Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Защитные свойства рекомбинантного человеческого белка теплового шока (70 КДА) при экспериментальном сепсисе у крыс

на правах рукописи

ОСТРОВ Владимир Федорович

ЗАЩИТНЫЕ СВОЙСТВА РЕКОМБИНАНТНОГО ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО БЕЛКА ТЕПЛОВОГО ШОКА (70 КДА) ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ СЕПСИСЕ У КРЫС

14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА БИОЛОГИЧЕСКИХ НАУК

3 0 2010

Старая Купавна, 2010

004609691

Работа выполнена в лаборатории биологических испытаний Филиала Учреждения российской академии наук института биоорганической химии им. академиков М. М. Шемякина и ЮЛ. Овчинникова (ФИБХ)

Научный доктор биологических наук, профессор

руководитель - Мурашов Аркадий Николаевич,

Официальные академик РАН, доктор химических наук, профессор оппоненты: Мясоедов Николай Федорович

доктор медицинских наук, профессор Березовская Ирина Владимировна

Ведущая Факультет фундаментальной медицины

организация Московского государственного университета

им. М.В. Ломоносова

Защита состоится Ъьс5.к£^2010 г. в_часов на заседании

диссертационного совета Д 217.004.01 при ОАО "Всероссийский научный центр по безопасности биологически активных веществ" по адресу: 142450, Московская область, г. Старая Купавна, ул. Кирова, 23.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ОАО "ВНЦ БАВ".

Автореферат разослан "Ш>

Ученый секретарь диссертационного совета

Доктор биологических наук, профессор Корольченко Л.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Септический шок является главной причиной летальных исходов в палатах интенсивной терапии (Parrillo, 1993). Более того, прослеживается тенденция роста смертности пациентов от сепсиса (Friedman et al., 1998). Только в США ежегодно регистрируют сепсис примерно у 750 ООО пациентов (Martin G. et al., 2003). При этом почти каждый третий такой случай заканчивается летальным исходом (Riedemann et al., 2003).

Сепсис развивается при проникновении в системный кровоток больших количеств бактерий. Как известно, ведущим звеном патогенеза сепсиса являются структурные компоненты бактериальной клеточной стенки: молекулы тейхоевых и липотейхоевых кислот (lipoteichoic acid, LTA) - в случае грамположительных бактерий, а также липополисахариды - в случае грамотрицательных бактерий (lipopolysaccharides, LPS).

Механизм действия LPS подробно изучен в экспериментах in vitro и in vivo. Они являются эндотоксинами и при проникновении в системный кровоток связываются с TLR-4 (Toll-like receptor) на поверхности моноцитов, нейтрофилов. Происходит секреция в кровоток больших количеств воспалительных цитокинов (ФНО-альфа, ИЛ-6, ИЛ-1 и др.) (Chow J. et al., 1996). В свою очередь, LTA являются супер-антигенами и способствуют гиперактивации иммунной системы (Drainga С. et al., 2008). В отличие от LPS механизм действия LTA связан с TLR-2 рецепторами, однако, в дальнейшем патологический процесс развивается сходным образом (Foumier В., Philpott D. 2005).

Таким образом, гиперцитокинемия, прямое токсическое воздействие на клетки эндотелия сосудов, а также нарушение агрегации тромбоцитов и определяют клиническую картину сепсиса. Установлено, что септический процесс сопровождается нарушениями гемодинамики, системы гемостаза и патологическими изменениями во внутренних органах (Karima R. et al., 1999). При этом наблюдается тахикардия и системная гипотензия (вплоть до шока).

Наиболее ярким клиническим проявлением сепсиса является синдром диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови (ДВС). При этом происходит неконтролируемое внутрисосудистое тромбооразование на фоне депрессии фибринолиза (Lin H. et al., 1999; Грачев С. и др. 2003; Bhagat К. et al. 1996; Сидоркин В., Преснякова М. 2008). Необходимо отметить, что из-за нарушений микрососудистого кровотока развивается

недостаточность кровообращения и ишемия тканей, что приводит к дисфункции внутренних органов - полиорганной недостаточности (ПОН).

Высокая смертность от сепсиса пациентов в палатах интенсивной терапии свидетельствует об отсутствии в настоящее время в клинической медицине средств эффективной борьбы с этой патологией. Исследование принципиально новых подходов к профилактике и терапии септических состояний представляет огромный интерес, как для фундаментальной науки, так и для клинической медицины.

Одним из возможных путей борьбы с сепсисом являются белки теплового шока с молекулярной массой 70 кДа (heat shock proteins 70, HSP70). Ранее считалось, что HSP70 являются универсальной защитой клетки от стрессовых воздействий и выполняют шаперонную функцию внутри клетки. В настоящее время предполагают, что HSP70 при различных стрессорных воздействиях выходят из тех клеток организма, где они повышенно экспрессируется, взаимодействуют с рецепторами на мембранах других клеток, могут поглощаться клетками, и в целом участвуют в стресс-реакции и оказывают защитное действие на организм. Известно также, что HSP70, подобно эндотоксинам, могут связываются с TLR-рецепторами (Asea A. et al., 2002). Следует отметить, что при этом такие экзогенные HSP70 способны стимулировать неспецифический иммунный ответ, и выполняют роль "сигнала опасности" для окружающих клеток (Johnson J., Fleshner М. 2006).

Экспериментально доказана корреляция между уровнем экспрессии HSP70 и выживаемостью грызунов при моделировании у них эндотоксинового шока (Hotchkiss R. et al., 1993). Известно также, что тепловое прекондиционирование, предшествующее эндотоксемии, увеличивает содержание HSP70 и уменьшает дисфункцию органов и смертность животных (Villar J. et al., 1994).

Ранее нами были получены данные о защитных свойствах смеси конститутивной и индуцибельной форм HSP70, выделенных из мышцы быка (Guzhova et al., 1998), которая вводилась внутривенно животным с экспериментальным сепсисом. Такое экзогенное введение HSP70 снижает токсическое действие LPS (Kustanova G. et al., 2006). Следующим этапом исследований в данном направлении явилось получение с помощью генно-инженерных методов рекомбинантного человеческого HSP70 (Евгеньев М.Б., 2007) для изучения его защитного действия при сепсисе с перспективой дальнейшего использования в клинической медицине.

Цель исследования. Изучить защитные свойства рекомбинантного человеческого белка теплового шока 70 кДа (rhHSP70) на модели экспериментального сепсиса у крыс.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить защитные свойства rhHSP70 на модели экспериментального грамотрицательного сепсиса при различных схемах введения.

2.Изучить зависимость защитного действия от дозы вводимого вещества.

3.Изучить защитные свойства rhHSP70 на модели грамположительного сепсиса у крыс.

4.Исследовать фармакологическое действие rhHSP70 на здоровых крысах. 5.Определить острую токсичность rhHSP70.

Научная новизна работы. В исследовании показаны дозозависимые защитные эффекты rhHSP70 в дозе 266 мкг/кг при профилактическом внутривенном введении крысам с моделируемым грамотрицательным сепсисом. Обнаружено, что предварительное внутривенное введение rhHSP70 снижает токсические эффекты LTA из S. aureus при экспериментальном сепсисе у крыс. Установлено, что rhHSP70 при внутривенном введении крысам в дозе 266 мкг/кг не оказывает заметного влияния на гемодинамику, систему гемостаза и биохимические показатели крови. Проведено токсикологическое исследование. Показано отсутствие токсических эффектов rhHSP70 при однократном внутривенном введении мышам в дозе (26,6 мг/кг), в 100 раз превышающей эффективную дозу (266 мкг/кг) при сепсисе. Расчитаны терапевтический индекс и LD50, характеризующие rhHSP70 как малоопасное и умеренно токсичное вещество, соответственно.

