Автореферат и диссертация по медицине (14.00.26) на тему:Значение быстрого определения множественной лекарственной устойчивости Mycobacterium tuberculosis методом биочипов в клинике туберкулеза легких

При подтверждении диагноза туберкулеза легких "золотым стандартом" считается выделение культуры MET щ мокроты Однако бактериологические методы выявления МЕТ требуют длительного периода иременн {до 3-х месят») к хлиинщнт-фпанкр получает сведения о лекарственной чувствительности возбудителя туберкулеза практически к моменту завершения интенсивной фазы лечения. Таким образом. больным туберкулезом лёгких с самого начата Кит начнется эмпирическое лечение бе» достоверной информации о наличии лекарственной устойчивости МБТ. В «или с этим кирастает актуальность проблемы внедрения и практику ноны* ускоренных методов лабораторной диагностики МЛУ МБТ

В Институте модекуляриой биологии им, В А. Энгельгардта РАН (ИМБ) был разработан биологический мнкрочкп (биочип), позволяющий определять деэокскрнбонуклеииовую кислоту (ДНК) МБТ и идентифицировать мутации, ответственные за чувствительность возбудителя туберкулеза к Н и R та максимально короткое время (24 часа) [Грялунов Д.А., Михайлович В.М., Лш СЛ., 2003], Тест-система «ТБ-Биочип* прошш регкетршию в Министерстве ^драиоокранения и Социального развития (Регистрационное удостоверение № ФС 0326200^/0&&9-04) однако ло настоящего времени клиническая значимость диагностики МЛУ МБТ на биотипах «ТБ-Бночип» не установлена

Цель исследования.

Оценки. эффективность химиотерапии больных туберкуледа* легких, основанной на раннем определен ни чувствительности Mycobacterium ivbercuhsis к рнфшкинюш)' и юоишяиу «столом биочнпо»

9 Изучить частоту совпадений результате» бактериологического (абсолютных концентраций) к молекулярно-генетнческого (на биочипах "ТБ-Биочнн" J методой определения чувствительности Mycobacterium tuberculosis к июииазилу н рифампнинну

2- Определить спектр мутаций н kaiG mhA, ahpC.rpvB reitax Mycobacterium tuberculosis, ответственных за устойчивость к иэонивзиду и рнфампиинну. у больных туберкулезом легких.

3. Изучить особенности клинических проявлений и частоту выявления мутаинй в генах Mycobacterium tuberculosis у впервые выявленных н ранее леченных больны* туберкулезом лёгких.

4. Оценить эффективность лечения больных туберкулезом легких в ависимости от сроню коррекции химиотерапии по результата* определения лекарственной чувствительности Mycobacterium tubcrculoiu с помощью «ет<истемы *ТБ-Бноцнпн.

5. Оценить эффективность химиотерапии комбинацией из 5-тн протиьотуберкулг-шых препаратов реэераного ряда »№ начальном этапе лечения у больных туберкулезом легких, выделяющих мультнрсзнетентные \hvobaetcrium tuberculosis поданным тест-системы «ТЬ-биочин»,

Новиша исследования.

Впервые щучена эффективность химиотерапии деструктивного туберкулёза лёгких, основанной на определении чувствительности МВТ к итониазиду и рнфамлниину бночиповьш методом «ТБ-Бночил»

Установлено, что эффективность лечения больных, выделяющих резистентные к нзониазнду и/илн рнфампнцнну мнкобактернн туберкулеза, зависит от методики химиотерапии и течение начальной фазы согласно данным лекарственной чувствительности МБ Г по методу бночнпов.

Оперные проведено сравнение спектра мутаций в генах каЮ. тЬЛ. ahpC, rpoB Mycobacterium tuberculosis, выделенных от больных туберкулезом легких разни* категорий: впервые выманенных, не получавших противотуберкулйтные препараты и ранее леченых.

Показано, что наиболее часто мутации в katG, tniiA. afspC, rpoB генах Mycobacterium tubercuhsis определяются у больных туберкулезом яйгкнх, 1юлучавших ранее противотуберкулезную терапию.

