Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:NO-зависимый механизм активации синтеза стресс-белков и его роль в адаптации к гипоксии

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ОБЩЕЙ ПАТОЛОГИИ И ПАТОФИЗИОЛОГИИ ВЛАДИМИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ПЕДАГОГИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

ЗЕНИНА ТАТЬЯНА АЛЕКСЕЕВНА

ЫО-ЗАВИСИМЫЙ МЕХАНИЗМ АКТИВАЦИИ СИНТЕЗА СТРЕСС-БЕЛКОВ И ЕГО РОЛЬ В АДАПТАЦИИ К ГИПОКСИИ.

доктор медицинских наук И. Ю. Малышев доктор медицинских наук, профессор Н.П. Ларионов

На правах рукописи

14.00.16. - патологическая физиология 03.00.04. - биохимия

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители:

Москва -1998

\

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

вн4 - тетрагидробиоптерин НЭР - белки теплового шока

СаМ - кальмодулин

сАМР - циклический аденозинмонофосфат

свМР - циклический гуанозинмонофосфат

ЕОРР - эндотелий-зависимый фактор расслабления

РАО - флавинадениндинуклеотид

РМ1Ч - флавинмононуклеотид

НБЕ - регуляторный элемент промотора ДНК

НБТР - фактор транскрипции НБР-гена

1_-ЫЫА - Мт-нитро-1_-аргинин

N0 - оксид азота (II)

ыов - ЫО-синтаза

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ДНКЖ - динитрозильный комплекс железа

ДЭТК - диэтилдитиокарбамат

м-РНК - матричная рибонуклеиновая кислота

ОГЛАВЛЕНИЕ.

Стр.

ВВЕДЕНИЕ....................................................................6

ГЛАВА 1. БИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ Н8Р70 И N0 И МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ ИХ СИНТЕЗА (обзор литературы)................................................................................12

1.1. Биологическая роль стресс-белков и механизмы их активации... 12

1.1.1. Биологическая роль стресс-белков.......................................12

1.1.2. Механизмы транскрипции и стресс-индуцированной активации синтеза НБР70...........................................................................15

1.1.3. Механизмы нейрогуморального контроля НЭР70....................20

1.2. N0 - важный регулятор физиологических функций организма....25

1.2.1. Структура монооксидов азота..............................................26

1.2.2. Характеристика изоформ ЫО-синтазы...................................27

1.2.3. Ферментативный механизм действия 1М0-синтазы..................29

1.2.4. Регуляция активности ЫО-синтазы.......................................30

1.2.5. Мишени действия N0.........................................................32

ГЛАВА 2. ОСНОВНЫЕ МЕХАНИЗМЫ АДАПТАЦИИ К

ГИПОКСИИ (обзор литературы)..........................................36

ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.......46

3.1. Эксперименты на животных...................................................46

3.1.1. Методика теплового шока...................................................47

3.1.2. Методика измерения продукции оксида азота в органах и тканях............................................................................................47

3.1.3. Введение донора N0 (динитрозильного комплекса железа -ДНКЖ) животным.......................................................................48

3.1.4. Введение ингибитора ЫО-синтазы (1Т-нитро-1_-аргинин - 1_-ЫЫА) животным..................................................................................49

3.1.5. Методика приготовления и введения «ловушки» N0 - Ыа-ДЭТК (СбНюИЗгИа) при оценке ее влияния на устойчивость организма к острой гипоксии........................................................................49

3.1.6. Методика перфузии изолированного сердца..........................49

3.2. Методика экспериментов на культуре клеток............................50

3.2.1. Методика теплового шока на культуре клеток.........................50

3.2.2. Методика проведения ауторадиографии с помощью метода «меченых» аминокислот..............................................................51

3.2.3. Методика введения донора N0 (динитрозильного комплекса железа -ДНКЖ) в культуру клеток.....................................................51

3.2.4. Методика измерения продукции N0 в культуре клеток............52

3.3. Электрофорез и иммуноблотинг.............................................52

3.4. Методика адаптации к гипоксии...............................................53

3.5. Методика создания острой гипоксии........................................54

3.6. Статистическая обработка результатов....................................55

ГЛАВА 4. АКТИВАЦИЯ СИНТЕЗА БЕЛКОВ ТЕПЛОВОГО ШОКА В ОРГАНИЗМЕ СВЯЗАНА С УВЕЛИЧЕНИЕМ ПРОДУКЦИИ N0 (результаты и обсуждение)...................................................56

