Автореферат и диссертация по медицине (14.01.01) на тему:Функциональное состояние перитонеальных макрофагов и влияние на него in vitro препарата глюкозаминилмурамилдипептида (ГМДП) у женщин с наружным генитальным эндометриозом
Автореферат диссертации по медицине на тему Функциональное состояние перитонеальных макрофагов и влияние на него in vitro препарата глюкозаминилмурамилдипептида (ГМДП) у женщин с наружным генитальным эндометриозом
ЕЛИСЕЕВА МАРИЯ АНДРЕЕВНА
ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ ПЕРИТОНЕАЛЬНЫХ МАКРОФАГОВ И ВЛИЯНИЕ НА НЕГО IN VITRO ПРЕПАРАТА ГЛЮКОЗАМИНИЛМУРАМИЛДИПЕПТИДА (ГМДП) У ЖЕНЩИН С НАРУЖНЫМ ГЕНИТАЛЬНЫМ ЭНДОМЕТРИОЗОМ
14.01.01 - акушерство и гинекология 14.03.09-клиническая иммунология, аллергология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук
" 0 ЛЕИ 2070
Иваново 2010
004617101
Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении «Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства имени В.Н. Городкова» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации. Научные руководители: Заслуженный деятель науки РФ, заслуженный врач РФ,
доктор медицинских наук, профессор Посисеева Любовь Валентиновна
доктор биологических наук Анциферова Юлия Станиславовна
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор (ГУЗ «Московский областной научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии»
Минздрава Московской области) Попов Александр Анатольевич
доктор медицинских наук, профессор (ГОУ ВПО «Российский государственный
медицинский университет Росздрава») Козлов Иван Генрихович Ведущая организация - ГОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»
Защита диссертации состоится «_» декабря 2010 года в «_» часов на
заседании диссертационного совета Д208.028.01 при ФГУ «Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства имени В.Н. Городкова» Минздравсоразвития России по адресу: 153045, Россия, г. Иваново, ул. Победы, 20.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «Ив НИИ М и Д им. В.Н. Городкова» Минздравсоразвития России.
Автореферат разослан «_» ноября 2010 года.
Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук
И.А.Панова
Актуальность научного исследования
Эндометриоз относится к числу наиболее распространенных гинекологических заболеваний, сопровождается нарушением менструальной и репродуктивной функций, стойким болевым синдромом, снижением трудоспособности больных (Адамян Л.В., 2010; Кудрина Е.А., 2010; Khan K.N., е.а., 2008). Частота его встречаемости среди женщин репродуктивного возраста составляет по данным разных авторов 5-15% (Rodgers P.A., е.а., 2009), при этом у женщин с бесплодием неясной этиологии эндометриоз диагностируется в 4060% случаев (Высоцкий М.М. с соавт., 2009; Ozkan S., е.а., 2008; Rogers Р.А, е.а., 2009). Согласно статистическим данным, в последние годы отмечен значительный рост заболеваемости эндометриозом (Адамян Л.В., Осипова A.A., 2010; Э.К. Айламазян, 2002). Таким образом, проблема изучения патогенеза эндометриоза и поиск новых путей его лечения имеет в настоящее время не только медицинское, но и социальное значение.
Показано, что в механизмах развития эндометриоза важную роль играют иммунные нарушения (Сельков С.А, 2002; Полумисков Д.М., 2007; Шаалалп Ю.С., 2010; Barcz Е., 2000; Sirístatidis С., 2006). В последние годы пристальное внимание уделяется изучению особенностей функционирования перитонеальных макрофагов при эндометриозе (Santanam N., 2002; Sidell N., е.а., 2002 , Khan K.N., е.а., 2008). Установлено, что перитонеальные макрофаги женщин с эндометриозом гиперактивированы, продуцируют большое количество цитокинов и факторов роста (Sidell N ., е.а., 2002 , Khan KN, е.а., 2008). Однако при эндометриозе до сих пор не изучена функция макрофагов как «клеток-мусорщиков». Известно, что одной из важных функций перитонеальных макрофагов является удаление клеточного дебриса и апоптирующих клеток через специфические поверхностные рецепторы, получившие название «рецепторы-мусорщики» или SRs (Sidell N., 2002; Moore K.J., 2006). Но в литературе отсутствуют данные о характере экспрессии SRs при взаимодействии макрофагов с аутологичным эндометрием при эндометриозе. Так же недостаточно изучены особенности экспрессии других
функциональных молекул, например интегриновых молекул и ко-стимуляторных рецепторов, на поверхности перитонеальных макрофагов женщин с наружным генитальным эндометриозом.
Помимо нарушения функции макрофагов, большое значение в патогенезе эндометриоза имеют изменения на уровне эутопического эндометрия (Vinatier D., е.а, 2000). Исследованиями последних лет было показано, что в эутопическом эндометрии женщин с эндометриозом нарушена экспрессия минорных трансплантационных антигенов, ряда интегриновых и адгезионных молекул (Vinatier D., е.а, 2000). Противоречивые данные получены при изучении особенностей экспрессии в эндометрии белков теплового шока или HSP молекул, обладающих цитопротективным действием. Сообщалось о повышении экспрессии ряда HSP в эутопическом эндометрии (Ota Н.. е.а., 1997) и в ткани очага эндометриоза (Matsuzaki S., е.а., 2006). Также есть данные об отсутствии выраженных изменений в экспрессии HSP в эндометрии пациенток с эндометриозом (Nip ММ., е.а., 1994). Пока еще не установлены факторы, которые могут влиять на изменение экспрессии HSP молекул в эндометрии женщин с эндометриозом.
В настоящее время возрос интерес исследователей к проблеме медикаментозной коррекции иммунных нарушений у женщин с наружным генитальным эндометриозом (Сельков С.А., 2002; Шаалали Ю.С., 2010). Однако до настоящего времени не проводилось изучение возможного направленного воздействия на функцию перитонеальных макрофагов. Одним из препаратов, оказывающих влияние на фагоциты, является Ликопид. В состав этого препарата входит глюкозаминилмурамилдипептид (ГМДП), который является компонентом пептидогликанов, входящих в состав клеточной стенки всех бактерий (Козлов И.Г. 2005). Для лечения женщин с эндометриозом и бесплодием ранее Ликопид не применялся. Цель исследования:
Установить новые механизмы развития наружного генитального эндометриоза на основании оценки функционального состояния
перитонеальных макрофагов при их взаимодействии с клетками эндометрия и обосновать в опытах in vitro целесообразность использования препарата глюкозаминилмурамилдипептида (ГМДП) в терапии данной патологии. Задачи исследования:
1. Дать сравнительную характеристику состояния соматического и репродуктивного здоровья женщин с бесплодием, обусловленным наружным генитальным эндометриозом и трубно-перитонеапьным фактором.
2. Определить особенности экспрессии функциональных молекул (CDllb, CD49e, CD95, CD86) и «рецепторов-мусорщиков» (CD36 и CD204) пери-тонеальными макрофагами у женщин с ненарушенной репродуктивной функцией и у женщин с бесплодием, обусловленным наружным генитальным эндометриозом и трубно-перитонеапьным фактором.
3. Выявить особенности экспрессии мРНК белков теплового шока (HSP27) в эутопическом и эктопическом эндометрии у женщин с наружным генитальным эндометриозом.
4. В эксперименте in vitro определить характер изменений экспрессии функциональных молекул и «рецепторов-мусорщиков» перитонеальны-ми макрофагами после их взаимодействия с тканью аутологичного эндометрия, а также оценить влияние макрофагов и перитонеальной жидкости на экспрессию белков теплового шока (HSP27) клетками эутопиче-ского эндометрия при наружном генитальном эндометриозе.
5. В опытах in vitro установить влияние препарата ГМДП на функциональное состояние перитонеальных макрофагов у женщин с наружным генитальным эндометриозом и оценить возможность применения нанораз-мерных транспортных систем на основе модифицированного кремнезема для направленного транспорта ГМДП в макрофаги.
Научная новизна исследования
Установлены новые механизмы развития наружного генитального эндометриоза и связанного с ним бесплодия. Выявлено, что развитие с наружного генитального эндометриоза у женщин связано с угнетением
экспрессии на поверхности макрофагов «рецепторов-мусорщиков» (С036 и С0204) и ингегриновых молекул (С049е), а нарушение фертильности у этих больных - со сниженной экспрессией адгезионных (С011Ь) и сигнальных ко-стимуляторных (СЭ8б) молекул перитонеальными макрофагами.
Показано, что в ткани очага эндометриоза повышен синтез цитопротективных молекул Н5Р27, а перитонеальная жидкость женщин с эндометриозом оказывает стимулирующее действие на экспрессию мРНК Н8Р27 в эутопическом эндометрии.
Установлено, что при наружном генитальном эндометриозе нарушено взаимодействие перитонеальны.х макрофагов с аутологичным эндометрием, что проявляется отсутствием реакции со стороны «рецепторов-мусорщиков» и снижением экспрессии интегриновых и адгезионных молекул С049е и С011Ь на поверхности макрофагов после их стимуляции клетками эндометрия.
Дано теоретическое обоснование к использованию препарата ГМДП при наружном генитальном эндометриозе. Выявлено стимулирующее действие препарата ГМДП на экспрессию «рецепторов-мусорщиков» перитонеальными макрофагами женщин с наружным генитальным эндометриозом и бесплодием.
Показано, что наноразмерные частицы кремнезема (100 нм в диаметре) специфически связываются с перитонеальными макрофагами, не оказывая влияния на их жизнеспособность и уровень активации.
Определена возможность топической доставки препарата ГМДП в перитонеальные макрофаги женщин с наружным генитальным эндометриозом с помощью наноразмерной транспортной системы на основе модифицированного кремнезема, при этом эффект действия транспортной наносистемы с ГМДП превышает действие чистого препарата ГМДП Практическая значимость исследования
Разработаны нормативные показатели уровня экспрессии «рецепторов-мусорщиков» СТО6 и СЭ204 перитонеальными макрофагами.
Акушерско-гинекологической практике предложены новые критерии для оценки функционального состояния перитонеальных макрофагов у женщин с
наружным генитальным эндометриозом и бесплодием, связанные с определением экспрессии «рецепторов-мусорщиков» перитонеальными макрофагами.
Обоснована in vitro возможность применения
глюкозаминилмурамилдипептида (в составе препарата Ликопид) для коррекции нарушенной функции перитонеальных макрофагов при наружном генитальном эндометриозе.
Дано обоснование к дальнейшему исследованию применения препарата Ликопид в комплексе лечебных мероприятий у женщин с наружным генитальным эндометриозом и бесплодием Положения, выносимые на защиту
Развитие наружного генитального эндометриоза у женщин связано с угнетением функции «клеток-мусорщиков» перитонеальных макрофагов, приводящим к нарушению взаимодействия макрофагов с эутопическим эндометрием, и с особенностями цитокинового профиля перитонеальной жидкости, которая стимулирует синтез цитопротективной молекулы HSP27 в клетках эндометрия, обуславливая высокую экспрессию HSP27 в ткани эндометриоидного очага.
Препарат ГМДП in vitro стимулирует экспрессию «рецепторов-мусорщиков» перитонеальными макрофагами женщин с наружным генитальным эндометриозом и бесплодием.
Топическая доставка ГМДП в перитонеальные макрофаги с использованием транспортной наносистемы на основе модифицированного кремнезема в большей степени, чем чистый препарат ГМДП, стимулирует экспрессию «рецепторов-мусорщиков» перитонеальными макрофагами женщин с наружным генитальным эндометриозом и бесплодием и восстанавливает ответ макрофагов на стимуляцию клетками аутологичного эндометрия. Апробация работы
Основные результаты исследований по теме диссертации докладывались и обсуждались на: XIII Всероссийском научном Форуме с международным участием имени академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Птербурге» (С.-Петербург, 2009), 1 Международной научной школе "Наноматериалы и нанотехнологии в живых системах" (Москва, 2009), 12th International Symposium for Immunology of Reproduction (Varna, Bulgaria, 2009), 13-й международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука 21 века» (Пушино, 2009), областном фестивале «Молодые ученые - развитию Ивановской области» (Иваново, 2009), XIII Международном конгрессе с курсом эндоскопии «Новые технологи в диагностике и лечении гинекологических заболеваний» (Москва, 2010), V111 конференции иммунологов Урала (Сыктывкар, 2010).
