Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Феномен адаптационной стабилизации структур и роль в нем белков теплового шока

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ОБЩЕЙ ПАТОЛОГИИ И ПАТОФИЗИОЛОГИИ

На правах рукописи

МАЛЫШЕВ Игорь Юрьевич

ФЕНОМЕН АДАПТАЦИОННОЙ СТАБИЛИЗАЦИИ СТРУКТУР И РОЛЬ В НЕМ БЕЛКОВ ТЕПЛОВОГО ШОКА

14.00.16 - патологическая физиология

автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Москва - 1992

- г -

Работа выполнена в лаборатории патофизиологии сердца Научно-исследовательского института общей патологии и патофизиологии Российской АМН.

Научный консультант - доктор медицинских наук, профессор, лауреат Государственной премии СССР, заслуженный деятель науки РСФСР Ф.З.Меерсон

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор А.Л.Верткин доктор биологических наук, профессор В.А.Сакс доктор биологических наук, профессор Р.Н.Глебов

Ведущее учреждение:

Российский университет дружбы народов

Защита диссертации состоится "/г " 5'<-^:<'1992 г. • "/£_" часов на заседании Специализированного совета Д 001.03.01 при Научно-исследовательском институте общей патологии и патофизиологии Российской•АМН (125315 Москва, Балтийская ул., д.8) С диссертацией можно ознакомиться в би_0,лиотеке института.

Автореферат разослан

Ученый секретарь Специализированного совета,

кандидат медицинских наук Л.Н.Скуратовская

- 3 -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность данной работы

В 1989 - 90 годах был открыт феномен адаптационной стабилизации структур (ФАСС) (Меерсон Ф.З., iggo; KeersonF.Z., Malyshev I. Yu ., amotrinsky A.V., 1991; Meerson F.Z., Sazontova T.G., Arkhipenko u.V., 1990), который состоит в том, что при адаптации организма к :трессорным воздействиям резко возрастает устойчивость не только целого организма, но также изолированных органов, и прежде всего :ердца, к широкому спектру повреждающих факторов от токсических юнцентраций катехоламинов до реперфузионного парадокса. >дновременно увеличивается резистентность к аутолизу таких датоплазматических структур как саркоплазматический ретикулум и штохондрш. Таким образом ФАСС можно определить как звено щаптации, обеспечивающее повышение устойчивости клеточных структур, йсазалось, что ФАСС лишен антиишемического эффекта, но обладает ¡ильным антинекротическим, т.е. цитопротекторным эффектом после геревязки коронарной артерии (н eerson F.Z., 1991)- ОчеВИДНО, ЧТО ЖСС является одним из факторов адаптационной защиты организма.

Исследования последних лет показали, что адаптация животных к говторным кратковременным стрессовым ситуациям влечет за собой жтивацию ГАМК-ергической, опиоидергической, антиоксидантной и 1ругих стресс-лимитирумцих систем и одновременно повышает эезистентность организма к многообразным повреждающим факторам среды (Меерсон Ф.З. И др., 1987; Меерсон Ф.3.,1984; Wallance J., Cohen М., L984; Kuroshima А. et al., 1984; Андреев Б.В. И Др., 1982). 1оказано, что в условиях организма такая адаптация может эграничивать или полностью предупреждать нарушения сократительной функции, электрической стабильности, аритмии сердца при стрессорном говреждении (Меерсон Ф.З..1ЯВ4), острой ишемии, инфаркте миокарда и. гастинфаркгном кардиосклерозе (Меерсон Ф.З. и др., 1986). Ранее нами 5ыло показано, что эти эффекты формируются не только за счет *ейро-эндокринной регуляции, глубокие изменения которой развиваются з процессе адаптации, но также реализуются за счет локальных механизмов, действующих на уровне самого сердца (Малышев И.Ю., 1990;

leerson F.Z., Malyshev I.Yu., Zanotrinsky A.V., 1991). В СВЯЗИ С этими данными возникло представление об адаптационной стабилизации

структур сердца (ФАСС). Однако, многие вопросы развития ФАСС и его молекулярного механизма оставались открытыми.

Так до последнего времени было неизвестно защищает ли ФАСС сердце от такого важного в кардиологии повреждающего фактора, как реперфузия после тотальной ишемии; повышает ли ФАСС устойчивость сердца к тепловому повреждению и к токсическим концентрациям антибиотиков, блокирующих процессы транскрипции или протеинкиназу С.

Установлено, что ФАСС значительно увеличивает устойчивость таких цитоплазматических структур как саркоплазматический ретикулум И митохондрии (Meerson F.Z., Sazontova T.G., Arkhipenko Yu.V., 1990), но неизвестно было распространяется ли ФАСС на ядра клеток, где локализован их генетический аппарат.

Далее при изучении клеточных механизмов защиты оставалась неизученной роль белков теплового шока (heat shock proteins), и Е частности белков из семейства hsp70. Между тем известно, что эти белки обладают защитными свойствами и играют важную роль е постстрессорном востановлении структуры и функции клеток («eich W.J., Suhan J.P., 1986; Pelham Н.R.В., 1986; Carper S.W. et.al., 1987; Tomasovic s.p., 1989). Следовательно, возможная роль адаптивного изменения содержания этих белков в механизме стабилизации структур, защите сердца и других органов заслуживает самого серьезного внимания.

Первоначально ФАСС был обнаружен на уровне сердца и егс клеточных структур. Соответственно возник вопрос, является ли ФАСС локальным явлением, или он также формируется на уровне других органов кроме сердца.

Известно, что кардиопротекторный эффект, подобный тому, который дает адаптация к иммобилизационным стрессам, можно воспроизвести е условиях организма с помощью адаптации к гипоксии (Меерсон Ф.З., 1986; Меерсон Ф.З., Устинова Е.Е., Орлова Э.Х., 1988; Ostadal в. et al., 1989). Установлено, что адаптация к гипоксии также приводит в активации некоторых центральных и локальных стресс-лимитирующш систем (Меерсон Ф.З., 1986). Однако, вопрос о том формируется лк ФАСС при адаптации к гипоксии и какова роль в этом случае белкоЕ теплового шока до сих пор не решен.

Данное исследование посвящено изучению этих неясных вопросоЕ адаптационной защиты сердца и молекулярных механизмов ФАСС.

Цель настоящей работы состояла в том, чтобы проанализировать влияние адаптации к стрессу на устойчивость изолированного сердца и выделенных из миокарда ядер к различит повреждающим воздействиям; провести детальное сопоставление изменения содержания, изоформного состава и субклеточного распределения белков теплового шока при адаптации с устойчивостью изолированного сердца и ядерной ДНК; исследовать развитие ФАСС в печени; и наконец изучить особенности развития ФАСС при адаптации к гипоксии и роли hsp70 в этих процессах.

В рамках этой общей цели решались следующие конкретные задачи:

1.Как влияет адаптация к повторным кратковременным шмобилизационным воздействиям на устойчивость изолированного сердца к реперфузионному парадоксу, к тепловому повреждению и к кардиотоксическим эффектам антибиотиков.

2.Как влияет адаптация к иммобилизационным стрессам на устойчивость ядерной ДНК сердечных клеток к повреждающему действию эднонитевой экзогенной ДНК, которая как известно активирует зуклеопротеолиз И деградацию ядерной ДНК (Surovy С.S., Berger N.A., L983) .

3.Как влияет адаптация к стрессорным воздействиям на содержание, субклеточное распределение и изоформный состав hsp70 в зердце.

4.Какова динамика развития и снижения повышенной устойчивости изолированного сердца к реперфузионному и гипертермическому говреждениям в процессе адаптации и после нее.

5.Какова динамика содержания hsp70 в миокарде в процессе адаптации и после ее прекращения и совпадает ли она с динамикой &АСС.

6.Как влияет адаптация к стрессорным воздействиям на устойчивость ядерных структур клеток печени к повреждающему действию автолиза.

7.Как влияет адаптация к стрессорным воздействиям на содержание, субклеточное распределение и изоформный состав hsp70 в гечени.

8.Как влияет адаптация к гипоксическш воздействиям на остойчивость изолированного сердца к реперфузионному и тепловому

повреждению и устойчивость ядерной ДНК сердечных клеток к повреждающему действию одноыитевой экзогенной ДНК.

9.Как влияет адаптация к гипоксическим воздействиям на содержание, субклеточное распределение и изоформный состав ьзр70 в сердце.

Работа выполнена в лаборатории патофизиологии сердца Института общей патологии и патофизиологии Российской АМН, в лаборатории молекулярной и радиационной биофизики С.-Петербургского института ядерной физики РАН, в Московском и Томском институтах медицинской генетики Российской АМН.

Научная новизна исследования определяется следующими его основными результатами:

Показано, что адаптация организма к периодическим иммобилизационным стрессам обладает прямым кардиопротекторным действием: при реперфузии предварительная адаптация в 6 раз снижает контрактуру, в 2 раза уменьшает длительность аритмий и существенно ограничивает выход ферментов в перфузат изолированного сердца; при гипертермическом воздействии адаптация в 3 раза уменьшает контрактуру и практически полностью ограничивает выход ферментов в перфузат; при действии токсических доз антибиотиков адаптация предупреждает развитие контрактуры, вызванной ингибитором транскрипции - рифампицином, но неэффективна по отношению к токсическим эффектам ингибитора протеинкиназы С - полимиксина В.

Показано, что защитные эффекты адаптации к стрессу ■ формируются не только на уровне органа, но и на уровне клеточных структур и в частности ядерной ДНК. Предварительная адаптация -животных к иммобилизационным стрессам в 5-6 раз уменьшает деградацию ДНК при действии экзогенной однонитевой ДНК на суспензию изолированных ядер сердечных клеток.

Впервые показано, что адаптация организма к периодическим иммобилизационным стрессам сопровождается накоплением в клетках сердца белков теплового шока из семейства Ьзр70- Причем степень накопления, изоформный состав и субклеточное распределение в значительной мере предопределяет развитие ФАСС и защитных эффектов. Так при адаптации к иммобилизационным стрессам в цитоплазме накапливаются 5 изоформ Ь5р70, а в нуклеоплазме 2 изоформы, и соответственно 'формируются мощные кардиопротекторные эффекты:

ъежчивается • устойчивость -. изолированного сердца как к )еперфузионндму, так и к тепловому повреждению. Кроме того ювышается устойчивость ядерной ДНК к нуклеопротеолизу.

Впервые показано, что динамика прямого и обратного развития ¡ащитных эффектов ФАСС и содержания Ьэр70 в миокарде в процессе адаптации к стрессу и после нее коррелируют между • собой. При этом щнамика накопления Нбр70 имеет нелинейный характер и :арактеризуется определенным латентным периодом - 6-8 дней, после соторого происходит очень быстрое увеличение синтеза этих белков и Армирование защитных эффектов адаптации к стрессу.

Впервые показано, что ФАСС имеет нелокальный характер, и зазвивается не только в сердце, но и в других органах и в частности з печени. Так, предварительная адаптация к стрессу почти в два раза ювысила устойчивость ядерных гистонных белков печени к ювревдавдему действию автолиза.

Впервые показано, что адаптационное накопление белков теплового вока также имеет нелокальный характер - в процессе адаптации .к ^мобилизационным стрессам эти белки накапливаются в сердце и течени. Наиболее выраженное накопление Ьзр70 при адаптации к ©мобилизационному стрессу происходит в сердце - 5 изоформ в датоплазме и 2 в ядре, а в печени - I изоформа в цитоплазме и I в эдре.