Научно-практическое значение. На основании полученных данных можно предположить, что rhHSP70 предотвращает развитие сепсиса, вызванного как грамлоложительных, так и грамотрицательных бактерий. Также стоит отметить, что rhHSP70 является малоопасным и умеренно токсичным веществом. Таким образом, высокоочищенный рекомбинантный человеческий белок теплового шока с молекулярной массой 70 кДа может быть рекомендован для дальнейших доклинических испытаний, как перспективное средство профилактики сепсиса.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы докладывались и обсуждалсь на следующих конференциях: Молодежная

научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2009 и 2010); IV-я конференция по клинической гемостазиологии и гемореологии (Москва, 2009); Международная научная конференция Ломоносов (Москва, 2009 и 2010); «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2009); IV-й симпозиум «Белки и пептиды» (Казань, 2009); Международная научная конференция по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии (Москва-Пущино, 2009); Международная школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2008, 2009 и 2010); Международная русско-финская школа по биотехнологии (Пущино, 2009); 11-й Ежегодный Всероссийский конгресс по инфекционным болезням (Москва, 2010); VI-я Научно-практическая конференция «Биомедицина и биомоделирование» (Москва, 2010); Ш-й Всероссийский, с международным участием, конгресс «Симбиоз-Россия» (Нижний Новгород, 2010). Работа отмечена призами на конкурсах молодых ученых в рамках 2-й научно-практической конференции «Достижения клинической фармакологии в России» (Москва, 2009), VI-й международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2009), XVII-ro национального конгресса «Человек и лекарство» (Москва, 2010).

Публикации. По теме диссертации опубликовано печатных работ, из них Ч в журналах, рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 141 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, методы исследования, результаты и обсуждения, выводы. Материал иллюстрирован А таблицами и Vj_ рисунками. Список литературы включает [9 источника, в том числе работ зарубежных авторов.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследований. Эксперименты выполнены на бодрствующих самцах крыс Sprague-Dawley массой тела 300-350 г и мышах CD-I массой 25-35 г. Животные содержались в стандартных условиях (температура 21±3°С, влажность 30-70%, 12-ти часовой световой период) и получали ad libitum стандартизованный корм для грызунов

(Чара, Россия) и очищенную воду. В экспериментах были использованы животные SPF-статуса, полученные из Питомника лабораторных животных ФИБХ (Пущино). Все манипуляции с животными выполняли в соответствии с протоколами, утвержденными комиссией ФИБХ по контролю над содержанием и использованием лабораторных животных (Приказ Минздрава России №267 от 19.06.2003.).

За 24 часа до эксперимента проводили хирургические процедуры. Крысам под наркозом (хлоралгидрат, 400 мг/кг, i.p.) имплантировали полиэтиленовые катетеры в яремную вену (для введения веществ) и в сонную артерию (для регистрации параметров гемодинамики и забора образцов крови). Концы катетеров выводили в межлопаточную область (Мурашев и др., 1992).

Эндотоксиновый шок моделировали с помощью однократного внутривенного введения LPS из E.coli (Sigma) в дозе 2 мг/кг (Freudenberg N. et al., 1984). Грамположительный сепсис моделирировали с помощью однократного внутривенного введения LTA из S.aureus (Sigma) в дозе 3 мг/кг (Kengatharan К. et al., 1998).

Предметом исследования является rhHSP70, полученный генно-инженерными методами, и любезно предоставленный Михаилом Борисовичем Евгеньевым заведующим лабораторией молекулярных механизмов биологической адаптации Института молекулярной биологии им. Энгельгардта. Очищенный от бактериальных примесей rhHSP70 вводили крысам однократно внутривенно в различных дозах. Все растворы для введений готовили на основе стерильного 0,9% раствора NaCl. Объем введения веществ составлял 1 мл/кг.

Мониторинг параметров гемодинамики осуществляли прямым методом, с помощью катетерной технологии. Во время эксперимента артериальный катетер соединяли с электроманометром и регистрировали параметры гемодинамики непрерывно в течение 15 минут в исходном состоянии и 5 часов после инициирования сепсиса. Регистрацию сигналов производили с помощью электроманометра. Обработку сигнала проводили с помощью системы "Beat" (Medvedev et al., 1990). Регистировали среднее артериальное давление (ср.АД) и частоту сердечных сокращений (ЧСС).

Забор крови для определения параметров гемостаза осуществляли в трех временных точках: до введения веществ (baseline), через 20 минут и через 5 часов после инициирования сепсиса. Анализ параметров гемостаза проводили с помощью коагулометра "Trombostat" и стандартных наборов реактивов. Определяли активированное частичное тромбопластиновое

время (АЧТВ) и протромбиновое время (ПВ) свертывания крови, содержание фибриногена в плазме и время лизиса фибринового сгустка. В тех же временных точках с помощью фотометрического автоматического анализатора "Ellipse" (AMS, Италия) регистрировали следующие биохимические параметры крови: общий белок, альбумин, глюкозу, креатинин, триацилглицериды (ТАГ), билирубин. Выживаемость животных в эксперименте наблюдали в течение 72 часов после инициирования сепсиса.

При проведении токсикологических испытаний rhHSP70 вводили однократно внутривенно мышам CD-I в дозе 26,6 мг/кг. Проводили ежедневный клинический осмотр животных в течение 14 дней. Осмотр проводили в клетке, в руках и на открытой площадке. Отмечали следующие признаки, характеризующие состояние животных: поведение, активность, темперамент, походка, позы, тонус мышц, внешний вид (состояние покровов, слизистых, конечностей, зубов), вес, конституция, наличие видимых повреждений на теле, функциональные показатели (дыхание, рефлексы).

Животных выводили из эксперимента с помощью С02-камеры. Проводили некропсию с макроскопическим осмотром внутренних органов, полостей, мест введения и забором крови для биохимического анализа.

Статистический анализ проводили с помощью программы «STATISTICA 7.0». Выборки данных подвергали анализу на нормальность распределения. Для статистической оценки данных по гемодинамике использовали критерий Краскела-Уоллиса с последующим тестом Манна-Уитни. При обработке данных по гемостазу и биохимии крови для межгрупповых различий использовали тест Манна-Уитни, а для внутригрупповых различий использовали тест Уилкоксона. При сравнении выживаемости применяли тест хи-квадрат. Различия считали статистически значимыми при Р<0,05.

Результаты исследования и их обсуждение.

1. Изучение защитных свойств rhHSP70 при экспериментальном грамотрицательном сепсисе у крыс.

В клинической практике мероприятия контроля шоковых состояний ограничиваются учетом гемодинамических и метаболических изменений (Тарасенко C.B. и др., 2005). В случае сепсиса наиболее выраженным нарушением гемодинамики является шок.

Как показывают данные рис.1А, внутривенное введение LPS из E.coli

вызывает двухфазное снижение ср. АД с максимумами гипотензии на 10-й и 70-й минутах. К 5-му часу эксперимента у животных этой группы ср.АД было снижено относительно исходного уровня.

250 300

время, мин

250 300

время, мин

Рис.1. Динамика изменений ср. АД (А) и ЧСС (Б) при введении: 1- 0,9% NaCl, 2- LPS, 3- rhHSP70 на фоне LPS, 4- LPS на фоне rhHSP70. Примечание: # - Р<0,05 по тесту Краскела-Уоллиса с последующим тестом Манна-Уитни относительно группы LPS.