Внедрение результатов работы в практику
Результаты диссертационной работы внедрены в практику гинекологической клиники Федерального государственного учреждения ((Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства имени В.Н.Городкова Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации».
Личное участие автора
Автором самостоятельно проводился набор материала по теме диссертации, выполнена систематизация и компьютерная обработка полученных результатов.
Самостоятельно проводились отбор пациенток в группы, согласно критериям включения и исключения, обследование и лечение пациенток. Принимала участие в проведении иммунологических исследований и постановке эксперимента. Была проведена систематизация, статистическая обработка, анализ и описание полученных результатов. Публикации
По теме диссертации опубликовано 15 печатных работ, из них 3 - в журналах и изданиях, рекомендованных ВАК РФ.
Объём и структура диссертации
Диссертация изложена на 139 страницах машинописного текста, содержит введение, обзор литературы, 5 глав собственных исследований, обсуждение полученных результатов, выводы и практические рекомендации. Библиографический указатель включает 205 источников, в том числе 43 отечественных и 162 иностранных источников. Работа иллюстрирована 23 таблицами и 11 рисунками.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования
Работа выполнена на базе ФГУ «Ивановский НИИ материнства и детства им. В.Н.Городкова» Минздравсоразвития России, директор д.м.н. А.И.Малышкина. Исследования проводились в гинекологической клинике, эндоскопическом отделении - зав. к.м.н. В.Н. Романов, лаборатории клинической иммунологии - зав. д.м.н. профессор Н.Ю. Сотникова, лаборатории патоморфологии и электронной микроскопии - зав. д.м.н. профессор Л.П. Перетятко.
Всего было обследовано 167 женщин: 35 практически здоровых фертильных женщин, поступившие на плановую хирургическую стерилизацию (контрольная группа); 100 женщин с наружным генитальным эндометриозом, ассоциированным с бесплодием (основная группа); 32 женщины с бесплодием, обусловленным трубно-перитонеальным фактором (группа сравнения).
Женщины контрольной группы поступали в отделение эндоскопической хирургии для плановой хирургической стерилизации по социальным показаниям согласно приказа МЗ РФ №303 от 1993 года. Перед проведением оперативного вмешательства женщины данной группы обследовались в женских консультациях г. Иваново и Ивановской области, в консультативно-диагностической поликлинике НИИ МиД.
Женщины с наружным генитальным эндометриозом и трубно-перитонеальным фактором обследовались на специализированном приеме в КДП ФГУ «Ивановский НИИ материнства и детства им. В.Н. Городкова»
Минздравсоцразвития России в отделении нарушений репродукции гинекологической клиники НИИ МиД. Учитывались результаты предыдущих исследований.
На каждую женщину заполнялась «Карта клинико-лабораторных исследований», в которую вносились данные анамнеза, обследования из истории болезни и амбулаторных карт, сведения о тактике ведения больных и исходах заболевания.
Материалом для исследования служили: перитонеальная жидкость, биоптаты эндометрия из полости матки и ткань эндометриоидных очагов. Забор биологического материала проводился в момент лапароскопии. Образцы исследуемого материала забирались в стерильные пробирки.
В схему обследования входили общеклинические, электрофизиологические (УЗИ, ЭКГ), морфологические, иммунологические исследования.
Иммунологические методы:
- выделение популяции мононуклеарных клеток (МНК) перитонеальной жидкости стандартным методом скоростного центрифугировании в градиенте плотности фиколл-верографина (d=l,078);
определение экспрессии мембранных рецепторов перитонеальными макрофагами с помощью моноклональных антител анти-CDllb (ООО «Сорбент», Москва), CD49e (BD Boisceinces, USA), CD95 (Caltag Laboratories, USA), CD86, CD36 (Beckman Coulte, Francer) и CD204 (R&D Systems, USA) методом проточной цитометрии на приборе FACScan (Becton Dickinson, USA). Анализ результатов проводили в программе "CellQuest Pro" (Becton Dickonson, USA).
- определение экспрессии мРНК HSP27 в ткани эутопического и эктопического эндометрия методом количественной полимеразной цепной реакции (RT-PCR) в масштабе реапьного времени на амплификаторе с оптической насадкой ¡Cycler iQ (BIO-RAD, USA). В работе использовали праймеры и зонды для HSP27 и р2-микроглобулина (ЗАО «Синтол», Москва, Россия);
- совместное культивирование in vitro эксплантов эутопического эндометрия женщин основных клинических групп наблюдения с обогащенной популяцией аутологичных перитонеальных макрофагов, или в присутствии аутологичной перитонеатьной жидкости при 37°С и 5% С02 в течение 24 часов с последующим разделением эндометриальных фрагментов и макрофагов и определение уровня экспрессии мРНК HSP27 в эндометрии и уровня экспрессии мембранных рецепторов макрофагами;
- определение in vitro влияния ГМДП на функциональное состояние перитонеальных макрофагов женщин с наружным генитальным эндометриозом путем инкубирования обогащенной популяции макрофагов или совместной культуры макрофагов с аутологичным эндометрием в среде RPMI 1640, содержащей ГМДП в концентрации 2 мкг/мл, в течение 24 часов при 37°С и 5% СО; с последующем определении уровня экспрессии функциональных молекул макрофагами;
- определение in vitro влияния транспортной наносистемы, созданной на основе препарата ГМДП и диоксида кремния, на функцию перитонеальных макрофагов при наружном генитальном эндометриозе. В работе были использованы АПТЭС-модифицированные частицы кремнезема размером 100 и 200 нм. Синтез частиц был проведен в Учреждении Российской академии наук Институте химии растворов РАН в лаборатории «Химия гибридных нанокомпозитов и супрамолекулярных систем». Для оценки уровня клеток, реагирующих с наноразмерными частицами кремнезема, были синтезированы модифицированные частицы с иммобилизованными иммуноглобулинами овцы, мечеными флюоресецеинизотиоцианатом (FITC). При создании транспортной системы проводилась адсорбция ГМДП из раствора на поверхность частиц кремнезема за счет нековалентных электростатических и гидрофобных взаимодействий. Инкубировали обогащенную популяцию макрофагов, а также совместную культуру макрофагов с аутологичным эндометрием женщин с наружным генитальным эндометриозом в присутствии наноразмерной транспортной системы на основе кремнезема и ГМДП в течение 24 часов при
37°С и 5% С02 с последующем определении уровня экспрессии функциональных молекул макрофагами.
Морфологические методы
Производилась обзорная гистология. Оперативно удаленный материал фиксировался в 10%-ном нейтральном формалине в течение 72 часов. После стандартной парафиновой проводки готовились срезы толщиной 4-5 мкм, окрашивались гематоксилином Эрлиха с окраской эозином и заключались в бальзам. В обзорных препаратах изучалась межуточная ткань, сосудистое русло и мышечный компонент. В работе использовался микроскоп «Биолам» с бинокулярной насадкой А У - 12 (ЛОМО).
Статистические методы исследования
Статистическая обработка данных проводилась с расчетом среднего арифметического и ошибки среднего арифметического с использованием программы Statistica 6.0. Достоверность различий показателей женщин с эндометриозом по сравнению с контрольной группой определялась по t-критерию Стьюдента. Пороговые значения уровня CD36+ и С0204+макрофагов, характерные для наружного генитального эндометриоза. определяли с помощью ROC-анализа с использованием ROC-кривой (Receiver Operator Characteristic).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Под наблюдение были взяты пациентки репродуктивного возраста от 2635 лет. Средний возраст составил 32,58±0,79 года в контрольной группе, 29,43±0,41 лет - в основной группе и 29,40±0,79 лет - в группе сравнения. Сравнительный анализ показателей среднего возраста в обследованных группах не имел достоверных отличий.
Средний возраст менархе и характер становления менструальной функции не различались у обследованных женщин. Нарушение менструального цикла по типу дисменореи встречалось у 50,00% женщин основной группы, что достоверно чаще, чем в контрольной группе (20,00%) и в группе сравнения (25,00%) (р<0,01 во обоих случаях).
Репродуктивная функция была реализована у 100% женщин контрольной группы. Роды в анамнезе были у 22% женщин основной группы и у 31% женщин группы сравнения. Одновременно в этих группах наблюдения отмечался высокий процент женщин, не имевших в анамнезе беременности (56% и 22% соответственно), что достоверно отличает этих пациенток от группы контроля (р<0,001 во всех случаях). Общее количество абортов в основной группе (19,00%) и группе сравнения (25,00%) достоверно ниже было по сравнению с контрольной группой (74,29%, р<0,01и р<0,001, соответственно).
У всех женщин основной группы и группы сравнения на момент обследования было диагностировано бесплодие, при этом у женщин с наружным гени-тальным эндометриозом чаще отмечалось первичное бесплодие (56,00%). У женщин с трубно-перитонеальным фактором превалировало вторичное бесплодие (78,13%). Кроме того, у пациенток группы сравнения отмечалась высокая частота эктопических беременностей в анамнезе (37,50%), по сравнению с основной группой и группой контроля (р<0,001, в обоих случаях).
Анализ данных гинекологического анамнеза показал, что у пациенток с наружным генитальным эндометриозом и бесплодием в 12% случаев отмечалась ранее произведенная деструкция очагов эндометриоза (р<0,001 в обоих случаях). Кроме того, для женщин основной группы (10,00%) была характерна сниженная по сравнению с контрольной группой (25,71%) частота выявления эктопий шейки матки (р<0,05). Отличительной чертой группы сравнения было наличие в анамнезе реконструктивно-пластических операций на маточных трубах, а также туботомии и тубэктомии, и воспаления придатков маткл.
При изучении характера соматической патологии отмечено, что у женщин основной группы в анамнезе с высокой частотой отмечались аллергические реакции (23,00%), что достоверно отличало этих пациенток от женщин контрольной группы (5,71%) и группы сравнения (9,38%) (р<0,01 и р<0,05, соответственно). У женщин с трубно-перитонеальным бесплодием выявлена повышенная частота заболеваний мочевыделительной системы по сравнению с основной группой и группой контроля (15,63% случаев - в группе
сравнения, 0% случаев - в контрольной группе и 1% случаев - в основной группе, р<0,05 и р<0,02 соответственно).
В ходе проведения лапароскопической операции у всех женщин основной группы был выявлен наружный генитальный эндометриоз, что является отличительной чертой данной группы. По степени распространенности эндометриоидного процесса у женщин основной группы наиболее часто встречалась II степень - в 77%, III и IV степень была выявлена у 20 % пациенток. У женщин группы сравнения в 100% случаев был диагностирован хронический сальпингит, который сочетался со спаечным процессов в малом тазу в 22% случаев (р<0,001).
При изучении показателей функционального состояния перитонеальных макрофагов было установлено, что у женщин основной группы в перитонеальной жидкости было снижено содержание макрофагов, экспрессирующих на своей поверхности CDllb (72,83 ±2,29%) и CD86 молекулы (50,89 ±2,03%), по сравнению с группой контроля (CD11Ь+ - 85,21± 1,57%; CD86+ - 65,23 ±8,04%) (р<0,01 во всех случаях). Такие же изменения были выявлены и у пациенток группы сравнения (CDllb+ - 70,84 ±3,61%, р<0,01, CD86+- 47,13± 4,14, р<0,02).
Известно, что низкий уровень экспрессии CDllb молекул свидетельствует об угнетении опсонизированного фагоцитоза (Wu R., 2004). Нарушение функционирования CD86 рецепторов по данным литературы приводит к угнетению реакций адаптивного иммунитета, что часто ассоциируется с усилением реакций врожденного иммунитета (Seliger В., 2008). По-видимому, выявленные нами нарушения экспрессии CD11Ь и CD86 молекул могут отражать наличие локального хронического воспаления при нарушениях фертильности у пациенток с трубно-перитонеальным фактором и с наружным генитальным эндометриозом.