4.1. Влияние теплового шока на продукцию N0 в органах животных. 56

4.2. Влияние ингибитора ЫО-синтазы (ЬЫЫА) на индуцированный синтез НЭР70..................................................................................58

4.3. Влияние донора N0 (ДНКЖ) на накопление НБР70 в органах крыс..........................................................................................59

4.4. Обсуждение.........................................................................61

ГЛАВА 5. МО-ЗАВИСИМАЯ АКТИВАЦИЯ СИНТЕЗА БЕЛКОВ ТЕПЛОВОГО ШОКА РЕАЛИЗУЕТСЯ НА КЛЕТОЧНОМ

УРОВНЕ(результаты и обсуждение)............................................64

5.1. Влияние теплового шока на продукцию N0 в культуре гепатоцитов (Н35).........................................................................................64

5.2. Влияние донора N0 (ДНКЖ) на накопление белков из семейства НБР в культуре клеток........................................................65

5.3. Обсуждение.............................................................................67

ГЛАВА 6. МО-ЗАВИСИМЫЕ МЕХАНИЗМЫ ИГРАЮТ ВАЖНУЮ РОЛЬ В АДАПТАЦИИ ОРГАНИЗМА К ПЕРИОДИЧЕСКОЙ ГИПОКСИИ (результаты и обсуждение)......... .........................69

6.1. Обоснование выбора модели адаптации.....................................70

6.2. Изменение продукции N0 при острой гипоксии и адаптации к гипоксии...............................................................................................72

6.3. Влияние донора N0 и блокатора ЫО-синтазы на развитие защитных эффектов адаптации к гипоксии......................................................74

6.4. Роль Н8Р70 в антигипоксическом эффекте адаптации к гипоксии...............................................................................................77

6.5. Влияние донора N0, «ловушки» N0 и блокатора ЫО-синтазы на устойчивость организма к острой гипоксии...........................................78

6.6. Обсуждение..................................................................................80

ВЫВОДЫ......................................................................................85

ЛИТЕРАТУРА.............................................................................87

ВВЕДЕНИЕ.

Известно, что гипоксия является основным патогенетическим звеном большинства легочных, сердечно-сосудистых и неврологических заболеваний. Острая гипоксия может возникнуть также и у здоровых людей, например, у летчиков и космонавтов при разгерметизации корабля, у альпинистов на высоте более 7000 м, у рабочих в результате действия оксидов углерода или шахтного метанного газа и т.д. Во всех этих ситуациях именно кислородная недостаточность может стать непосредственной причиной гибели организма.

Для повышения устойчивости организма к недостатку кислорода широко применяется адаптация к периодической кратковременной гипоксии (20). Однако, механизмы антигипоксического эффекта такой адаптации до конца не изучены. Это ограничивает возможности для повышения эффективности адаптационной защиты от острой гипоксии.

Адаптация к гипоксии обеспечивается изменением физиологической регуляции практически всех основных систем организма и активацией внутриклеточных защитных механизмов. Поэтому очевидно, что важную роль в адаптации к гипоксии играют наиболее универсальные регуляторы физиологических функций и защитных систем организма.

По современным представлениям, одним из таких регуляторов является оксид азота (II) (N0) (80, 126). N0 является универсальным физиологическим мессенджером и вовлечен в функционирование иммунной, сердечно-сосудистой, нервной, пищеварительной систем и т.д. Показано, что при острой гипоксии и адаптации к периодической гипоксии в органах и тканях происходит изменение экспрессии генов, кодирующих ЫО-синтазу (117, 151) и сосудистых ЫО-зависимых реакций (14, 146). Однако, сведения о направленности таких изменений достаточно противоречивы. В пользу роли N0 в защитных эффектах адаптации к гипок-

сии косвенно свидетельствуют данные о том, что такая адаптация может, как замедлить развитие гипертензии (19, 35), так и предупредить острую гипотензию при инфаркте миокарда (15), которые связаны с нарушениями продукции N0 (5, 79). Вместе с тем вопрос о том, какие конкретные МО-зависимые механизмы лежат в основе защитного действия адаптации к гипоксии, до сих пор остается нерешенным.

Предполагается, что важную роль в защите клеток от повреждающих эффектов дефицита кислорода играют стресс-белки из семейства белков теплового шока Н8Р70. Действительно, показано, что исходно высокая продукция НвР70 у трансгенных животных (112) повышает устойчивость органов к гипоксическим повреждениям. Защитное действие Н8Р70 обусловлено связыванием избытка жирных кислот (86), повышением мощности антиоксидантных систем (145), дисагрегацией аномальных белок-белковых комплексов (173), связыванием кальмоду-лина (119) и соответственно ограничением повреждающих эффектов внутриклеточного избытка кальция.