Введение rhHSP70 через 10 минут после LPS приводит к достоверным отличиям в изменении ср. АД только в последние 15 минут. Предварительное введение rhHSP70 стабилизирует ср.АД. При этом гипотеизия выражена не столь значительно и достоверно отличается от группы с LPS в фазу гипотензии с 45-й по 95-ю минуту (рис.1 А).

Одной из причин септического шока является LPS-индуцированная системная вазодилатация, вызванная сосудорасширяющим эффектом оксида азота (NO) и других медиаторов воспаления, которые

секретируется в кровоток в больших количествах (Kuhl S, et al., 1998). Также происходит падение периферического сопротивления за счет системного раскрытия артериовенозных шунтов (Саенко C.B. и др., 2005).

На рис.1Б показана динамика изменений ЧСС. В первые минуты после введения LPS наблюдается тахикардия, которая является следствием развивающейся сердечной недостаточности и прогрессирует к 5-му часу. Последующее введение rhHSP70 на фоне LPS не приводит к заметному снижению тахикардии, тогда как предварительное введение rhHSP70 снижает ЧСС на двух участках в начале и в конце эксперимента: 10-20 и 240-300 минуты (рисЛБ).

Крайним проявлением активации системы гемостаза при сепсисе является развитие ДВС-синдрома. Обнаружение ДВС знаменует вступление пациента в декомпенсированную фазу шока. Кардинально нарушенная гемодинамика и гемореологические расстройства приводят к резкому дефициту кислорода в тканях, субстратов тканевого дыхания и питательных веществ. Прогрессирует тканевая гипоксия, нарушаются основные метаболические процессы, изменяется кислотно-основное равновесие, нарастает ацидоз. Септический шок с исходом в ДВС-синдром — наиболее частая причина летальных исходов при сепсисе (Козлов В.К., 2006).

В число обязательных скрининговых тестов входит измерение активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ), протромбиновогое времени (ПВ), тромбиновое время и/или фибриноген (Долгов В.В., Свирин П.В., 2005).

На рис.2 отражены результаты мониторинга системы гемостаза. В группе с LPS на 20-й минуте наблюдается стремительно развивающаяся фаза гиперкоагуляции (рис.2А, Б) (процесс активного тромбообразования в микрососудистом русле), которая переходит к 5-му часу в фазу глубокой гипокоагуляции (истощение механизмов свертывания) на фоне угнетения фибринолитической системы (рис.2Г).

Показатель ПВ, которым измеряется активность определенных факторов свертывания, вырабатываемых печенью, иногда используется как индикатор синтетической функции печени наравне с альбумином и билирубином (Цыганенко АЛ. и др., 2002).

Снижение уровня фибриногена свидетельствует об активном процессе тромбообразования (рис.2В). Согласно литературным данным снижение концентрации фибриногена и угнетение фибринолиза отмечается при сепсисе, гипокоагуляционной стадии ДВС (Долгов В.В., Свирин П.В., 2005).

Предварительное введение rhHSP70 стабилизирует параметры гемостаза, которые к 5-му часу достоверно отличаются от аналогичных значений в группе с LPS. Если rhHSP70 вводили после LPS, то статистически значимых отличий от группы с LPS не наблюдалось (рис.2).

□1 н2 ез

4020

□1 02 ИЗ

т^нГ

Л #

10-1

Ц1

Рис.2. Изменения параметров гемостаза (А- АЧТВ, Б- ПВ, В-концентрация фибриногена, Г- время фибринолиза) при введении: 1- LPS, 2- rhHSP70 на фоне LPS, 3- LPS на фоне rhHSP70. Примечание: # - Р<0,05 по тесту Манна-Уитки относительно группы LPS.

Подобные расстройства периферического кровообращения и микроциркуляции носят при сепсисе системный характер, не компенсируются и приводят к полиорганной недостаточности (ПОН), а также к нарушениям основных путей обмена веществ (Козлов В .К.. 2006).

Данные таблицы 1 отражают изменения биохимических показателей крови относительно исходного уровня (до введения веществ). Такие изменения характерны для ишемии тканей и ПОН.

Глюкоза является "топливом" для клеточного метаболизма и является основным показателем углеводного обмена. При сепсисе наблюдается гипогликемия. Происходит дефицит потребления мозгом глюкозы и развитие недостаточности ЦНС вплоть до летального исхода.

Одной из важных функций почек и печени является метаболическая (глюконеогенез) и нарушение баланса глюкозы может косвенно свидетельствовать о поражении этих органов (Цыганенко АЛ. и др., 2002).

Таблица 1. Изменение в процентах биохимических показателей крови при введении: LPS, rhHSP70 на фоне LPS, LPS на фоне rhHSP70. Примечание: # - Р<0,05 по тесту Манна-Уитни относительно группы LPS; * - Р<0,05 по тесту Уилкоксона относительно исходных значений до введения веществ.

Показатель LPS LPS+rhHSP70 rhHSP70+LPS

20 мин 5ч 20 мин 5ч 20 мин 5ч

Глюкоза 1±4 -26±5* 9±6 -14±6 3±2 -6±2U

Общий белок -3±4 -20±3* 2±3 -7±5 -1±3 -6±3#

Альбумин -8±4 -9±3* 1±4 -3±5 2±3# 3±4

ТАГ 36-U1* 62±40 И±7 75±28* 14±4*# 14±6*#

Креатинин 117±60 471±69* -1±11 134±54*# 9±8# 66±20*#

Билирубин 26±16* 145±31* 28±8 60±15*# 3±6# 31±12*#

Наиболее простым и надежным биохимическим тестом гломерулярной функции почек является определение креатинина в плазме крови (Маршал В.Дж., 1999). Значительное увеличение креатинина в крови может наблюдаться при эндотоксин-индуцировашюй сердечно-сосудистой недостаточности, которая может привести к почечной недостаточности (Цыганенко А.Я. и др., 2002).

В группе с LPS наблюдается увеличение ТАГ. Это объясняется неадекватной перфузией тканей в условиях сепсиса. Развивающаяся тканевая гипоксия начинает тормозить процессы липолиза, а выброс цитокинов способствует снижению утилизации жирных кислот и ТАГ тканями организма за счет подавления активности соответствующих ферментов (Козлов В.К., 2006).

Введение rhHSP70 на фоне LPS достоверно стабилизирует только показатели креатинина и билирубина. В то время как предварительное введение rhHSP70 за 10 минут до LPS уменьшает токсические эффекты. Достоверные отличия от группы с LPS наблюдаются почти по всем показателям (таблица 1).

Экспериментально доказано, что выживаемость животных в

эксперименте при введении им LPS составила к третьим суткам всего 17% (рис.3). Предварительное введение rhHSP70 достоверно увеличивает этот показатель до 70%. Если животные получали rhHSP70 после LPS, то выживаемость составила 50% и статистически не отличается от группы с LPS, но отличается от группы с физиологическим раствором..

#

-о

-1

-2 -3 -4

1

О 1 2 время, дни з

Рис.3. Выживаемость животных в экспериментальных группах: I- 0,9% NaCl (п=10), 2- LPS (п=18), 3- rhHSP70 на фоне LPS (п=10), 4- LPS на фоне rhHSP70 (п=16). Примечание: # - Р<0,05 по тесту хи-квадрат относительно группы LPS; * - Р<0,05 по тесту хи-квадрат относительно группы 0,9% NaCl.

Таким образом, введение rhHSP70 в дозе 266 мкг/кг перед LPS уменьшает токсические влияния эндотоксина на гемодинамику, показатели гемостаза и биохимии крови животных, а также увеличивает их выживаемость. С другой стороны, введение rhHSP70 в дозе 266 мкг/кг после LPS не столь эффективно, однако, наблюдается тенденция к увеличению выживаемости животных и стабилизации изучаемых параметров. Возможно, это объясняется пусковым механизмом сепсиса и подтверждает высказывание В.Г. Бочоришвили о необратимости процесса генерализации инфекции и невозможности самоизлечения.