Впервые показана высокая частота совладений результатов биочилоаого метода н истода Абсолютных концентраций по установленюо устойчивости Mycobacterium tuberculosis к нзонивзнду и рифампилину

ОЕатандуаач.лечиццц.'дь!

Применение тест-системы «ТБ-Бночил» позволяет сократит!, до 24 часов определение чувствительности Mycobacterium tuberculosa к основным протяюуФеркулвзныы препаратам первого ряда - нэонкюиду н рнфамлннииу,

Ройная коррекция схем химиотерапии НО результатам определенна чувствительности Mycobacterium tuberculous на биочипах да£т возможность в более короткие сроки добиться абациллнровання мокроты, ускорить репаративнме процессы в легочной ткани.

Надавать амазаиа^ м ашш

1. Тест-система «ТБ-Биочип* позволяет на этапе обследования в мокроте детектировать генетический маркёр ISSIIO и мутации к генах rpoB. katG. tnhA, ahpC Mycobacterium tubtrctrlosis, определяющих устойчивость к нзониазиду н рифампицину.

2. Результаты определения устойчивости Mycobacterium tuberculosis к изоиначнду и рифампицину на биочнпак «ТБ-Биочип» а высокой степени совпадают с резу льтатами метола абсолютных концентраций

3. Ранняя коррекция химиотерапии при быстром установлении чувствитслыюсти Mycobacterium tuberculosis к иэонивзилу и рифампицину на бмочнпах «ТБ-Биочнп» повышает эффективность лечения туберкулёза лёгких

-4. Ииволюиня специфических изменений в легких н конверсия мокроты у больных с МЛУ туберкулёзом шушет быстрее при назначении комбинации из 5-ти препаратов резервного ряда в начальной фазе химиотерапии. основанной на результатах установления устойчивости к нзонназиду и рифампицину на биочнпах «ТБ-Бночип», по сравнению с поздней коррекцией по результатам бактериологического метода абсолютных концентраций.

Внедрение результатов исследования в практик!.

Результаты исследования внедрены в лечебно - диагностический процесс ГУ ЦНИИТ РАМН, 1"У ПТД №2 г. Москвы. Материалы диссертации используются в лекциях и на практических шатиях с аспирантами и ординаторами, проходящими обучение в ГУ 1 [НИИТ РАМН, при проведении сертификационных курсов и курсов повышения квалификации и Учебном центре ГУ ЦНИИТ РАМН, а также внедрены п учебный провесе кафедры фтизиатрии Санкт-Петербургской медицинской академии последипломного образования.

Апробация работы.

Материмы диссертации доложены иа XIV u XV Национальных конгрессах по болезням органов дыхания в 2004г., 2005г„ на 14 конгрессе Европейского респираторного общества (2004). Научно-практической конференции молодых ученых, посвященной Всемирному дню борьбы с туберкулезом (2005), Научно-практической конференции молодых учёных «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» (2006).

Работа апробирована на соамсстном заседании отделов фтизиатрии, микробиологии и детско-подроеткояото отдела ГУ ЦНИИ туберкулой PAMFI4 мы 2006 годи,

ШЙдмдяшь

Материалы диссертации изложены в 12 публикациях

Об^сч и структура диссердации

Диссертация изложена на 144 страницах машинописного текста, состоит из введения* 5 глав с изложением материалов и результатов проведенных исследований. включения, выходов, практических рекомендаций и списка цитируемой литературы. В диссертации представлено 32 таблицы it 24 рисунка. Список литературы вюиочает 162 источника отечественных и зарубежных автороя

123 ВЫВОДЫ

1 Совпадение результатов молекулярио-генетнчесхого (на бночилах ТБ-БночяГ) и бактериологического (абсолютных концентраций) методов составило 93,1% при выявлении М tvbcvubtft , устойчивых одновременно к изонназнду н рнфампицину, н 8В.9% - при выявлении № tuberculosis , устойчивых только к изонназнду.