Показано, что между защитными эффектами адаптации к стрессу и эдаптации к гипоксии существуют глубокие различия как на уровне делого органа, так и на клеточном уровне. Это может быть связано с эсобенностями накопления Ьэр70 при разных типах адаптации. Так, при эдаптации к гипоксии накапливаются только 2 изоформы в цитоплазме из гати выявляемых при адаптации к стрессу и соответственно некоторые защитные эффекты, характерные для адаптации к стрессу, при адапатции ■с гипоксии отсутствуют, а именно: при адаптации к гипоксии повышалась устойчивость сердца к тепловому повреждению, а к реперфузионному - нет. В ядре повышения ьбр7о при адаптации к гипоксии не происходило, соответственно не увеличивалась устойчивость ядер к однонитевой ДНК.

Теоретическое значение работы. Выяснение роли Ьгр 70 в механизме ФАСС и таким .образом раскрытие одного из молекулярных механизмов защитных эффектов адаптации к стрессу и к высотной гипоксии.

Практическое значение работы. Полученные результаты о динамике развития и исчезновения ФАСС создают основу для разработки рекомендаций по выбору оптимального режима адаптации для получения наиболее эффективной защиты как на уровне сердца, так и на уровне других органов.

Результаты работы внедрены в учебный процесс в 3 медицинских вузах. Материалы исследований нашли отражение в монографиях: F.Z.Meerson. Adaptive protection of the heart. CRC Press.- Boca Raton, 1990; Ф.З.Меерсон, И.Ю.Малышев. Роль стресс-белков в адаптации и защита сердца. М.: Наука, :i992.

Положения выносимые на защиту:

1.При адаптации к стрессорным воздействиям развивается феномен адаптационной стабилизации структур (ФАСС), который состоит' в том, что при адаптации организма происходит резкое увеличение устойчивости органов и клеточных' структур к повреждающим факторам: в частности повышается устойчивость изолированного сердца к реперфузионному, термическому повреждению и токсическим дозам антибиотиков и одновременно увеличивается резистентность ядерной ДНК к нуклеопротеолизу. •

2.Адаптация организма к периодическим иммобилизационным стрессам сопровождается накоплением в клетках органа белков теплового шока из семейства hsp70. Причем степень накопления, изоформный состав и субклеточное распределение в значительной мере предопределяет развитие ФАСС и защитных эффектов. Динамика прямого и обратного развития защитных эффектов. ФАСС и содержания hsp70 в миокарде в процессе адаптации к стрессу и после нее коррелируют между собой. Это свидетельствует о том, что белки теплового шока составляют важное звено в механизме ФАСС.

3.ФАСС имеет нелокальный характер, то есть он развивается не только з сердце, но и в других органах и в частности в печени.

4.Между защитными эффектами адаптации к стрессу и адаптации к гипоксии существуют глубокие различия как на уровне целого органа, так и на клеточном уровне. Это может быть связано с особенностями накопления, изоформного состава и субклеточного распределения hsp70 при разных типах адаптации.

Апробация работы. Материалы • диссертации доложены и обсуждены на: 4 Всесоюзном симпозиуме "Кровообращение в условиях высокогорной и экспериментальной гипоксии" (Душанбе, 1990);

Sth Erwin Riesch Symposium (Freudenstadt, 1990); Constituent :ongress International Society for Pathophysiology (Hoscow, 1991); 4 всесоюзном симпозиуме "Стресс, адаптация и дисфункция" (Кишенев, 1991); 2nd International Symposium on Hypoxia "Hypoxia and ischemia: ;asic and applied aspects" (Berlin, 1991); The International Society 'or Heart Research "The calcium paradox: the first quarter century" Utrecht, 1991); The International meeting on two-dimensional ilectrophoresis (London, 1991).

Структура диссертации. Диссертационная )абота состоит из введения, двух глав обзора литературы, :арактеристики экспериментальных моделей и методов исследования, свух глав собственных исследований с обсуждением полученных юзультатов, выводов и списка литературы. Диссертация изложена на 51 странице, содержит 43 рисунка и II таблиц. Список литературы источает 251 источник, из которых 37 опубликовано в отечественных и 14 в зарубежных изданиях.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Общий план исследования. Работа была роведена на 557 крысах самцах линии Вистар массой 250 300 г и редусматривала пять этапов. На первом этапе было изучено влияние даптации к стрессу на устойчивость изолированного сердца к реперфу-ионному парадоксу, тепловому шоку и токсическим концентрациям анта-иотиков. Кроме того была детально исследована динамика развития и счезновения защитных эффектов адаптации к стрессу в процессе адап-ации и после нее.

Второй этап предусматривал более полный анализ ФАСС и ардиопротекторных эффектов адаптации к стрессу в экспериментах в оторых моделировалось повреждение ядер сердечных клеток. Было зучено влияние адаптации ка резистентность ядерной ДНК к эврежданлцему действию однонитевой ДНК.

Анализ собственных результатов и литературных данных позволил предположить, - что в развитии ФАСС и адаптационной защите сердца от повреждений ключевую роль играет активация биосинтеза Ьзр70. Возможная роль этих белков в защитных адаптивных эффектах была изучена на третьем этапе. В экспериментах с исспользованием двумерного электрофореза по о'ЕаггеИ р.н.(1975) исследовано влияние адаптации к иммобилизационному стрессу на содержание, субклеточное распределение и.изоформный состав Ьэр70 в миокарде.

На основе данных полученных в этих экспериментах, свидетельствующих в пользу важной роли Ьэр70 в развитии ФАСС в сердце, на четвертом этайе был изучен вопрос о том, является ли ФАСС генерализованным явлением, то есть реализуется ли он в других органах и какова роль ьбр70 в генерализации ФАСС. Для решения этих вопросов было изучено влияние адаптации к стрессу на устойчивость ядер клеток печени к повреждающим действию автолиза и на содержание, субклеточное распределение и изоформный состав ь=р70 в печени.

Наконец, на пятом заключительном этапе были проанализированы особенности формирования ФАСС и накопления белков теплового шока при адаптации к гипоксии.

Экспериментальные модели

1.Адаптацию к стрессорным воздействиям производили путем кратковременной иммобилизации животных в положении на спине в течение 12 дней: I день - 15 мин., 2 день - 30 мин., 3 день - 45 мин., остальные дни по 60 минут через день. Фиксация животных проводилась путем привязывания за 4 конечности без фиксации головы. В результате к концу курса иммобилизационных воздействий ни у одного из животных не возникали отек конечностей, стрессорных повреждений слизистой желудка и видимых изменений поведения.

2.Адаптацию животных к гипоксии проводили путем "ступенчатых" подъемов в барокамере: I день на 1000м, 2 день на 2000м, 3 день на 3000м, остальные дни на 4000м над уровнем моря. Весь курс адаптации к дозированной гипоксии состоял из 40 ежедневных сеансов продолжительностью пять часов. Адаптацию к гипоксии проводили в постоянно-вентилируемой проточно-вытяжной барокамере объемом 400 литров. Скорость откачки воздуха составляла 50 литров в минуту. Время подъема и время спуска составляло по 30 минут и неучитывалось в продолжительности гштоксического сеанса.

Физиологические методы исследования

1.Для оценки кардиопротекторных эффектов адаптации к стрессу и с гипоксии использовали методику изолированного сердца, герфузируемого по Лангендорфу. Для этого животных гепаринизирсзали и 1аркотизировали нембуталом. Затем проводили торакотомизо, сердце ¡ыстро извлекали и помещали в перфузионную систему. Для перфузии [спользовали стандартный раствор Кребса-Хензеляйта. Раствор юрировали газовой смесью 95% 02 и 5% С02 при температуре 37°С. При iTOM pH устанавливался в диапозоне 7.3-7.4. Перфузионкое давление ¡оставляло 9.5 кПа (97 см водного столба). Механическая активность [золированного сердца оценивали при помощи изотонического датчика d-112S ("nihon Kohden", Япония). Регистрацию механической ¡ктивности и ЭКГ производили с помощью специализированных модулей :олиграфа rh-6000- После 20-минутного периода стабилизации ;золированного сердца в условиях ретроградной перфузии измеряли оронарный проток, частоту сердечных сокращений и регистрировали сновные параметры механической и электрической активности: мплитуду, скорость сокращения и расслабления и ЭКГ.

2.Модели шемических и реперфузионных повреждений были оспроизведены ПО методу Hearse D.J. et al.(1973), ПОСрЭДСТВОМ одного перекрытия коронарного протока на 15 минут, после чего ерфузию включали и продолжали наблюдение в течение 20 мин еперфузии.

3.Тепловой шок на изолированном сердце моделировали при помощи величения температуры перфузионного раствора с -37°С до 42°С и родолжали наблюдение в течение 15 минут.

4.Для воспроизведения токсических эффектов антибиотиков спользовали рифамицин - блокатор РНК-полимеразы (Watson j.d., 1976)

полимиксин В - блокатор протеинкиназы С (Stutchfield j. et al., 986). Рифамицин вводили per os 7 мг/кг веса, а полнмиксин 3 в/м .12 мг/кг веса в течение 8 дней. Эксперименты проводили на 6 руппах жиеотных: I. контрольные крысы, 2. адаптированные к стрессу рысы, 3. крысы, которым вводили рифамицин, 4. крысы которым вводили олимиксин В, 5. крысы, которым вводили рифамицин и одновременно роводили адаптацию, 6. крысы которым вводили полимиксин В и дновременно проводили адаптацию. Наиболее отчетливо токсические ффекты антибиотиков воспроизводились на ишемизировакном сердце.

Ишемию в данном случае создавали по методу Currie r.w. et ai. (1988) при помощи снижения коронарного протока с 10 мл/мин до 1мл/мин.

Степень повреждения изолированного сердца при реперфузиокном парадоксе, тепловом шоке или при действии токсических доз антибиотиков оценивали по депрессии амплитуды сокращения, контрактуре, нарушениям ритма и выходу в перфузат креатинкиназы (КК) - явления маркерного для поврежденной сарколеммы. Контрактурные проявления оценивали в миллиметрах, по абсолютному изменению диастолической длины сердца в апико-базальном направлении, по отношению к диастолической апико-базальной длине сердца, зарегистрированной в конце периода стабилизации (Gilst W.H., Коопеп J.M., 1987). Нарушения ритма сердца оценивали по ЭКГ по суммарной длительности тяжелых форм аритмий: желудочковая тахикардия + фибрилляция желудочков в секундах. Повреждения сарколеммы оценивали по активности КК в оттекающем от сердца растворе, спектрофотометрическим методом при длине волны 340 пп, по методу szasz g. (1975). При этом были использованы наборы фирмы (LABSYSTEMS).

Биохимические методы исследования

1.Метод проточной цитофлуориметрии ДНК. Выделение кардиомиоцитов проводили С ПОМОЩЬЮ обычной методики (Mann O.L. et al., 1989) с использованием коллагеназы ТИП I (121 и/-МГ, Signa). Дальше клетки обрабатывали O.Is Triton х-юо, что приводило к лизису цитоплазматической мембраны. Ядра при этом оставались стабильными. Полученные ядра сначала подвергались повреждающим воздействиям и затем фиксировались в 0.5х глютаровом альдегиде и окрашивали флуоресцентным ДНК- связывающимся красителем - бромистым этидием (10мкг/мл). Цитофлуориметрический анализ ДНК был проведен на лазерном проточном флуориметре, по принятой методике (Watson J.v. et ai., 1985). Данный метод позволяет регистрировать ядра с нормальным диплоидным содержанием ДНК в виде пика флуоресценции, который при нашей методике находился в диапозоне с 48 по 112 канал анализатора интенсивности флуоресценции. Соответственно распад ядерной ДНК при действии повреждающих агентов количественно оценивали по уменьшению амплитуды этого пика.

