Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Фагодиагностика, фаготерапия и специфическая профилактика анаэробной энтеротоксемии свиней

1 1 ь

казанский ордена леш на ВЕТЕИНАМЙ институт ;;м. н.э.баумана

На правах рукописи

хайруллин и рек нургалиевич

фагод'/агностика, фаготерапия и специфическая профилактика анаэробной энтеротоксемш свиней

16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора ветеринарных наук

Казань 1991

Работа выполнена ка кафедрах э-изоотологйи и микробиологии, терапии и клинической диагностики с патологической физиологией Ульяновского сельскохозяйственного института

Официальные оппоненты:

1. Доктор биологических наук, профессор Е.С.Воронин

2. Доктор ветеринарных наук, профессор О.А.Котылев

3. Доктор медицинских наук, профессор А.Г.Хуснутдинов

Ведущая организация - Всесоюзный институт экспериментальной ветеринарии.

Защита состоится " " 1991 г.

в /'-) часов на заседании специализированного совета Д120.22.01 Казанского ордена Ленина ветеринарного института им. Н.Э.Баумана (420074, Казань, ветеринарный институт).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Казанского ордена Ленина ветеринарного института им. Н.Э.Баумана.

Автореферат разослан " /-г? " 1991 г.

Ученый Секретарь специализированного Совета, доцент

Уграмов В.И.

и

I

I '"*( ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОта

АктуЮгстооть темя. Огромная концентрация животных на ограниченных площадях в свиноводческих комплексах пр< наруяе-нки привычных условий обитания, в частности естественного и необходимого контакта с живой природой,- закономерно приводит к снижении их естественной резистентности и к более вирокому проявлении и развитии разнообразных инфекционных патологий.

Значительно обострилась эпизоотическая ситуация в ть.сих хозяйствах по инфекционной энтеротоксемии свиней, вызываемой анаэробными микроорганизмами вида пзрфрингенс.

Заболевание, как правило, приводит к сникенип продуктивности животных» их больной смертности и. следовательно, к огромному экономическому уаербу.

В настоящее время большинство исследователей как у нас в стране, так и за рубежом пришло к единому кненип, что основным возбудителен анаэробной энтеротоксемии свиней является Клостридиуи перфрлнгенс типа С.

Восприимчивы к нему главным образом поросята в первые дни жизни, которые зарадастоя от свиноматок алиментарным путем. Взрослые животные заболевают при снижении резистентности и наличии зисоковирулентных штаммов возбудителя. Предрас-юлагащими факторами заболевания являются также различные :трессы, неполноценность рационов, отсутствие моционов, сопутствующие болезни, которые, как известно, очень часто наблвда->тся в крупных свиноводческих комплексах.

Диагностически анаэробиуп энтеротоксеннв свиней очень ■рудно дифференцировать от болезней, ииеадих сходную .ллничес-.уп картину, - колибактерюза молодняка, анаэробной дизенте-ии поросят, отечной болезни, гастроэнтеритов различной этио-огии. Причем традиционные лабораторные ме оды исследования еоьма сл хны, требупт больших временных и материальных за-рат. Кроме того, следует учесть способность Клостридну пор-рингенс выделять токсины различного типа, а отезда и слож-эсть их типизации.

Не оправдывавт себя и общепринятые методы профи ^г.ти ки лечения больных свиней с использованием антибиотиков и прелатов !31трофураноЕОГо ряда. Одна нз причин - больаал адап-

тациснисд способность к пин клостридиа.

Бос ото обусловило, особенно б последние годи, интерес ясследова-. злей к поиску новых, более эффективных методов и средств борьбы против анаэробной энтеротоксекии свиней - фа-годиагностики, фаготерапии к фагопрофилактики.

