл 0,5 М трис-НС1 буфера, рН 7,8 и 25 мкл щелочной фосфатазы, полученной из кишок цыплят ("Реанал") 0,1 Е/мкл. Смесь инкубировали в течение 4 часов при 37°С. Затем реакцию останавливали путем добавления 50 мкл 1,8М хлорной кислоты. Пробы центрифугировали при 12000 £ в течение 10 минут при 4°С дня удаления осажденных, высокомолекулярных соединений. Надосадочную жидкость замораживали при -20°С до выполнения хроматографического анализа.

Для выполнения ВЭЖХ супернатанты нейтрализовали КОН и 200 мкл вводили в инжектор хроматографической системы Регкт-Е1шег-ЬС290. Разделение соответствующих нуклеозидов проводилось на колонке с обращенной фазой Диасорб С-16Т (4,6 х 250 мм) с размером частиц 8 мкм. Мобильная фаза состояла из 0,18М КН2РО4, рН 6,85 и метанола (1000 : 471). Скорость потока мобильной фазы составляла 1,0 мл/мин, температура элюента -22°С. Время анализа -10 минут. УФ-детектирование проводили при длинах волн 290 нм - для 6ММПР, 320 нм - для 6МТГР и 342 нм - для 6ТГР, при которых наблюдается максимальное поглощение соответствующих рибозидов. В этих условиях время удерживания 6ТГР составило 2 мин 55 сек, 6МТГР - 7 мин 10 сек, а 6ММПР - 8 мин 25 сек. Пороговая величина для количественного определения 6МТГР и 6ММПР составила 25 нг/мл, а для 6 ТГР -10 нг/мл.

Процент экстракции для 6ТГР из эритроцитов крови составил 96,5±2,3%, для 6ММПР - 98,4±1,8%, а для 6МТГР- 95,8 ±3,6%.

Фармакокинетнческнй анализ Расчет основных ФК параметров 6МП и его метаболитов проводили с использованием внемодельного метода с применением пакета специальных программ "Сотэ^Л". Период полувыведения и константу скорости элиминации на терминальном участке кривой рассчитывали с использованием метода линейной регрессии.

Статистический анализ

Корреляционный анализ между различными ФК'царамсфами-проводидся-методом регрессионного анализа. Определялись параметры как линейных, так и нелинейных уравнений. Рассчитывались средние значения концентраций и ФК

параметров ( х) в различных группах детей с ОЛЛ с соответствующими значениями стандартных ошибок (±Б ;;)■

Методика определения активности фермента ТПМТ в эритроцитарном лизате В стеклянные конические пробирки, предварительно помещенные в ледяную баню, добавляли по 100 мкл лизата эритроцитов больного и 20 мкл фосфатного буфера рН 7,5. Далее в две из приготовленных пробирок добавлялось по 10 мкл 6МП (120 мМ) и в одну - 10 мкл диметилсульфоксида (ДМСО) для контроля. Реакция запускалась добавлением 25 мкл смеси, содержащей 17,5 мкл (9 мМ дити-отрейтола; ДТТ), 2,5 мкл (3,2 мМ аллопуринола), 5,0 мкл С '"-меченого БАМ (Б-аденил-метионин).

После тщательного перемешивания смесь инкубировали в течение 1 часа при встряхивании на водяной бане при 37°С. Реакцию останавливали добавлением 2,5 мл 20% изоамилового спирта в толуоле. Смесь тщательно перемешивали в течение 10 секунд и центрифугировали при 1000 об/мин в течение 10 минут при комнатной температуре. После центрифугирования отбирали 1,5 мл надосадоч-ной жидкости, добавляли 6 мл сцинтилляционной жидкости далее пробу помещали в сцинтилляционный счетчик. Каждая проба обсчитывалась 1 мин. Параллельно был посчитан внешний контроль, включающий в себя 25 мкл смеси и 6 мл сцинтилляционной жидкости. После получения результатов путем математических расчетов была получена активность ТПМТ.

Результаты исследования 1. Фармакокинетика неизмененного 6МП в плазме и эритроцитах крови больных детей с ОЛЛ после его перорального приема

Изучалась индивидуальная вариабельность в концентрациях неизмененного 6МП в плазме и эритроцитах крови больных детей с ОЛЛ после перорального приема препарата. Больные исследовались в строго стандартизованных условиях. Несмотря на это индивидуальная вариабельность в концентрациях неизменного 6МП в различные интервалы времени после приема препарата (рис. 1), а также в таких ФК параметрах как АиС, Ка, Сши, ^и, МЯТ и Ьпь\ была в значительной степени выражена (табл.1).