2 Анализ мокроты больных деструктивным туберкулёзом лёгких на бночнпах выявил широкий спектр мутаций в генах М. tuberculosis . связанных с устойчивостью к изонназнду н рнфампицину, и продемонстрировал преобладание мутаций л 315 колош гена katG (Ser—Thr(l), AGC->ACC) в 65.3% и 531 кодонс гена г/дай (Ser-«Leu, TCG->TTG)- в 79,1% случаев,

3 Клиническая картина туберкулёза лёгких у ранее леченых больных по сравнению с впервые выявленными характеризовалась преобладанием двусторонних процессов (60,4%), наличием сформированных фиброзных каверн (31,3%). обильным бяктериовылелением (83,3%),

4 Молекулярно-генетнчсскнй анализ М, tuberculosis, выделенных от больных разных категорий, выявил мутации в генах katG, intiA, ahpC, гроИ в 49,1% -в группе впервые выявленных пациентов и в 89,6% случаев в группе ранее леченых, В группе впервые выявленных больных преобладали М tuberculous с мутациями в генах katG u inhA с доминированием мутации AGC->ACC в 315 кодонс гена kii/G, у ранее леченых пациентов А/ tuberculosis несли сочстанныс мутации одновременно в нескольких генах гроВ. katG, inhA, ahpC с преобладанием мутации TCG->TTG в 531 кодонс гена гроВ

5 Ранняя коррекция химиотерапии по результатам установления лекарственной чувствительности к изониазиду и рифампишму на бночнпах способствовала абацнлнроваиию мокроты у 64,1% больных после 2-х месяцев, у 72,0% - после 4-х н у 90,1% - после 6 месяцев лечения. При более поздней коррекции ил основании результатов метода абсолютных концентраций бактериоцыделеиие прекращалось значительно медленнее: у 41,6% больных после 2-х , у 524% - после 4-х и у 59,4% - после 6 месяцев терапии,

6 При режимах химиотерапии, назначенных по результатам выявления ЛУ М. Иtbercitlotis с использованием бночнпов, отмечается более быстрая регрессия специфических изменений о легких рассасывание инфильтрации н уменьшение деструкиий у 48,6% ■ через 2 чесани, у 673% - через 4 месяца и у 92.5% - через 6 месяцев При стандартной терапии инволюция специфических изменений в легких отмечена у 31,7%, 40,6% и 64,4% а соответствующие сроки.

7 Использование комбинации из 5-тн противотуберкулезных препаратов резервного ряда в начальной фазе химиотерапии повышает е£ зффектилиосп, у больных с МЛУ штаммами М («(етк/ий . выявленными по методу бночнпов. При пом исчезновение \t tuberculosis из мокроты определялось у 61,1% -через 2 и у 83,3% через 6 месяцев, частичное рассасывание воспалительных изменений наблюдалось у 463% и 85,2% больных в зги же сроки При стандартной химиотерапии на начальной фазе с последующей коррекцией по методу абсолютных концешрацнй абаинллнрованне мокроты у больных с МЛУ туберкулезом отмечено у 133% и 30,8%, а инволюция специфических изменений в лёгких -у 133% и 63,5% в соответствующие сроки.

UP А КТНЧ ЕСКИ F. PF.KOM КНДЛЦИИ

1 Определение мнкобоктерий туберкулfrjного комплекса н выявление мутаций в гага.х rpofi, katG, inhA. ahpC на биочипах «ТБ-Биочип» может быть рекомендовано в качестве информативного теста для детекции устойчивости А/. tuberculosis к рифампицину ы надииазиду как у впервые выявленных больных, нс получавших противотуберкулезные препараты, тох и у ранее леченых пацнигтол, при отсутствии лонных о лекарственной устойчивости возбудителя туберкул Си

2 При получении дойных биочннового анализа о мутациях в генах, ответственных та устойчивость А/ tuberculosis к изониаэнду, необходимо исключить препарат из схемы и заменить его двумя другими противотуберкулезными препаратами

3.Выявление мутаций в генах, ответственных за устойчивость .V/ tuberculosis к изоииазнду и рнфампипииу, является основанием для назначения химиотерапии комбинацией резервных противотуберкулёзных препаратов