Бактериофага, как установлено, обладают высокой специфичностью, не оказывают отрицательного влияния на организм животных, исклячают образование дисбиктерюза и являются ценным диагностическим, профилактическим и лечебным средством при мчогих болезнях (Я.К.Коланов, В.А.Байрак, 1962; А.Я.Мецеря-

1962; 1968; М.К.Щеглова, 1969: М.О.Нвания, 1974; К.А.Георгадзе, М.М.Натадзе и др., 1975; И.П.Ревенко, 1976; И.А.Ба-;:улов, Г.П.КольпиноЕа и др., 1980; riл'.Пр.-Hij'jDK, 1952; Л.И.Волосегич, Н.П.Фолен и др., 1932; В.Я.Ганюшкин, 193*»; С.Б.Ленев, 1908).

Однако проблема разработки фаговых препаратов при анаэробной энтеротоксемяи свиней до сих пор остается открытой.

Пели и задачи исследования. Целья настоящей работы явилось выделение и изучение биологических свойств перфрингенс-бактериофагов, их селекция с целью выделения наиболее ценник г диагностическом отношении штаммов и разработка эффективных лечебно-профилактических препаратов-бактерюфагов, а также средств для специфической профилактики анаэробной энтероток-секии свинеЯ.

Согласно поставленной цели необходимо было резить следу-кгае задачи:

1. Изучить эпизоотологию анаэробной энтеротоксемии свиней ¡; установить эти слога чески я фактор заболевания.

2. Выделить пурфрингенс-бактериофаги из различных источников.

3. Изучить особенности взаимодействия выделенных бактериофагов с бактериальным хозяином: диапазон литического действия, спзкгр специфичности, адсорбционную способность, латентный период внутриклеточного развития и уродсайность, устойчивость к различным физико-хккическим факторам.

Из выделенных бактериофагов провести се. .екцию диагно-стлчесюа (индикаторных^ перфрингенс-фагов типов А и С.

5. Выявить лечебно-профилактические свойства приготов-енных бактериофагов.

6. Определить, эффективность диагностических бактериофа-оа для типизации, выделенных культур и' ветвления 'возбудителя яаэробноЯ энтеротоксешш свиней в патологическом Материале.

7. Разработать препарат бактериофага .из выделенных стам-зэ и испытать его лечебно-профилактическ,з эффективность.

8. Изготовить гидроокисьалкминиевуа формолгакцину и фа-)лиэат-вакцину из местных токсигзнных типов Клостридиум пэр-эингенс типа С. Пролети- сравни ильное изучение антитокси-юкого иммунитета з эксперименте и з производственных усло-ях.

9. Приготовить опытную серию пэрфрингенс-бактериофага Ф-С.

Научная новизна. Выделены бактериофаги возбудителей аэробной энтеротоксемии свиней и изучены их би югичесгле оЯства.

Ка основа целенаправленной селекции отобраны штамма, отчаяние требованиям диагностических фагов.

Изготовлен лечебно-профилактический бактериофаг, который штан в производственных условиях.

Разработана вакцина против анаэробной энтеротоксемии спи' «

Теоретическая и практическая значимость работа. Дано на-ое обоснование пршципам селекции биологически активных ммоз фагов возбудителей анаэробной онтзротоксемии сзинэЯ онструирования эффективных в диагностической и лечебно-филактмческои отношениях препаратпч-бактерио^АГсв при этоЯ гкции.

Диагностические перфрннгенс-фаги типоь А и С апробированы Зсесеюзном Государственном научно-контрольном ннсткт^ге ес-шарнцх прзпаратов при участии центральной ветеринарной да-игории ГУВ СССР.

Разработаны и утверждены методические упаьакия по типиза-возбудителеЯ анаэробной энтеротоксекии сгинеп тапоспяцифи-ими (индикаторными) бактериофагами Клостридиуи перфр-.нген" в А и С (10.07.1090).

- Ц

Временная инструкция по изготовлению и контроле бактериофага анаэробного диагностического Клостридиум перфршгеж тиг.ов А и С и технические условия ТУ 10-09-70-90 "Бактериоф! анаэробна?, диагностический Клсстридиук г.ер5рингенс типов А I С" (8.08.1990).