Эти различия между соответствующими концентрациями и ФК параметрами достигали иногда величины, значительно превосходящей целый порядок, хотя максимальная разница в дозах, приведенных к 1 м2 отличалась не

более чем в 4 раза. У некоторых больных детей не удалось зарегистрировать фазу элиминации препарата из-за достижения Сми через 3 часа, или из-за неопределяемых концентраций 6МП во все исследуемые интервалы времени. По этой причине не удалось рассчитать у этих больных Kei и Una-

0.5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0

Время (час)

Рис. 1. Индивидуальные фармакокинетические кривые неизмененного 6МП в плазме крови детей с ОЛЙ после перорального приема препарата

Табл.1. Фармакокинетические параметры 6.MII в плазме крови детей с ОЛЛ

№/№ Сщах tmax AUCo-Зчас MRT К,. Ul2c\

больные (нг/мл) (час) (нг/млхч) (час) (час1) (час)

1 2 3 4 5 6 7

1. - - - - - -

2. 126.0 1.0 202.5 2.15 0.51 1.36

3. 112.0 1.0 166.5 2.11 0.61 1.14

.. - 4. 1080.0 0.5 1250.0 1.84 0.85 0.82

5. 1100.0 2.0 1430.0 2.49 - -

6. 51.0 2.0 97.0 2.74 - -

' 7. 50.0 1.0 92.0 2.19 0.38 1.84

8. 150.0 0.5 172.8 1.93 0.79 0.88

9. 1 Л- 65.0 3.0 117.3 2.30 1 ъд - -

И. 40.0 1.0 56.8 2.19 0.11 6.21

12. 7.0 3.0 - - - -

13: 102.4 1.0 206.4 3.13 0.39 1.76

14. 108.2 2.0 192.0 5.62 0.23 3.08

15. 190.4 2.0 379.4 3.61 0.36 1.92

16. 120.6 2.0 232.6 6.57 0.18 3.82

1 2 3 4 5 6 7

17. 76.4 1.0 138.8 3.50 0.32 2.13

18. 216.4 2.0 - - - -

19. 106.6 1.0 214.8 2.81 0.44 1.58

20. 160.2 2.0 317.9 2.31 0.64 1.08

21. 180.6 2.0 288.3 2.63 0.74 0.94

22. 126.4 1.0 237.8 3.02 0.41 1.71

23. 144.2 1.0 316.8 4.28 0.26 2.65

24. 126.2 1.0 231.6 2.53 0.50 1.39

25. 110.6 1.0 226.4 4.02 0.29 2.42

26. 50.4 2.0 - - - -

27. 112.6 1.0 203.0 2.52 0.52 1.34

28. 112.3 2.0 226.1 2.45 0.59 1.17

29. 42.6 2.0 73.3 2.56 0.73 0.95

30. 80.4 1.0 155.2 3.33 0.36 1.90

Х+БЕ 174.09± 42.20 1.52± 0.13 281.60± 63.20 2.98± 0.22 0.460± 0.040 1.91± 0.26

Примечание: Пробелы в графах связаны с невозможностью расчетов соответствующих параметров.

В нашей работе показано, что в ряде случаев не существует простого линейного выведения 6МП, как было описано ранее, а его кинетика описывается полиномом 2-ой степени (рис.2).

Рис. 2. Усредненный профиль неизмененного 6МП в плазме, крови детей с ОЛЛ после перорального приема препарата (п=30; х±8

В литературе имеются отдельные данные, указывающие на значительный разброс в концентрациях неизмененного 6МП в крови больных с ОЛЛ. Однако до настоящего времени неизвестны механизмы, отвечающие за. индивидуальную вариабельность полученных данных. Исследование воспроизводимости разработанного нами метода количественного определения неизмененного 6МП

указывают на незначительную роль этого фактора в вариабельности полученных результатов. В литературе имеются противоречивые данные по влиянию пищи на биодоступность 6МП после его перорального приема. Так как в нашем исследовании все больные получали препарат натощак, этот источник вариабельности можно практически исключить. Имеются единичные данные о том, что метотрексат может увеличивать биодоступность 6МП после его перорального приема, вероятно из-за ингибирования ксантиноксидазы. Однако в нашем случае представляется маловероятным, что это могло повлиять на полученные нами результаты, так как в I группе больных не было ни одного предварительного введения метотрексата, а во II группе детей с ОЛЛ исследования по ФК неизмененного 6МП в плазме и эритроцитах крови проводились на 5 или 6 день после приема метотрексата.