2.Для воспроизведения повреждающих эффектов однонитевой ДНК ядра клеток крысинных сердец инкубировали 15 минут с добавление

эднонитевой экзогенной ДНК при 37°С.*

3.Содержание Ьгр70 в сердце и печени определял! в четырех слеточных фракциях: I - в цитоплазме, 2 - в экстрактах ядерных 5елков, 3 - в нуклеоплазме, 4 - в хроматине и ядерных мембранах. 1вумерный электрофорез проводили ПО О'БаггеП Р.Н. (1975). )лектрсф0ре3 ВО втором направлении проводили В Юх ПААГ ПО ЬавттИ г. к. (1970). Гели окрашивали азотнокислым серебром по методу 1оггхэеу Л.Н. (1981).**

4.Методика определения устойчивости ядерных структур печени к ¡ндогенным факторам автолиза. При изучении влияния адаптации к :грессу на устойчивость ядер печени к автолизу, суспензия ядер :ранили при 37°С и определяли относительное содержание белков с м.м. ¡коло 51 кДа через 2 и 4 часа после начала инкубации. Кинетика :нижения содержания гистонных белков в процессе хранения суспензии [дер отражает протеолитический распад этих структур и соответственно южет быть использована в качестве критерия устойчивости ядер печени

эндогенным факторам автолиза. Для определения относительного удержания гистонных белков, через указанное выше время из суспензии дер отбирали аликвоты и использовали для одномерного электрофореза :о ЬеатпН У.к. (1970) в 12,5% полиакриламидном геле. Гели крашивали серебрением по Мотиву а.н., (1981). Измерение тносительного содержания белков проводили при помощи лазерного енситометра.

^следования по определению устойчивости ядерной ДНК к .повреждающим акторам были проведены в С.- Петербургском институте ядерной физики АН совместно с Носкиным JT.A., Варфоломеевым Д.Б. и Варфолсмеевой .Ю.

Исследования по определению белков теплового шока в . клетках рганов были проведены в Московском и Томском институтах генетики АМН совместно с Замотринским A.B.

Диссертант искренне признателен всем этим ученым за помощь и ворческое сотрудничество.

- 14 -

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

I. ФЕНОМЕН АДАПТАЦИОННОЙ СТАБИЛИЗАЦИИ СТРУКТУР ПРИ АДАПТАЦИИ ОРГАНИЗМА К СТРЕССОРНЫМ ВОЗДЕЙСТВИЯМ: РОЛЬ нзр70.

1.1.Влияние адаптации к стрессу на устойчивость изолированного сердца к повреждающим факторам.

1.1.1.Влияние адаптации к стрессорным воздействиям на устойчивость изолированного сердца к реперфузионному'парадоксу.

Кривые на рисунке I показывают реакцию сердец в контроле, после адаптации к иммобилизационному стрессу на реперфузию после тотальной ишемии. Видаю, что при реперфузии сердца животных, адаптированных к стрессу, характеризовались резко повышенной устойчивостью к повреждению. Наиболее определенно защитный эффект адаптации к стрессу проявлялся на 5 минуте реперфузии, когда амплитуда сокращений сердец адаптированных животных оказалась в 8.8 раз выше, чем в контроле. К 20 минуте амплитуда сокращений в контроле составляла 0.49+0.04 мм и, следовательно степень восстановления этого параметра была 22%. При адаптации к стрессу к этому времени амплитуда сокращений была в 2.4 раза выше чем в контроле, а степень ее восстановления составляла 51%. Ускоренное постишемическое восстановление амплитуды сокращений при адаптации к стрессу было обусловлено более быстрым исчезновением контрактуры.

Антиконтрактурный эффект адаптации к иммобилизационному стрессу при реперфузии сопровождался антиаритмическим действием. Так, суммарная длительность тахикардии и фибрилляции желудочков, в расчете на одно сердце, составляла в контроле 246+16 с, а "при адаптации к иммобилизационному стрессу 119+12 с (р<0.оо1). Кроме того адаптация к иммобилизационному стрессу приводила к прямой защите сердца от реперфузионкого повреждения по такому важному критерию, как выход в перфузат КК. В контроле активность КК в перфузате на 5 минуте реперфузии достигала 719+34 мЕ/мин/г веса сердца, а при адаптации к иммобилизационному стрессу - 302+120 мЕ/мин/мг веса сердца.

Таким образом, адаптация к иммобилизационному стрессу обладает

-5

-■-■-Ш

О 5 10 15 —15СНЕМ1А —

20 25 30

Рисунок I. Влияние адаптации к иммобилизационному сттассу на амплитуду сокращений и выход КК в перфузат изолированного" сердца крысы три ишемии и последующей реперфузии,

Ось абсцисс - время от начала эксперимента,- минуты, Ось ординат: А - амплитуда сокращений, мм; Б - выход КК, мЕ/мин/г. 0 - контроль, п=7. ■ - адаптация к иммобилизационному стрессу, п=7.

42° С гшп 0

42 С тт

^исунок 2. Влияние адаптации к ¡¡^мобилизационному стсессу :-:= амплитуду сокращеш-тй и выход КК в перфузат изолированного " сердца крысы три высокой температуре (42 С).

Ось абсцисс - время от начала эксперимента, минуты, Ось ординат: А - амплитуда сокращений, мм; Б - выход КК, мЕ/мин/г. о - конт-эоль, п=6. ■ - адаптация к иммобилизационному стрессу, п=6.

Все результаты представлены как М±м. Значимость оазличий между юнтролем и адаптацией к иммобилизационному стрессу: ** р<0.25; ** э<0.01; *** р<0.001.

выраженным мембраннопротекторным действием и однозначно защищает сердце от реперфузионного повреждения.

1.1.2.Влияние адаптации к иммобилизационному стрессу на устойчивость изолированного сердца к тепловому повреждена

Кривые на рисунке 2 показывают влияние адаптации к иммобилизиционным стрессам на толерантность изолированных сердец к тепловому шоку. Видно, что 15 минутная перфузия раствором, нагретым до 42°С,. вызывает в контроле большую депрессию амплитуды сокращений, с 2.40+0.06 мм до 0.44+0.15 мм, контрактуру до 36% от исходной амплитуда сокращений, и приводит к массированному выходу КК в перфузат, активность, которой достигает 295+110 мЕ/мин/г. Адаптация к стрессу эффективно ограничивает депрессию амплитуды сокращения, контрактуру и выход ферментов (рис.2). Так например, на 15 минуте действия горячего раствора, выход КК в перфузат для сердец адаптированных к иммобилизационным стрессам змвотных был в 37 раз меньше, по сравнению с контролем.

Весьма существенно, что увеличение термостабильности сердца, как и повышение устойчивости миокарда к реперфузионному повреждению ни когда не возникало после однократного иммобилизацилнного воздействия, а всегда развивалось после серии таких воздействий, то есть формировалось как результат адаптации.

1.1.3.Влияние адаптации к стрессу на устойчивость изолированного сердца к кардиотоксическим эффектам антибиотиков. ■

Токсический эффект рифампицина и соответственно адаптационная защита оценивались по параметру "контрактуры": на 30-й минуте ишемии для сердец животных, получавших рифампицин, контрактура была в 2,5 раза больше, чем в контроле. Адаптация к стрессу не влияла на ишемическую конрактуру как таковую, но вместе с тем полностью предупреждала развитие дополнительной контрактуры в сердцах животных, которым длительно зводили рифампииин.

Токсический эффект другого антибиотика - полимиксина В - ингибитора протеинкиназы С реализозалься в виде значительного увеличения ишемической контрактуры по сравнению с контролем. Адаптация к стрессу не приводила к ограничению дополнительной контрактуры, которая развивалась в ишемизированных сердцах животных,

получавших полимиксин В.

Таким образом, влияние адаптации к стрессу на устойчивость сердца к токсическим эффектам антибиотиков тлеет дифференциальный характер: адаптация ограничивает повреждения, вызванные ингибитором транскрипции - рифампицином, но неэффективна по отношению к токсическим эффектам ингибитора протеинкиназы С - полимиксина 'В.

При объяснении механизма повышенной устойчивости изолированных зердец адаптированных животных к повреждающим факторам следует иметь з виду следующие адаптивные сдвиги.

Во-первых, показано, что при постишемической реперфузии сердца î3 его адренергических структур освобождаются катехоламикы в галичествах больших, чем при ишемии (Abrahanson T. et al., 1985). Такого рода адренергический эффект может играть роль в нарушении целостности мембран, возникновении аритмий и депрессии сократительной функции. При адаптации к иммобилизационным зоздействиям наблюдается закономерное снижение активных i-адренорецепторов, известное как десенситизация (u'Prichard d.c.. , Lvetnansky R., 1980). При этом как показали наши ранние эксперименты (Малышев И.Ю., 1990), адаптация к иммобилизационному стрессу !ащшцает сердце от аритмий и контрактуры, вызванных большими дозами адреналина. Поэтому можно думать, что защитный эффект этой адаптации гри реперфузии, также в той или иной мере зависит от десенситизации ¡дренорецепторов и снижения адренореактивности сердца.

Во-вторых, известно, что в развитии реперфузионных повреждений ¡ажную роль играют нарушения липидного слоя мембран, вследствии жтивации перекисного окисления ЛИПИДОВ (Guarnieri G. et al., 1980; eerson F.Z. et al., 1987) И В СООТВеТСТВИИ С ЭТИМ ЭНТИОКСИДаНТЫ [остаточно эффективно ограничивают реперфузионные аритмии (Меерсон >.3. и др., 1987). Показано, что в результате адаптации к :трессорным воздействиям в сердечной мышце возрастает активность [нтиоксидантных ферментов: каталазы на 30%, супероксиддисмутазы на 5% (Meerson F.Z., 1988). Одновременно при. этом в несколько раз ;озрастает резистентность изолированного предсердия адаптированных мвотных к индуктору свободно- радикального окисления - перекиси одорода (Меерсон Ф.З., Каткова Л.С., 1985). Таким образом, :овышение эффективности антиоксидантных механизмов миокарда является дним из вероятных механизмов адапаптациовдой защиты клеток сердца.

В-третьих, при реперфузии происходит массивное вхождение в

клетки Са2+, избыток которого играет важную роль в нарушении структуры И функции кардиомиоцитов (Clusin W.T. et al., 1935). Возникающее в процессе адаптации к стрессорным воздействиям периодическое увеличение действующих концентраций цАМФ и ДАТ приводит к умеренному увеличению вхождения Са2+ по медленным каналам (Watanabe A.M., Besch Jr., 1974). Следовательно каждый такой эффект должен приводить к активации кальциевых насосов и на/Са-обменника -механизмов, ответственных за удаление Са2+ из цитоплазмы. При многократном повторении таких ситуаций, весьма вероятным становиться увеличение эффективности механизмов кальциевого транспорта и как результат - повышение устойчивости сердца к реперфузионному парадоксу. В пользу этого предположения свидетельствуют экспериментальные данные о том, что предварительная адаптация организма к иммобилизационным воздействиям эффективно защищает миокард от действия больших концентарций Са2+ (Меерсон Ф.З., Малышев И.Ю., Сазонтова Т.Г., 1989) и кальциевого парадокса (Малышев И.Ю., Меерсон Ф.З., 1990).