Препарат пер^рингенс-фагов типов А и С депонирован во Всесоюзном Государственной научно-контрольно« институте век ри¡¡арных препаратов.

Изготовлена опытная серая перфрингенс-фага А и С (5000 доз).

Изготовлен лечебночпрофилактический перфрингенс-фаг типа С и комиссионно испытан при участии представителя ГУВ СССР в экспериментальных и производственных условиях.

Разработана вакцина против анаэробной, энтеротоксемии св:п:ей и освоен её выпуск биопромиыленностью. Утверждено постановление по применению вакцины против онтеротоксемии евпней (9.02.1989).

Апробация результатов исследований.Основные материалы диссертации доложены и обсувдены на:

- Научной конференции профессорско-преподавательского соста ва и аспирантов УСХл (Ульяновск, 1981-1990г.).

- Методической комиссии Всесоюзного Государственного научно контсольного института ветеринарных препаратов (Москва, 198 1991г.).

- Кг смиренном заседании научных сотрудников ветеринарного Факультета УСХИ (Ульяновск, 1991г.).

Публикация результатов исследований. По теме диссертац опубл!кованы 2'* научных статьи и "олучено 4 положительных реаения ка изобретение.

Бнедге ние. Бактериофаги Клостр1диум перфрингенс типов и С для индикации и типизации возбудителей анаеробноП онтер тохсемии егкг;еЕ5 и бактериофаг Клострдаум иер$ршгенс типа для профилактики и терапии анаироС ой энтпротоксемии свиней а также ^ориолгадроокис -аламиниевая вакцина против анаоробн пм.-еротоксемии свике?.

ГУВ СС^? утверждено 3 разработанных наставления по при копня отих фаговых препаратов пр| анаэробной онтеротоксемии свиней.

Основные научные положения выносимые, при защите диссертации . В хозяйствах зоны Среднего Поволжья, основным этиологическим фактором анаэробной эитеротоксекии свиней является возбудитель Кдостр. диум перфрингенс типа С.

Использование сконструированн^л* наш яерфрингенс-фагов Клостр1диум перфрикгеис типа А и С дает возможность проводить индикация и типизации возбудителей анаэробной энтеротоксеиии свиней.

Бактериофаг Клострндиум пер}п!нгенс типа С обладает сравнительно высске1 профилактической и терапевтической эффективность»).

Разработанные ГОА формолвакцина и фаготазат-вакцига про-1вляпт достаточно высокуо икмуногеикуп активность.

Применение эакцины против анаэробной зитзротоксекия. 5Еиней практически целесообразно и экономически выгодно.

Структура и объем диссертации. Диссертации изложена на :06 страницах мапиногисного текста и включает: введение, обзор итература, собственные исследования, обсухдз.. ¡е результатов, ыводы и практические предложения.

работа содержит '¡2 таблицы и б фотографий.

Список литературы насчитывает 228 источников, из ¡ссто-ах 60 иностранных.

I. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ I.I. Материалы я метода

Исследования проводил!' в 1931-1991 годах на кафедрах изоотолок.и и микробиологии, терапии и • bi ни ческой диагност с патологической физиологией Ульяновского сельскс озяЯ-зенного института, а такхе в производственных условиях - в товодческих хозяйствах Ульяновской, КуйбыяевскоЯ областей Татарской ССР.

' Изучение эпизоотологии анаэробной энтеротоксемии свиней становление этиологического фактора заболевания. С .иельв чения особенностей распространения анаэробной энтеротохсе-свиней в хозяйствах различного типа и вняс .ения этиологи-

- б -

ческого фактора заболевания осуществляли клиникс-эпизоотоло-гическое обследование, патологоаиатомические вскрытия, бак.те риологкческие i; токсикологические исследования пагологическо го материала. С отой целью проведено вскрытие 216 трупов новорожденных поросят с подозрением на анаэробную энтеротоксем и исследовано на присутствие возбудигсля 237 прсб естественных субстратов внелней среди.

®ыделекнке культуры подвергались токсикологическому исс дованию з реакции нейтрализации токсина диагностическими тиг специфическими антитоксическими сыворотками.