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проблема лекарственной устойчивости возбудителя туберкулёза человека приобрела в последнее «ремл глобальное значение. Запоздалая диагностика ЛУ МБТ к нэо ни азиду может привести к ускоренному развитию устойчивости к другим ранее действенным лекарственным препаратам, прежде всего к микобактернцндноыу рифампицину. В последнее время большое значение придается выявлению штаммов МБТ с МЛУ Заражение человека такими штаммами приводит к быстрому прегрессированию специфического процесса н, нередко, к детальному исходу Бактериологические методы выявления Л У МБТ требуют длительного периода времени (до трёх месяцев) и клиницист • фтизиатр получает сведении о ЛУ МБТ практически к моменту завершения интенсивной фазы лечения. Технология биочнпов ддя выявления устойчивости MET к рнфамлниину и изонназнду 1го1воляет определять ДНК МБТ и идентифицировать мутации в генах, ответственные та устойчивость возбудителя туберкулёза к Н и R , за 24 часа. Для того, чтобы оисинтъ эффективность химиотерапии больных туберкулезом лёгких, основанной на раннем определении чувствительности А/ tuberculosis к рифампиннну и изонназнду методом биочнпов бито обследовано -ОН ВИЧ- отрицательных пациентов с деструктивным туберкулезом органов дыхания, находившихся на лечении в ГУ ЦНИИТ РАМН с 2003 «о 2005 гг. Среди обследованных больных мужчин было 55,8%, женщин - 44,2%. Наибольшей по численности оказалась возрастная группа от 21 до 40 лет - 523%. У 47,6% пациентов диагноз туберкулеза лег*нх был установлен впервые в жизни в период до 1 месяца до поступления в клинику ГУ ЦНИИТ РАМН- 21,2% были с рецидивом туберкулезного процесса. 25,4% - с прогрессировал нем туберкулёзного процесса на фо«№ предшествующего лечения препаратами первого ряда в течение 3-6 месяцев. НнфнльтратнаныЙ туберкуле1! легких при поступлении в стационар был выявлен у 71,2% больных. лисееминированиый - 2,9 %. кавернозный - 3,9%. фнброэио-кввериозиый - 14.3%, казеошая пневмония - 7,7% обследованных пациентов. У 60,5% больных процесс заболевания ограничивался поражением 1 -2 долей лёгких, у 33,7% протяженность процесса соответствовала 3-5 долям легких. Двусторонний процесс отмечался у 40,4%, односторонний - у 59,6% больных- Микобактерин туберкулеза были обнаружены методом посева при поступлении в клинику у всех 208 naiuteirroB. Исследование культур М. tuberculosis нз чувствительность к противотуберкулезным препаратам первого ряда проводили метолом абсолютных концентраций по методике, описанной в Приказе МЗ РФ № 109 от 21 марта 2003 года. В 107 случаях определение устойчивости к рифампицкну и «гэонназиду А/ tuheixuUxiis проводили на бночипох «ТБ-Биочнп».

Для оценки эффективности лечения больных туберкулезом легких в зависимости от сроков коррекции химиотерапии по данным бактериологического и молскулярио-гснегичеекого методов определения лекарственной чувствительности М. tvbercutosto 208 пациентов были разделены на две группы: 107 пациентов составили 1-ую н 101- It-ую. Группы были сопоставимы по полу, дорасту, формам туберкулезного процесса. Веем пациентам прн поступлении в стационар и далее ежемесячно проводили исследование мазка мокроты методом люминесцентной микроскопии и посев мокроты на плотную питательную среду Левснигтсйна-Йенссна. Выделенные на средах М tuberculosis исследовались на чувствительность к стрептомицину, изонилзилу, рнфампнцнну, згамбутолу, пнразднамнлу методом абсолютных концентраций. 107 пациентам 1-ой группы прн поступлении в стационар исследовали мокроту и выделенную из нее культу ру М tuberculosis на бночилш «ТБ-Бночнп» По результатам определения мутаций в генах, ответственных за чувствительность возбудителя туберкулёза к рифам Пнин ну н изонназнду, назначались схемы химиотерапии, При отсутствии мутаций в ieHax гроВ, katG, inhA, ahftC MET пациентам назначали 4 препарат [криш ч ряда -изониоэид, рифампицнн, пирознномнд, этамбутол (стрептомицин). Прк выявлении мутаций в генах МБТ, ответственных за устойчивость к изониазиду (katG. inhA, ahpC). и отсутствии мутаций в геле гроВ. ответственные за устойчивость к рифампицину, больным назначалась следующая комбинация препаратов, рнфампнцнн. этамбутол. пират ним лл. фторхннолон, амнкации (каиамицин). При выявлении мутаций одновременно в гроВ и и одном или нескольких rwiax katG. inhA. aftpC, лечение назначалось по IV режиму: протнонамнд, пиразниамил. омикацин или капреомицин, ПАСК, циклосерин, офлоксашн или левофлоксацнн Коррекция лечения проводилась после получения результатов чувствительности МБТ но методу абсолютных концентраций Пациентам II-И группы лечение назначалось по стандартным схемам 4-5 препаратами первого ряда с последующей коррекцией через три меся цл по результатам метода абсолютных концентраций