В-четвертых, в процессе адаптации к иммобилизационным стрессам происходит активация локальных стресс-лимитирующих систем, таких например как простагландиновая и аденозикергическая (Boroyan R.G., 1979; Wennmalm А., 1978; Meerson F.Z., 1991). Постепенное увеличение мощности этих защитных механизмов, по- видимому, также может вносить свой вклад в адаптационную стабилизацию клеточных структур и повышение устойчивости сердца к реперфузионному парадоксу.

Не исключено, что все эти факторы вносят определенный вклад в формирование повышенной устойчивости сердца при адаптации стрессу. Однако, наиболее интересная возможность объяснения защитного эффекта адаптации может быть связана с белками теплового шока, которые как известно накапливаются после стресса в клетках органов и участвуют в восстановлении поврежденных клеточных структур (Welch W.J., Suhan

J.P., -1986; Pelham H.R.B., 1986 ). ДеЙСТВИТвЛЬНО, результаты

экспериментов свидетельствуют, что в процессе адаптации организма сердце приобретает повышенную устойчивость не только к реперфузионному, но и к термическому повреждению. Этот факт наводит на мысль о том, что при адаптации в миокарде могут накапливаться белки теплового шока и соответственно изучение роли этих белков в защитных адаптивных эффектов становиться очень перспективной задачей.

На следующем этапе также выяснилось, что адаптация к стрессу эффективно защищает сердце от токсического действия' антибиотика рифампицина. Оценивая возможный механизм этого эффекта необходимо учитывать, что мишенью для рифампицина служит (З-субсединица РНК-полимеразы (stryer l., 1975). Связывание антибиотика с этой субъединицей приводит к нарушению образования первой фосфодизфиркой связи в цепи РНК и специфическому ингибированию инициации синтеза РНК. Вероятно, протекторный эффект адаптации при повреждениях, вызванных рифампицином, может быть' связан с формированием на уровне ядра механизма, защищающего процесс транскрипции, а точнее препятствующего ингибированию ß-субъединицы . РНК-полмеразы. Интересная возможность объяснение защитных эффектов адаптации в этом случае, также может быть связана с hsp?o. Можно предположить, что hsp70 могли бы узнавать комплекс рифампицин - РНК-полимераза как аномальный белок. Известно, что связывание hsp7Q с аномальной структурой сопровождается изменением конформации hsp70, которое передается на субстратный белок (Pelham h.r.b., '1986). Не исключено, что изменение конформации субъединиц фермента приведет к ослаблению связи антибиотика с ß-субъединицей вплоть до диссоциации ингибитора. Эта гипотеза требует серьезного экспериментального подтверждения, и прежде всего прямого ответа на вопрос, накапливаются ли в миокарде адаптированных животных hsp70.

Вместе с тем, несомненным остается тот факт, что адаптация организма к стрессориым воздействиям повышает устойчивость изолированного сердца к щирокому спектру повреждающих факторов: к реперфузии, тепловому шоку и токсическим концентрациям катехоламинов. Ранее было установлено, что адаптация также повышает устойчивость сердца к токсическим концентрациям катехоламинов и Са2+ (Малышев И.Ю., iggo; Heerson F.z. et ai., 1990), а выделенные из миокарда адаптированных животных цитоплазматические структуры -элементы саркоплазматического ретикулума, митохондрии - отличаются ОТ контрольных ВЫСОКОЙ степенью УСТОЙЧИВОСТИ к аутолизу (.Чеегноп F.Z., Sazontova T.G., Arkhipenko Yu.V., 199t)). ЭТОТ КОМПЛеКС ЯЗЛеНИЙ

был обозначен как "ФЕНОМЕН АДАПТАЦИОЖОИ СТАБИЛИЗАЦИИ СТРУКТУР" (Меерсон Ф.З., 1990) (ФАСС). Понятно, что ФАСС является наиболее вероятной основой защитных эффектов адаптации. Вместе с открытием ФАСС сразу возникло несколько серьезных вопросов: I. Реализуется ли ФАСС только на уровне сердца и его цитоплазматических структур или

он также формируется на .-.уровне ядра клетки; 2. Кэкоеы механизмы ФАСС и в частности какова роль белков теплового шока в его развитии; 3. Является ли ФАСС не локальным явлением, то есть формируется ли он в других органах кроме сердца; 4. Каковы особенности развития ФАСС при адаптация к другим факторам среды и наиболее важному из них -гипоксии. Результаты изучения этих вопросов изложены в следующих разделах.

1.2.Влияние адаптации к стрессорным воздействиям на устойчивость ядерной ДНК сердечных клеток к повреждающим воздействиям.

Для решения вопроса о том, реализуется ли ФАСС только в цитоплазматических структурах или он развивается также на уровне генетической матрицы - ДНК было оценено влияние адаптации к стрессу на резистентность изолированных ядер клеток миокарда к повреждающему действию однонитевой экзогенной ДНК. Показано, что однонитевые участки ДНК могут возникать в результате свободно- радикального повреждения ДНК при ишемии или сильном стрессе (Васильев В.К., Меерсон 0.3., 1984). Как известно однонитевая ДНК активирует ядерные протеазн (Surovy с.s., Berger N. д., 1983 ; Газиев А.И., Куцый М.П., 1985) и, в конечном счете, может запускать процесс разрушения ДНК в клеточных ядрах..

Гистограммы, зарегистрированные в типичном эксперименте представлены на рисунке 3. Они отражают влияние адаптации к иммобилизационным стрессам на величину пика флуоресценции ядер миокарда-с нормальным содержанием ДНК. Видно, что добавление к суспензии ядер однонитевой ДНК в концентрации 50 мкг/мл, в контроле приводило к существенному уменьшению амплитуда пика флуоресценции ядер. Зто свидетельствует о значительном распаде ядерной ДНК при действии экзогенной однокитеЕой ДНК.

На рисунке 3 Б представлен такой же эксперимент на суспензии ядер клеток, выделенных из сердца адапифованного к иммобилнзиционкым стрессам животного. Видно, что явления распада ДНК начинают отчетливо проявляться только с концентрации однонитевой ДНК 200 мкг/мл , тогда как в контроле Еыраженкый распад ДНК происходил уже при 50 мкг/мл экзогенной ДНК. Количественный анализ, представленный на рисунке 4 показал, что при добавлении экзогенной

- 21 -t. аз<м<та*я да.

.. KOHTPOJly

1 W,. W \А ......?ТГ>г..... ч ......?У>чУ,ц.,ч

АДАПТАЦИЯ

IA i <t in иг 1/1 0 44 1Я 11 ч. 9 *1- tri !)2 Lv в <4 UI 0 w .......Ултч 'i > 11 <i i« is:

м loo гсо 400

Рисунок 3. Влияние адаптации к иммобилизационному стрессу на резис тентность ядерной ДНК сердечных клеток к повреждающему действию однонитевой экзогенной ДНК.

На гистограммах: ось ординат - количество ядер в тысячах; ось абсцисс - интенсивность флуоресценции ДНК-связывакхцегося красителя в относительных единицах, каналах анализатора.

Слева от стрелки - гистограммы распределения ядер в контроле и адаптации без добавки однонитевой ДНК; справа - гистограммы после добавления однонитевой ДНК в концентрациях - 50, 100, 200, 400 цг/мл

o-J-.—--.-1-,

•о 100 - 200 ■• 300 400

ONE CHAIN DNA CONCENTRATION, ug/ml

Рисунок 4. Влияние адаптации к иммобилизационному стрессу на устойчивость ядерной ДНК сердечных клеток к повреждающему действию однонитевой экзогенной ДНК.

Ось абсцисс - концентрация однонитевой ДНК, цг/мл, Ось оодинат - амплитуда пика флуоресценции ядер с нормальным содержанием ДНК, •/.. Амплитуда пика без добавки однонитевой ДНК принята за 100%. о контроль, п=5. ■ - адаптация к иммобилизационному стрессу, п=5.

Все результаты представлены как М±м. Значимость различий между контролем и адаптацией к иммобилизационному стрессу: * р<0.05; ** р<0.01; *** р<0.001.

ДНК в концентрации 50 мкг/мл деградировало всего лишь 8% ядерной ДНК, адаптированных к стрессам животных, против 43% в контроле. При увеличении концентрации однонитевой ДНК до 400 мкг/мл защитный эффект сохранялся.

Таким образом, ФАСС может формироваться не только на цитоплазматическом уровне, но и на уровне генетической матрицы - ДНК

При объяснении ядернопротекторного эффекта адаптации к стрессам следует иметь в виду, что однонитевая ДНК может активировать ядерные протеазы, специфически гидролизувдие ГИСТОН Hj (Surovy С.S., Berger N.A., 1983), и таким образом увеличивать доступность участков ДНК для внешних агентов, и в частности для нуклеаз (Газиев А.И., Куцый М.П., 1985). Это в конечном счете может приводить к распаду ДНК. Действительно, результаты специальных серий экспериментов показали, что ингибитор сериновых протеаз фениметилсульфонилфторид в концентрации 2мМ полностью предотвратил распад ядерной ДНК, вызванный действием однонитевой ДНК. Это подтверждает гипотезу о специфическом протеазозависимом характере повреждения ядерной ДНК.

Под этим углом зрения возникает интересная возможность объяснения защитного эффекта адаптации, в связи с hsp70. Известно, что после стресса эти белки накапливаются как в цитоплазме, так и в ядре (Pelham H.R.B., 1936). Установлено также, что hsp обладают СПОСОбНОСТЬЮ СВЯЗЫВаТЬСЯ С ПОВреЖДеННЫМИ белками В ЯДре (Pelham

H.R.B., 1986; Welch W.J., Suhan J.P., 1986 ), экранируя ИХ ОТ действия протеаз. Совокупность этих данных позволяет предположить, что hsp могут играть определенную роль в антипротеолитическом механизме адаптационной стабилизации ядерной ДНК.

I.3.Влияние адаптации к стрессорным воздействиям на содержание, субклеточное распределение и изоформный состав hsp70 в сердце.

Адаптация к иммобилизационным стрессам приводила к накоплению в цитоплазме не менее пяти полипептидов с молекулярной массой около 72 кДа и изоэлектрическими точками в диапазоне от 6,3 до 5,7 (рис. 5А, фрагмент 3). В контроле все эти фракции не выявлялись (рис. 5А, фрагмент I).

Далее мы' последовательно проанализировали влияние адаптации к .стрессу I) на спектр ядерных белков, 2) на спектр белков связанных с

Рисунок 5. Влияние адаптации к стрессу на содержание белков теплового шока в цитозоле и нуклеоплазме сердечных клеток.

А - фрагменты электрореграмм цитозоля, соответствующие области локализации Ьэр70. Стрелками указана, локализация изоформ ьгр^О.

Б - фрагменты электрореграмм нуклеоплазмы, 'соответствующие области локализации Ьзр70. Окружностью указана локализация изоформ 1^70.

I - контроль, 2 - тепловой шок, 3 - адаптация к стрессу.

хроматином и ядерными мембранами и 3) на спектр белков нуклеоплазмы.

В ядерных экстрактах выявлялось не менее двух -индуцибельных белков при адаптации к стрессам. Их молекулярная масса составляла 70-72 кДа, а изоэлектрическая точка была около 6.2-6.3. Эти характеристики соответствуют белкам семейства ьзр?о.