В литературе имеются данные по изучению хронофармакокинетики 6МП и показаны определенные различия в ФК неизмененного препарата в зависимости от времени суток его приема, однако влияние этого фактора на вариабельность в ФК параметрах 6МП можно полностью исключить, так как все больные принимали препарат и исследовались в одно и то же вечернее время суток.

Хотя корреляций между уровнем неизмененного 6МП в плазме и эритроцитах и клиническими результатами у больных детей с ОЛЛ не удалось обнаружить, тем не менее несколько описанных случаев указывают на возможность проведения терапевтического мониторинга по концентрациям 6МП в плазме и эритроцитах. У7 детей неизмененный 6МП определялся в плазме и эритроцитах крови в незначительных количествах в исследуемые интервалы времени или не определялся вовсе и по клиническим данным, впоследствии у них был выявлен ранний или поздний рецидив. Во втором случае (6 наблюдений) отмечалось снижение количества лейкоцитов у детей с ОЛЛ. ФК анализ показал, что у этих детей наблюдались самые высокие показатели АИС и Сми. Эти значительные колебанш АиС могли быть результатами более высокой биодоступности или более низкого плазменного клиренса (С1Р), так как АИС= ОхР7С1Р, где О - доза препарата, Б

- биодоступность. ------

Таким образом показано, что АиС И Сшах ЯВЛЯЮТСЯ НЗиб0Л66 ВАЖНЫМИ ДСТбр минирующими ФК параметрами, отражающими общее действие 6МП.

Следует также отметить, что не было отмечено существенного влияния поддерживающей терапии на основные ФК параметры 6МП, на основании чего можно сделать заключение об отсутствии индукции ферментов, отвечающих за биотрансформацию 6МП.

Таким образом, на основании выполненных в этой главе исследований не ясно, что является причиной столь выраженной вариабельности в ФК 6МП. Отсутствие прямой корреляции между концентрациями неизменного 6МП в плазме и эритроцитах крови больных детей с ОЛЛ в различные интервалы времени после приема 6МП с эффектом препарата вероятно связано с тем, что сам неизмененный 6МП не активен как таковой и необходима его внутриклеточная активация до образования так называемых активных метаболитов, что является основной задачей следующего раздела нашей работы.

Тем не менее, сильно выраженная индивидуальная вариабельность в

концентрациях и ФК параметрах неизмененного 6МП в плазме и эритроцитах больных детей с ОЛЛ и установленные взаимосвязи между их существенными отклонениями от среднего диапазона в сопоставлении с эффективностью лечения и побочными эффектами 6МП указывают на возможность проведения мониторинга этого препарата для корректировки лечения, выявления токсических проявлений действия 6МП и оценки фактора риска в развитии рецидива.

2. Фармакокинетнка внутриклеточных метаболитов 6 МП Во-первых, необходимо подчеркнуть, что ферментный метод, используемый в нашем исследовании для количественного определения метилированных и неметилированных внутриклеточных метаболитов 6МП, являлся более специфичным, чем наиболее часто используемый для этой цели химический метод [L. Lennard and Singleton, 1992], так как при этом определялись только пулы соответствующих нуклеотидов. При использовании более жесткого химического метода, разрушающего различные метаболиты до соответствующих оснований, которые затем хроматографически определяются, не представляется возможным количественно отдифференцировать и оценить вклад различных групп внутриклеточных нуклеотидных метаболитов 6МП, которые могут играть и, по-видимому, играют главенствующую роль в проявлении терапевтической активности 6МП [S. Giverhaug et al., 1997; L. Lennard etal., 1995].

Так как в нашем исследовании в виде свободной формы метилмеркапто-пуринрибозид, тиогуанинрибозид и метилтиогуанинрибозид в эритроцитах

крови детей с ОЛЛ не определялись, можно утверждать, что исследуемые метаболиты существуют главным образом в виде соответствующих рибонуклеотидов (ТГН, МТГН и ММПН). При этом не удалось зарегистрировать даже в следовых количествах неметилированные меркаптопуриновые нуклеотиды по соответствующему нуклеозиду.