Только для женщин с эндометриозом, ассоциированным с бесплодием, было характерно угнетение экспрессии интегриновых молекул CD49e и так называемых «рецепторов-мусорщиков» CD36 и CD204 на поверхности
перитонеальных макрофагов, по сравнению с контрольной группой (CD49e -основная группа 80,15± 2,34%, контрольная группа -87,91 ±2,19%; CD36 -основная группа - 57,76 ±1,93%, контрольная группа - 70,86± 9,22%; CD204 -основная группа 53,20 ±2,36%, контрольная группа - 68,31± 5,37%, р<0,01 во всех случаях). Подобных изменений не было отмечено в группе сравнения, что позволяет сделать вывод о том, что эти нарушения не связаны с бесплодием, а определяются наличием эндометриоидных очагов в перитонеальной полости у женщин основной группы.
Низкий уровень экспрессии CD49e молекул, являющихся рецепторами к фибронектину (Bowen J., 2000), на поверхности перитонеальных макрофагов женщин с наружным генитальным эндометриозом может вести к нарушению своевременного распознавания макрофагами аутологичных клеток, в том числе и клеток эктопического эндометрия. «Рецепторы-мусорщики» являются важнейшими функциональными рецепторами макрофагов, участвуя в осуществлении реакций фагоцитоза и способствуя удапению клеточного дебриса из перитонеальной полости (Moore K.J., Freeman M.W., 2006). Выявленное нами снижение экспрессии «рецепторов-мусорщиков» А и В типа перитонеальными макрофагами женщин с наружным генитальным эндометриозом, может приводить к нарушению своевременной элиминации эндометриалышх клеток из перитонеальной полости макрофагами.
В эндометрии женщин основных клинических групп наблюдения мы оценили характер синтеза белков теплового шока - HSP27. При эндометрнозе в эктопическом эндометрии уровень экспрессии мРНК HSP27 не отличался от такового у женщин контрольной группы и группы сравнения (контрольная группа - 0,23+0,05 копий парх104/мкл; основная группа - 0,22±0,08 копий парх104/мкл; группа сравнения - 0,41±0,19 копий парх104/мкл, р>0,05 во всех случаях). Однако в ткани эндометриоидного очага экспрессия мРНК HSP27 значительно превышала этот показатель в эутопическом эндометрии пациенток с эндометриозом, а также в эндометрии здоровых женщин и женщин с трубно-перитонеальным бесплодием (1,75±0,55 копий парх104/мкл, р<0,01 во всех
случаях). По данным литературы молекулы HSP27 обладают сильным цитопротективным действием, подавляя апоптоз (Javid В., 2007). Высокий уровень синтеза HSP27 в эктопическом эндометрии может быть важным механизмом, участвующим в формировании и росте эндометриоидного очага. Возможно, что высокий уровень экспрессии HSP27 в эктопическом эндометрии у женщин с наружным генитальным эндометриозом связан с факторами перитонеального микроокружения, которые непосредственно влияют на клетки эутопического эндометрия, попадающего в перитонеальную полость в результате менструального рефлюкса, усиливая их жизнеспособность и помогая им избегать атаки со стороны клеток иммунной системы. Для проверки этого предположения нами была проведена серия экспериментов in vitro. Мы культивировали экспланты эутопического эндометрия пациенток с эндометриозом в присутствии аутологичной перитонеальной жидкости или в присутствии обогащенной популяции перитонеатьных макрофагов, после чего определяли уровень экспрессии в ткани эндометрия мРНК HSP27. Кроме того, в макрофагах после их взаимодействия с эндометрием оценивали уровень экспрессии функциональных молекул и «рецепторов-мусорщиков».
По нашим данным, у женщин контрольной группы и группы сравнения как перитонеальные макрофаги, так и перитонеальная жидкость не влияли на уровень экспрессии мРНК HSP27 в эндометрии. У пациенток с эндометриозом непосредственный контакт эндометриальных клеток с перитонеальными макрофагами также не приводил к существенным изменениям в экспрессии гена HSP27. Однако аутологичная перитонеальная жидкость стимулировала экспрессию мРНК HSP27 в ткани эндометрия по сравнению с таковой в эндометрии, культивировавшемся в тех же условиях только в культуральной среде RPMI 1640 (р<0,05). По-видимому, особенности цитокинового профиля перитонеальной жидкости женщин с эндометриозом, в частности высокое содержание в ней провоспалительных цитокинов и факторов роста, вызывают изменения в ткани эндометрия, способствуя его эктопическому росту.
При изучении ответа самих перитонеальных макрофагов на стимуляцию клетками эутопического эндометрия было установлено, что в контрольной группе и в группе сравнения наблюдались сходные изменения экспрессии поверхностных рецепторов макрофагами после их взаимодействия с эндометрием. У здоровых фертильных женщин мы отмечали достоверное усиление экспрессии СБЗб (с 65,18 ±3,52% до 80,28±2,44%), и С0204 молекул макрофагами (с 65,83 ± 2,58% до 75,10±1,00%) под действием аутологичного эндометрия (р<0,05 во всех случаях). У женщин с трубно-перитонеальным бесплодием в ответ на стимуляцию аутологичным эндометрием происходило повышение уровня СЭ36+ макрофагов (с 58,17 ±4,79% до 70,87 ±2,96%, р<0,001). Выявленное нами усиление экспрессии «рецепторов-мусорщиков» перитонеальными макрофагами здоровых женщин и женщин с трубно-перитонеальным бесплодием после их взаимодействия с аутологичным эндометрием, по-видимому, является физиологичным и отражают нормальную реакцию макрофагов на эктопически перемещенный эндометрий.
У пациенток с наружным генитальным эндометриозом была выявлена другая направленность изменений экспрессии поверхностных рецепторов перитонеальными макрофагами после их взаимодействия в клетками аутологичного эндометрия. У женщин этой группы мы не отмечали каких-либо изменений в экспрессии «рецепторов-мусорщиков» на поверхности макрофагов после их контакта с аутологичным эндометрием. Одновременно после инкубации перитонеальных макрофагов женщин с эндометриозом с фрагментами эндометриальной ткани происходило снижение экспрессии интегриновых молекул СБПЬ (с 76,08 ±1,71% до 65,25± 3,64%) и С049е (с 77,41± 1,89% до 66,83± 3,51%) на клеточной мембране макрофагов (р<0,01 во всех случаях).
По-видимому, измененные антигенные свойства ткани эндометрия и выявленные нами нарушения функционального состояния перитонеальных макрофагов при эндометриозе определяют отсутствие адекватного ответа макрофагов на стимуляцию клетками эндометрия. Данный феномен может
лежать в основе механизмов эктопического роста эндометриальных клеток, позволяя им избежать атаки со стороны иммунной системы. Можно предположить, что поиск путей коррекции функции «клеток-мусорщиков» у перитонеальных макрофагов позволит разработать новые подходы к лечению наружного генитапыюго эндометриоза и ассоциированного с ним бесплодия.
Одним из препаратов, оказывающих влияние на клетки моноцитарно-макрофагальной системы, является глюкозаминилмурамилдипептид (ГМДП), входящий в состав препарата Ликопид. ГМДП относится к иммуномодуляторам микробного происхождения и является минимальным биологически активным компонентом пептидогликанов, входящих в состав клеточной стенки всех бактерий. Для лечения женщин с наружным генитальным эндометриозом Ликопид ранее не применяли. В нашей работе мы в эксперименте in vitro оценили влияние ГМДП на функциональное состояние макрофагов женщин с эндометриозом.
Было установлено, что после 24-часовой инкубации перитонеальных макрофагов женщин с наружным генитальным эндометриозом с ГМДП происходило достоверное увеличение по сравнению с показателями клеток, инкубировавшихся только в культуральной среде RPMI 1640, экспрессии макрофагами молекул CD36 (с 63,73 ±2,75% до 75,67 ±3,15%, р<0,01) и CD204 (с 55,11± 8,74% до 69,79±3,75 %, р<0,001). В тех случаях, когда препарат ГМДП добавляли в совместную культуру перитонеальных макрофагов с эутопическим эндометрием, мы выявили не только усиление экспрессии на поверхности макрофагов CD36 (с 63,73 ±2,75% до 76,06 ±3,21 %, р<0,05) и CD204 молекул (с 55,11± 8,74% до 71,37± 3,61 %, р<0,01), но и повышение экспрессии CD1 lb молекул (с 76,08 ±1,71% до 84,25± 1,70 %, р<0,001). Таким образом, ГМДП нормализовал не только изначально сниженную экспрессию «рецепторов-мусорщиков» перитонеальными макрофагами при эндометриозе, но и ответ макрофагов на специфическую стимуляцию клетками эндометрия.
В нашей работе мы попытались разработать подход к топической доставке ГМДП непосредственно в макрофаги. Для этой цели в Институте
Химии растворов РАН были синтезированы наноразмерыне частицы кремнезема, диаметром 100 и 200 нм. Иммобилизация на частицы иммуноглобулинов, меченных флюорохромной меткой, позволило провести количественный анализ различных типов клеток иммунной системы, реагирующих с наночастнцами, используя проточную цитометрию.
Культивирование макрофагов перитонеальной жидкости в присутствии наночастиц кремния различного размера не оказывало влияния на жизнеспособность макрофагов. При оценке уровня активации макрофагов после их инкубации с наночастнцами кремния было установлено, что после 1-часовой инкубации макрофагами с частицами кремнезема размером 200 нм происходило усиление экспрессии НЬА-БЯ и С0204 молекул макрофагами, тогда как частицы размером 100 нм не оказывали влияния на уровень активации макрофагов. После 24-часового культивирования в присутствии наночастиц кремния размером 100 и 200 нм изменений в экспрессии функциональных молекул перитонеальными макрофагами отмечено не было. Был сделан вывод о том, что частицы более крупного размера могут приводить к нежелательной дополнительной активации макрофагов, поэтому в дальнейшем в эксперименте мы использовали только частицы размером 100 нм, которые не влияли на уровень активации клеток.
Для определения степени специфичности реагирования наноразмерных частиц кремнезема с макрофагами мы провели сравнительный анализ реакции различных типов клеток иммунной системы (лимфоцитов и макрофагов) с исследуемыми наночастнцами. Было установлено, что уровень лимфоцитов, реагирующих с наночастнцами, был невелик и колебался от 0,1% до 2%. Перитонеальные макрофаги более интенсивно реагировали с наночастнцами кремнезема. После 1 часа совместного культивирования около 60% всех макрофагов характеризовались наличием на их мембране и/или во внутриклеточном пространстве частиц кремнезема. После 24 часового культивирования количество макрофагов, имеющих на мембране и/или во внутриклеточном пространстве частицы кремнезема, составляло более 90%.
На следующем этапе наших исследований на основе препарата ГМДП и диоксида кремния была создана наноразмерная транспортная система для топической доставки ГМДП в перитонеальные макрофаги. При создании транспортной системы проводилась адсорбция ГМДП из раствора на поверхность частиц кремнезема за счет нековалентных электростатических и гидрофобных взаимодействий.
Направленный транспорт в макрофаги ГМДП с помощью транспортной наносистемы приводил к усилению экспрессии «рецепторов-мусорщиков» перитонеальными макрофагами. Нами отмечалось увеличение экспрессии СЭЗб молекул перитонеальными макрофагами с 72,64 ±1,51% до 84,10 ±1,55% (р<0,004) и увеличение уровня СВ204+ макрофагов с 56,60± 1,52% до 69,48±3,64% (р<0,01). Добавление транспортной наносистемы в совместную культуру перитонеальных макрофагов и клеток эндометрия приводило к повышению экспрессии на поверхности перитонеальных макрофагов не только БЯ рецепторов (СБЗб молекул с 72,64 ±1,51% до 87,46 ±2,1%, р<0,001; СЭ204 молекул с 56,60± 1,52% до 74,30± 7,32%, р<0,05), но и СБ11Ь молекул (с 77,56 ±2,89% до 87,96± 1,18%, р<0,02). При этом эффект, полученный при действии транспортной наносистемы, превышал таковой, выявленный для чистого препарата ГМДП. Таким образом, топическая доставка препарата ГМДП в перитонеальные макрофаги позволяет добиться максимального стимулирующего действия иммуномодулятора в отношении макрофагов.
Обобщая полученные результаты можно заключить, что в основе иммунных механизмов формирования эндометриоидного очага лежит нарушение взаимодействия перитонеальных макрофагов с клетками эутопического эндометрия, связанное с угнетением функции «клеток-мусорщиков» у макрофагов и с усилением жизнеспособности клеток эндометриоидного очага из-за повышенного синтеза НЯР27 молекул. Препарат ГМДП нормализует ответ перитонеальных макрофагов на стимуляцию клетками эндометрия при эндометриозе, что позволяет рекомендовать
проведение дальнейших исследований по возможности применения ГМДП для
лечения пациенток с наружным генитальным эндометриозом.