Электрофоретический анализ белков, связанных с хроматином и ядерными мембранами, показал, что фракция, соответствующая ьбр 70, ни в контроле, ни при адаптации не обнаруживается. С учетом этого обстоятельства мы предположили, что основным местом накопления Ьзр70 з ядре пси адаптации к иммобилизационным стрессам является нуклеоплазма.

Рисунок 5Б позволяет оценить влияние адаптации к иммобилизационным стрессам на содержание ьэр70 в этой субъядерной локализации. Видно, что при адаптации к иммобилизационным стрессам, в нуклеоплазме, также как и в ядерных экстрактах в области 71-72 кДа и р1 6.2-6.3 появляются полипептиды, которые отсутствуют в нуклеоплазме в контроле (рис.ББ, фрагменты 1,3).

Однократное иммобилизационный стресс не приводило к появлению hsp70 ни в цитоплазме, ни в нуклеоплазме. Следовательно речь идет именно об адаптационном накоплениии этих стресс-белков.

При ответе на вопрос о возможном механизме накопления белков теплового шока при адаптации к иммобилизационным стрессам, необходимо учитывать, что активация синтеза hsp70 может увеличиваться при действии самых разных факторов, и в частности при изменении температуры (Schlesinger M.J., 1386; Currie R.W. et al., 1988), увеличении нагрузки на сердце (Contard'F., et al., 1989) ИЛИ повышении действующей на клетки концентрации катехоламинов и стероидных гормонов (Moalic J.M. et al., 1989; Gibbs D.M., 1985; Blake M.J. et al., 1990). При ЭТОМ ИЗВвСТНО, ЧТО В КЭЖДОМ КОНКреТНОМ

случае механизм активации hsp70 имеет свои определенные особенности. Соответственно, прежде чем пытаться анализировать возможные пути накопления hsp70 при адаптации к иммобилизационным стрессам, надо было определить какие из вышеперечисленных Ь2р70-индуцирующих факторов реально сопровождают адаптацию к стрессорным воздействиям.

Для этого была проведена специальная серия экспериментов. Температуру тела регистрировали с помощью специального ректального датчика (nihon Kohden, Japan). Определение кровяного давления и частоты сердечных сокращений проводили непрямым бескровным способом по методу Короткова на хвостовой артерии при помощи пневматического датчика (Narco-Bio-System, usa). Оказалось, -что в течение одночасовой иммобилизации ректальная температура была постоянной -примерно 3G.9°C и ее колебания не превышали о.1°. Частота сердечных сокращений изменилась с 440 ± 25 уд/мин до 486 ± 31 уд/мин, а кровяное давление с ПО ± 2 мм рт. ст. до 115 ± 3 мм рт. ст. Едва ли эти незначительные изменения температуры, кровяного давления и частоты сердечных сокращений могли играть существенную роль в активации синтеза hsp70 при адаптации к иммобилизационным воздействиям.

В отношении гормонально-гуморальных факторов, при адаптации к иммобилизационным стрессам складывается иная ситуация. Показано, что в ответ на иммобилизацию в крови животных происходит многократное увеличение концентрации катехоламинов и стероидных гормонов (Kein K.L., sigg Е.в., 1976). В связи с этим особое значение приобретает вопрос о нейро-гуморальном механизме, который мог бы играть роль в накоплении hsp70 при повторных стрессорных воздействиях.

" В целом, результаты настоящего исследования свидетельствуют, то адаптация к иммобилизауционнсму стрессу сопровождается акоплением з миокарде Ьзр7о: в цитоплазме накапливаются 5 изоформ эр70, а в нуклеоплазме 2 изоформы. Одновременно с этим происходит ыраженное повышение устойчивости сердца и выделенных из миокарда итоплазматических и ядерных структур к повреждающим факторам. Это же само по себе позволяет сделать предположение о важной роли Ьср70 -формировании ФАСС.

Важность указанных адаптивных изменений в изоформном составе зр70 и их субклеточном распределении трудно оценить в полной мере, ока не проведен анализ динамики накопления Ьзр70 в процессе даптацш и после нее и не сопоставлены эти изменения с развитием и счезновением ФАСС.

.4.Динамика становления и обратного раззития феномена адаптационной табилизации структур. Сравнительный анализ с изменением содержания

Ьэр70 в миокарде

.4Л.Развитие и снижение повышенной устойчивости изолированного ердца к реперфузионному и гипертермическому повреждениям в процессе даптации и после нее.

На рисунках 6 и 7 отражена динамика формирования и обратного 'азвития ФАСС в течение и после адаптации к стрессу. При этом в ачестве поврездагацих факторов использовали реперфузионный парадокс рис. 6) и тепловой шок (рис. 7) воспроизводимый на изолированных по ангендорфу сердцах. Защитные эффекты ФАСС и в том и другом случае ценивали по трем параметрам: I. по степени ограничения депрессии мплитуды сокращений, 2. по степени ограничения контрактуры и 3. по граничению выхода креатинкиназы в перфузат. При реперфузионном арадоксе защитный эффект дополнительно оценивали по нтиаритмическому действию.

Видно, что в процессе адаптации, .формирование повышенной стойчивости сердца к реперфузионным повреждениям характеризуется пределенной латентной фазой, в нашем случае - 10 дней (рис. 6). На 4-й день формировался выраженный кардиопротектроркый эффект, роявляющийся ограничением депрессии амплитуды сокращения на 315», меньшением контрактуры на 78%, уменьшение длительности аритмий на

Рис. 5.

Рис.7.

Ограничение депрессии 30 "I амплитуды сокращений, %

20-

10

О*—•

80-IОграничение контрактуры, X

60

20

ое-•

60-.Ограничение аритмий. % 50 40 30 20 10

-10

40

20

Ограничение депрессии амплитуды сокращений, %

бо,Ограничение контрактуры, %

40

20

ао 70 И 60 50 40 30 20 10 о -10

О« —•-/

Ограничение выхода креатинкиназы. %

\

О 2 4 6 а 10 12 14 16 1В

ДЛДД Д Д Д Д

О 1 4 6 8 10 12 14 16 18

ДДДД Д Д Д Д

Рисунок 6. Динамика развития и исчезновения ФАСС при реперфузионном повреждении изолированного сердца.

По оси ординат - защитный эффект адаптации к стрессу, в гооцентах, за 100£ принято полное ограничение действие повреждающего фактоса.

По оси абсцис - дни адаптации и после нее. - указывают дни в которые проводились иммобилизационные стрессы, стрелка указывает прекращение адаптации.

Рисунок 7. Динамика развития и исчезновения ФАСС при термическом повсеждении изолированного сердца. Все обозначения такие же как на рис.6.

Ю% и снижением выхода креатинкиназы в перфузат на 58" (рис 6). [осле прекращения адаптации этот защитный эффект быстро исчезал и же через 4 дня устойчивость сердца к реперфузионному парадоксу была ■акая же как в контроле (рис. 6).

Развитие адаптационной устойчивости сердца к термическому ювреждению также происходило после латентного периода - через 6-10 лей после начала адаптации (рис.7). Далее видно, что по параметру ограничение депрессии амплитуды сокращения" максимальный защитный ффект был выражен на 4 день после адаптации. По двум другим ¡■араметрам: "ограничение контрактуры" и "ограничение выхода :реатинкиназы" максимальное повышение устойчивости сердца к 'епловому шоку происходило на 10-й день адаптации и поддерживалось [а таком уровне в течение 4-х дней. В этот период в сердцах даптированных животных контрактура, вызванная тепловым шоком была яижена примерно на 50%, а выход ферментов уменьшен почти на 80% рис.7). Далее оказалось, что после прекращения курса адаптации, 'ермопротекторный эффект сохраняется значительно дольше, чем :овышенная устойчивость к реперфузионным повреждениям (рис.6 и 7). 'ак, даже через 6 дней после адаптации, сердца адаптированных ивотных отличались от контрольных, более высокой устойчивостью к епловому шоку.

Таким образом, динамика прямого и обратного развития ФАСС, пределяемая по устойчивости сердца к реперфузии и тепловому шоку, меет три важных особенности: во-первых, развитие защитных эффектов роисходит не сразу с началом адаптации, а характеризуется прбделенной задержкой - латентным периодом от 6 до 10 дней; ;о-вторых, после латентного периода ФАСС формируется очень быстро, в 'ечение 4-х дней; в-третьих, после прекращения адаптации ФАСС быстро угасает", особенно при реперфузионной парадоксе, и на 6-й после по когим параментам не обнаруживается.

.4.2.Динамика содержания ьзр70 в миокарде.в процессе адаптации и осле ее прекращения. Сопоставление с динамикой ФАСС.

В цитоплазме максимальное накопление пяти индуцибельных стресс-елков происходило на второй день после полного 12-ти дневного курса даптации животных к иммобилизационным воздействия (рис 8). Именно к тому времени формировались наиболее мощные защитные эффекты -

§ гл 60-,

со

Ч -

О г

X 2! со 40-

И €>

аз о.

к о

к с

аз а: 20-

з- о. г:

са О.

си с

1-,

О 0(

100-,

о

г-0. ье 00-

л

X _

аз 60-

О Ч

£ а. о:

со ^

* О 40-

О.

аз 2

«

8 20-

[-80 §

га _

Ч аз

- 60 о X х О

> а а

га

2

-40 аз О га

к о

аз ч

5" с

-20 Я 03

К Е-

СП

О. к

и а.

• 0 О с

100

0 12 3 4 Д Л Д Д

10 11 12 13 14 15 16 17 18 Д Л

Рисунок 8. Динамика развития и исчезновения ФАСС при реперфузионном и тепловом повреждении изолированного сердца. Сопоставление с

ДИНамИКОЙ Ьзр70.

По оси ординат - защитный эффект адаптации к стрессу, в процентах, за 100% принято полное ограничение действие повреждающего фактора.

По оси абсциис - дни адаптации и после нее.А - указывают дни в которые проводились иммобилизационные стрессы, стрелка указывает прекращение адаптации.

повышение устойчивости изолированного сердца к реперфузионному повреждению, тепловому шоку (рис.8) и т.д. Нбр70 начинают появлятся на 6 день адаптации. Соответственно этому, кардиопротекторные эффекты - защита от реперфузионного парадокса и теплового шока -начинают обнаруживаться не раньше, чем через 6 дней адаптации к иммобилизационным стрессам (рис. 6,7,8).

Прекращение адаптации животных приводило к постепенному исчезновению И5р70. На 6 день после курса адаптации в цитоплазме их содержание было сильно уменьшено, хотя и оставалось выше, чем до

даптации (рис.8.). К этому дню достоверно определялся лишь ■ермопротекторккй эффект адаптации, а устойчивость' сердца к >еперфузии была такая не как до адзпташт (рис.5,7,8).

В ядре динамика содержания ¡^дуцибелъюсс белксз с м.м. "2 кДа >ыла несколько иной. В процессе адаптации в ядре происходило ;акопление только двух изсфсрм из пяти выявляемых в штозоле.» Они »являлись на 10 день адаптации, а исчезали на 5 день после курса :ериодических итобишзацисккых воздействий.

Таким образом, динамика изменения содержания белков теплового юка в миокарде в течение и после адаптации сказалась очень похожей :а динамику развития и исчезновения защитных эффектов :АСС, а менно: и в том и другом случае существует определенный латентный :ериод, после которого происходит очень быстрая активация синтеза :тресс-белков и формирование защитных эффектов. После прекращения даптации содержание стресс-белков быстро уменьшается и примерно с 'акой же скоростью угасают защитные эффекты. Это е^э раз видетельствует в пользу важней роли стресс-белков в механизмах ¡даптациовдой стабилизации структур.