Наиболее важным результатом настоящего исследования являются данные, указывающие на отсутствие изменений в концентрации изучаемых внутриклеточных нуклеотидов в лизатах эритроцитов до и после перорального приема 6МП. То есть в процессе хронического приема препарата устанавливаются постоянные уровни концентраций внутриклеточных нуклеотидных метаболитов, имеющие определенное значение для каждого индивидуального пациента. Эти данные кардинальным образом отличаются от ФК неизмененного 6МП в плазме и эритроцитах крови больных, где можно проследить кинетику препарата, зарегистрировать Смах, измерить АиС и другие ФК параметры (табл.2).

Вместе с тем, обнаружена высокая степень корреляции между ФК параметрами неизмененного 6МП и уровнем ТГН и ММПН (табл.3), что указывает на важную прогностическую значимость результатов ФК неизмененного препарата, несмотря на то, что 6МП является пролекарством и сам не оказывает терапевтического эффекта. Таблица2.

Фармакокинетнческие параметры 6МГ1 в плазме крови и

его внутриклеточных метаболитов в эритроцитах крови

Неизмененный 6МП Метаболиты

№/№ Сшах 1 шах АиСо-Зчас Ьпй С* ТГН Са, ММПН

больные (нг/мл) (час) (нг/млхч) (час) (нг/мл) * (нг/мл) *

1 2 3 4 5 6 7

1. 102.4 1.0 206.4 1.76 153.6±10.74 2344187.51

2. 108.2 2.0 192.0 3.08 174.4±13.05 1931±193.4

3. 190.4 2.0 379.4 1.92 53.08±4.15 41951105.1

4. 120.6 2.0 232.6 3.82 106.618.02 3123±85.13

5. 76.4 1.0 138.8 2.13 223.4±12.93 830.8130.33

6. 216.4 -=_ —55^6.48 42481107.1

■ 7. 106.6 1.0 214.8 1.58 1 146.2±11.69 25761119.3

8. 160.2 2.0 317.9 1.08 62.96±8.14 39691127.4

9. 180.6 2.0 288.3 0.94 78.08±11.24 35541189.3

10. 126.4 1.0 237.8 1.71 92.84±10.90 3186170.04

11. 144.2 1.0 316.8 2.65 64.54±8.25 38381142.3

1 2 3 4 5 6 7

12. 126.2 1.0 231.6 1.39 Ю2.б±9.55 314 5±64.61

13. 110.6 1.0 226.4 2.42 121.4±17.09 2883+156.1

14. 50.4 2.0 - - 246.0113.60 399.6±12.49

15. 112.6 1.0 203.0 1.34 145.8±10.23 2240±115.8

16. 112.3 2.0 226.1 1.17 101.7±10.21 3071±58.37

17. 42.6 2.0 73.3 0.95 257.0±13.40 380.8±13.63

18. 80.4 1.0 155.2 1.90 207.0±9,78 887.2+15.63

Примечание: * - средние концентрации метаболитов и соответствующие им стандартные отклонения, рассчитаны по данным до приема и через 0,5, 1,0, 2,0 и 3,0 часа после приема 6МП.

Таблица 3.

Корреляционные зависимости между фармакокинетическими параметрами неизмененного 6МП и его внутриклеточных метаболитов

Коррелируемые параметры Уравнения линейной регрессии

У X

С* ТГН Ста* 6МП у = 291.24- 1.31 х (г=-0.9109; п=18; Р<0.05)

Сж ТГН Аис 6МП у = 305.48 - 0.77 х (г= -0.9439; п=16; Р<0.05)

С* ТГН С* ММПН у = 5144.47- 19.14 х (г = -0.9941; п=18; Р<0.05)

О* ММПН Сш„ 6МП у =-470.04 + 25.49 х (г= 0.9171; п=18; Р<0.05)

С*, ММПН Аис 6МП у = -691.47 + 14.61 х (г= 0.9463; п=16; Р<0.05)

При сопоставлении данных по Си внутриклеточных метаболитов 6МП с клинической эффективностью препарата было обнаружено, что у 4 больных были самые низкие показатели Св ММПН и именно у этих больных были выявлены рецидивы. При этом уровни ТГН у них были наиболее высокими. Кроме того, у четырех больных отмечалась выраженная нейтропения и именно у этих детей регистрировались наиболее высокие уровни ММПН и низкие ТГН.