Выделенные штаммы идентифицировали общепринятыми метода ки по морфолого-тиюсториальным и культурально-биохимическим свойствам.

Зыделенные культуры изучали общепринятыми методами с пс мсцьи определителей Бердки (1936, 1957), Р.А.Циона (19^8"), Н.А.Красильникова <19^9>.

Морфологию бактерий изучали в мазках, изготовленных из 18-часовых культур, окрааенних по Граму.

Биохимические свойства культур изучали общепринятыми мс дани (И.И.Розанов, 1952).

Для определения концентрации бактериальных клеток соответствующие разведения их внеевали (10" \ 10"°) на питательный агар с 0,5/5 глякози в чазки Петри с подсчетом ьыросаих колония после 18-часовой инкубации при температуре 37-38°С при анаэробиозе. 3 отдельных случаях концентрацию бактерлал: ной культуры определяли в сравнении с оптическим стандартом порученным из института им. Л.А.Тарасевича.

Л-я подтверждения птоз Клостридиум перфрингенс выделе: >:ые втамкы посылали s ЗГНКИ эетер/.нар.чых препаратов и pecnyi ликакскуа лаборатория г. Москвы.

Выделение бахт ериофага. Выделение бактериофага проводз по общепринятой методике из различных нате лалов, подозрева ci ¡их з содержании возбудителя с ¡аопобноП энтеротоксемии cbhi кз сточных вод свиновод-еских комплексов, каловых масс и по

Для выделения бактериофага плотные материалы измельчал: и растирали j стерильной ступке до получения кааицеобразной касс«, которую затем помечали в колбу я тщательно размешива

с десятикратным количеством концентр»роЕанного кясо-пептон-ного бульона.

Менее плотные материалы сметизали с бульоном без предварительного растирания. Воду, кочу, навознуо жижу и другие жидкие материалы смевивали с концентрированным бульоном. На IG0 мл исследуемого материала брали 30 мл концентрированного бульона. Реакция среды выявляли раствором углекислой содц, рН - 0,0.

Выделение бактериофагов из сточных вод свиноводческих комплексов (й.Д.Эрелль, 1935; ¡4 .Адаме, 1961). К 450 мл сточной воды добавляли 50 мл концентрированного иясо-пептон-ного бульона и 5 мл '»-часовой культуры Клостридиун перфгмнгенс. Флаконы ставили в микроанаэростаты под давлением мм рт.ст. и инкубировали при 37°С в течение 13 часов. После этого смесь фильтровал;, скачала через вату, а затем через асбестозыЯ сте» рилизуетий фильтр "С$". Фильтрат исследовали кр содержание фага с использованием следующих методов:

1. В три пробирки с регеиярирогоинсЯ ерзд Т Китт-Тароцци вносили по ОД мл -Ч-чассвсй культуру, использованной д.'л обогащения пробы води. В первую пробирку вносили 0,1 мл фильтрата, во вторуя - 0„2 мл и э третья - 0,5 кл. В контрольную прс-Зирку - только ОД мл культуры. Пробирки помогали в термостат ipn 45-'1J°C и следили за появлением мути з контрольно.'! пробир-:е. Фиксировали наличие или отсутствие лигиса в опытных ггро-»ирках о фильтратом.

2. На пластинку с 2/' агара и 0,5;? глккозы наносили ло.иоо-:и ¿(-часовой культуры дтамма, использованного обогрей:;: робы, и подсривал1- Чапки помецог.; з микроанаэростаты и ин-убиронали прл 37°С в течек 18 часов. Лизно фиксировали на естах нанесения капель фильтрата.

3. I мл испытуемого фильтрата засевали методом Гр*чиа о спользовышем культура, примененной для обогащения. Четки и ¡г— убировали в микроанаэростат-ах npi 37сС, после чего учитывали игачяе негативных колоний; ......