При внимательном анализе адаптационной активации стресс-белков ;ыявляется одна очень интересная закономерность. Ска состоит з том, то при адаптации организма к периодическим одинаковым по силе и родолжительности стрессорным воздействиям настурает момент, когда в -тЕет на очередное стандартное воздействие происходит резкое величение экспрессии генов стресс-белхоз. Эта ситуация ясно редставлена на рисунке 8. Видно, что вплоть до шестсго дня даптации, стрессорные воздействия не вызывали как:го-либо величения содержания стресс-балксз в миокарде. На шестой . день в дтоплазме кардиомиоцитез обнаруживается една пзеформа ,-.зр70 в :езначительном количестве. На десятый день адаптации, несмотря на .ополнительные стрессорные воздействия ситуация по сравнению с :естым днем практически не изменяется (рис.З). 11, вдруг на 14 день, :осле очередного стандартного стрэсссрнсгэ зсздзйстзия происходит ющная триггерная активация синтеза Ьзр70, которые обнаруживается в летках в большом количестве в взде пяти изоферм индуппбельных елков. Такой характер акт;:зацип синтеза И2р70 :чевидно видетельствует о том, что при адаптации формируется свой, вз многом 'Гличкый от стрессорного, механизм индукцж стрэсс-белков.

1.5.Формируется ли ФАСС в других органах кроме сердца: роль hsp70.

Хорошо известно, что в процессе адаптации к факторам среды происходит активация биосинтеза белков и нуклеиновых кислот, которая охватывает необычайно широкий круг органов. Это приводит к формированию обширного системного структурного следа, обладающего разветвленной архитектурой (Меерсон Ф.З., 1984). Так, активация биосинтеза в костном мозге становиться основой пролиферции клеток эритроидкого ряда, в результате развиваются адаптационная полицитемия и увеличение кислородной емкости крови. Активация синтеза нуклеиновых кислот и белков в клетках легочной ткани приводит к гипертрофии легких и увеличению их дыхательной поверхности. Увеличение синтеза белков в печени приводит к увеличению массы органа и к повышению мощности систем микросомального окисления, в которой главную роль играет цитохром 450Р и т.д.

Результаты экспериментов, представленых выше свидетельствуют, что при адаптации к стрессу в миокарде происходит значительное увеличение синтеза белков теплового шока и одновременно повышается устойчивость сердца в целом и его клеточных структур к повреждающим воздействиям. Другими словами, на основе активации синтеза белков, в сердце разбивается феномен адаптационной стабилизации структур.

Однако вопрос о том, формируется ли ФАСС в других органах кроме сердца и какова в этом случае роль белков теплового шока до сих пор оставался открытым. То есть по существу оставался неизученным вопрос имеет ли ФАСС локальный характер' или нет.

Для решения этой проблемы было оценено во-первых: влияние адаптации к стрессу на резистентность -изолированных ядер клеток печени к повреждающему действию автолиза, который как известно сопровождается активацией ПОЛ (Бондаренко H.A. и др., 1985; Джафаров А.И.б 1981), фосфолипаз (Грибанов Г.А., Сергеев С.А., 1983), протеаз (Реброз Л.Б. и др., 1983) и других эндогенных факторов деградации клеточных структур и во-вторых: проанализировано влияние такой адаптации на содержание, субклеточное распределение и изоформный состав hsp70 в клетках печени.

Кривые на рисунке 9 и типичные электрофореграммы отражают динамику снижения содержания ядерных белков с м.м. около 51 кДа при хранении ядер при температуре 37°С. Видно, что в контроле содержание этих белков к 4-му часу хранения практически линейно уменьшается до 36% от исходного уровня. При адаптации к стрессу содержание этих Зелков после 4-х часового хранения снизилось лишь до 71% от

>исунок 9. Влияние предварительной адаптации к стрессу на динамику :нижения содержания ядерных белков печени с м.м. около 51 кДа при :ранении при 37 С.

По оси абсцисс - длительность хранения в часах; по оси >рдинат - относительное содержание ядерных белков в %, за 100% гринята величина отражающая содержание этих белков непосредственно юсле выделения - момент времени 0 часов, о - контроль, п=4; ■ -даптация к стрессу, п=4. * - р<0,05 - достоверность различий между :ериями.

На вставках представлены электорофореграммы ядерных белков [ечени. Стрелки указызают полосы соответствующие белкам с м.м. около |1 кДа

исходного уровня, что в 2 раза вше чем в контроле. На вставках представлены электрофоре граммы, где видно, что полоса соответствующая белкам с молекулярным весом около 51 кДа в контроле при хранении постепенно исчезает, а при адаптации сохраняется. Следовательно, гистонные белки в ядрах печени адаптированных животных обладают большей стабильностью при хранении, чем в контроле.

Таким образом, ФАСС имеет нелокальный характер, так как он может формироваться не только на уровне структур сердца, но и на уровне других органов, й в частности - на уровне ядер клеток печени.

Б ---- / • м! >■!»

I 2 3

Рисунок 10."Влияние.^ адаптации к стрессу на содержание белков теплового шока в цитозоле и ядерных экстрактах клеток печени".

А - фрагменты электрофореграмм, соответствующие области локализации Ьэр70 в цитозоле.'I - контроль, 2 - тепловой шок, 3 -адаптация к стрессу. Стрелками указана локализация изоформ Ьзр70.

Б - фрагменты электрофореграмм, соответствующие области локализации ьзР70 в ядерных экстрактах. I - контроль, 2 - тепловой шок, 3 - адаптация к стрессу. Стрелками указана локализация изоформ ЬзР70.

Оказалось, что при адаптации к стрессу формированию ЗАСС в эзных органах соответстует активация синтеза hsp70 в клетках разных рганов. Так наши эксперименты показали, что при адаптации к стрессу клетках печени происходит накопление hsp7o: в цитоплазме - I зоформа и в ядре - I (рисунок 10).

Данные полученные в экспериментах делают целесообразным анализ зух основных явлений: во-первых, возникающего под веянием цаптации к стрессу повышения устойчивости ядер клеток печени к эвреждагацим факторам и, во-вторых, повышения содержания белков зплового шока в печении при такой адаптации.

Способность адаптации к стрессу предупреждать нарушения груктуры и функции печени была установлена в 1987. году (Уеерсон .3. и др., 1987). При этом, как было показано цитопротенторный Ёфект адаптации достигался за счет активации антиоксиданткых систем ограничения чрезмерной индукции ПОЛ (Меерсон Ф.З. и др., ISS7). В эстоящем исследовании впервые выявлено, что важным компонентом цаптационной защиты печени на уровне ее клеток является увеличение ;тойчивости ядер к действию естественных факторов деградации неточных структур. Однако поскольку антиоксидантные ферменты эеимущественно локализованы в цитоплазме клеток, роль этого ¿актора защите изолированных ядер оказывается весьма проблематичной и ^ответственно вопрос о том, за счет каких молекулярных механизмов 1аптация приводит к повышению устойчивости ядерных структур зедставляется достаточно сложным и в настоящее зремя может 5суждаться лишь в предположительном плане.

При объяснении защитного эффекта адаптации к стрессу на уровне iep сердечных клеток, мы предположили, что накапливающиеся з ходе 1аптащш в ядрах hsp70, обладая способностью связываться с зврежденными белками (Welch W.J., Suhan J.P., 1986;"Pelhan H.R.B., 386) и экранируя их от действия протеаз могут играть определенную )ль в антипротеолитическом механизме адаптационной стабилизации тер сердечных клеток. Можно думать, что аналогичный механизм также ;жит в основе адаптационного повышения устойчивости ядерных :руктур печени. Действительно наши эксперименты показали, что при ;аптации к иммобилизационному стрессу в клетках печени происходит жопление hsp7o: в цитоплазме - I изоформа и в ядре - I. Таким ¡разом, одно из предположений состоит в том, что адаптационное >вышение стабильности ядер печени связано с накоплением белков

теплового шока, тем более, что защитные эффекты этих белков хорошо известны и наиболее изучены именно по отношению к ядерным структурам

(Pelham H.R.B., 1986).

Кроме того необходимо отметить, несмотря на то, что возможность индукции синтеза изоформ hsp70 в ответ на стрессорные воздействия генетически детерминирована в равной степени во всех органах организма, тем не менее как показали наши эксперименты наиболее выраженное накопление стресс-белков происходит в сердце - 5 изоформ в цитоплазме и 2 в ядре, в то время как в печени в цитоплазме и в ядре накапливается только по одной изоформе. Таким образом, вопрос о том, в каких органах возможность индукции hsp70 превратиться в реальность решается в ходе адаптации и вероятно зависит не только от тканевой специфичности в стресс-активации hsp70 генов, но и от того какие исполнительные органы будут вовлечены в формирование адаптации организма к иммобилизационному стрессу. Это интересная проблема, однако она требует дальнейшего изучения и пока выходит за рамки нашего обсуждения.

В целом, основной вывод который можно сделать из этих экспериментов состоит в том, что повышение устойчивости клеточных структур, как и адаптационное накопление белков теплового шока не является оригинальной принадлежностью сердечной ткани и также происходит в других органах, и в частности в печени. Это означает, что активация биосинтеза hsp70 в процессе адаптации, как и развитие самого ФАСС имеет нелокальный характер и по-видимому представляет собой достаточно важное явление.

Другое направление в развитии нашего понимания сути адаптационного стабилизации клеточных структур, состоит в изучении зависимости ФАСС от фактора среды к которому происходит, адаптация.

2.ФЕНОМЕН АДАПТАЦИОННОЙ СТАБИЛИЗАЦИИ СТРУКТУР ПРИ АДАПТАЦИИ ОРГАНИЗМА К ПЕРИОДИЧЕСКОЙ ГИПОКСИИ: РОЛЬ HSP70.

(Сравнительный анализ с адаптацией к стрессу.)

Известно, что кардиопротекторный эффект, подобный тому, который дает адаптация к иммобилизационным стрессам, можно воспроизвести в

словиях целого организма с помощью адаптации к гипоксии (Меерсон .3., 1986; Ostadai в. et ai., 1989; Меерсон Ф.З., Устинова Е.Е., рлова Э.Х., 1988). Установлено, что адаптация к гипоксии также риводит к активации некоторых центральных и локальных стресс-имитирующих систем (Меерсон Ф.З., 1986).

Однако в настоящее время выяснилось, что наряду с общими ертами, кардиопротекторные эффекты этих двух типов адаптации ущественно отличаются друг от друга. Так адаптация животных к

ерИОДИЧесКОЙ ГИПОКСИИ За СЧеТ роста Коронарных СОСУДОВ (Jürgens .d:, 1989; Obradovic d. et ai., 1989) более, чем в два раза меньшает зону первичной ишемии в условиях целого организма, оответственно на эту же величину уменьшается зона некроза, змеренная двое суток спустя после лигирования коронарной артерии Меерсон.Ф.З., Шнейдер А.Б., Устинова Е.Е., 1990). Адаптация к ммобилизационным стрессам лишена такого антиишемического эффекта и то же время обладает выраженным цитопротекторным действием, и при еизменной зоне первичной ишемии более, чем на 40% уменьшает объем екротической ткани (Меерсон.Ф.3., Шнейдер А.Б., Устинова Е.Е., 990). Возникает закономерный вопрос можно ли с помощью адаптации к ипоксии воспроизводить ФАСС, обнаруженный нами при адаптации к трессу и каковы особенности этого процесса.