ВЫВОДЫ
1. У женщин с наружным генитальным эндометриозом и бесплодием, в отличие от пациенток с трубно-перитонеальным бесплодием, преобладает первичное бесплодие, нарушение менструальной функции по типу дис-менореи, низкая встречаемость эктопий шейки матки и высокая - аллергических реакций.
2. У женщин с наружным генитальным эндометриозом и бесплодием отмечается нарушение функционального состояния перитонеальных макрофагов, характеризующееся угнетением экспрессии «рецепторов-мусорщиков» CD36, CD204 и интегриновых молекул CD49e, а также снижением содержания CDllb+ и CD86+ макрофагов по сравнению с показателями женщин контрольной группы. Сниженное содержание CDllb+ и CD86+ макрофагов в перитонеальной жидкости характерно и для женщин с трубно-перитонеальным бесплодием.
3. У женщин с наружным генитальным эндометриозом и бесплодием уровень экспрессии мРНК HSP27 в ткани эктопического эндометрия превышает таковой в эктопическом эндометрии у пациенток этой группы, а также у женщин с трубно-перитонеальным бесплодием и у здоровых фертильных женщин. Перитонеальная жидкость женщин с эндометриозом в опытах in vitro стимулирует экспрессию мРНК HSP27 клетками эу-топического эндометрия.
4. Совместная инкубация in vitro перитонеальных макрофагов с тканью эу-топического эндометрия у фертильных женщин приводит к усилению экспрессии CD36 и CD204 молекул на поверхности макрофагов, у женщин с трубно-перитонеальным бесплодием - повышению уровня CD36+ макрофагов при отсутствии изменений в экспрессии интегриновых молекул. У женщин с наружным генитальным эндометриозом при взаимодействии перитонеальных макрофагов с эндометрием не происходит измене-
ний экспрессии «рецепторов-мусорщиков», но снижается экспрессия ин-тегриновых молекул CD1 lb и CD49e макрофагами.
5. Препарат ГМДП in vitro стимулирует экспрессию CD36 и CD204 молекул перитонеальными макрофагами женщин с наружным генитальным эндо-метриозом и бесплодием. При добавлении ГМДП в совместную культуру перитонеальных макрофагов и тканевых эксплантов аутологичного эндометрия женщин с эндометриозом усиливается экспрессия перитонеальными макрофагами не только «рецепторов-мусорщиков», но и интегри-новых молекул CD1 lb.
6. Наноразмерные частицы кремнезема диаметром 100 нм не влияют на жизнеспособность и функциональное состояние перитонеальных макрофагов. Транспортная наносистема на основе модифицированного кремнезема и ГМДП стимулирует экспрессию «рецепторов-мусорщиков» перитонеальными макрофагами в большей степени, чем чистый препарат ГМДП.
Практические рекомендации
Разработанные нормативные значения показателей экспрессии «рецепторов-мусорщиков» перитонеальными макрофагами (CD36+ более 64,5% и CD204+ -более 59,9%) рекомендуется использовать для оценки функционального состояния перитонеальных макрофагов.
Рекомендуется проведение дальнейшего исследования по применению препарата Ликопид в комплексе лечебных мероприятий у женщин с наружным генитальным эндометриозом и бесплодием.
Список работ, опубликованных по теме диссертации.
Публикации в журналах, включённых в перечень изданий, рекомендованных ВАК РФ:
1. Анциферова Ю.С., Сотникова Н.Ю., Посисеева Л.В., Елисеева М.А., Филиппова Е.С. Иммунные механизмы, определяющие нарушение взаимодействия перитонеальных макрофагов с эутопическим эндометрием у женщин с наружным генитальным эндометриозом // Медицинская иммунология. - 2009,- т.11, №4-5,- С.400-401.
2. Филиппова Е.С., Елисеева М.А., Красильникова А.К./ Особенности регуляции инвазии и апоптоза клеток эутопического и эктопического эндо-
метрия при эндометриозе// Ж. «Вестник Уральской медицинской академической науки. Тематический выпуск по аллергологии и иммуноло-гии».-2010.- № 2/1 (29). -С.214.
3. Анциферова Ю.С., Парфенюк Е.В., Красильникова А.К., Елисеева М.А., Куликова Г.А. Экспериментальное обоснование возможности регуляции ликопидом экспрессии «рецепторов-мусорщиков» на поверхности пери-тонеальных макрофагов у женщин с наружным генитальным эндометрио-зом // Ж. «Вестник Уральской медицинской академической науки. Тематический выпуск по аллергологии и иммунологии».-2010.- № 2/1 (29). -С.241.
Публикации в журналах, сборниках, материалах конференций и тезисы докладов:
1. Antsiferova Yu.S., Sotnikova N.Yu., Posiseeva L.V., Filippova E.S., Eliseeva M.A. Immune mechanisms of endometriosis lesions forma-tion//Abstracts book of 12th International Symposium for Immunology of Reproduction- Varna, Bulgaria, 2009,- P. 77-78.
2. Kulikova G. A., Parfenyuk E.V., Ryabinina I.V., Antsiferova Y.S., Sotnikova N.Y., Posiseeva L.V., Eliseeva M.A. In vitro studies of interaction of modified silica nanoparticles with
different types of immunocompetent cells // Journal of Biomedical Materials Research.-2010.- Vol. 95A, issue 2, -P.434-439.
3. Елисеева M.А., Посисеева JI.В., Сотникова Н.Ю., Филиппова Е.С., Анциферова Ю.С. Изменение фенотипа и цитокинового профиля перито-неальных макрофагов при их взаимодействии с клетками эутопическо-го эндометрия при наружном генитальном эндометриозе // Проблемы репродукции.- 2009.- спец. выпуск.- С.179-180.
4. Елисеева М.А., Посисеева Л.В., Сотникова Н.Ю., Анциферова Ю.С. Изменение экспрессии функциональных молекул на поверхности пе-ритонеальных макрофагов при их взаимодействии с клетками эутопи-ческого эндометрия у женщин с наружным генитальным эндометрио-зом // Вестник Военно-Медицинской академии.- 2009.-№1(25).- С.697.
5. Елисеева М.А., Посисеева Л.В., Сотникова Н.Ю., Кирсанов А.Н., Анциферова Ю.С. Характеристика функционального состояния перито-неальных макрофагов у женщин с бесплодием, ассоциированным с наружным генитальным эндометриозом и трубным фактором // Аллергология и иммунология. -2009,- т.10, №2.- С.249-250.
6. Сотникова Н..Ю., Анциферова Ю.С., Елисеева М.А., Парфенюк Е.В., Куликова Г.А. Характеристика взаимодействия частиц модифицированных кремнеземов с различными типами иммунокомпетентных клеток// Сборник тезисов. I Международной научной школы "Наномате-риалы и нанотехнологии в живых системах",- 29 июня-4 июля 2009, Москва,- С. 340-342
7. Куликова Г.А., Сотникова Н.Ю., Анциферова Ю.С., Елисеева М.А. Разработка наноносителей лекарственного препарата для лечения эн-дометриоза // Сб. тезисов 13-й междунар. Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука 21 века».-Пущино, 2009.-С.169.
8. Сотникова Н.Ю., Анциферова Ю.С., Посисеева Л.В., Елисеева М.А., Куликова Г.А., Парфенюк Е.В. Обоснование возможности создания
новых лекарственных транспортных систем на основе наночастиц модифицированного кремнезема для коррекции функции перитонеальных макрофагов у женщин с наружным генитальным эндометриозом // тезисы III всероссийской научно-практической конференции «Высокие' медицинские технологии»,- Москва, 2009,- С. 138.
9. Елисеева М.А., Посисеева JI.B., Сотникова Н.Ю., Анциферова Ю.С. Исследование in vitro влияния иммуномодулятора ликопид на экспрессию функциональных рецепторов перитонеальными марофагами женщин с наружным генитальным эндометриозом // сб. науч. тр. и материалов науч.-практ. конф. «Современные перинатальные медицинские технологии в решении проблем демографической безопасности».-2009, г.Минск.- с. 151-155.
Ю.Елисеева М.А. Особенности экспрессии рецепторов-мусорщиков перитонеальными макрофагами при их взаимодействии с аутологичным эндометрием при наружном генитальном эндометриозе // Материалы 89й ежегодной научно-практической конференции молодых ученых ИвГМА, посвященной 120летию со дня рождения профессора Н.М. Иценко. «Неделя науки - 2009».-20-25 апреля 2009,Иваново,- С.20.
П.Анциферова Ю.С., Сотникова Н.Ю., Мапышкина А.И., Шаалали Ю.С., Елисеева М.А. Иммунные нарушения при эндометриозе и новые подходы к их коррекции// Сб.тезисов XIII Международного конгресса с курсом эндоскопии «Новые технологи в диагностике и лечении гинекологических заболеваний».- Москва, 2010.-С.153-154.
12.Анциферова Ю.С., Сотникова Н.Ю., Елисеева М.А., Филиппова Е.С. Особенности регуляции апоптоза в эутопическом и эктопическом эндометрии у женщин с эндометриозом // Jurnali nazariy va klinik tibbiyot (Журнал теоретической и клинической медицины, Узбекистан).- 2010.-№5,-С. 71-74.
Список сокращений
CD - кластер дифференцировки
HSP - белок теплового шока
ГМДП - глюкозаминилмурамилдипептид
МНК — мононуклеарные клетки
УЗИ - ультразвуковое исследование
ЭКГ - электрокардиограмма
мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота
ЕЛИСЕЕВА МАРИЯ АНДРЕЕВНА
ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ ПЕРИТОНЕАЛЬНЫХ МАКРОФАГОВ 11 ВЛИЯНИЕ НА НЕГО IN VITRO ПРЕПАРАТА ГЛЮКОЗАМШШЛМУРАМИЛДИПЕПТИДА (ГМДП) У ЖЕНЩИН С НАРУЖНЫМ ГЕНИТАЛЬНЫМ ЭНДОМЕТРИОЗОМ
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук
Подписано в печать 18.11.2010. Формат 60x84 1/16.
Печать плоская. Уел печ.л. 1,39 Тираж 80 экз. Закат № 118.
ГОУ ВПО «Ивановский государственный энергетический универагтет им. В.И, Ленина» 153003, Иваново, ул. Рабфаковская, 34.
Отпечатано в УИУНЛ ИГЭУ.
Оглавление диссертации Елисеева, Мария Андреевна :: 2010 :: Иваново
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.
ВВЕДЕНИЕ.
Глава 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
1.1. Современные представления о патогенезе наружного генитального эндометриоза.
1.2. Роль эндометриальных факторов в развитии' наружного генитального эндометриоза.
1.3. Функциональное состояние перитонеальных макрофагов у женщин с наружным генитальным эндометриозом и существующие подходы Кчего коррекции.
Глава 21 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Организация работы и объем исследований.29«
2.2'. Методы исследования.•.
Глава 3. СРАВНИТЕЛЬНАЯ КЛИНИЧЕСКАЯ
ХАРАКТЕРИСТИКА ОБСЛЕДОВАННЫХ ЖЕНЩИН.
Глава . 4. ХАРАКТЕРИСТИКА ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ПЕРИТОНЕАЛЬНЫХ МАКРОФАГОВ С КЛЕТКАМИ ЭНДОМЕТРИЯ ПРИ НАРУЖНОМ, ГЕНИТАЛЬНОМ ЭНДОМЕТРИОЗЕ
4.1. Характеристика экспрессии функциональных и SR молекул перитонеальными макрофагами у женщин с наружным генитальным эндометриозом.
4.2. Особенности экспрессии функциональных и SR молекул на поверхности перитонеальных макрофагов после их взаимодействия in vitro с эутопическим эндометрием при наружном генитальном эндометриозе.
4.3. Характеристика экспрессии мРНК HSP27 молекул в эндометрии женщин с наружным генитальным эндометриозом.
4.4. Характеристика экспрессии мРНК HSP27 молекул клетками эндометрия после их взаимодействия in vitro с перитонеальными макрофагами при наружном генитальном эндометриозе.