2. Изучение зависимости защитного действия от дозы вводимого rhHSP70 при экспериментальном грамотрицательном сепсисе у крыс, а также фармакологической активности rhHSP70 на здоровых крысах.

В данном эксперименте животным одной группы за 10 минут до LPS вводили rhHSP70 в дозе 133 мкг/кг, а животные другой группы получали только rhHSP70 в дозе 266 мкг/кг. При измерении ср.АД в группе rhHSP70+LPS были выявлены некоторые статистически значимые отличия

от группы с LPS, однако, на наиболее важном участке минимума гипотензии (70-я минута) группы между собой не отличались (рис. 4А). Тахикардия в группе rhHSP70+LPS заметно менее выражена, чем в группе с LPS (рис.4Б).

-10 -I-,-,-,-,-,-,-

0 50 100 150 200 250 300

время, мин

Рис.4. Динамика изменений ср.АД (А) и ЧСС (Б) при введении: 1- 0,9% NaCl, 2- LPS, 3- LPS на фоне rhHSP70,4- rhHSP70. Примечание: # - Р<0,05 по тесту Краскела-Уоллиса с последующим тестом Манна-Уитни относительно группы LPS.

В то же время, введение rhHSP70 здоровым животным без сепсиса не вызывает изменений ср.АД или ЧСС, и статистически значимо не отличается от группы с 0,9% раствором NaCl (рис.4А,Б).

Анализируя данные на рис.5, можно предположить, что при введении rhHSP70 в дозе 133 мкг/кг за 10 минут до LPS у животных этой группы

наблюдаются изменения параметров гемостаза, характерные для ДВС. Значения этой группы не отличаются от группы с LPS (рис.5).

Особое внимание следует обратить на то, что однократное введение здоровым крысам rhHSP70 в дозе 266 мкг/кг не оказывает влияния на систему гемостаза и не отличается от исходных значений (рис. 5).

% д 01 02 гЪ Ш вз 60 ■ ад-го - % Б о1 02 Q3 -Тт,

L^1..... -20

-30

-50

20 мин

Ff

Рис.5. Изменения параметров гемостаза (А- АЧТВ, Б- ПВ, В-концентрация фибриногена, Г- время фибринолиза) при введении: 1- LPS, 2- rhHSP70 в дозе 133 мкг/кг перед LPS, 3- rhHSP70 в дозе 266 мкг/кг.

Предварительное введение rhHSP70 за 10 минут до LPS не привело к достоверному увеличению выживаемости животных в группе, и она составила 30% (рис.6). В свою очередь, при введении здоровым крысам rhHSP70 не отмечено случаев гибели животных.

Таким образом, установлено, что защитное действие rhHSP70 зависит от вводимой дозы. Снижение дозы эффективной при экспериментальном сепсисе в два раза, заметно ослабляет защитное действие rhHSP70. С другой стороны введение здоровым крысам rhHSP70 в дозе 266 мкг/кг не вызывает изменений изучаемых физиологических параметров.

100 а-80 -60 -40 20

%

время, дни 3

Рис.6. Выживаемость животных в экспериментальных группах: 1- LPS, 2-rhHSP70 в дозе 133 мкг/кг перед LPS (п=10), 3- rhHSP70 (п=6). Примечание:*-Р<0,05 по тесту хи-квадрат относительно группы 0,9%NaCl.

3. Изучение защитных свойств rhHSP70 при экспериментальном грамположительном сепсисе у крыс.

Как известно, при грамположительном сепсисе молекулы LTA играют такую же роль, как и молекулы LPS при грамотрицательном. Однако, сепсис, вызванный грамположительными микроорганизмами, азвивается не столь стремительно (Саенко В.Ф. и др., 2005).

Развитие гемодинамических нарушений у крыс после введения LTA из S.aureus в дозе 3 мг/кг наблюдается втечение 5 часов (рис.7). Сепсис сопровождается гипотензией с минимумом ср.АД через один час после инъекции и частичным восстановлением значений в течение следующего часа (рис.7А). Предварительное введение rhHSP70 в дозе 266 мкг/кг до LTA предотвращает падение ср.АД. Достоверные отличия от контрольной группы с сепсисом наблюдаются на отрезках 35-90 и 275-285 минуты.

При развитии грамположительного сепсиса также наблюдается прогрессирующая тахикардия, которая является следствием снижения сердечного выброса. В группе с LTA увеличение ЧСС продолжается в течение всего эксперимента и является наибольшим в точке 245 минут (рис.7Б). Предварительное введенние rhHSP70 в дозе 266 мкг/кг за 10 минут до LTA оказывает слабое влияние на нарушение данного параметра гемодинамики (рис.7Б).

время, мин

-10 -I-.-.-,--.-1->-

О 50 100 150 200 250 300

время, мин

Рис.7. Динамика изменений ср.АД (А) и ЧСС (Б) при введении: 1- 0,9% NaCl, 2- LTA, 3- LTA на фоне rhHSP70. Примечание: # - Р<0,05 по тесту Краскела-Уоллиса с последующим тестом Манна-Уитни относительно группы LTA.

Как показывают данные рис.8, при внутривенном введении крысам LTA в дозе 3 мг/кг наблюдается нарушение сбалансированной работы внутреннего и внешнего путей системы гемокоагуляции. Эти пути характеризуются показателями АЧТВ и ПВ соответственно, которые и в точке 20 минут, и в точке 5 часов заметно снижены (рис.8А,Б). Предварительное введение rhHSP70 в дозе 266 мкг/кг полностью предотвращает депрессию гемокоагуляции по внешнему пути, а к 5-му часу и по внутреннему.

Фибриноген является одним из белков острой фазы и может быть использован как маркер воспалительного процесса. Количество фибриногена в точке 20 минут остается на уровне исходных значений (рис.

8В). Этот баланс объясняется интенсивным синтезом фибриногена в печени в процессе развития сепсиса на фоне расходования этого белка для тромбообразования. Однако, к 5-му часу уровень фибриногена в группе с ЬТА достоверно снижается относительно исходного уровня. В то же время в группе с гШ8Р70 содержание фибриногена находится на уровне первоначальных значений (рис.8В).

201%

-20

•40

.7

#

□1 02

1<И % о

-10 -20 ■3040 •

20 10 О -10 -20 • -30 -

80

60

20

20 мин

5ч

20 мин

Рис.8. Изменения параметров гемостаза (А- АЧТВ, Б- ПВ, В-концентрация фибриногена, Г- время фибринолиза) при введении: 1- ЬТА, 2- ЬТА на фоне гЬН8Р70. Примечание: # - Р<0,05 по тесту Манна-Уитни относительно группы ЬТА.

Нарушение функционирования фибринолитической системы при грамположительном сепсисе напоминает ЬР8-индуцированную депрессию фибринолиза. На рис.8Г видно как к 5-му часу после введения ЬТА увеличивается время, затрачиваемое ни лизис фибриновых сгустков. В группе, животные которой получали гШ8Р70, подобные нарушений отмечены в значительно меньшей степени.

Таблица 3. Изменение в процентах биохимических показателей крови при введении: 1Л'Л, ЬТА на фоне гЬН8Р70. Примечание: # - Р<0,05 по тесту Манна-Уитни относительно группы ЬТА; * - Р<0,05 по тесту Уилкоксона относительно исходных значений до введения веществ.