В соответствии с этим цель работы, представленной в данной лаве, состояла в том, чтобы во-перзых, количественно оценить ардиопротекторные эффекты адаптации к периодической гипоксии на ровне изолированного сердца и сопоставить с таковыми при адаптации периодическим иммобилизационным стрессам; во-зторых, роанализировать влияние адаптации к гипоксическим воздействиям на стойчивость клеточных структур сердца к повреждающим, факторам и равнить эти эффекты с эффектами адаптации к стрессу, и наконец, -третьих, оценить влияние адаптации к гипоксии на содержание, зоформный состаз и субклеточное распределение hsp70 в сердце и акже сопоставить с адаптацией к стрессу.

При изучении влияния адаптации к гипоксии на резистентность золированного сердца к поврездающему действию реперфузии после зтальной ишемии оказалось, что сердца адаптированных животных не тличались от контрольных.

Данные о влиянии адаптации к гипоксии на термотолерантность

Термопротекторный эффект, %

Ограничение депрессии Ограничение Ограничение выхода

амплитуды сокращения контрактуры креатинкиноэы

Адоптация к стрессу ИЗ Адаптация к гипоксии

Рисунок II. Сравнительный анализ влияния адаптации к гипоксии и адаптации к стрессу на термотолерантность изолированного сердца.

По оси ординат - термопротекторный эффект в процентах, за 100" принято полное ограничение действия повреждающего фактора.

изолированного сердца и их сопоставление с адаптацией к стрессу представлены на рисунке II.

Видно, что адаптация к гипоксии обладает термопротекторным эффектом и на 40« снижает депрессию амплитуды сокращений, на 50% ограничивает контрактуру и на 80% уменьшает выход креатинкиназы. Вместе с тем, на том же рисунке видно, что адаптация к стрессу более эффективно, чем адаптация к гипоксии, ограничивает контрактуру и выход КК при термическом воздействии на изолированном сердце.

Таким образом на уровне изолированного сердца между защитными эффектами адаптации к стрессу и к гипоксии обнаруживаются

:ущественкые различия: адаптация к стрессу повышает устойчивость |ргана как к реперфузионному повреждению, так и к тепловому; при [даптащш к гипоксии резистентность сердца к тепловому иоку величивается в меньшей степени, а повышение устойчивости сердца к «перфузии Еообще отсутствует.

Результаты исследований по определению влияния адаптации к ипоксии на устойчивость ядерной ДНК сердечных клеток видетельстзуют, что эта форма адаптации не сопровождалась аким-либо повышением устойчивости ДНК к позреждащим эффектам днонитевой ДНК.

В совокупности это позволяет сделать важный вывод о том, что азвитие ФАСС на ядерном уровне существенно зависит от вида фактора которому происходит адаптация: при адаптации к стрессу происходит ногократное повышение резистентности ядер к повреждающим оздействиям, а при адаптации к гипоксии этот эффект отсутствует.

Далее мы оценили влияние адаптации к гипоксии на содержание, убклеточное распределение и изоформный состав ьзр70 в сердце.

Адаптация к высотной гипоксии приводила к накоплению в цитозоле эрдца крыс лишь двух изоформ белков семейства ьэр70 из пяти ^являемых после адаптации к стрессу (рисунок 12).

Б -г- Г

г 2 3 4

¡сунок 12. Сравнительная оценка влияния адаптации к стрессу и к ¡поксии на содержание белков теплового шока в цитозоле сердечных юток.

Фрагменты электрореграмм, соответствующие области локализации ;Р70. I - контроль, 2 - тепловой шок, 3 - адаптация к стрессу, 4 -[аптация к гипоксии. Стрелками указана локализация изоформ Ьбр70.

Выяснилось также, что в отличии от адаптации к стрессу, адаптация к гипоксии не сопровождалась накоплением индуцибельных ьбр70 в ядре.

В совокупности эти данные дают основание предположить, что глубокие различия в механизме кардиопротекторных эффектов двух форм адаптации могут быть связаны со специфичностью распределения и накопления ибр^О в клетках. Так при адаптации к стрессу в цитоплазме накапливаются 5 изоформ Ьбр70, а в нуклеоплазме 2, и соответственно формируются мощные протекторные эффекты как на уровне сердца, так и на уровне цитоплазматических и ядерных структур; при адаптации к гипоксии накапливаются только 2 изоформы в цитоплазме и соответственно повышается устойчивость сердца к термическому повреждению, однако некоторые защитные эффекты, характерные для адаптации к стрессу - повышение устойчивости сердца к реперфузионному повреждению и увеличение устойчивости ядерной ДНК, при адапатции к гипоксии отсутствуют. Другими словами ФАСС при адаптации к гипоксии на уровне сердца выражен существенно меньше по сравнению с адаптацией к стрессу.

Рассмотренные выше факты в месте с данными представленными в предыдущих главах позволяют сделать закономерный вывод: вероятно, белки теплового шока играют очень важную роль в формировании ФАСС. Этот вывод можно было сделать уже после того как было установлено, что в процессе адаптации к стрессу и после нее, становление и обратное развитие ФАСС хорошо коррелирует с изменением содержания Ьзр70 в миокарде. Изучение ФАСС при адаптации к гипоксии и сравнение ее защитных эффектов с эффектами адаптации к стрессу делает этот вывод еще более обоснованным и дополнительно позволяет утверждать, что степень выраженности ФАСС существенно зависит от фактора среды к которому осуществляется адаптация и что эта зависимость может быть связана с особенностями накопления, изоформного состава и субклеточного распределения ьбр70 при том или ином типе адаптации.

Результаты настоящего исследования приводят к постановке трех важных вопросов: I. За счет каких механизмов может происходить накопление ьбр70 в миокарде адаптированных животных? 2. С чем связано дифференциальное накопление изоформ Ъбр70 в зависимости от типа адаптации? И, 3. Каким образом ьбр70 участвует в формировании защитных эффектов?

Один из возможных механизмов активации синтеза Ьзр70 при

щаптации к факторам среды может состоять в следующем. 3 ходе щаптации - возбуждение высших вегетативных центров приводит к шогократному увеличению действующей на органы мишени концентрации :атехоламинов и кортикостероидов. В результате в клетках возникает га меньшей мере три цепи явлений, конечным звеном которых будет величение содержания ьзр70 (см. рис.13). Во-первых, активация

юунок 13. Механизм стресс-индуцированной активации синтеза белков яиювого шока.

ДАТ - диацилгдицерол, ПК-С - протеинкиназа С, ПК-КМ шьмодулин-зависимая протеинкиназа, ПК-А - протеинкиназа А, ■тг-белок, активирующий транскрипцию ьэр гена

кальций-мобилизующих рецепторов и связанное с этим увеличение концентрации диацилглицерола, в конечном счете через активацию протеинкиназы С и изменение внутриклеточного pH приведет к активации генов (Nishizuka Y, 1984 ). Moalic J.И. et al (1989) показали, ЧТО ПО такому механизму может происходить активация транскрипции генов теплового шока. Во-вторых, активация бета-рецепторов и последующее увеличение концентрации цАМФ и Са2+ в клетке приведет к активации соответствующих протеинкиназ, которые могут активировать фактор транскрипции теплового шока (Tanguay R.M. 1988). Наконец, вттретьих, стероидные гормоны, проникая в цитоплазму связываются там со своим рецептором. Активированный таким образом рецептор приобретает высокое сродство к ДНК и связывается с генетической матрицей. Результатом такого взаимодействия будет продукция ряда белков

(Tomasovic S.P. 1989). Kasambalides E.J., Lanks K.M. (1985)

показали, что одним из таких белков является hsp70.

Понятно, что при многократной активации рецепторного аппарата клетки в процессе адаптации к факторам среды может произойти значительное накопление hsp70 в цитоплазме и ядре.

В настоящее время мы не можем ответить на второй вопрос и указать на конкретные причины того, почему при адаптации к стрессу накапливается пять изоформ hSp70, а при адаптации к гипоксии только две из них. Вместе с тем сама возможность индукции синтеза разных изоформ hsp70 в ответ на разные воздействия хорошо известна. Так Mehta et al ( 1988) показали, что после ишемии в сердце кролика происходит накопление трех изоформ с pi 6.0, 6.1, 6.15. currie et ai.(I988) обнаружили, что после непродолжительного теплового шока в миокарде крысы обнаруживается только одна изоформа hsp70. Возможность дифференциальной регуляции различных представителей семейства индуцибельных генов hsp70 продемонстрирована также у человека (Leung т.к.с. et al., 1990) и хорошо изучена у дрожжей. Можно полагать, что при адаптации к таким разным факторам как иммобилизационный стресс и гипоксия различия в последовательности и длительности действия гормонов и катехоламинов на сердце могут предопределять различия в экспресси генов белков теплового шока и накопление разных изоформ. v

При обсуждении третьего вопроса о том, каким образом hsp70 могут участвовать в формировании кардиопротекторных эффектов, необходимо учитывать: во-первых, способность hsP70 дисагрегировать

аномальные гидрофобные белок-белковые взаимодействия. Таким образом isp70 могут участвовать в ренатуращш поврежденных белков (Pelham LR.в., 1986), которые накапливаются в клетках при действии самых эазных факторов, и в частности при реперфузии и тепловом шоке

Nayler W.G. , Daly M.S., 1984; Pelham H.R.B., 1986); ВО-ВТОрЫХ, Itevenson H.A., Calderwood S.K. (1990) Обнаружили В Молекуле hsp70 гчасток связывания для кальциевого рецептора - кальмодулина. Не юключено, что в условиях кальциевой прегрузки, например при )еперфузии, результатом взаимодействия hsp70 с кальмодулином будет гменьшение сродства кальмодулина к Са2+ и ограничение :а2+-кальмодулин-зависимых процессов: протеолиза, фосфолиполиза и

Понятно, что ограничение агрегации полипептидов, восстановление :труктуры денатурированных белков и связывание кальмодулина белками ■еплового шока будет блокировать реализацию основных [атогенетических звеньев, связанных с повреждением белков и ¡нутриклеточной кальциевой перегрузкой, и тем самым предотвращать ювреждения миокарда.

В заключении необходимо подчеркнуть, что белки теплового шока :е являются уникально действующим фактором в защите клеток от гавреждакхцих воздействий. Более обоснованной на наш взгляд является мель, что hsp70 образуют лииь одно из важных звеньев В' сложной и :оординированной системе защитных механизмов ФАСС. Эти механизмы югут быть использованы не только как средство защиты клетки от :еожиданных неблагоприятных воздействий, но и как средство правления адаптационными реакциями здорового организма, в которых ;ам ФАСС занимает ключевое место. Можно думать, что своеобразие ащитных эффектов и особенностей ФАСС столь же велико как и :оличество факторов среды к которым может адаптироваться организм, то делает перспективным дальнейшее изучение молекулярных механизмов >АСС при адаптации к холоду, высокой температуре, физической агрузке, не говоря уже о том, сколь интересными и необычными ащитными эффектами может обладать адаптация к сочетанному действию ■азумно подобранных факторов.

- 42 -ВЫВОДЫ

1.Адаптация организма к периодическим иммобилизационным стрессам обладает выраженным кардиопротекторным действием и защищает изолированное сердце от реперфузионного повреждения. Так, при реперфузии после тотальной ишемии, в сердцах адаптированных животных степень восстановления амплитуды сокращения составила 50%, тогда как в контроле всего 20%, величина контрактуры была в 6 раз меньше, а длительность тяжелых форм аритмий и выход креатинкиназы в перфузат были снижены в 2 и 2,3 раза по сравнению с контролем, соответственно. Эти результаты соответствуют представлению о том, что кардиопротекторный эффект адаптации к сгрессорным воздействиям реализуется не только на центральном • уровне, но и на уровне регуляторных механизмов самого сердца.