Глава 5. ОЦЕНКА ВЛИЯНИЯ IN VITRO ПРЕПАРАТА ГМДП НА ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ ПЕРИТОНЕАЛЬНЫХ МАКРОФАГОВ ЖЕНЩИН С НАРУЖНЫМ ГЕНИТАЛЬНЫМ ЭНДОМЕТРИОЗОМ И ВОЗМОЖНОСТЬ ЕГО НАПРАВЛЕННОГО ТРАНСПОРТА В КЛЕТКИ С ПОМОЩЬЮ НАНОСИСТЕМЫ
5.1. Изменение экспрессии функциональных и SR-молекул перитонеальными макрофагами женщин с наружным генитальным эндометриозом под действием препарата ГМДП.
5.2. Влияние in vitro транспортной наносистемы на основе препарата ГМДП и диоксида кремния на экспрессию функциональных и SR-молекул перитонеальными макрофагами при наружном генитальном эндометриозе.
Введение диссертации по теме "Акушерство и гинекология", Елисеева, Мария Андреевна, автореферат
Актуальность проблемы
Эндометриоз относится к числу наиболее распространенных гинекологических заболеваний, сопровождается нарушением менструальной и репродуктивной функций, стойким болевым синдромом, снижением трудоспособности больных (31, 20, 124). Частота его встречаемости среди женщин репродуктивного возраста составляет по данным разных авторов 515% (31), при этом у женщин с бесплодием неясной этиологии эндометриоз диагностируется в 40-60% случаев (25, 160, 168). Согласно статистическим данным, в последние годы отмечен значительный рост заболеваемости эндометриозом (31, 5). Таким образом, проблема изучения патогенеза эндометриоза и поиск новых путей его лечения имеет в настоящее время не только медицинское, но и социальное значение.
Показано, что в механизмах развития эндометриоза важную роль играют иммунные нарушения (24, 29, 41). В последние годы пристальное внимание уделяется изучению особенностей функционирования перитонеальных макрофагов при эндометриозе (177, 124). Установлено, что перитонеальные макрофаги женщин с эндометриозом гиперактивированы, продуцируют большое количество цитокинов и факторов роста (177, 124). Однако при эндометриозе до сих пор не изучена функция макрофагов как «клеток-мусорщиков». Известно, что одной из важных функций перитонеальных макрофагов является удаление клеточного дебриса и апоптирующих клеток через специфические поверхностные рецепторы, получившие название «рецепторы-мусорщики» или SRs (177, 146). Но в литературе отсутствуют данные о характере экспрессии SRs рецепторов при взаимодействии макрофагов с аутологичным эндометрием при эндометриозе. Так же недостаточно изучены особенности экспрессии других функциональных молекул, например интегриновых молекул и ко-стимуляторных рецепторов, на поверхности перитонеальных макрофагов женщин с наружным генитальным эндометриозом.
Помимо нарушения функции макрофагов, большое значение в патогенезе эндометриоза имеют изменения на уровне эутопического эндометрия (196). Исследованиями последних лет было показано, что в эутопическом эндометрии женщин с эндометриозом нарушена экспрессия минорных трансплантационных антигенов, ряда интегриновых и адгезионных молекул (194). Противоречивые данные получены при изучении особенностей экспрессии в эндометрии таких цитопротективных молекул, как белки теплового шока или HSP молекул. Сообщалось о повышении экспрессии ряда HSP в эутопическом эндометрии (156) и в ткани очага эндометриоза (143). Также есть данные об отсутствии выраженных изменений в экспрессии HSP в эндометрии пациенток с эндометриозом (149). Пока еще не установлены факторы, которые могут влиять на изменение экспрессии HSP молекул в эндометрии женщин с эндометриозом.
В настоящее время возрос интерес исследователей к проблеме медикаментозной коррекции иммунных нарушений у женщин с наружным генитальным эндометриозом (24, 41). Однако до настоящего времени не проводилось изучение возможного направленного воздействия на функцию перитонеальных макрофагов. Одним из препаратов, оказывающих влияние на фагоциты, является Ликопид. В состав этого препарата входит глюкозаминилмурамилдипептид (ГМДП), который является компонентом пептидогликанов, входящих в состав клеточной стенки всех бактерий (18). Для лечения женщин с эндометриозом и бесплодием ранее Ликопид не применялся. Цель работы:
Установить новые механизмы развития наружного генитального эндометриоза на основании оценки функционального состояния перитонеальных макрофагов при их взаимодействии с клетками эндометрия и обосновать в опытах in vitro целесообразность использования препарата глюкозаминилмурамилдипептида (ГМДП) в терапии данной патологии.
Задачи исследования:
1". Дать сравнительную характеристику состояния соматического и репродуктивного, здоровья женщин с бесплодием, обусловленным наружным генитальным эндометриозом и' трубно-перитонеальным фактором.
2. Определить особенности экспрессии функциональных молекул (CDMb, CD49e, CD95, CD86) и «рецепторов-мусорщиков» (CD36 и CD204)1 перитонеальными» макрофагами» у женщин с ненарушенной» репродуктивной функцией и у женщин с бесплодием, обусловленным наружным генитальным эндометриозом и трубно-перитонеальным фактором.
3'. Выявить особенности^ экспрессии мРНК белков теплового« шока (HSP27) в- эутопическом и« эктопическом эндометрии- у женщин с наружным генитальным эндометриозом.
4. В эксперименте in vitro определить характер изменений* экспрессии-! функциональных молекул и «рецепторов-мусорщиков» перитонеальными макрофагами после их взаимодействия, с тканью аутологичного эндометрия, а также оценить влияние* макрофагов и-перитонеальной жидкости на экспрессию белков, теплового шока (HSP27) клетками эутопического эндометрия при наружном генитальном эндометриозе.
5. В опытах in vitro < установить влияние препарата4 ГМДГТ на функциональное состояние перитонеальных макрофагов у женщин с наружным генитальным эндометриозом и оценить возможность, применения наноразмерных транспортных систем на основе модифицированного кремнезема для направленного транспорта ГМДП в макрофаги.
Научная < новизна:
Установлены новые механизмы развития наружного генитального эндометриоза и связанного с ним бесплодия. Выявлено, что развитие наружного генитального эндометриоза у женщин связано с угнетением экспрессии на поверхности макрофагов «рецепторов-мусорщиков» (СБЗб и СБ204) и интегриновых молекул (СБ49е), а нарушение фертильности у этих больных - со сниженной экспрессией адгезионных (С011Ь) и сигнальных ко-стимуляторных (С086) молекул перитонеальными макрофагами.
Показано, что в ткани очага эндометриоза повышен синтез цитопротективных молекул Н8Р27, а перитонеальная жидкость женщин* с эндометриозом оказывает стимулирующее действие на экспрессию мРНК Н8Р27 в эутопическом эндометрии.
Установлено, что при наружном генитальном эндометриозе нарушено взаимодействие перитонеальных макрофагов с аутологичным эндометрием, что проявляется отсутствием реакции со стороны «рецепторов-мусорщиков» и снижением экспрессии интегриновых и адгезионных молекул С049е и СБ11Ь на поверхности макрофагов после их стимуляции клетками эндометрия.
Дано теоретическое обоснование к использованию препарата ГМДП при наружном генитальном эндометриозе. Выявлено стимулирующее I действие препарата ГМДП на экспрессию «рецепторов-мусорщиков» перитонеальными макрофагами женщин с наружным генитальным эндометриозом и бесплодием.
Показано, что наноразмерные частицы кремнезема (ЮОнм в диаметре) специфически связываются с перитонеальными макрофагами, не оказывая влияния на их жизнеспособность и уровень активации.
Определена возможность топической доставки препарата ГМДП в перитонеальные макрофаги женщин с наружным генитальным эндометриозом с помощью наноразмерной транспортной системы на основе модифицированного кремнезема, при этом эффект действия транспортной наносистемы с ГМДП превышает действие чистого препарата ГМДП.
Практическая значимость работы:
Разработаны нормативные показатели уровня экспрессии «рецепторов-мусорщиков» CD36 и CD204 перитонеальными макрофагами:
Акушерско-гинекологической практике предложены новые критерии для оценки функционального состояния' перитонеальных макрофагов у женщин с наружным генитальным эндометриозом и бесплодием, связанные'с определением экспрессии «рецепторов-мусорщиков» перитонеальными макрофагами.
Обоснована in vitro возможность применения глюкозаминилмурамилдипептида (в составе препарата' Ликопид), для* коррекции нарушенной функции перитонеальных макрофагов,при наружном^ генитальном эндометриозе.
Дано обоснование к дальнейшему исследованию применения препарата Ликопид в комплексе лечебных мероприятий у женщин с наружным генитальным эндометриозом и бесплодием.
Положения, выносимые на защиту:
Развитие наружного > генитального* эндометриоза у женщин связано с угнетением функции «клеток-мусорщиков» перитонеальных макрофагов, приводящим к нарушению взаимодействия макрофагов с эутопическим эндометрием, и с особенностями цитокинового профиля перитонеальной жидкости, которая стимулирует синтез цитопротективной молекулы HSP27 в клетках эндометрия, обуславливая) высокую экспрессию' HSP27 в ткани эндометриоидного очага.
Препарат ГМДП in vitro стимулирует экспрессию «рецепторов-мусорщиков» перитонеальными макрофагами женщин с наружным генитальным эндометриозом и бесплодием.
Топическая^ доставка ГМДП в перитонеальные макрофаги с использованием транспортной наносистемы на основе модифицированного кремнезема в большей степени, чем чистый препарат ГМДП, стимулирует экспрессию «рецепторов-мусорщиков» перитонеальными макрофагами женщин с наружным генитальным эндометриозом и бесплодием и восстанавливает ответ макрофагов на стимуляцию клетками аутологичного эндометрия.
Внедрение результатов в практику: Результаты диссертационной работы внедрены в практику гинекологической клиники Федерального государственного учреждения*
Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства имени В.Н.ГородковаМинистерства здравоохранения и социального развития Российской,Федерации».
Апробация работы:
Основные результаты исследований по теме диссертации докладывались и обсуждались на: XIII Всероссийском научном Форуме с международным участием имени;академика В.И. Иоффе «Дни>иммунологии в Санкт-Петербурге» (С.-Петербург, 2009), Г Международной научной; школе "Наноматериалы и. нанотехнологии в живых системах" (Москва, 2009),. 12th International Symposium for Immunology of Reproduction (Varna, Bulgaria, 2009); 13-й; международной^ Пущинской школе-конференции, молодых ученых «Биология - наука 21 века» (Пущино, 2009), областном фестивале. «Молодые ученые — развитию; Ивановской области» (Иваново, 2009); XIII Международном; конгрессе с курсом эндоскопии «Новые технологи в диагностике и лечении, гинекологических заболеваний» (Москва, 2010), VIII? конференции иммунологов Урала (Сыктывкар; 2010). Личное участие автора:
Автором самостоятельно проводился набор материала по теме диссертации, выполнена систематизация и компьютерная' обработка полученных результатов.
Публикации: по теме диссертации опубликовано 15 печатных работ, из них 2 в международной печати и 3 - в журналах, рецензируемых ВАК.
Структура и объем диссертации:
Диссертация изложена на 139 страницах машинописного текста, содержит введение, обзор литературы, 5 глав собственных исследований, обсуждение результатов, выводы и практические рекомендации. Библиографический указатель включает 205 источников. Работа иллюстрирована 23 таблицами и 11 рисунками.
Заключение диссертационного исследования на тему "Функциональное состояние перитонеальных макрофагов и влияние на него in vitro препарата глюкозаминилмурамилдипептида (ГМДП) у женщин с наружным генитальным эндометриозом"
выводы.
1. У женщин с наружным генитальным эндометриозом и* бесплодием, в отличие от пациенток с трубно-перитонеальным бесплодием, преобладает первичное бесплодие, нарушение менструальной функции по типу дисменореи, низкая встречаемость эктопий шейки матки и высокая - аллергических реакций.
2. У женщин с наружным генитальным эндометриозом и бесплодием отмечается* нарушение функционального состояния перитонеальных макрофагов,- характеризующееся' угнетением экспрессии «рецепторов-мусорщиков» CD36, CD204 и интегриновых молекул CD49e, а также снижением содержания GDl lb+ и OD86+ макрофагов по* сравнению-с показателями женщин контрольной группы. Сниженное1 содержание CD11Ь+ и CD86+ макрофагов в перитонеальной жидкости характерно и для женщин?с трубно-перитонеальным бесплодием.