Выделение бактериофагов из каловых масс (Ф.Д.Эралль, 1935; ,Адаме, IS6I). На I часть материала добавляли 20 мл ci ,риль-iro физиологического раствора, тпательно размепнвали, добаь-

ляли 2 мл концентрфованного бульона и 0,? мл 4-часовой куль, тура. Флаконы ставили ъ микроанаэростаты и инкубировали при 37°С в течение 18 часоз. После инкубирования смесь фильтровали визе описанным методом. Фильтрат исследовали на присутствие бактериофага.

'Виделение бактериофага'из почвы (Ф.Д.Эрелль, 1945). I часть почвы растворяли в 20 ил стерильного физиологического раствора. К полученной суспензии добавляли 2 мл концентрированного бульона и 0,2 мл 4-часовой культуры И инкубировали при 37°С в кякроанаэростате. На второй день содержимое флаконов фильтровали и исследовали выпеописанными методами.

Во всех случаях отсутствие роста или более слабый'рост индикаторных культур в У,ПП5 в пробирках по сравнению с контролем, а также наличие зон лизиса принимал) как свидетельство присутствия специфического сактериофага, который в даль нейсем подвергал! пассированию на соответствующих тест-культурах.

Чистые линии бактериофага получали высевок на агаровые пластинки по методу Грация с таким расчетом, чтобы образовались отдельные свободно расположенные колонии (НХ) фага.

Отдельные негативные колонии фага переносили с агара с помоцью бактерюлоги ческой иглы (петли) в пробирку с МППБ. Затем из этого бульона сразу ке или после выдержки в термос: те в течение 8 часов проводили повторные Еысевы с целью пол^ чония негативных колоний фага.

Такие манипуляции повторяли 10-18 раз, после чего очиш н«й штамм фага размножали на МППБ на соответствующих индикач ных к,,льтурах в необходимых количествах.

Изучение явления лизогении культур Клостридиум перфрин-гене. Лизогении птаммов Клострдаум перфрингенс изучали нес1 кими методами:

I. Рассев культур методом Грациа (двуслойный агар). И< пытали питательные среды, содс.тгие различные концентрации гдшеезы, при этом выбр-та следующий режим постановки опыта: на подсушенные чааки с 2#-ным мясо-пептонным агаром, содержг ын 0,5% г: ;коза, наносили 4 мл 0,7^-ного мясо-пептонного а1 ра, расплавленного и охлазденного до 50°С, куда вносили I м.

-часовой культуры исследуемого итамма. Верхний слой распре-,еляли розно и чааки оставляли в горизонтальном положении :ри 37°С в микроанаэростате при давлении 400 мм рт.ст. По" стечении 18 часов чашки тщательно обследовали на наличие егатиЕных колоний.

2. Рассев культуры методом Грациа с использованием индй-аторной культуры: по 0,5 мл исследуемой к индикаторной куль-ур вносили в мл 0,7^-ного расплавленного и охлажденного

0 50сС мясо-пептонного агара и ткательно переиеиизали путем ыстрого вращения про')рки между ладонями. Смесь вливали на оверхность 2^-ного мясо-пептонного агара, содержащего 0.3,1? лпкозы. Инкубировали и просматривали чаяки с использован"я неуказанного метода.'

3. Метод перекрестных культур. К 2^-ному мясо-пептонно-Ч агару перзд разливкой на чашки добавляли 2% гдпкозы,. Чап-

1 просушивали в термостате, предварительно рязгг-фив донце гениальными чернилами. По горизонтали отмечали номер*культур, юеваемых полосками, а по вертикали - номера культур, нано-1мых в виде капель.

Полоски культур наносили петлей шириной 5 мм по б на эдую чайку, Чаяки подсусивали, а затем на каждую полоску 1Нко оттянутой пипеткой наносили по одной капле нести дру-х культур так, чтобы капля ке касалась непосредственно по-ски, а сползала по ней при наклоне чалки. Чайка вновь подвивали и инкубировали при 37°С в течение 13 часоз в вдкро-аоростатах, устанавливая давление 400 мм рт.ст. После ин-бации фиксировали наличие лизиса на местах нанесения капель.