В настоящее время не вызывает сомнения, что Н8Р70 представляют собой важную внутриклеточную систему защиты организма от различных повреждающих воздействий. Наиболее общепринятым способом активации синтеза Н8Р70 является тепловой шок (64). Доказано, что стресс-белки участвуют в повышении устойчивости организма к высоким температурам (106, 162), защите миокарда от ишемических и реперфу-зионных повреждений (62, 71), а также в развитии защитных эффектов адаптации к стрессу (27) и физическим нагрузкам (112).

Однако, несмотря на исключительно важное значение этих стресс-белков в защите организма, механизмы активации их синтеза до сих пор остаются до конца неизученными. Анализ литературы и большое количество экспериментальных данных о сочетанном изменении синтеза Н8Р70 и N0 (63, 112) позволяет выдвинуть гипотезу о том, что N0 мо-

жет быть вовлечен в активацию синтеза этих белков. Соответственно, можно предположить, что МО-зависимая активация Н8Р70 играет важную роль в антигипоксическом эффекте адаптации.

Актуальность данной работы определяется тем, что она расширяет существующие представления о регуляторных свойствах оксида азота и посвящена изучению его роли в регуляции внутриклеточных систем защиты и возможностей повышения устойчивости организма к острой гипоксии с помощью воздействия на системы генерации N0.

Цель настоящей работы состояла в проверке гипотезы о существовании МО-зависимого механизма активации синтеза Н8Р70 и роли этого механизма в формировании защитного эффекта адаптации к периодической гипоксии.

В рамках этой общей цели решались следующие конкретные задачи:

1) изучение продукции N0 при тепловом шоке и сопоставление изменений продукции N0 с накоплением Н8Р70 в условиях целого организма;

2) исследование действия блокатора МО-синтазы (!_-ММА - Мш-нитро-1_-аргинин) на индуцированное тепловым шоком накопление Н8Р70;

3) изучение влияния донора оксида азота (ДНКЖ - динитрозильного комплекса железа) на синтез Н8Р70 в условиях культуры клеток, изолированного сердца и целого организма;

4) изучение продукции N0 при тепловом шоке и сопоставление изменений продукции N0 с накоплением Н8Р70 в условиях культуры клеток;

5) определение изменения продукции оксида азота в органах при острой гипоксии и в динамике формирования адаптации к гипоксии;

6) оценка влияния блокатора МО-синтазы, "ловушки" N0 (ДЭТК - ди-этилдитиокарбамат) и донора оксида азота на устойчивость организма к острой гипоксии и формирование адаптации к периодической гипоксии;

7) определение изменения содержания НБР70 в органах в процессе формирования адаптации к гипоксии и оценка влияния Ь-ЫЫА на адаптационное накопление Н8Р70.

Работа выполнена в лаборатории генетических механизмов адаптации НИИ общей патологии и патофизиологии РАМН. Эксперименты на культуре клеток проведены на кафедре молекулярно-клеточной биологии Утрехтского университета (Утрехт, Голландия). Эксперименты по оценке продукции N0 с помощью ЭПР метода проводились совместно с лабораторией физхимии биополимеров РАН.

Научная новизна исследования определяется следующими его основными результатами:

Установлено, что тепловой шок приводит к транзиторному увеличению синтеза N0 в культуре клеткок и органах животных. При этом увеличение синтеза N0 предшествует активации синтеза Н8Р70.

Впервые установлено, что блокатор синтеза N0 ограничивает ин-дуцирванное тепловым шоком накопление Н8Р70

Впервые обнаружено, что донор N0 в отсутствии теплового шока, активирует синтез Н8Р70 в культуре клеток и изолированном сердце.

Показано, что острая гипоксия приводит к выраженной гиперпродукции N0 в головном мозгу.

Выяснилось, что однократное введение блокатора синтеза N0 или «ловушки» N0 увеличивают, а донора N0, напротив, снижает устойчивость организма к острой гипоксии.

Установленно, что адаптация к гипоксии приводит к снижению продукции N0 в разных органах и предупреждает гиперпродукцию N0 при острой гипоксии.

Продемонстрировано, что адаптация к гипоксии сопровождается накоплением Н8Р70 в головном мозгу и печени. Блокатор синтеза N0

предупреждал как накопление HSP70, так и развитие защитного антиги-поксического эффекта адаптации к гипоксии.