Показатель ЬТА гШ8Р70+ЬТА

20 мин 5ч 20 мин 5ч

Глюкоза -4±8 -6±6 6±6 -3±4

Общий белок -9±9 -10±4 -2±3 -6±2*

Альбумин -П±8 -14±4* -2±3 -5±2#

ТАГ 67±44 244±74* 26±18 71±22*#

Креатинин 13±24 36±25 44±33 45±24

Билирубин -8±15 37±21 -13±9 24±31

Анализируя данные таблицы 3, необходимо отметить, что биохимические параметры по сравнению с грамотрацительным сепсисом меняются довольно слабо. Это согласуется с утверждением о менее значительном проявлении ПОН при ЬТА-индуцированном сепсисе (Эе Ктре й а!., 1995). В группе с ЬТА наблюдаются отклонения от исходных значений только по уровню альбумина и ТАГ. В группе, где животным предварительно вводили гЬШР70, незначительно снижен уровень общего белка, а также ТАГ (таблица 3).

100 о—

во -во

*

-о -о

г

время, дни з

Рис.9. Уровень выживаемости животных в экспериментальных группах: 1- 0,9% ЫаС1,2- ЬТА (п=10), 3- ЬТА на фоне гЬН8Р70 (п=10). Примечание: # - Р<0,05 по тесту хи-квадрат относительно группы ЬТА.

При однократном внутривенном введении крысам LTA смертность животных составила 50%. В экспериментальной группе, где животным предварительно вводили rhHSP70, выживаемость составила 90% (рис.9). По тесту хи-квадрат группа с LTA достоверно отличается как от контрольной группы с 0,9% NaCl, так и от группы с rhHSP70.

Таким образом, предварительное внутривенное введение rhI4SP70 в дозе 266 мкг/кг за 10 минут до LTA, оказывает выраженное защитное действие, предотвращает развитие артериальной гипотензии, нарушений системы гемостаза, характерных для ДВС-синдрома, а также значительно увеличивает выживаемость животных.

4. Определение острой токсичности rhHSP70.

Для проведения предварительного исследования токсичности rhHSP70 была выбрана доза 26,6 мг/кг, превышающая в 100 раз дозу эффективную при экспериментальном сепсисе. Вводили rhHSP70 однократно в хвостовую вену мышам CD-I.

Проводили ежедневный клинический осмотр животных в течение 2 недель по набору стандартных признаков, характеризующих следующие показатели состояния животных: поведение, активность, темперамент, походка, позы, тонус мышц, внешний вид (состояние покровов, слизистых, конечностей, зубов), масса тела, конституция, наличие видимых повреждений на теле, функциональные показатели (дыхание, рефлексы).

Не зафиксировано отклонений по показателям поведения, внешнего вида животных, а также в реакциях на внешние раздражители. Случаев смерти животных отмечено не было.

Таблица 4. Биохимические параметры крови мышей при однократном внутривенном введении: гЬН5Р70 в дозе 26,6 мг/кг и 0,9% ЫаС1._

Показатель Глюкоза, Общий ТАГ, Альбумин, Креатинин, Билирубин,

ммоль/л белок, г/дл ммоль/л г/дл мкмоль/л мкмоль/л

0,9% NaCI 6,8±0,3 5,4±0,2 1,3±0,1 37±1 51±2 4,2±0,5

rhHSP70 5,8±0,4 5,5±0,4 1,3±0,1 34±2 51±2 4,3±0,6

Некропсию животных проводили через 14 дней после введения гШ8Р70. Макроскопический осмотр органов, полостей тела и места

введения не выявил патологических изменений. Биохимический анализ крови не показал статистически значимых отклонений от группы животных, получавших физиологический раствор (п=10) (таблица 4).

Согласно руководству для доклинических исследований определение показателя Ш50 для препаратов, полученных с помощью биотехнологии, как правило, невозможно в связи с их низкой токсичностью при однократном введении животным. В таких случаях следует указывать максимальную дозу, которая была введена животным (Хабриев Р.У., 2005). В данном случае величиной 1Л)50 можно считать дозу более 26,6 мг/кг. При оценке безопасности ЛС применяют показатель терапевтический индекс (ТИ), определяемый как отношение средней смертельной дозы (Ш50) к средней эффективной (ЕО50) (Гуськова Т.А., 2003).

юо

у ■ О.ЗСОЗх - ю

200

доза, мкг/кг

Рис.10. Зависимость выживаемости животных в эксперименте от дозы вводимого гЬН8Р70.

Для расчета ЕО50 использовали графический метод (рис.10). При этом учитывали, что при введении гЬНБР70 в дозе 266 мкг/кг животным с сепсисом выживаемость составила 70%, а при введении в дозе 133 мкг/кг-30%. Таким образом, средняя эффективная доза составила 200 мкг/кг. Полученные значения ЬВ50 и ЕВ<0 позволяют рассчитать значение тарепевтического индекса для гЬШР70:

ТИ= ЬО50 / ЕБ50= 26,6 / 0,2= 133

Значение ТИ позволяет определить принадлежность rhHSP70 к тому или иному классу опасных веществ. Необходимо отметить, что классификация степени опасности токсического действия лекарственных средств определяет вещества с ТИ>45 как малоопасные (Березовская И.В., 1985). В то же время, по классификации токсичности химических веществ rhHSP70 характеризуются как умеренно токсичное вещество (Березовская И.В.,2003).

Таким образом, экспериментально показано отсутствие токсического действия при однократном внутривенном введении мышам rhHSP70 в дозе 26,6 мг/кг. Экспериментальным и расчетным способами для rhHSP70 определены важные фармакологические показатели (LDS0, ED50, ТИ), с помощью которых ориентировочно охарактеризована безопасность данного вещества.

ВЫВОДЫ

1. Превентивное внутривенное введение rhHSP70 в дозе 266 мкг/кг при экспериментальном сепсисе у крыс оказывает выраженное защитное действие и уменьшает токсическое эффекты LPS из E.coli или LTA из S. aureus.

2. При введении rhHSP70 после LPS защитные свойства выражены значительно слабее.

3. Наблюдается зависимость защитного эффекта от дозы вводимого rhHSP70. Снижение в два раза дозы, эффективной на модели экспериментального сепсисе (266 мкг/кг), приводит к заметному ослаблению защитного действия rhHSP70.

4. Введение rhHSP70 в дозе 266 мкг/кг здоровым крысам без сепсиса не влияет на изучаемые физиологические параметры гемодинамики, системы коагуляции и биохимические показатели крови животных.

5. По величине ТИ rhHSP70 является малоопасным, умеренно токсичным по LD5o и не проявляет токсического действия при однократном внутривенном введении мышам в дозе 26,6 мг/кг, которая в 100 раз превышает дозу, эффективную при экспериментальном сепсисе.

6. На основании экспериментальных данных rhHSP70 может быть рекомендован для доклинических исследований в качестве профилактического антисептического средства.

СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Остров В.Ф., Кустанова ГА., Мурашев А.Н. Изучение влияния экзогенного рекомбинантного человеческого HSP70 на развитие эндотоксического шока у крыс. "Биология - наука XXI века". Пущино, 1014 ноября 2008 г. Сборник тезисов, стр. 145.

2. Остров В.Ф., Слащева Г.А., Евгеньев М.Б., Мурашев А.Н. Рекомбинантный HSP70 человека как средство защиты от грамотрицательных инфекций. «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». Москва, 9-11 февраля 2009 г. Тезисы докладов, стр. 24.

3. Остров В.Ф., Слащева Г.А., Евгеньев М.Б., Мурашев А.Н. Протекторное действие рекомбинантного человеческого HSP70 на систему гемостаза при моделировании сепсиса у крыс. "Клиническая гемостазиология и гемореология". Москва, 4-6 февраля 2009 г. Материалы конференции, стр.368.