Определение активности пер1'>рингенс-бактеркг','ага. Активность гоз определяли общеприняты!методами: по количеству жизне-эсобных фаговых частиц методом агаровых с - зев по Грациа и хитическсму действию фагов методом Аппельмана.

Метод Аппельмяна. В штатив помевали 14-15.пробирок оди-'оеого диаметра из нейтрального стекла, наливали по 9 мл !о-пептоного печеночного бульона, В перзуа п;. .»бирку граду-»ванной пипеткой вносили I мл испытуемого препарата фага. :ле тщательного перемеоивания I мл смеси новой пипетхо.. пе-юеили в следующую пробирку и т.д. (до получения полного.ряда

десятикратных разведений). Затем во все пробирки, начиная с последнего разведения, вносили по 0,1 мл соответствующей индикаторной культуры возбудителя анаэробной энтеротоксемии свикей, выракепной в мясо-пепюмном бульоне с добавлением 0,5/5 глюкозы. Одновременно индикаторные культуры для контроля вносили в пробирку с бульоном баз фага.

Птатив с пробирками помечали в термостат и результаты титрации учитывали'через каздые 15 минут, через I час с начала опыта по отсутствию помутнения среды в опытных пробирках при наличии типичного роста индикаторных культур в контрольных пробирках. Титром фага считали последнее разведение в котором среда оставалась прозрачной.

¡■'зтол агаровых слоев по 1'рациа. Накануне титраини в чаш ки Петри разливали 1,5;?-ныП МПА с глюкозой в количестве 2530 пл. Чазки, прикрытые стерильны»; бумакхамн, высушивали под бактерицидной лаилоП в течение нескольких часов, а затек закрывали ишаками и в перевернутом виде оставляли па ночь при комнатной температуре для подсупивашш поверхности агар} так как даже незначительное увлажнение может исказить резуль тати количественного учета активности фага. Агар (0,7^-кыя) в количестве 2,5 мл, заранее приготовленный в пробирках, рас платгллли в водяной бане и охлаждали до Исследуемый

фаг в количеств-" I мл помешали в 2,5 мл 0,7/5-ного агара, туг ха впосилч ОД мл зталонноЯ культуры, быстро и тщательно пе-рамеаивали врас;к::ем пробирки кевду ладонями и выливали на поверхность 1,5^-ного агара.

Смесь осторожно распределяли по поверхности агара и чаи ки оставляли на столе в течение 1-1,5 часа, а затем ишсубирс вали ь апаэрсстате при 37°С н давлении ;)00 мм рт.ст. После инкубации в аназростата подсчитывала количество колоний фага и умножали полученное количество на степень разведения.

Например, при исследовании по метод} агаровых слоев в I мл фага и разведении 10~7 к ча^ке было обнаружено 25 коле ¡шй." Следовательно, ти-р фага равен 2,5-Ю"8 (В.Д.Тимаков, Д.М.Гольдфарб, 1962).

Для б.лов точного определения титра фага по методу Гра-киь то же ил? соседнее разведение фага высевали в соответстг

ющих дозах одновременно на 2-3 чалки, а затем подсчитывали обиее количество негативных колоний фага и выводили среднее для одной чайки (с соответствующим пересчетом на взятые разведения).

Титр фага определяли по формуле:

X У »

V х П

'де X - искомый титр 1ага,

У - количество негативных колоний на чалке, I/ - объем высеянного фагопрепалата, П - его разведение.

Изучение морфологии негативных колоний. Морфологию кега-ивных колоний изучали методом Грациа. При этом считывали тепень прозрачности, их фор-1у и диаметр. Изучение морфологии ирионов проводили на микроскопе У ЕЯ-100 с ХП ускоряюцем апряжении 80 киловольт с использованием метода негативного энтрастир^вания фосфорновольфрановой кислотой.

Исследование спектра литической активности. Спектр лити-;ской активности изучаемых бактериофагов определяли путем видения Л!.зосенсибильных птаммоэ методом полосок и методом >ациа.