3. У женщин с наружным' генитальным5 эндометриозом и- бесплодием уровень экспрессии мРНК HSP27 в ткани эктопического эндометрия превышает таковой в эутопическом эндометрии у пациенток этой группы, а также у женщин с трубно-перитонеальным бесплодием и у здоровых фертильных женщин. Перитонеальная жидкость женщин с эндометриозом в опытах in vitro стимулирует экспрессию мРНК HSP27 клетками эутопического эндометрия.
4. Совместная инкубация in vitro перитонеальных макрофагов с тканью эутопического эндометрия у фертильных женщин приводит к усилению экспрессии CD36 и CD204 молекул на поверхности макрофагов, у женщин с трубно-перитонеальным бесплодием -повышению уровня CD36+ макрофагов при отсутствии изменений в экспрессии, интегриновых молекул. У женщин с наружным генитальным эндометриозом при взаимодействии перитонеальных макрофагов с эндометрием не происходит изменений экспрессии рецепторов-мусорщиков», но снижается экспрессия интегриновых молекул CD1 lb и CD49e макрофагами.
5. Препарат ПУТДП (Ликопид) in vitro стимулирует экспрессию CD36 и CD204 молекул перитонеальными макрофагами женщин с наружным генитальным эндометриозом и бесплодием. При добавлении ГМДП в совместную культуру перитонеальных макрофагов и тканевых эксплантов аутологичного эндометрия женщин с эндометриозом усиливается экспрессия перитонеальными макрофагами не только «рецепторов-мусорщиков», но и интегриновых молекул CD1 lb.
6. Наноразмерные частицы кремнезема диаметром 100 нм не влияют на жизнеспособность и функциональное состояние перитонеальных макрофагов. Транспортная наносистема на основе модифицированного кремнезема и ГМДП стимулирует экспрессию «рецепторов-мусорщиков» перитонеальными макрофагами в большей степени, чем чистый препарат ГМДП.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
Разработанные нормативные значения показателей экспрессии «рецепторов-мусорщиков» перитонеальными макрофагами (CD36+ более 64,5% и CD204+ - более 59,9%) рекомендуется использовать для оценки функционального состояния перитонеальных макрофагов.
Рекомендуется проведение дальнейшего исследования по применению препарата Ликопид в комплексе лечебных мероприятий у женщин с наружным генитальным эндометриозом и бесплодием.
Список использованной литературы по медицине, диссертация 2010 года, Елисеева, Мария Андреевна
1. Абдуллаева У.А., Ищенко А.И., Озген Д. Актуальные вопросы лечения наружного генитального эндометриоза с хроническими тазовыми болямю// Российский вестник акушера-гинеколога. 2004. — Т. 4, № Ь.1. С. 41-45.
2. Адамян Л.В., Кулаков В.И. Распространенные формы генитального эндометриоза // Третий международный конгресс по эндометриозу с курсом эндоскопии: материалы. М., 1996. - С. 30-36.
3. Адамян Л.В., Кулаков В.И. Эндометриозы: руководство для врачей. -М.: Медицина, 1998. 320 с.
4. Айламазян, Э.К., Цвелев Ю.В:, Беженарь В.Ф. Российская« гинекологическая школа в1 разработке проблемы эндометриоза // Журнал акушерства и женских болезней. 2002. - Т. LI, Вып. 3. - С. 10-14.
5. Алиханова З.М. Биологические свойства перитонеальной жидкости в норме и при патологии репродуктивной системы // Акушерство и гинекология. 1991. - № 6. - С. 3- 6.
6. Андреева E.H. Распространенные формы генитального эндометриоза: медико-генетические аспекты, диагностика, клиника; лечение и-мониторинг больных: автореф. дис. д-ра мед. наук. -М., 1997. 41 с.
7. Баскаков В.П. Клиника и лечение эндометриоза. Л.: Медицина, 1990. -238 с.
8. Баскаков В.П. Эндометриоз (клиника и лечение эндометриоза). — М.: Медицина, 1990. 238 с.
9. Варданян Л.Х., Пшеничникова Н.И.,.Волков Н.И. Иммунологические аспекты наружного генитального эндометриоза // Акушерство и гинекология. 1992. - № 2. - С. 6- 9.
10. Вихляева Е.М., Пшеничникова Т.Я. Роль специальной программы ВОЗ по* репродукции человека в решении актуальных проблем бесплодного брака // Акушерство, и гинекология. 1988. - № б. - С. 34.
11. Горбушин С.М. О патогенезе бесплодия при перитонеальном эндометриозе // Акушерство и гинекология. 1999. - № 6. - С. 8- 10.
12. Железнов Б.И., Стрижаков А.Н. Генитальный эндометриоз. М.: Медицина, 1985. - 158 с.
13. Ищенко А.И. Патогенез,.клиника, диагностика и оперативное лечение распространенных форм генитального эндометриоза: автореф: дис. . д- ра мед. наук. М., 1992. - 44 с.
14. Камыш Е.С. Неспецифические факторы защиты и их особенности у женщин с трубно-перитонеальным бесплодием // Проблемы репродукции. 2009. - Спец. выпуск. - С. 278- 279.
15. Кирсанов А.Н. Роль индукторов апоптоза и ТОВ(31 в развитии бесплодия, ассоциированного с наружным генитальным эндометриозом и трубно-перитонеальным фактором: автореф. дис. .канд. мед. наук. Иваново, 2009. - 22 с.
16. Ковальчук Л.В., Чередеев А.Н. Иммунорегуляторная роль моноцитов в норме и иммунопатологии // Итоги науки и техники. ВИНИТИ. Сер. Иммунология. 1991. - Т. 27. - 217 с.
17. Козлов И.Г. Лекарственные воздействия через рецепторы врожденного иммунитета // Ликопид в комплексном лечении и профилактике иммунодефицитных состояний: сб. трудов. М., 2005. — С. 6-18.
18. Коколина В.Ф. Современные подходы к диагностике и лечению эндометриоза // Фарматека. 2003. - № 2(65). - С. 63- 67.
19. Кулаков В.И; Дискуссионные; вопросы современной гинекологии! // Материалы международного конгресса по эндометриозу. М., 1996. -С. 309- 310.
20. Кулаков В.И., Овсянникова Т.В. Проблемы, и перспективы лечения бесплодия-в браке // Акушерство и гинекология. -. 1997. № 3. - С. .58. ■ ■;.
21. Лещинский П.Т., Галазюк Л.В., Осорх О. Системный и местныйиммунитет у женщин, больных, эндометриозом // Иммунология• * •репродукции: тезисы всесоюзного Симпозиума- с международным участием: Киев, 1990. - С. 33-34.,
22. Локальная продукция цитокинов у пациенток с наружным генитальным эндометриозом / С.А. Сельков и др.. // Журнал акушерства и женских болезней. 2002. - Т. 51, Вып. 3. - С. 57-62.
23. Место традиционной оперативной г лапароскопии в лечении, бесплодия / М.М. Высоцкий и др. // Проблемы репродукции: 2009. - Спец. выпуск. - С. 275.
24. Митькин В:В., Кулаков? В:И., Сухих Г.Т. Особенности иммунологических показателей перитонеальной жидкости при: эндометриозе //Акушерство и гинекология.- 1991.-№2. С. 6-10.
25. Пальцев М.А., Иванов А. Межклеточные взаимодействия. М.: Медицина, 1995. - 224 с.
26. Полумисков Д.М. Роль факторов врожденного иммунитета, генов-фолатного обмена- и системы детоксикации в развитии наружного генитального эндометриоза: автореф. дис. канд. мед. наук. — Иваново, 2007. 22 с.
27. Посисеев Д.В. Иммунные механизмы инвазивности эндометриальных клеток при,эндометриозе: автореф; дис. канд. биол. наук. М., 2006. -19 с.
28. Пшеничникова* Т.Я., Сухих Г.К. Бесплодный брак // Акушерство и гинекология. 1994. - С. 57-60".
29. Саидова- Р. А. Эндометриоз: клиника, диагностика и лечение. М., 2000. - 324 с:
30. Сметник В.П. Фармакотерапия генитального эндометриоза // Consilium medicum. 2002. - Т. 4, № 10. - С. 8-12.
31. Сонова М.М., Осипова A.A. Роль макрофагов перитонеальной жидкости при наружном генитальном эндометриозе // Мать и< дитя: материалы IX всерос. науч. форума М., 2007. - С. 522.
32. Старцева Н.В., Швецов М.В. Лимфоидная система как регулятор морфогенеза при эндометриозе // 'Третий международный конгресс по эндометриозу с курсом эндоскопии: материалы. М-., 1996. - С. 63-64.
33. Сухих Г.Т., Волков Н.И., Ионов И.Д. Диагностика и лечение бесплодного брака. М., 1988. - 356 с.
34. Тактика лечения бесплодия при наружном генитальном эндометриозе / И.Б. Манухин и др. // Мать и дитя: материалы IX всерос. науч. форума. М., 2007. - С. 455.
35. Фоновые заболевания генитального эндометриоза / JI.B. Адамян и др. // Современные технологии в диагностике и лечении гинекологических заболеваний / под ред. В .И: Кулакова, JI.B. Адамян. -М., 2006.-С. 96-97.
36. Хаитов. P.M., Пащенков М.В., Пинегин Б.В'. Роль паттернраспознающих рецепторов во врожденном и адаптивном иммунитете // Иммунология. 2009. - № 1. - С. 66- 76.
37. Шаалали Ю.С. Обоснование применения препаратов с иммуномодулирующим действием в комплексном лечении женщин с бесплодием, обусловленным «малыми» формами наружного генитального эндометриоза: автореф. дис.канд. мед. наук. Иваново, 2010.-24 с.
38. Шор A.JL Состояние иммунитета и влияние на его фагоцитарное звено препаратов плацентарных белков у женщин с бесплодием при наружном генитальном эндометриозе: автореф. дис. . канд. мед. наук. Иваново, 1999. - 20 с.
39. Ярилин А.А. Иммунология: учебник. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2010. — 752 с.
40. Allaire С. Endometriosis and infertility: а» review // J. Reprod. Med. -2006. Vol. 51(3). -P. 164-168.
41. Endometriosis: an enigma between the immune system and the endometrium / C. Alviggi et al. // Gynecological Endocrinology. 2004. -Vol. 18, Suppl. 1. -P. 221-222.
42. Berkkanoglu M., Arici A. Immunology and endometriosis; II Am. Ji Reprod. Immunol. 2003. - Vol. 50.-P. 48-59.
43. Bondza P.K., Maheux R., Akoum A. Insights; into endometriosis-associated endometrial dysfunctions:; a review // Front. Biosci. (Elite Ed).- 2009. -Vol. 56. P. 415- 428.
44. Böwen J.A., Hunt J:S. The rolè of integrins in reproduction;// P.S:E.BiM: -2000. Vol. 223. - P. 331- 343.
45. Quantitative expression of apoptosis-regulating genes in endometrium from women with and without.endometriosis / D;P. Braun et al. // Fertil. Steril. 2007. - Vol. 87, № 2. - P. 263- 268.
46. Premenstrual and menstrual changed in the macaque and human endometrium: relevance to endometriosis / R.M: Brenner etal. // Ann. NY Acad. Sei. 2002. - Vol. 955. - P. 60-74.
47. Brosens I.A. Reproductive disorders affecting fertility in endemetriosis Text. /1. Brosens, R!: Gampo, S. Gördts// Reprod Biomed Online.».- 2000. -Vol. 77, N 1. P. 359-363.
48. Hsp27 egatively regulates eel! death by interacting with-cytochrome c / Ji M: Bruey et al. // Nat. Cell Biol. 2000. - Vol. 2. - P. 645-652.
49. Fibrinolytic factors in endometriotic tissue, endometrium, peritoneal fluid, and plasma from women with endometriosis and in endometrium and peritoneal fluid from healthy women / C. Brüse et al. // Fertil. Steril. -1998. Vol. 70. - P. 821-826.
50. Core-shell silica nanoparticles as fluorescent labels for nanomedicine / J. Choi et al. // J. Biomed. Opt. 2007. - Vol. 12, № 6. - P. 064007.