4. Остров В.Ф. Защитные свойства рекомбинантного человеческого HSP70 на модели эндотоксического шока у крыс. "Ломоносов-2009". Москва, 13-18 апреля 2009 г. Тезисы докладов, стр. 272.

5. Остров В.Ф., Слащева Г.А., Евгеньев М.Б., Мурашев А.Н. Блокирование токсических эффектов ЛПС из E.coli экзогенным HSP70 на модели эндотоксинового шока у крыс. "Рецепция и внутриклеточная сигнализация". Пущино, 2-4 июня 2009 г. Сборник статей, стр. 483

6. Остров В.Ф., Слащева Г .А., Евгеньев М.Б., Мурашев А.Н. Изучение механизма действия HSP70 in vivo при моделировании сепсиса у крыс. «Белки и пептиды». Казань, 23-27 июня 2009 г. Тезисы докладов, стр. 63

7. Ostrov V.F., Murashev A.N., Evgen'ev M.B. Human recombinant HSP70 prevents toxic effects of lipopolysaccharides. Международная научная конференция, посвященная 75-летию со дня рождения академика Ю.А. Овчинникова. Москва-Пущино, 28 сентября-1 октября 2009 г. Сборник тезисов, стр. 311

8. Остров В.Ф., Евгеньев М.Б., Мурашев А.Н. Профилактическое и терапевтическое действие рекомбинантного человеческого HSP70 при моделировании на крысах острого сепсиса. "Биология - наука XXI века". Пущино, 28 сентября - 1 октября 2009 г. Сборник тезисов, стр. 113

9. Ostrov V.F., Murashev A.N. Human recombinant HSP70 protects from gram-negative sepsis. Международная русско-финская школа по биотехнологии. Пущино, 15-17 июня 2009 г. Сборник тезисов, стр. 139

10. Остров В.Ф., Евгецьев М.Б., Мурашев А.Н. Исследование защитного действия экзогенного HSP70 при моделировании сепсиса у крыс. «Молекулярная медицина и биобезопасность». Москва, 10-11 ноября

2009 г. Сборник материалов конференции, стр. 171

11. Остров В.Ф., Евгеньев М.Б., Мурашев А.Н. Исследование защитного действия экзогенного БТШ70 при моделировании сепсиса у крыс. «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», Москва, 8-11 февраля 2010 г. Тезисы докладов и стендовых сообщений, стр. 111

12. Остров В.Ф. Протекторные свойства hrHSP70 при моделировании грамположительного сепсиса. "Ломоносов-2010", Москва, 12-15 апреля

2010 г. Тезисы докладов, стр. 1-2

14. Остров В.Ф. Изучение эффективности препарата hrHSP70 при моделировании сепсиса у крыс. «Симбиоз Россия 2010», Нижний Новгород, 24-28 мая, 2010 г. Сборник тезисов, стр. 182

15. Рожкова Е.А., Юринская М.М., Зацепина О.Г., Гарбуз Д.Г., Мурашев А.Н., Остров В.Ф., Маргулис БА., Винокуров М.Г., Евгеньев М.Б. Экзогенный внеклеточный БТШ70 млекопитающих ослабляет проявления сепсиса на уровне клетки и организма. "Биология - наука XXI века". Пущино, 19-23 апреля 2010 г. Сборник тезисов, стр. 170

16. Остров В.Ф., Слащёва Г.А., Жармухамедова Т.Ю., Е.А. Рожкова, Евгеньев М.Б., Мурашев А.Н. Влияние человеческого рекомбинантного и бычьего белков теплового шока (70 кДа) на гемодинамику и гемостаз при эндотоксиновом шоке у крыс. Доклады Академии Наук, 2009, том 429, №5, стр. 691-693

17. Остров В.Ф., Евгеньев М.Б., Мурашев А.Н. Изучение защитного действия рекомбинантного HSP70 человека при внутривенном введении крысам с эндотоксиновым шоком. Клиническая фармакология и терапия,

2009, №6, стр. 283

18. Остров В.Ф., Слащёва Г.А., Жармухамедова Т.Ю., Гарбуз Д.Г., Евгеньев М.Б., Мурашев А.Н. Влияние рекомбинантного человеческого белка теплового шогка HSP70 на биохимические параметры крови при моделировании эндотоксинового шока у крыс. Биоорганическая химия,

2010, том 36, №3, стр. 337-342

19. Rozhkova Е., Yurinskaya М., Zatsepina О., Garbuz D., Karpov V., Surkov S., Murashev A., Ostrov V., Margulis В., Evgen'cv M., Vinokurov M. Exogenous mammalian extracellular HSP70 reduces endotoxin manifestations at the cellular and organism levels. Ann N Y Acad Sei. 2010 Jun; 1197:94-107.

Подписано в печать:

10.09.2010

Заказ № 4102 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Актуальность исследования

Сепсис и септический шок остаются самой частой причиной смерти у больных в отделениях реанимации, несмотря на использование мощных антибиотиков и химиотерапевтических препаратов, а также современных технологий интенсивной терапии (Parrillo, 1993). Более того, прослеживается тенденция роста смертности пациентов от сепсиса (Friedman et al., 1998). По данным Национального Института Здоровья США ежегодно регистрируют сепсис примерно у 750 ООО пациентов (Martin G., 2003), и почти каждый третий такой случай заканчивается летальным исходом (Riedemann et al., 2003).

Это свидетельствует об отсутствии в настоящее время в клинической медицине средств эффективной терапии и профилактики септических состояний. Сказывается разброс мнений относительно клинического прочтения, первопричины сепсиса, основных звеньев патогенеза, а также отсутствие четко определенной терминологии. Это затрудняет сравнительную оценку статистических данных, создает трудности в диагностике и не способствует выработке единой тактики лечения (Козлов В.К., 2006).

Как известно, сепсис имеет инфекционную природу и этиология его разнообразна. Это патологическое состояние развивается при проникновении в системный кровоток больших количеств бактерий. Наиболее трудно поддается терапии сепсис, вызванный эндотоксинами грамотрицательных бактерий. Однако, известно, что примерно в 50% случаев причиной сепсиса являются грамположительные бактерии, из которых наиболее часто в микрофлоре пациентов доминирует Staphylococcus aureus (Solomkin, 2001). По данным литературы в 1990-1996 годах S. aureus был наиболее частым возбудителем внутрибольничных инфекций. Являясь характерным возбудителем нозокомиальной пневмонии и внутрибольничных катетер-ассоциированных инфекций, S. aureus нередко вызывает и внебольничные инфекции (Козлов В.К., 2006).

Ведущим звеном патогенеза являются структурные компоненты бактериальной клеточной стенки: молекулы тейхоевых и липотейхоевых кислот (lipoteichoic acid, LTA) - в случае грамположительных бактерий, а также липополисахариды (lipopolisaccharides, LPS) - в случае грамотрицательных бактерий. Механизм действия LPS подробно изучен в экспериментах in vitro и in vivo. Они являются эндотоксинами и при проникновении в системный кровоток связываются с рецепторным комплексом CD 14, TLR-4, MD-2 на поверхности моноцитов, нейтрофилов и некоторых других клеток. Происходит запуск внутриклеточного каскада реакций и секреция воспалительных цитокинов (TNF-альфа, IL-6, IL-1) в системный кровоток. В свою очередь LTA является супер-антигеном и способен стимулировать иммунный ответ организма. В отличие от LPS механизм действия LTA связан с TLR-2 рецепторами, однако, в дальнейшем патологический процесс развивается сходным образом (Fournier В., Philpott D., 2005). Таким образом, секреция чрезмерного количества цитокинов в кровоток, прямое токсическое воздействие на клетки эндотелия сосудов, а также нарушение агрегации тромбоцитов и определяют клиническую картину сепсиса.