2.Предварительная адаптация животных к коротким иммобилизационным воздействиям значительно повышает резистентность изолированного сердца к термическому повреждению. Так при адаптации амплитуда сокращений сердца при действии, горячего перфузионного раствора (42°С) была в 2,5 раза выше, а контрактура в 3 ниже по сравнению с контролем. При этом в сердцах адаптированных животных, в отличии от контрольных, практически полностью отсутствовал выход ферментов в перфузионный раствор.

3.Влияние адаптации к стрессу на устойчивость сердца к токсическим эффектам антибиотиков имеет дифференциальный характер: адаптация ограничивает повреждения, вызванные ингибитором транскрипции - рифампицином, но неэффективна по отношению к токсическим эффектам ингибитора протеинкиназы С - полимиксина В. Это может свидетельствовать о том, что при адаптации к стрессу, на уровне ядер формируется механизм, обеспечивающий повышение устойчивости процессов транскрипции к ингибиторам.

4.Предварительная адаптация животных к стрессу обеспечивает увеличение резистентности ядерной ДНК к повреждающим воздействиям. Так при добавлении экзогенной однонитевой ДНК в концентрации 50 мкг/мл деградировало всего лишь 8% ядерной ДНК, адаптированных животных, против 43% в контроле. Таким образом, феномен адаптационной стабилизации структур (ФАСС) может формироваться не только на уровне цитоплазматических структур, но и на уровне генетической матрицы - ДНК.

5.ФАСС при адаптации организма к. периодическим иммобилизационным стрессам сопровождается накоплением в клетках органа белков теплового шока из семейства ъз?70. Так при адаптации к стрессу в цитоплазме накапливаются 5 изоформ Ьз?70, а в нуклесплазме 2 изоформы; и одновременно формируются мощные кардиопротекторные эффекты: увеличивается устойчивость изолированного сердца как к реперфузионному, так и к тепловому повреждению. Кроме ' того повышается устойчивость ядерной ДНК к нуклеспротеолизу.

6.Динамика прямого и обратного развития защитных эффектов ФАСС и содержания кэр70 в миокарде в процессе адаптации к стрессу и после нее коррелируют между собой. При этом динамика накопления Ьзр70 имеет нелинейный характер и характеризуется определенным латентным периодом - 6-8 дней, после которого происходит очень быстрое увеличение синтеза этих белков и формирование защитных эффектов адаптации к стрессу.

7.ФАСС имеет нелокальный характер, то есть он развивается не только в сердце, но и в других органах и з частности з печени. Так, установлено, что предварительная адаптация организма к стрессу в два раза увеличивает устойчивость ядерных гистонных белкоз клеток печени к автолизу.

8.Адаптационное накопление белков теплового шока также имеет нелокальный характер - в процессе адаптации к иммобилизационным стрессам эти белки накапливаются в сердце и печени. Наиболее выраженное накопление Ьзр70 при адаптации к иммсбилизационному стрессу происходит в сердце - 5 изоформ в цитоплазме и 2 в ядре, а в печени - I изоформа в цитоплазме и I в ядре. Зтот "градиент" адаптационного накопления и изоформного спектра ьзр?о, по-видимому соответствует степени вовлечения органов в формирование адаптации организма к стрессу.

9.При адаптации организма к периодической гипокс:н ФАСС Еыражен существенно меньше, чем при адаптации к стрессу; а именно: при адаптации к гипоксии повышалась устойчивость сердца к тепловому повреждению, а к реперфузионному - нет. Кроме того, при адаптации к гипоксии, в отличии от адаптации к стрессу, устойчивость ядер к однонитевой ДНК не увеличивалась. Таким образом, между защитными эффектами двух типов адаптации существуют глубокие различия как на уровне целого органа, так и на уровне клеточных структур.

10.При адаптации к гипоксии, в цитоплазме кардиомиоцитов накапливается только 2 изоформы Ьбр70 из пяти, выявляемых при адаптации к стрессу, а в ядре повышения ьэр70 вообще не происходило. Таким образом, различия между кардиопротекторными эффектами двух форм адаптации могут быть связаны с особенностями накопления, изоформного состава и субклеточного распределения ьбр70 в сердце.

11.В целом результаты диссертационного исследования соответствуют гипотезе о том, что белки теплового шока из семейства Ьзр70 составляют один из механизмов ФАСС и играют важную роль в развитии защитных эффектов адаптации к факторам среды.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1.Adaptation to stress increases the heart resistance to ischemic and reperfusion arrhythmias. // J.Hoi.Cell.Cardiol.~ 1989.-V.21-- P.299-303. (Co-autor Heerson F.Z.)

2.Increased efficiency of the SR functioning and the antiarrhythmic effect of adaptation to stress exposure // J.Hoi.Cell.Cardiol.- 1989.- V.21.- Suppl.2.- P.17. (Co-autors Heerson F.Z., Sazontova T.G.)

3.Prevention of ischemic arrhythmias by activation of stress-limiting systems of the organism. // CV World Report.- 1989,-V.2.- P.205-212. (Co-autors Heerson F.Z., Pshennikova H.G Belkina L.H., Abdikaliev H.A.>

4.Adaptation to stress exposure prevents arrbythmogenic and contractural effects of the excess of Ca2+ on th"e heart by the increased activity of sarcoplasmic reticulum. // Basic.Res.Cardiol.-1990.-. V.85.- P.96-103. (Co-autors Heerson F.ZSazontova T.G.)

5.Адаптация к стрессорным воздействиям ограничивает реперфузионные повреждения сердца после тотальной ишемии и повышает его устойчивость к тепловому шоку. // Доклады АН СССР.- 1990.-T.3I3.- J63- С.750-752. (соавтор Meерсон Ф.З.)

6 - Сравнительная оценка кардиопротекторных эффектов адаптации к гипоксии и к стрессорным воздействиям. // Кровообращение в условиях ■высокогорной и экспериментальной гипоксии.- Тез.докл. 4 Всесоюз.

симпозиума.- Дуйанбе, 1990.- С.103-105. (соавторы Меерсон Ф.З., Пшенникова М.Г., Сазонтова Т.Г., Вовк В.И.)

7.Различия клеточных механизмов зашиты организма при адаптации к стрессу и периодической гипоксии // Стресс, адаптация и дисфункция.- Тез.докл. 4 Всесоюз. симпозиума.- Кишенев, 1991,- С.SO. (соавтор Меерсон Ф.З.)

8.Phenomenon of the adaptive stabilization of structure-s and protection of the heart // Proceedings Inter.Soc.Pathophysiol.-Moscow.- 1991,- abstr.2.4.12. (co-author Meerson F.Z.)

9.Two-dimensional electrophoretic analyzis of the accumulation of hsp70 isoforms in the rat heart under many time-repeated stress exposure. // Proceedings Inter.Meeting.- London.- 1991.- P.279-280. (co-authors Zamotrinsky A. V. Meerson F.Z.)

10.Comparative estimation of cardioprotective effects of adaptation to restraint stress and to hypoxia: role hsp70. // Reihe Medizin.- 1991.- V.40.- P.61-69. (co-authors Meerson F.Z., Zamotrinsky A. V. , Archipenko Yu.V., Vovk V.I.)

11.Различия в формировании феномена адаптационной стабилизации ДНК ядер сердечной мышцы при адаптации к стрессу и высотной ГИПОКСИИ: роль hsp. // Доклады АН СССР.- 1991.- Т.317.- С.1503-I50S. (соавторы Меерсон Ф.З., Замотринский А.В.)

12.Адаптация организма к стрессу и к высотной гипоксии приводят к накоплению в миокарде крыс разных изоформ ' hsp70. // Доклады АН СССР.- 1991.- Т.320.- Ж2.- С.470-472. (соавторы Замотринский А.В., Меерсон Ф.З.)

13.Adaptive protection of the heart and stabilization of myocardial structures. // Basic Res.Cardiol.- 1991,- V.86.- P. 87-98. (co-authors Meerson F.Z., Zamotrinsky A, V.)

14.Адаптация организма к стрессорным воздействиям повышает устойчивость ядер сердечных клеток к повреждающему действию однонитевой экзогенной ДНК. // Бюл.эксперим.биол. и мед.- 1991.-Л6.- С. 4G0-462. (соавторы Меерсон Ф.З., Варфоломеева Е.Ю., Варфоломеев Д.Б., Носкин Л.А.)

15.Сравнительная оценка влияния адаптации к стрессорным воздействиям и к высотной гипоксии на устойчивость сердца к реперфузионному повреждению после тотальной ишемии. // Бюл.эксперим.биол. и мед.- 1991.- ШC.I8-20. (соавторы Меерсон Ф.З., Вовк В.И.)

16-Адаптация организма к стрессорнш воздействиям повышает устойчивость ядерной ДНК сердечных клеток за счет накопления белков теплового шока в ядре // Бнш.эксперим.биол. и мед.- 1991.- JS8.-С.126-128. (соавторы Замотринский А.В., Меерсон Ф.З.)

17.Адаптация организма к стрессорным воздействиям предупреждает кардиотоксический эффект рифамицина, но не полимиксина В. // Бюл.эксперим.биол. и мед.- 1991.- ШО.- С.344-345. (соавтор Меерсон Ф.З.)

18.Adaptive increase in the resistance of heart to calcium paradox. // J.Mo 1.Cell.Cardiol.- 1991.- V.23.(Suppl.5).- P.162. (co-authors Meerson F.Z., Arkhipenko Yu.V., Vovk V.I.)

19.Phenomenon of the adaptive stabilization of sarcoplasmic and nuclear structures. // Basic Res. Cardiol.- 1991,- V.86.(Suppl.3).-P.205-214. (co-authors Meerson F.Z., Shneider A.В.)

20.Comparative estimation of cardioprotective effects of adaptation to hypoxia arid to stress: Role of heat shock proteins (hsP70). // 2nd International symposium on hypoxia.- Berlin.- 1991.-P.19-21. (co-authors Meerson F.Z., Arkhipenko Yu.V., Zamotrinsky A.V., Vovk V.I.)

21.Differences in the development of the PhASS during adaptation to stress and to hypoxis are related with the differential accumulation of hsp70 isoforms. // Mol.Cell.Biol.-1992.- V.lll.- P.87-95. (co-authors Meerson F.Z., Zamotrinsky A.)

22.Кардиопротекторные эффекты адаптации к иммобилизационным стрессам и к гипоксии. // Кардиология.- . 1992.- Л 5.- С.43-48. (соавторы Меерсон Ф.З., Замотринский А.В., Воронцова Е.Я.)

23.Феномен адаптационной стабилизации структур и роль hsp70 в его механизме. // Вопросы мед.химии.- 1992.- Т.38.- Ш.- С.5-9. (соавторы Меерсон Ф.З., Замотринский А.В., Шнейдер А.В.).

24 -Изоформный состав индуцибельных hsp70 в миокарде крысы зависит от времени после теплового шока. // Бюл.эксперим.биол. и мед.- 1992.- Jfe.- С.563-566. (соавторы Замотринский А.В., Меерсон Ф.З.)

25.Phenomenon of the adaptive stabilization of structures and protection of the heart. //Can.J.Cardiol.- 1992.- V.26I.- p.237-248 (co-authors Meerson F.Z., Zamotrinsky A.V.)