51. Downregulation of CD36 results in reduced phagocytic ability of peritoneal macrophages of women with endometriosis / P.C. Chuang et al. // J. Pathol. 2009. - Vol. 219, № 2. - P. 232-241.
52. Inhibition of CD36-dependent phagocytosis by prostaglandin E2 contributes to the development of endometriosis / P.C. Chuang et al. // Am. J. Pathol. 2010.-Vol. 176, №2.-P. 850-860.
53. CDC42 and endometriosis: immunohistochemical study an eutopic endometrioum / A. Ciavattini et al. // Gynecological Endocrinology. -2004. Vol. 18, Suppl. 1. - P. 223.
54. Endometriosis and infertility / P. Collinet et al. // Gynecol. Obstet. Fertil. 2006. - Vol. 34(5). - P. 379-384.
55. Corwin E.J. Endometriosis: pathophysiology, diagnosis, and treatment // Nurse Pract. 1997. - Vol. 22(10). - P. 35-38.
56. Peritoneal fluid volume, estrogen, progesterone, prostaglandin and epidermal growth factor concentration in patients with and with endometriosis / F.D. De Leon et al:. // Obstet. Gynecol. 1986. - Vol. 68, №2.-P. 189-194.
57. De Villiers W.J., Fräser I.P., Gordon S. Cytokine and growth factor regulation of macrophage scavenger receptor expression and function // Immunol, lett. 1994. - Vol. 43. - P. 73-79.
58. Cathepsin D protease mediates programmed cell death induced by interferon-gamma, Fas/APO-1 and TNF-alpha / L.P. Deiss et al. // EMBO J. 1996.-Vol. 1,№ 15(15). -P. 3861-3870.
59. Differential' heat shock protein localization in chronic lymphocytic leukemia / №G. Dempsey et all. i ■// J1 Leukoc; Biol: 2010- - Vol: 87(3). - P. 467- 476. .
60. Heat-shock protein 27 (HSP27.) and its role in female reproductive organs / 0:.Devajaet al:. // Eür. JIGrynaecoU OncoK 1997. - Vol: 18p): — P: 16-22. ;
61. Vascular endothelial growth factor (VEGF) in endometriosis / J; Donnez etal:. IIHum.,Reprod. 1998:-Vol. 13,№6.-P. 1686-1690.
62. The mesothelium, Teflon or Velcro? / G:A. Dunselman et al. // Hum. Reprod: 2001. - Vol. 16, № 4. P. 605-607.
63. Functional aspects of peritoneal macrophages in endometriosis of women / G.A. Dunselman et al. II J. Reprod. Fertil. • 1988. Vol. 82. - P. 707710.
64. CD36 is a receptor for oxidized low-density lipoprotein / G. Endemann et al.,//J. Biol. Chem. 1993. - Vol. 268. -P. 11811-11816.
65. Validation study of nonsurgical1 diagnosis of endometriosis / B. Eskenazi et al. // Fertil. Steril. 2001. - Vol. 76(5). - P. 929-935.
66. Recurrence of endometriomas. after laparoscopic removal: Sonographic and clinical follow-up andiindication for second surgery / C. Exacoustos et al.! // J'. Minim: Invasive Gynecol. 2006. - Volt 13(4). - P. 281-288.
67. Faguer C., FaiR., Maghioracos P. Endometriose et sterlite // Contracept.
68. Fertil. Sex.- 1983.-Vol. 11,№9:-P. 1029-1034.
69. Relation« between pain symptoms and the anatomic location of deep infiltrating endometriosis / A. Fauconnier et al. // Fertil. Steril: 2002. -Vol. 78(4).-PI 719-726.
70. Fernandez H. Traité de gynécologie. Paris: Flamarion Médecine-Sciences, 2005. - 572 p.
71. Frackiewicz E.J. Endometriosis: an overview of the disease and" its treatment // J. Am. Pharm. Assoc .(Wash). 2000. - Vol. 40(5). - P. 645657.
72. Faber, B.M. Macrophage secretoryproducts and sperm zona pellucida binding Text. / B.M. Faber, N. Chegini, C.G. Coddington // Obstet Gynec. -2001. Vol. 98, N 4. - P. 668-673.
73. Effect of endometrial stromal cells and peritoneal fluid on fertility associated with endometriosis / M. Furukubo et al. // Osaka Citi Med. J. 1998. - Vol. 44, № 1. - p. 43- 54.
74. Garcia-Ulloa A.C., Arrieta O. Tubal occlusion causing infertility due to an excessive inflammatory response in patients with predisposition for keloid formation // Med. Hypotheses. 2005. - Vol. 65, № 5. - P. 908- 914.
75. Uterine and ovarian function in endometriosis / N. Garrido et al. // Semin Reprod: Med. 2003. - Vol. 21(2). - P. 183-192.
76. Tlie endometrium versus embryonic quality in endometriosis-related infertility / N. Garrido?et a!. // Hum. Reprod. Update. 2002. - Vol; 8(1) -P. 95- 103. .'.■';.:■
77. HSP27 inhibits cytochrome: c-dependenti activation! of procaspase-9" / G. Garridoíet ah.^ //FASEBJv -1999:- Vol: 13; Pi 2061-2070;
78. Developments on drug delivery systems for the treatment of mycobacterial infections / M:Mí-Gaspar et:ali.{// Curr. Topi Medí Gherm 20081- Voll8; № 7:- P; 579^-59 It
79. Involvement of the nuclear factor-/cB pathway in the pathogenesis of endometriosis / R. González-Ramos et al. II Fértil. Steril: 2010. -Vol. 94, № 6. - P. 1985-1994.
80. Guo S;W. Nuclear. Factor-kappaB (NF-kappaB): An Unsuspected Major Culprit in the Pathogenesis of Endometriosis; That Is Still, at Large? // Gynecol Obstet Invest. 2006;- Vol. 4, № 63(2). - P. 71-97.
81. Halis G., Arid A. Endometriosis and inflammation in infertility // Ann N Y Acad Sci. 2004. - Vol. 1034. -P. 300-315.
82. Increased activation of pelvic macrophages in infertile women with mild endometriosis / J. Halme et al. // Am. J. Obstet. Gynecol. 1983. - Vol. 145.-P. 333-337.
83. Halme J., Becker S., Haskill S. Altered maturation and function of peritoneal macrophages: possible role in pathogenesis of endometriosis // Am. J. Obstet. Gynecol. 1987. - Vol. 156. - P. 783- 789.
84. Haney A.F., Jenkina S., Weinberg J.B. The stimulus responsible for the peritoneal fluid inflammation observed in infertile women with endometriosis//Fertil. Steril.- 1991.- Vol.56. P. 408-413.
85. Haney A.F., Mascato J.J., Weinberg J.B. Peritoneal fluid cell populations in infertility patients // Fertil. Steril. 1981. - Vol. 35. - P. 696- 698.
86. Hansen K.A., Eyster K.M. A review of current management of endometriosis in 2006: an evidence-based approach // S. D. Med. 2006. -Vol. 59(4).- P. 153- 159.
87. Aberrant expression of regulators of cell-fate found in eutopic endometrium is found in matched ectopic endometrium among women and in a baboon model of endometriosis / D.K. Hapangama et al. // Hum. Reprod. 2010. - Vol. 25, № 11. - p. 2840- 2850.
88. Apoptosis and endometriosis / T. Harada et al. // Front. Biosci. -2007.-Vol. 12.-P. 3140-3151.
89. Harada T., Iwabe T., Terakawa N. Role of cytokines in endometriosis // Fertil. Steril. 2001. - Vol. 76. - P. 1-10.
90. Hsp27 inhibits Bax activation and apoptosis via a phosphatidylinositol 3-kinase-dependent mechanism / A. Havasi et al. // J. Biol. Chem. 2008. -Vol. 283, № 18.-P. 12305- 12313.
91. Hernández-ValenciaM., Zarate A. Endometriosis. Pathophysiological background for treatment // Rev. Med. Inst. Méx. Seguro. Soc. 2009. -Vol. 47, №1.- P. 57-60.
92. Ho H.W., Wu M.Y., Yang Y.S. Peritoneal cellular immunity and endometriosis // Am. J. Reprod. Immunol. 1997. - Vol. 38. - P. 400412.
93. Thiazolidinedione inhibition of peritoneal inflammation / D. Hornung et al. // Gynecol. Obstet. Invest. 2003. - Vol. 55(1). - P. 20- 24.
94. An association of IgG anti-laminin-1 autoantibodies with endometriosis in infertile patients / J. Inagaki et al. // Hum. Reprod. -2003.- Vol. 18(3).-P. 544-549.
95. Leukocyte subpopulation and natural killer activity in endometriosis / K. Iwasaki et al. // Int. J. Fertil. Menopausal. Stud. 1993. - Vol. 38, № 4. -P. 229-234.
96. Javid B., MacAry P.A., Lehner P J. Structure and Functions: Heat Shock Proteins and Adaptive Immunity // J. Immunol. 2007. - Vol. 179. -P. 2035-2040.
97. Cell mediated immunity in endometriosis / P. Jha et al. // Abst. of 4 Int. Congr. of Reproductive Immunology. Kiel, 1989. - P. 192.
98. Signals leading to apoptosis-depended inhibition of neovascularization« by thrombospondin-1 / B. Jimenez et al. II Nat. Med. 2000. - Vol. 6. -P. 41-48.
99. Jones G., Jenkinson C., Kennedy S. The impact of endometriosis upon quality of life: a qualitative analysis // J. Psychosom. Obstet. Gynaecol. -2004! Vol. 25(2). - P. 123-133.
100. Surgically induced endometriosis does not alter peritoneal factors in the rabbit model / J.V. Jonson et al. // Fertil. Steril. 1991. - Vol. 56, № 2. - P. 363-368.
101. Expression profiling of endometrium from women with endometriosis reveals candidates genes for diseases-based implantation failure in infertility / L.C. Kao et al. II Endocrinology. 2003. - Vol. 144, № 7. - P. 28702881.
102. Localization of anti-andometrial antibody binding in women with endometriosis using a double-labeling immunohistochemicaF method / S.H. Kennedy et al. // Br. J. Obstet. Gynecol. 1990.« - Vol. 97. - P. 671-674.
103. Results of insemination (AIH) following GnRH treatment of endometriosis / A. Kereszturi et al. // Arch Androl: 2002. - Vol. 48(4). -P. 243-249.
104. Immunopathogenesis of pelvic endometriosis: role of hepatocyte growth factor, macrophages and ovarian steroids / K.N. Khan et al. // Am. J. Reprod. Immunol. 2008. - Vol. 60(5). - P. 383^04.
105. Kichukova D.,. Uchikova E., Velevski V. Endometriosis as an unexpected finding during laparoscopy on sterile women // Akush. Ginekol. 2000: - Vol. 39, № 3. - P. 25-26.
106. Koninckx P.R., Kennedy S.H., Barlow D.H. Pathogenesis of endometriosis: the role of peritoneal1 fluid // Gynecologic and Obstetric Investigation. 1999. - Vol. 47, № 1. - P. 23-33.
107. CA-125 and placental protein-14 concentrations in plasma and peritoneal fluid' of women with deeply infiltrating pelvic endometriosis / P.R. Koninckx et al. // Fértil, and Steril. 1992. - Vol. 57, № 3. p. 523-530.
108. Measurable serum markers of oxidative stress response in women with endometriosis / I.V. Lambrinoudaki et al. // Fértil. Steril. 2009: -Vol. 91, № 1.- P. 46-50.
109. Apoptosis Versus Cell Differentiation Role of Heat Shock Proteins HSP90, HSP70 and HSP27 / D. Lanneau et al. // Prion. 2007. -Vol. 1, Issue. 1. - P. 53-59.
110. Lassey B.A., Young S.L. Integrins and other cell adhesion molecules in-endometrium and endometriosis // S'emin Reprod Endocrinol. 1997. - Vol. 15(3).-P. 413-417.
111. Leukocyte subpopulation and natural killer activity in endometriosis / K. Iwasaki et al. // Int. J. Fertil. Menopausal. Stud. 1993. - Vol. 38, № 4. -P. 229-234.
112. Lougheed M., Steinbrecher U.P. Mechanisms of uptake copper- oxidized low density lipoprotein in macrophages is depended on its extend of-oxidation // J. Biol. Chem. 1996. - Vol. 271. - P. 11798-11805.