Установлено, что септический процесс сопровождается нарушениями гемодинамики, гемостаза и патологическими изменениями во внутренних органах (Karima et al., 1999). При этом наблюдается тахикардия и системная гипотензия (вплоть до шока), вызванная секрецией в кровь мощного вазодилататора оксида азота (NO). Также известно, что нарушения свертываемости крови характеризуются фазой гиперкоагуляции с последующей фазой глубокой гипокоагуляции. При этом происходит неконтролируемое внутрисосудистое тромбооразование на фоне депрессии фибринолиза. Такой характерный симптомокомплекс получил название синдром диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови (ДВС-синдром) (Lin et al., 1999; Грачев и др. 2003; Bhagat et al. 1996; Сидоркин, Преснякова 2008).

Необходимо отметить, что из-за нарушений микрососудистого кровотока развивается ишемия тканей и внутренних органов - полиорганная недостаточность (ПОН). В связи с этим, важным диагностическим показателем является мониторинг биохимических параметров крови, которые отражают функционирование отдельных органов и систем организма, а также обмена веществ.

Одним из возможных путей борьбы с септическими патологиями могут стать белки теплового шока (heat shock proteins, HSP) с молекулярной массой 70 кДа (HSP70). Это предположение основано на уникальных свойствах HSP70, которые были исследованы в последние годы.

В экспериментах in vitro показано, что эти белки способны связываться с TLR-рецепторами (Asea A. et al., 2002; Zuo N. et al.,2008). Если ранее считалось, что HSP70, являясь универсальной защитой клетки от стрессовых воздействий, выполняют свои функции внутри клетки, то в настоящее время известно, что HSP70 при различных стрессорных воздействиях выходит из клеток, где он повышенно экспрессируется. При этом HSP70 взаимодействует с рецепторами на мембранах других клеток, может поглощаться клетками, в целом участвуя в стресс-реакции и оказывая защитное действие на клетки организма. Следует отметить, что при выходе из клетки такие экзогенные HSP70 способны стимулировать неспецифический иммунный ответ и выступать в роли "сигнала опасности" для окружающих клеток (Johnson, Fleshner, 2006).

Экспериментально доказана корреляция между уровнем экспрессии HSP70 и выживаемостью грызунов при моделировании у них эндотоксинового шока (Hotchkiss R. et al., 1993). Тепловое прекондиционирование, предшествующее эндотоксемии увеличивает содержание HSP70 и уменьшает дисфункцию органов и смертность животных (Villar J. et al., 1994). Известно также, что введение крысам HSP70, полученного из мышцы быка, вызывает снижение токсического действия LPS (Kustanova G. et al., 2006).

Цель исследования

Цель данного исследования - изучить протекторные свойства препарата рекомбинантного человеческого белка теплового шока 70 кДа (recombinant human Heat Shock Protein, rhHSP70) на модели экспериментального сепсиса у лабораторных грызунов и оценить его безопасность.

Задачи исследования

1. Изучить защитные свойства rhHSP70 на модели экспериментального грамотрицательного сепсиса при различных схемах введения.

2. Выявить зависимость защитного действия от дозы вводимого rhHSP70.

3. Изучить защитные свойства rhHSP70 на модели грамположительного сепсиса у крыс.

4. Исследовать фармакологическое действие rhHSP70 на здоровых крысах.

5. Определить острую токсичность rhHSP70.

Научная новизна работы

В исследовании показаны дозозависимые защитные эффекты rhHSP70 в дозе 266 мкг/кг при профилактическом внутривенном введении крысам с моделируемым грамотрицательным сепсисом. Обнаружено, что предварительное внутривенное введение rhHSP70 снижает токсические эффекты LTA из S. aureus при экспериментальном сепсисе у крыс. Установлено, что rhHSP70 при внутривенном введении крысам в дозе 266 мкг/кг не оказывает заметного влияния на гемодинамику, систему гемостаза и биохимические показатели крови. Проведено предварительное токсикологическое исследование. Показано отсутствие токсических эффектов rhHSP70 при однократном внутривенном введении мышам в дозе (26,6 мг/кг), в 100 раз превышающей эффективную дозу (266 мкг/кг) при сепсисе. Рассчитаны следующие токсикологические параметры: терапевтический индекс (ТИ), характеризующий rhHSP70 как малоопасное вещество; средняя смертельная доза LD50, характеризующая rhHSP70 как умереннотоксичное вещество.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Превентивное внутривенное введение rhHSP70 в дозе 266 мкг/кг при экспериментальном грамотрицательном сепсисе у крыс оказывает выраженное защитное действие и уменьшает или полностью блокирует токсические эффекты LPS из E.coli.

2. Наблюдается зависимость защитного эффекта от дозы вводимого rhHSP70. Снижение в два раза дозы, эффективной на модели экспериментального грамотрицательного сепсиса (266 мкг/кг) приводит к заметному ослаблению защитного действия rhHSP70.

3. Введение rhHSP70 в дозе 266 мкг/кг здоровым крысам без сепсиса не влияет на изучаемые физиологические параметры гемодинамики, системы коагуляции и биохимические показатели крови животных.

4. Превентивное внутривенное введение rhHSP70 в дозе 266 мкг/кг при экспериментальном грамположительном сепсисе у крыс уменьшает токсический действие LTA из S. aureus на организм животных.

5. Проведено предварительное токсикологическое исследование rhHSP70. При однократном внутривенном введении мышам rhHSP70 в дозе 26,6 мг/кг, которая в 100 раз превышает дозу, эффективную при экспериментальном сепсисе не проявляет токсического действия. По величине терапевтического индекса (ТИ) rhHSP70 является малоопасным, а по значению LD50 -умереннотоксичным веществом.

Научно-практическое значиние

Полученные результаты указывают на эффективность rhHSP70 как профилатического средства при сепсисе, вызванного как грамположительными, так и грамотрицательными микроорганизмами. Полученные в данной работе результаты могут быть использованы при разработке нового фармакологического средства для профилактики септических патологий, что свидетельствует о перспективности дальнейшего изучения свойств rhHSP70 и механизма его действия.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа изложена настраницах машинописного

выводы

1. Превентивное внутривенное введение rhHSP70 в дозе 266 мкг/кг при экспериментальном сепсисе у крыс оказывает выраженное защитное действие и уменьшает токсическое эффекты LPS из E.coli или LTA из S.aureus.

2. При введении rhHSP70 после LPS защитные свойства выражены значительно слабее.

3. Наблюдается зависимость защитного эффекта от дозы вводимого rhHSP70. Снижение в два раза дозы, эффективной на модели экспериментального сепсисе (266 мкг/кг) приводит к заметному ослаблению защитного действия rhHSP70.

4. Введение rhHSP70 в дозе 266 мкг/кг здоровым крысам без сепсиса не влияет на изучаемые физиологические параметры гемодинамики, системы коагуляции и биохимические показатели крови животных.

5. По величине ТИ rhHSP70 является малоопасным, умереннотоксичным по LD50 и не проявляет токсического действия при однократном внутривенном введении мышам в дозе 26,6 мг/кг, которая в 100 раз превышает дозу, эффективную при экспериментальном сепсисе.