Исследование терморезистентности (Д.М "ольдфарб, 1961). пытугмнЯ фаг разводили до содержания Ю3 частиц в I мл. По мл этого разведения вносили в пробирки и выдерживали при мпературе 40°, 45°, 50°, 55°, 60°, 65°, 70°, и 80°* С течение 30 минут. Контроле! служил бактериофаг в тол :?е раз-цении, поманенный в термостат при темпера уре 37° С. Как контрольной, так и из каждой опытной пробы брали по г I мл юследовали методом Грациа. Чаикм' инкубировал! в микроана->статах при 37°С и учитывали количество негативных колоний ■.онтроле VI в опыте.

После установления эффективной температуры пробирки с им же разведением фага выдерживали в этих условиях и орали бы в количестве 0,1 мл с интервалом в 5 минут. Опыт повто-

ряли при температуре, превышающей эффективную на 2°С. Затем окончательно устанавливали порог термоинактивации.

'Изучение биологических свойств выделенных бактериофагов.

Адсорбционная способность (М.Адаме, 1961). Определяли время и процент максимальной адсорб'.'ий методом учета количества неадсорбировакного фага. В неотермостат- при 37°С помещали пробирку с 2 мл культуры, разведенной до содержания 2 х 1С микробных тел в I мл и добавляли исследуемый бактериофаг в концентрации 2 х 10® частиц в I мл. Такое же количество бактериофага вносили в 2 мл бульона (контрольная проба). Из опы-Н1й пробирки через каждую минуту брали по 0,1 мл и вносили в 9,9 мл охлажденного на льду бульона.

Разведенные пробы центр1фугировали пр1 5000 оборотах в минуту в течение 5 мин, после чего 0,1 мл верхнего слоя засе. ьали методом Грациа, Время максимальной адсорбции в минутах определяли в той пробе, в которой обнаруживали наименьшее количество негативных колоний.

Для определения процента адсорбции от количества фага в контроле отнимали количество свободного фага. Константу скорости адсорбции определяли по формуле:

К - 2,3 (В х Р0) (Р),

где Р0 - исходное количество фага,.

Р - количество неадсорбированного фага за время, В - концентрация бактерий, выраженная количеством клеток в I мл.

Латентный период (3.Д.Тимагсв, Д.М.Гольдфарб, 1958). При 3'( ' С в пробирку помещали 2 мл культуры в концентрации 2 х 10 микробных тел в I мл (опт-) и 2 мл бульона Кигг-Та-роцци (контроль). В каждую пробирку вносили по 2 мл бактериофага в концентрации 2 х Ю5 частиц в I мл. Через каждые 5 к из опытной пробирки брали 0,1 мл, разводи: I 1:100 и 0,1 мл этого разведения засевали мете, ,ом Грациа. Длительность латег тного периода определяв по пробе, в которой отмечали достоверное увеличение количества негативных колоний по сравнени! с контроле!- .

Урожайность а.М Гольдфарб, 1961). К 2 мл культуры в концентрации 1,1» х Ю5 микробных тел в I мл добавляли 2 мл

бактериофага в концентрации 2 х 10^ частиц в I ил. После адсорбции фага смесь быстро разводили 1:10000, по 0,5 мл конечного разведения разливали в двадцать пробирок и инкубировали в микроана^.остатах в течение времени, соответствующего латентному периоду инкубации изучаемого фага. После этого содержимое каждой пробирки исследовали по методу Грациа.

Вычисление урожайности вели в следу^ем порядке. На каздуп из 20 проб приходи Аэс > 7 микробов (0,35 х 20 с 7). На это число делили общее количество негативных колоний, полученных на 20 чазках.

Концентрирование перфриигенс-бактеркофагсз (М.Адане, 1961). Оптимальное соотношение бактериофага и кyльтypJ эталонного штамма засевали методом агаровых слоев. После инкубации верхний слоя осторожно снимали, тщательно растирали в физиологическом растворе и центрифугировали при 5000 оборотах в минуту в течение 15 мин. Полученный препарат центрифугирогахи пр! ?000 оборотах в теченио 30 мин, верхний слоя отсасывал! и 'ентрифугировали при 4000 оборотах в течение мин. Верхний злой сливали, а остаток тщательно растирали в I мл физиодоги-1еского раствора.