113. Innate defence functions of macrophages can be biased by nano-sized ceramic and metallic particles / M. Lucarelli et al. // European Cytokine Network. 2004. - Vol. 15, № 4. - P. 339-346.
114. Mahmood T.A., Templeton A. Folliculogenesis and ovulation in infertile women with mild endometriosis // Hum. Reprod. 1991. - Vol. 6. - P. 227-231.
115. Mardh P.A. Tubal factor infertility, with special regard to chlamydial salpingitis // Curr. Opin. Infect. Dis. 2004. - Vol. 17, № 1. - P. 49-52.
116. Endometriosis and autoantibodies / P. Martinez et al. // Am. J. Reprod. Immunol.-1998.-Vol. 40, №4.-P. 271.
117. Transferrin receptor (CD71) expression in peritoneal macrophages from fertile and infertile women with and without endometriosis / Martinez S. Roman et al. // Am. J. Reprod. Immunol. 1997. - Vol. 38, № 6. -P. 413-417.
118. Embriotoxicity of peritoneal fluid in women with endometriosis. Its relation with cytokines and lympfocytes populations Text. / M.J. Gomes-Torres, P. Acien, A. Campos, I. Velasco // Hum Reprod. 2002. - Vol. 17, N3.-P. 777-781.
119. Autoimmuniy to endometrium and ovary in endometriosis / S. Mathur et al. // Clin. Exp. Immunol. 1982. - Vol. 50. - P. 259-266.
120. Mathur S.P. Autoimmunity in endometriosis: relevance to infertility // Am. J. Reprod. Immunol. 2000. - Vol. 44(2). - P. 89- 95.
121. Moore. K.J:,, Freeeman* MIW. Scavenger receptors in* aterosclerosis. Beyond lipid uptake // Arteriosclerosis, thrombosis and vascular biology. -2006.-Vol. 26.-P. 1702-1711.
122. Ragulated expression of the human acetylated low-density lipoprotein receptor gene and isolation of promoter sequences / K.S. Moulton et al. // Proc. Natl:,Acad. Sei.- 1992.-Vol: 89:-P. 8102-8106.
123. Protein kinase inliibitors can control the progression of endometriosis in vitro and in vivo / C.Ngö et al. // J. Pathol. 2010: - Voh,222; № 2: -P: 148-157.
124. Expression of heat shock protein 70 kDA in human endometrium of normal and infertile women / M.M.C. Nip et all. // Hum: Reprod. 1994: -Vol. 9.-P. 1253-1256.
125. Galectin-r3 is Overexpressed in Various Forms of Endometriosis / J.C. Noel etal.// Appl.Immunohistochem. Mol: Morpholl 2010. - P: 456«
126. Olive D.L., Weinberg J.B., Haney A.F. Peritoneal macrophages and infertility: the association between cell number and pelvic pathology. // Fertil. Steril. 1985. - Vol. 44. - P. 772-777.
127. Transforming growth factor (3 activity is increased in peritoneal fluid from women with endometriosis / D.J. Oosterlilynck et al. // Obstet. Gynecol. 1994. - Vol. 83. - P. 287-292.
128. Women with endometriosis, show a defect in natural killer activity resulting in decreased cytotoxicity to autologous endometrium / D.J. Oosterlynck et al. // Fertil. Steril. 1991. - Vol. 56. - P. 45-51.
129. Ory S.J. Pelvic endometriosis // Obstet. Gynecol. Clin. J. Amer. -1987. Vol. 14, № 4. - P. 999-1014.
130. Osteen K.G., Bruner K.L., Sharpe-Timms K.L. Steroid and growth factor regulation* of matrix metalloproteinase expression and endometriosis // Semin. Reprod. Endocrinol. 1996. - Vol. 14. - P. 247-255.
131. Distribution of heat shock proteins in eutopic and ectopic endometrium* in endometriosis and adenomyosis / H. Ota et al. // Fertil Steril. 1997. -Vol. 68(1).-P. 23-28.
132. Effect of danazol on the immunocompetent cells in the eutopic endometrium in patients with endometriosis: a multicenter cooperative study / H. Ota et al. // Fertil. Steril. 1996.- Vol.65. - P. 545-551.
133. Expression profiling of endometrium from women with endometriosis reveals candidate genes for disease-based implantation failure and infertility Text. / L.C. Kao et al'. // Endocrinology. 2003. - Vol. 144, N 7. - P. 28702881.
134. A macrophages recptor for oxidized low-density lipoprotein: partial purification and role in recognition of oxidatively damaged cells / E. Ottnad et al. //Proc. Natl. Acad. Sci. 1995. - Vol. 92. - P. 1391-1395.
135. Ozkan S., Murk W., Arid A. Endometriosis and infertility: epidemiology and evidence-based treatments // Ann. N. Y. Acad. Sci. 2008. - Vol. 1127.-P. 92-100.
136. Panidis D.K., Matalliotakis I.M. Subfertility associated with minimal to mild endometriosis. Main mechanisms. // J. Reprod. Med. 1998. - Vol. 43, № 12. -P. 1034-1042.
137. Pervulov M., Terzic M.M. The influence of ovarian endometriosis in reproductive function // Acta Obstet. Gynecol. 1997. - Vol. 76, Suppl. 167(4).-P. 63.
138. Retroperitoneal endometriosis causing unilateral hip pain / S. Rana et al. // Obstet Gynecol. 2001. - Vol. 98(5 Pt 2). - P. 970.
139. Patterns of matrix metalloproteinase expression in cycling endometrium imply differential functions and regulation by steroid hormones / W.H. Rodgers et al. // J. Clin. Invest. 1994. - Vol. 94. - P. 946- 953.
140. Priorities for endometriosis research: recommendations from an international consensus workshop / P.A. Rogers et al. // Reprod. Sci. — 2009. Vol. 16, № 4. - P. 335- 346.
141. Intracellular and extracellular functions of heat shock proteins: repercussions in cancer therapy / E. Schmitt et al. // J. Leukoc. Biol. -2007.- Vol. 81.- P. 15-27.
142. The complex role of B7 molecules in tumor immunology / B. Seliger et al. // Trends Moll Med. 2008. - Vol. 14, № 12. - P. 550-559.
143. Senturk L.M., Arici A. Immunology of endometriosis // J. Reprod. Immunol. 1999. - Vol. 43. - P. 67-83.
144. FOXOl and c-jun transcription factors mRNA are modulated in endometriosis / K. Shazand et al. // Mol. Hum. Reprod. 2004. - Vol. 10(12).- P. 871-877.
145. Sherman M, Multhoff G. Heat shock proteins in cancer // Ann N Y Acad Sci. 2007.- Vol. 1113.- P. 192-201.
146. Chemokine bioactivity of RANTES is elevated in the sera of infertile women with1 past Chlamydia trachomatis infection / H. Shibahara et al. // Am. J. Reprod. Immunol. 2003. - Vol. 49, № 3. - P. 169173.
147. Detection of chromosomal aneuploidy in endometriosis by multi-color fluorescence in situ hybridization / J.C. Shin et al. // Hum. Genet. 1997. -Vol. 100, №3-4.-P. 401-406.
148. Sidell N., Nam S.W., Parthasarathy S. Regulation and modulation of abnormal immune response in endoemtriosis // Annals New York Academy of Sciences. 2002. - Vol. 955. - P. 159-173.
149. Stratton High rates of autoimmune and endocrine disorders, fibromyalgia, chronic fatigue syndrome and atopic diseases among women with endometriosis: a survey analysis / N. Sinaii et al. // Hum Reprod. -2002.- Vol. 17(10).- P. 2715-2724.
150. Haptoglobin phenotype in patients with spondyloarthritis and healthy individuals / T.S. Soliev et al. // Klin tab Diagn. 2002. - Vol. 4. -P. 41-42.
151. Mechanisms regulating invasiveness and growth of endometriosis, lesions in rat experimental model and in humans / N.Yu. Sotnikova et al. // Fertil. Steril. 2010. - Vol. 93, № 8. - P.' 2701-2705.
152. A macrophage Fc receptor for, oxidized? low-density lipoprotein / L.W. Stanton et al. // J. Biol. Chem. 1992. - Vol-. 267. - P. 2244622451.
153. In search of pathogenic mechanisms in endometriosis: the challenge for molecular cell biology / A. Starzinski-Powitz et al. //Current Molecular Medicine. 2001. - Vol. V, № 6. - P. 655-664.
154. High rates of autoimmune and endocrine disorders, fibromyalgia, chronic fatigue syndrome and" atopic diseases,among women with endometriosis: a survey analysis / N. Sinaii et al.> // Hum Reprod. 2002. - Vol. 17(40). -P. 2715-2724.
155. Stummvoll W., Kapshammer E. Clinical aspects»of endometriosis.// Wien Med Wochenschr. 1999. - Vol. 149(13). - P. 358-360.
156. Szamatowicz J., Laudanski P., Tomaszewska I. Matrix metalloproteinase-9 and tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-1: a possible role in the pathogenesis of endometriosis // Hum. Reprod. 2002. -Vol. 17(2). - P: 284-288.
157. Intestinal endometriosis causing subacute ileus. Experience in three cases / G. Szendei et al. // Magy Seb. 2002. - Vol. 55(5). - P. 307-312.
158. Endometriosis and pain / Topalski N. Fistes et al. // Med. Pregl. 2002. - Vol. 55(9-10). -P. 415-418.
159. Trinder J:, Cahill D:J. Endometriosis and infertility: the debate continues // Hum Fertil (Camb). 2002. - Vol. 5, Suppl. 1. - S. 21-27.
160. Endometriosis in reproductive immunology / Z. Ulcova-Galova et al. //Am. J. Reprod. Immunol. 2002. - Vol. 47, № 5. - P. 269- 274.
161. Ulukus M., Cakmak H., Arici A.J. The role of endometrium in endometriosis // Soc. Gynecol. Investig. 2006. - Vol. 13, 7. -p. 467-476.
162. Detection of minimal residual disease in* hematologic malignancies by real-time quantitative PCR: priciples, approaches, and laboratoty aspects / Velden van V.H J. et al. // Leukemiear 2003'. - Vol: 17. - P. 1013-1034.
163. Theories of endometriosis / D.w Vinatier et al. // Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprodi Biol.- 2001.- Vol. 96.-P. 21-34.
164. Vinatier D., Cosson M:, Dufour P: Is endometriosis an« endometrial disease? // Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. 2000. - Vol. 91(2). - P. 113-1125.
165. Vouri K. Integrins signaling: Tyrosine phosphorylation events in focal adhesions // J. Membr. Biol. 1998. - Vol. 165. - P. 191-199:
166. Cell proliferation is increased in the endometrium of women with-endometriosis / M. Wingfield et al. // Fertil. Steril. 1995. - Vol. 64. - P. 340-346.
167. Combinatorial interactions between AP-1 and Ets domain proteins contribute to the development regulation* of the macrophages scavenger receptor gene / H. Wu et al. // Mol. Cell. Biol. 1994. - Vol. 14. -P. 2129-2139.
168. Macrophage contributions to ovarian function / R. Wu et al. // Hum. Reprod. Update. 2004. - Vol. 10, № 2. - P. 119-133.
169. Serum and endometrial markers / W.C.V. Yang et al. // Best Practice & Clinical Obstetrics and Gynaecology. 2004. - yol. 18, № 2. - P. 305— 318.
170. Oxidative stress and TGF-beta2 increase heat shock protein 27 expression in human optic nerve head astrocytes / A.L. Yu et al. // Invest Ophthalmol Vis Sci. 2008.- Vol. 49(12).- P. 5403-11.
171. Zhang H., Yang Y., Steinbrecher U.P. Structural requirements for the binding of modified proteins to the scavenger receptors of macrophages // J. Biol. Chem. 1993. - Vol. 268. - P. 5535- 5542.
172. Zhang J., Salamonsen L.A. Tissue inhibitor of metalloproteases (TIMP)-1, -2 and -3 in human endometrium during the menstrual cycle // Mol. Hum. Reprod. 1997. - Vol. 3. - P. 735-741.
173. Down-regulation of HSP27 sensitizes TRAIL-resistant tumor cell to TRAIL-induced apoptosis / H. Zhuang et al. // Lung Cancer. 2010. -Vol. 68, № 1.- P. 27-38.