До сих пор по литературным данным считается, что главными метаболитами 6МП по механизму действия являются ТГН. Однако, наши результаты указывают на то, что существенную роль в проявлении эффекта и цитотоксического действия 6МП играют ММПН. У тех больных, у которых регистрировались самые низкие уровни ММПН эффективность 6МП была минимальной, а самые

высокие показатели ММПН сопровождались цитотоксическим действием препарата.

Логически, с позиций ТГН, эти клинические данные обсудить не представляется возможным. Известно, что механизм действия ТГН связан с возможностью этих метаболитов встраиваться в РНК и ДНК и губить при этом клетку, не давая ей возможности дальше делиться . В то же время имеются данные, что меркап-топуриновые нуклеотиды (в частности, тиоинозинмонофосфат) являются ингибиторами синтеза пуриновых оснований de novo. Не исключено, что ММПН могут оказывать свой цитотоксический эффект именно по этому механизму действия. Учитывая тот факт, что концентрации ММПН в клетках крови в значительной степени выше, чем других нуклеотидов, может быть эта группа внутриклеточных метаболитов играет более существенную роль в эффективности 6МП. Наши результаты подтверждают это предположение.

И, наконец, наибольший интерес представляет установленная обратная корреляция между ММПН и ТГН (рис. 3).

Css ММПН (нг/100 мкл эритроцитов)

5000 г

4000

3000

2000

1000

у » 6144,47 - 19,14х (т=- 0,6941; гр 18; Р«0,05>

200 250

Css ТГН (нг/100 мкл эритроцитов)

Рис.З Корреляционная зависимость между Ся ТГН и Ся ММПН в эритроцитах крови детей с ОЛЛ

Чем более высокие концентрации ММПН определяются в эритроцитах крови больных детей с ОЛЛ, тем меньшие уровни ТГН при этом регистрируются. Вероятно это связано с активностью фермента ТПМТ, ответственного за процесс метилирования метаболитов 6МП. То есть, чем выше активность этого фермента, тем больше, по-видимому, образуется при этом ММПН и соответственно меньше ТГН.

3. Влияние тиопуринметилтрансферазы на образование основных внутриклеточных метаболитов б-меркашгопурина

Установлен существенный разброс в ТПМТ активности у 18 детей с ОЛЛ. Однако в наших результатах не было ни одного больного„у которого бы не определялась активность ТПМТ, что по данным литературы встречается крайне редко - приблизительно в одном случае из 300 наблюдений. Вместе с тем у трех больных детей с ОЛЛ была отмечена низкая активность фермента, составляющая менее 10 ед/мл эритроцитов (табл. 4). Именно у этих больных наблюдалась самая низкая концентрация ММПН (менее 1000 нг/100 мкл эритроцитов) и самая высокая концентрация ТГН (более 200 нг/100 мкл эритроцитов). При проведении корреляционного анализа по всей выборке больных была впервые установлена высокая степень корреляции между активностью ТПМТ и содержанием ММНП и обратная корреляция - с содержанием ТГЩтабл. 4). Таких тесных корреляций между этими величинами ранее выявлено не было. Установленные корреляции являются крайне важными, так как дают возможность по активности ТПМТ прогнозировать содержание главных внутриклеточных метаболитов 6МП, играющих, как было показано в предыдущих разделах, ведущую роль в проявлении основного и побочного эффектов препарата. В мировой практике основное внимание при изучении активности ТПМТ направлено на выявление дефицитных больных, у которых не выявляется активность ТПМТ и которые чаще всего погибают от токсических проявлений действия 6МП, что согласно нашим данным может быть связано с образованием больших количеств ТГН.