Сравнение результатов установления устойчивости к рифампицину и нзоннлэнду по методу абсолютных концентраций и на биочипах показало, что процент совпадения составил; для МЛУ МБТ 93,1%, для устойчивых к Н - 88.9%, для чувствительных к Н и R- 94,3%. Полное совпадение результатов наблюдалось при определении моноустойчнвости к рифампицину ни одним методом не было получено данных об устойчивости к этому препарату при отсутствии устойчивости к другим ПТП. Подобные результаты были получены ранее Скотникмюй О Н- с соавт, которая показало, что результаты определения устойчивости М. tuberculosa к рифампицину и Изоииазнду но бночипах из диагностического материала совпадали с результатами традиционного бактериологического метода абсолютных концентраций на среде Лсвснштсйна -Йексена в 88,8% случаев, а при выявлении чувстшгтельных к изоииазнду и рифампицину М. ruhercnioxi*-№ 100%, Результаты исследовании клинических изолятов

At. tuberculosis ид устойчивость к рнфампнцнну н иэониаянду обоими методами соаплпали на 97,3%, а при выявлении чувствительных ■ на 97,6%. (Скотннкова О.И., Галкина КЮ, Носова ЕЮ-. 2005).

Дня определения показаний к использованию бночнпов сравнивались клинические проявления туберкулеза и спектр мутаций в «на* МОТ у двух категорий больных: 59 впервые выявленных больных, не получавших противотуберкулезные препараты до поступления в стационар, и 4В ранее леченных нацистов препаратами первого ряда в течение тр5х месяцев и более, Мутации в генах rpoB. katG, inhA. ahpC МБТ выявляли на б но чип ах и при отсутствии мутаций относили к чувствительным к R и Н, при наличии мутаций - к устойчивым к R или Н. Молскудярно-гснстичсскнй анализ М tuberculosa показал, что чувствительных к И и R в группе впервые выявленных больных было 50,9%, в группе ранее леченых - 10,4%, то есть по числу М4делителей МБТ, чувствительных к итониазиду и рнфачпнинну, категория впервые выявленных больных достоверно отличалась от категории ранее леченных (р<0.01), По выделению МБТ с МЛУ достоверно большее число пациентов было in категории ранее леченных ■ 83,3%, Среди пациентов из категории впервые выявленных выделяющие МБТ с МЛУ составили 23,7% (р<0,01). При определении устойчивости МБТ к нзоннатиду разница между категориями оставалась, однако пациентов, выделяющих МБТ, устойчивые к изониазнду. было л группе впервые выявленных больных больше, чем в груп не ранее леченных (25,4% н 6,3% , соответственно, р-0,018). Такая разница может быть объяснена тем. в группе ранее леченных значительно преобладали выделители МЛУ штаммов МБТ

Акал № спектра мутаций в генах rpott. katG. I'thA. ahpC на биочипах МБТ, выделенных от больных разных категорий, выявил 21 вариант мутаций МБТ в зтнх генах (табл. 32)- Наиболее распространённым был вариант мутаций №1 (rpoB 53ITCG-TTG;jfcaxG 3I5AOC-ACC), который встречался у впервые выявленных в 20,3%, а у ранее леченных в 47,6%.