Теоретическое значение работы состоит в том, что показана важная роль оксида азота в активации синтеза стресс-белков и значение этого механизма в антигипоксическом эффекте адаптации к гипоксии. Таким образом, впервые продемонстрирована взаимосвязь между оксидом азота - ключевым физиологическим регулятором и одной из важных эндогенных систем организма - белками теплового шока.

Практическое значение работы определяется тем, что полученные результаты показывают возможность эффективного повышения устойчивости организма к острой гипоксии и управления процессом адаптации с помощью направленного воздействия на системы генерации N0. В перспективе это позволит разработать новые методы профилактики заболеваний, связанных с кислородной недостаточностью.

Положения выносимые на защиту :

1.Оксид азота активирует синтез белков теплового шока и таким образом регулирует активность одной из важных внутриклеточных систем защиты.

2.Повреждающее действие острой гипоксии связано с гиперпродукцией NO в мозге, и соответственно ограничение продукции NO с помощью однократного введения ингибитора NO-синтазы или «ловушки» N0 повышает устойчивость организма к недостатку кислорода.

3.NO-зависимая активация синтеза HSP70 играет важную роль в адаптационном повышении устойчивости организма к острой гипоксии.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены: на 2-ой международной конференции "Гипоксия в медицине" (Москва, 1996 год), на международной конференции " Molecular mechanisms and pathophysiological consequences of damage in membranes and lipoproteins" (Австрия, 1996 год), на 2-ой международной конференции "Bio-

chemistry and molecular biology of nitric oxide" (США, 1996 год), на 5-ом всемирном конгрессе "International society for adaptive medicine" (США, 1997 год), на 3-ем международном симпозиуме "Free radicals in biology and medicine" (Болгария, 1997 год), на конференции молодых ученых 1996 года (ВГПУ, Владимир, 1997 год), на 8-ом международном симпозиуме "Эколого-физиологические проблемы адаптации" (Москва, 1998 год), на 3-ем международном конгрессе по патофизиологии ( Лахти, Финляндия, 1998 год) и на межлабораторной конференции в Институте общей патологии и патофизиологии РАМН (Москва, 1998).

ГЛАВА 1. БИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ HSP70 И N0 И МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ ИХ СИНТЕЗА.

1.1. Биологическая роль стресс-белков и механизмы их активации.

1.1.1. Биологическая роль стресс-белков.

Все известные организмы от простейших прокариотов, дрожжей, растений до высших эукариотов разнообразными способами реагируют на стрессорные воздействия окружающей среды. Вместе с тем характерной общей чертой клеточного ответа является быстрый синтез так называемых белков теплового шока (обозначаются аббревиатурой HSP от англ. heat shock protein) и снижение продукции большинства других клеточных пептидов (57, 64, 106, 169). Своим названием белки теплового шока обязаны тому случайному обстоятельству, что впервые они были обнаружены в клетках, подвергнутых острому тепловому воздейсвию (48, 147). В сущности, термин «белки теплового шока» неточен, так как еще в 1984 году Elwood и Craig (76) показали, что синтез этих белков стимулируется Холодовыми воздействиями. Поэтому этот класс пептидов в равной мере можно было бы назвать «белками холодового шока». Далее было показано, что синтез белков теплового шока увеличивается при разных стрессорных воздействиях: при обработке клеток арсенатом натрия или аналогом пролина (169), острой ишемии миокарда (122, 124), остром гипоксическом воздейсвии (67), аноксии (149). Показано также, что эти белки накапливаются в клетках сосудов, пораженных атеросклерозом (50), культуре нервных клеток, зараженных вирусом герпеса (98) и т.д. Поэтому более компромиссным обозначением для этих белков является название «стресс-белки». Хотя сейчас очевидно, что и этот термин не отражает всей сути клеточной роли данных пептидов, так как в целом ряде исследований было показано, что белки из этого класса с молекулярным весом около 70 кДа (HSP70) играют важную роль в фор-

мировании таких адаптивных реакций, как термотолерантность (57, 106, 107, 108, 162, 169), ранняя стадия компенсаторной гипертрофии миокарда (62, 71, 125, 140). Соответственно их можно было бы назвать «белками адаптации». Однако название «белки теплового шока» уже получило широкое распространение и, поэтому в дальнейшем будет использоваться именно этот термин.

В эволюционном отношении HSP являются высоко консервативными белками. Это свидетельствует о том, что они выполняют фундаментальны