Таблица 4

Концентрации ТГН и ММПН (нг/100 мкл эритроцитов) и ТПМТ активность (ед/ ил эритроцитов) у детей с ОЛЛ

№№ наблюдений ТГН ММПН ТПМТ

1 2 3 4

13 153,6 2344 15,48

14 174,4 1931 11,96

15 53,08 4195 34,70

16 106,6 3123 18,00

17 223,4 830,8 10,73

18 55,62 4248 28,96

19 146,2 2576 15,97

20 62,96 3969 26,85

21 78,08 6554 35,82

22 92,84 " 3186 18,29

23 65,54 3838 20,66

24 102,6 3145 17,77

25 121,4 2883 16,74

26 245,0 399,6 6,72

27 145,8 2240 12,91

28 101,7 3071 16,44

29 257,0 877,2 9,27

. 30 207,0 877,2 9,27

у=а+Ьх

у=-125,58+162,80х х = ТПМТ г=0,9372 у= ММПН

п=18 р < 0,05

у=а+Ьх

у=246,61-6,40х х=ТПМТ г=- 0,8754 у=ТГН

п=18 р < 0,05

ВЫВОДЫ

1.Разработан новый метод с применением ферментативного расщепления и ВЭЖХ для количественного определения трех основных групп внутриклеточных метаболитов 6-меркаптопурина - тиогуаниновых, метилтиогуаниновых и метилмеркаптопуриновых нуклеотидов в эритроцитах крови детей с острым лимфобластным лейкозом.

2.0бнаруженысущёствён1Шеттди^ и

фармакокинетических параметрах как для неизмененного 6-меркаптопурина в плазме и эритроцитах крови, так и для двух групп его внутриклеточных метаболитов - метилмеркаптопуриновых и тиогуаниновых нуклеотидов, а также активности тиопуринметилтрансферазы в эритроцитах крови.

3. Установлено, что кинетика неизмененного 6-меркаптопурина как в плазме, так и в эритроцитах крови больных подчиняется полиному 2-ой степени.

4. Установлены границы значений фармакокинетических параметров неизмененного 6-меркаптопурина ( максимальной концентрации, 80-130 нг/мл, и площади под фармакинетической кривой, 155-240 нг/мл • час ), при которых у детей с острым лимфобластным лейкозом не наблюдается выраженного побочного действия препарата, а также возникновение рецидива.

5. Концентрации метилмеркаптопуриновых, тиогуаниновых и метилтиогуа-ниновых нуклеотидов на фоне поддерживающей терапии у больных устанавливаются на постоянном уровне и не зависят от времени определения их содержания - до или после приема 6-меркаптопурина.

6. Выявлен высокий уровень корреляций между фармакокинетическими параметрами неизмененного 6-меркаптопурина и постоянными уровнями концентраций его внутриклеточных метаболитов.

7. Показано, что с увеличением активности фермента тиолуринметилтранс-феразы в эритроцитах больных с острым лимфобластным лейкозом увеличивается образование метилмеркаптопуриновых нуклеотидов и соответственно снижается содержание тиогуаниновых нуклеотидов.

8. Постоянные уровни концентрации метилмеркаптопуриновых нуклеотидов, наряду с фармакокинетическими параметрами неизмененного 6-меркаптопурина и активностью тиопуринметилтрансферазы могут служить предикторами клинической эффективности 6-меркаптопурина у детей с острым лимфобластным лейкозом.

Практические рекомендации

1. Разработанные методы количественного определения неизмененного 6МП и его "активных" нуклеотидных метаболитов могут быть использованы для изучения фармакокинетики и биотрансформации препарата в эксперименте и клинике.

2. Фармакокинетические параметры неизмененного 6МП Стк и AUC могут рассматриваться в качестве предикторов фармакотерапии ОЛЛ у детей. При Стах меньше 80 нг/мл и AUC меньше 155 нг/млхчас у детей с ОЛЛ отмечается ранние или поздние рецидивы, а при Сши больше 130 нг/мл и AUC больше 240

нг/млхчас - регистрируется цитотоксическое действие препарата, что необходимо учитывать при оптимизации лечения 6МП.

3. Css двух групп внутриклеточных метаболитов 6МП - ТГН и ММПН могут служить предикторами эффективности терапии 6МП. Css ММПН меньше 880 нг/100 мкл эритроцитов и Css ТГН больше 200 нг/100 мхл эритроцитов сопровождаются появлением рецидивов у детей с OJIJ1, a Css ММПН больше 3200 нг/100 мкл эритроцитов и Css ТГН меньше 90 нг/100 мкл эритроцитов - нейтропенией, что указывает на возможность проведения лекарственного мониторинга на основе определения Css "активных" метаболитов 6МП.