Необходимо отметать, что этот вариант мутаций встречался у ранее леченных больных в достоверно большем числе случаев, чем у впервые выявленных, Били выявлены и другие варианты мутаций {№ 2-5), которые встречались с одинаковой частотой у МБ'Г от больных обеих групп Кроме того, были детектированы варианты мутаций, которые обнаруживались только у больных ранее леченных (№ 6-17) и только у впервые выявленных больных (№ 18-21). Сопоставление вариантов мупший показало, что у ранее леченных больных были более сложные мутации, затрагивающие одновременно несколько генов, ответственных за устойчивость х изоиназиду в сочетания с мутациями в репных колонах гена гроВ, Мутации, выявленные в МБТ от кнервые выявленных больных. затрагивали только по одному гену, ответственному за устойчивость к изоиназиду.

Эти данные являются фундаментальной основой, объясняющей трудность лечения у больных, ранее подвергавшихся терапии и больных с рецидивами. Так как МБТ. имеющие сложные мутации а нескольких генах являются более защищенными от воздействие противотуберкулёзных препаратов

В работах некоторых отечественных исследователей, изучавших мутации в генах устойчивых к ПТП микобактернй. также было показано большое разнообразие вариантов мутаций. Всеми группами было показано преобладание МБТ с мутациями а 3(5 кодоне гена katG (Геиерозов Э В . Акопян Т А-, Говорун В М„ 2000. Шемякин И,Г., СтепаншнНа В.Н., Иванов НЮ.,2003, Скотникова ОЛ., Галкина К.Ю., Носова EJO,, 2005), Однако распространение штаммов с мутациями а гене гроВ зависело от региона обследования. Так Шемякин ИХ. с соавт. при анализе устойчивых к рнфампнцииу штаммов М tuberculosis, выделенных от больных в Приволжском и Центральном округах показал, что устойчивость к рнфзмпнцнну в 87.4% случаев детерминирована мутациями в 516, 526. 531 колонах гена, причем наиболее часто встречалась мутация в 516 кодоне гроВ (74,5%), Скотникова О.И, с соавт. продемонстрировали преобладание МБТ с мутациями в 531 кодоне гена гроВ (от 47,8% в Саратове до 933% в Алматы). В отличие от ранее проведенных исследований и нашей работе проанализированы особенности спектра мутаций у впервые выявленных н

Варианты мутаций в генах katG. inhA. ahpC rpoB M fuberculoru, определенные на биочинах «ТБ-Бкочига у впервые выявленных и ранее леченных больных туберкулезом

Мутаини в генах katG. inhA. ahpC. гроВ Ранее леченные n-48 Впервые выявленные n-59 P абс % абс % мутации lie выявлены 5 10.414,4 30 SO,9±6.5 0,0

1 гроВ 531 TCG-TTG kxaC 31SAGC-ACC 23 47,617,2 12 20,315,2 0.005

2 rpoB 516 GAC-GTC luuG 315 AGC-ACC; m/iA I5C-T 2 4,212,9 i 1,711,7 0,849

3 t-poB 531TCG-TTG katG 315 AGC-ACC inhA I5C-T 2 4,2±2,9 i 1,711,7 0,849

4 katG 315AGC-ACC inhA 15C-T 1 2,112,1 2 3.412,4 0.855

5 katG 315AGC-ACC I 2.1 ±2.1 8 13,514.4 0,078

6 rpoB 511CTG-CCG. rpoBS 16GAC-GGC katG 3£5AGC-ACC 2 4,2*2,9

7 rpoB 526TCG-TTG katG 315AGC-ACC 2 4,212,9

8 rpoB 531TCG-TGG katG 315AGC-CGC inhA 15C-T I

9 rpoB 531TCG-TTG mhA iSC-T I 2,l±2.l *

10 гровшгсо-тга katG 315AGC-ACC inhA 15C-T 1 2,1 ±2.1

11 rpoB 531 TCG-TTG katG 315AGC-ACC ahpC 9G-A 1 2,l±2,l

12 rpoB 53tTCG TTG katG 315AGC-ACA 1 2. [±2,1