6. На основании экспериментальных данных rhHSP70 может быть рекомендован для доклинических исследований в качестве профилактического антисептического средства.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, сепсис является актуальной проблемой для клинической медицины. Сложность терапии этого патологического процесса объясняется механизмом заболевания, который будучи запущен быстро развивается и приводит к разнообразным нарушениям функционирования органов и систем организма. Чрезмерный синтез и серкреция в кровь медиаторов воспаления приводит к состоянию цитокиновой бури. Нарушается баланс гомеостаза и развиваются коагулопатии (синдром ДВС), системная гипотензия (септический шок), нарушения микроциркуляции и ишемия тканей внутренних органов (ПОН). Высокая смертность пациентов, а также неуклонный рост числа случаев сепсиса в клинической практике и определяют необходимость поиска новых эффективных подходов в терапии и профилактике этого заболевания.

Стоит заметить, что предыдущие многочисленные попытки разработать препараты на основе анти-LPS и анти-TLR антител не привели к ожидаемым результатам (Fink М., 1993; Calandra Т. et al., 1991).

Одним из перспективных направлений борьбы с сепсисом являются белки теплового шока с молекулярной массой 70 кДа. В ряде научных работ in vitro показаны защитные свойства этих молекул при различных патологических состояниях. Известно, что начальный этап фармакологического исследования новых природных и синтетических соединений подчинен задачам возможно быстрого выяснения общих черт биологической активности изучаемого вещества при минимуме затрат и риска негативной оценки веществ, имеющих ценные фармакологические свойства (Сернов Л.Н., Гацура В.В., 2000).

В рамках данной работы планировалось подтвердить защитные свойства rhHSP70 на моделях грамположительного и грамотрицательного сеспсиса у крыс. Изучить зависимость этих эффектов - от дозы вводимого rhHSP70. Провести на здоровых животных предварительное исследование токсикологических и фармакологических свойств rhFISP70.

В настоящее время имеется целый ряд работ, указывающих на центральную роль молекул LPS и LTA при моделировании сепсиса. Это связано с их способностью стимулировать различные компоненты воспалительного ответа. В частности, они активируют систему комплемента, нейтрофилы и мононуклеарные фагоциты. Циркулирующие в крови молекулы LPS и LTA могут активировать полиморфноядерные лейкоциты и макрофаги, которые продуцируют различные воспалительные медиаторы и цитокины, адгезивные к клеточной поверхности молекулы, токсические кислородные радикалы, продукты метаболизма арахидоновой кислоты и оксид азота. Кроме того, LPS и LTA способны воздействовать на системы коагуляции и фибринолиза (Саенко В.Ф., 2005).

Для септического шока характерны уменьшение системного сопротивления и артериальная гипотензия при увеличении сердечного выброса. Одним из ключевых моментов явялется угнетение сократительной способности миокарда, несмотря на начальное увеличение сердечного индекса. На ранней стадии развивается тахикардия и вазодилатация вен и артерий, приводящая к снижению ОПСС. Высокий сердечный выброс объясняется тахикардией, а не увеличением сократительной активности миокарда. Более того, систолическая и диастолическая функции желудочков часто угнетены, несмотря на высокий сердечный выброс. При дальнейшем развитии шокового процесса функциональные способности сердца продолжают ухудшаться, и происходит снижение сердечного выброса. Литературные данные свидетельствуют, что при доминирующей грамотрицательной микрофлоре септический шок наблюдается приблизительно в 40% случаев сепсиса, при грамположительной - в 5% случаев (Саенко С.В. и др., 2005). Полученные в работе экспериментальные данные подтверждают, что при моделировании грамположительного и грамотрицательного сепсиса у лабораторных крыс наблюдается разная выживаемость животных в эксперименте. Во втором случае она значительно выше, чем в первом. Это хорошо согласуются с приведенными выше статистическими данными.

Также получены результаты, позволяющие сделать вывод о том, что высокоочищенный rhHSP70, полученный в культуре эукариотических клеток, при однократном внутривенном введении в дозе 266 мкг/кг проявляет защитные свойства при экспериментальном сепсисе у крыс. При этом подобные свойства отмечены как при грамположительном, так и при грамотрицательном сепсисе.

Интересным фактом является сочетание ярко выраженных защитных эффектов HSP70 на молекулярном уровне, которые продемонстрированы ранее в ряде работ, и неспособностью rhHSP70 вмешиваться в физиологические процессы на уровне организма. В данном исследовании продемонстрировано отсутствие заметного собственного фармакологического действия rhHSP70 на организм животных. В подтверждение этому получены данные свидетельствующие, что однократное внутривенное введение rhHSP70 здоровым крысам не оказывает влияния на параметры гемодинамики, гемостаза и биохимии крови.

В работе показано отсутствие токсических эффектов rhHSP70 при однократном внутривенном введении мышам в дозе (26,6 мг/кг), в 100 раз превышающей эффективную дозу (266 мкг/кг) при сепсисе. Также экспериментальным и расчетным способами определены токсикологические показатели (LD50, ED50, ТИ), с помощью которых ориентировочно охарактеризована безопасность данного вещества.

Значение ТИ позволяет определить принадлежность rhHSP70 к тому или иному классу опасных веществ. Необходимо отметить, что классификация степени опасности токсического действия лекарственных средств определяет вещества с ТИ > 45 как малоопасные (Березовская И.В., 1985). В то же время, по классификации токсичности химических веществ rhHSP70 характеризуются как умеренно токсичное вещество (Березовская И.В., 2003).

Механизм действия rhHSP70 плохо изучен и требует дальнейшего детального исследования. Однако, стоит отметить шаперонную функцию внутриклеточных HSP70. Она осуществляется благодаря способности этих

119 белков узнавать гидрофобные участки поли пептида. Это могут быть открытые участки вновь синтезированных белков или неправильно свернутые полипептиды, у которых в норме гидрофобные остатки находятся внутри молекулы. Молекула HSP70 связывается своим пептид-связывающим доменом с гидрофобным участком и с затратой энергии АТФ осуществляет шаперонный цикл. Таким образом, подобное уникальное свойство позволяет HSP70 способствовать правильному фолдингу белков.

Стоит обратить внимание на тот факт, что в структуре амфифильных молекул LPS и LTA также присутствуют гидрофильные и липофильные части. Поэтому взаимодействие rhHSP70 с молекулами LPS и LTA потенциально возможно и этот факт необходимо учитывать при исследовании механизма действия белков теплового шока при септических состояниях.

С другой стороны, в настоящее время имеется целый ряд работ, показыващих способность rhHSP70 взаимодействовать с То11-подобными рецепторами. Как было описано выше, данные рецепторы вовлечены в процесс развития воспаления в организме. Они способны связывать как молекул LPS, так и молекул LTA. В последние годы в ряде работ экспериментально доказано, что экзогенные HSP70 также могут связываться с рецепторами TLR (Calderwood S. et al., 2007). Таким образом, с полным основанием можно предположить, что возможно конкурирование между молекулами rhHSP70 с одной стороны, и молекулами LPS или LTA с другой стороны за связывание с рецепторами, играющими ключевую роль в развитии воспаления.

Таким образом, учитывая защитные свойства rhHSP70 при экспериментальном сепсисе, использование этих стресс-белков в профилактике сепсиса представляется, как новый эффективный подход в борьбе с подобными патологическими состояниями. Вместе с тем отсутствие собственной фармакологической активности и крайне низкая токсичность rhHSP70 позволяет предположить также и отсутсвие в будущем значительных побочных эффектов. Это является огромным преимуществом перед химическими агентами, вызывающими множество побочных эффектов на различные системы организма.

В целом, данная экспериментальная работа по изучению rhHSP70 in vivo является шагом в изучении нового перспективного подхода по борьбе с септическими патологиями. По результатам исследования высокоочищенный рекомбинантный человеческий белок теплового шока с молекулярной массой 70 кДа может быть рекомендован для дальнейших доклинических испытаний, как перспективное средство профилактики сепсиса.