4. Активность фермента ТПМТ также может рассматриваться в качестве прогностического критерия эффективности лечения 6МП OJIJI у детей. Активность ТПМТ меньше 10 ед/мл эритроцитов указывает на низкую эффективность фармакотерапии 6МП, а активность выше 20 ед/мл эритроцитов - на возможность проявления побочных эффектов 6МП.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Фармакокинетика 6-меркаптопурина у детей с острым лимфобластным лейкозом.// Материалы VIII съезда педиатров России "Современные проблемы педиатрии". М., 1998, С.319 (в соавт. с Г.Б. Колывановым, Н.М. Трубиной, А.Г. Румянцевым, Е.В. Самочатовой).

2. Значение фармакохинетических исследований в создании и применении лекарственных средств,// Ж. Клиническая лабораторная диагностика, 1998, №9, С.16-17 (в соавт. с В.П. Жердевым, Г.Б. Колывановым, Г.Г. Незнамовым, A.A. Литвиным).

3. Индивидуальные различия в фармакокинетике 6-меркапторурина у детей с острым лимфобластным лейкозом.// Тез. докл. V Российского национального конгресса "Человек и лекарство". М., 1998, С.272 (в соавт. с Н.М. Труби-ной, А.Г. Румянцевым, Е.В. Самочатовой).

4. Возможность оптимизации фармакотерапии острого лимфобластного лейкоза у детей-б-мсркапходущном (фармакокинетичесхое исследование).// Тез. докл. Всероссийской научной конференции "От Materia тесПсаТГсовременньш медицинским технологиям". С.-Петербург, 1998, С.56 (в соавт. с Г.Б. Колывановым, A.A. Литвиным, Г.И. Ковалевым, В.П. Жердевым).

5. Фармакокинетические аспекты оптимизации применения лекарственных средств.// Тез. докл. Всероссийской научной конференции с международным участием "Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии". С.-Петербург, 1999, С.71 (в соавт. с В.П. Жердевым, Г.Г. Незнамовым, А.К. Сариевым, A.A. Лигвиным, Г.Б. Колывановым, С.С. Бойко).

6. Сравнительный анализ метилированных и неметилированых метаболитов 6-меркаптопурина в эритроцитах детей с острым лимфобластным лейкозом.// Мат. докл. "Национальных дней лабораторной медицины России", Ж. Клиническая и лабораторная диагностика, 1999, С.40 (в соавт. с Г.Б. Колывановым, A.A. Литаиным, А.Г. Румянцевым, В.П. Жердевым).

7. Фармакокинетика 6-меркаптопурина и его нуклеотидных метаболитов в плазме и эритроцитах крови детей с острым лимфобластным лейкозом.// Ж. Гематология и трансфузиология, 1999, №6, С. 6-10 (в соавт. Г.Б. Колывановым, A.A. Литвиным, А.Г. Румянцевым, Н.М, Трубиной, В.П. Жердевым).

Список условных сокращений

1. ОЛЛ-острый лимфобластный лейкоз

2. 6МП-6-меркаптопурин

3. ФК-фармакокинетика

4. ТПМТ- тиопурин- S- метилтрансфераза

5. 6ТГ- 6-тиогуанин

6. Р-рибозид

7. ЩФ- щелочная фосфатаза

8. КО- ксантиноксидаза

9. ТГН- 6-тиогуаниновые нуклеотиды

10. МТГН- 6-метилтиогуаниновые нуклеотиды 11.6ТГР-6 тиогуан рибозид

12. 6МПР- 6-неркаптопурин рибозид

13. 6ММПР- 6-метилмеркаптопурин рибозид

14. 6МТГР- 6-метилтиогуанин рибозид

15. ММПН-6- метилмеркаптопуриновые нуклеотиды

16. ДТТ-дитиотрейтол

17. 6ММП- 6 метилмеркаптопурин

18. Смвх- максимальная концентрация

19. AUC-гагощадь под ФК кривой

20. MRT-среднее время удержания препарата в организме

21. Clp-плазменный клиренс

22. F-биодоступность

23. ВЭЖХ-высокоэффективная жидкостная хроматография

24. tmax - время достижения максимальной концентрации

25. Kei - константа скорости элиминации

26. ti/2ei - период полувыведения.

27. Css-постоянный (равновесный) уровень концентрации.