Приготовление антифаговых -сывороток (М.Адаме, 1961). ¡Еум кроликам в ушные вены вводили по 5 мл бактерюфага, кок-[ентриро: анного до содержания 5 х 10^ частиц в I мл с трзх-.невными интервалами ■ в течение 21 дня и повторяли цикл имму-■изации через недели. После каждого цикла гчмунизации из сер-ца каждого животного брали 20-25 мл крови, свертывали, декан-ировали сыворотку и центрифугировали при 5300 оборотах з ми-уту в течение 15 мин. Активность кроличьих антисывороток к агам определена по реакции ¡ейтвгли зации, стандартным у.сто-ом по М.Адамсу (1951). '

Оценка диагностической ценности бактериофагов. Ди^чости-гскую ценность перфрингенс-бактериофагов типа А и С для типитии и индикации возбудителей анаэробной онтеротоксемни свя-гй устанавливали опытным путем в условиях яа^эраторк.. на |дкой и плотной питательных средах.

Для типизации выделенных культур использовали сред. Китт-фоцци и метод полосок на мясо-пептокном кровяном агаре по

Цс-йсляру. Для индикации возбудителя анаэробной энтеротоксе-мии свиней в патологическом материале и других естественних субстратах использовали метод агаровых слоев по Грациа.

'Типизацию и индикацию возбудителей анаэробной энтероток семпи свиней проводили согласно временному наставлению по применению диагностического бактериофага Клостридиум перф-рингенс типов А и С, утвержденному главным управлением ветеринарии при Государственной комиссии Совета Министров СССР по продовольствию и закупкам от 10 июля 1990сода.

Оценка лечебно-лрсфклактической эффективности бактерио-йага Клостридиум пзрфрингенс типа С. Исследование проводили в диагностической лаборатории курса клинической диагностики ветеринарного факультета УСХИ на 54 новорожденных поросятах, полученных от клинически здоровых свиноматок из благополучны по анаэробной энтеротоксемии хозяйств. До постановки опыта была установлена заражающая доза культур Клостридиум перфрин гене типа С, что составило 8 мл культуры на казеиновой среде с добавлением 0,5% глюкозы при восьмичасовом росте в концентрации I млрд микробных клеток в I мл.

Для этих целей создали 2 группы поросят. I группа состс ла из 9 подгрупп по 3 головы в каждой - для установления прс филактичзской эффектавности бактериофага.

Схема испытания профилактического действия фага

Номер : Количество: Фаг 10 мл гоуплы : пороет : пер ос

;Срок заражения пер о< ¡культурой Клостридиу» :перфрингенс типа С ■:после дачи фага, ч

1

2 з-

5

6

7

8 9

3

3 3 3

3 3 3 3

+

+

+

+

+

+

I? 24 36 ■48 60 72 84

2 группа поросят была скомплектована аналогачно для установления лечебной оффектизнооти препарата.

Схема испытан' т лечебного действия фага

Номер группы

Количество поросят

:Заражение поросят :Срок введения :культурой Клоетри-:Ю мл фага :диум перфринг.нс :после заряже-:.лна С 8 мл, пев ос:ния, ч •

1

2

1

5

6

7

8 9

3

3 3 3 3 3 3 3

1

2 3 И

5

6 7

Содержание и кормление в обеих группах были равноценны. Корм давали 5 раз в сутки (молочная смесь"Малыз:"). Опыты ставили на поросятах до'получения ими молозива.

Наблюдение за всеми животными велось"В течение 5 дней» Методика изготовления ГОД Формолвакиина и фагслнзат-гак-диь'и против аиааробной зятеротоксекпн свинзЧ.'Изготовлен;:с закцины осуществляли по методике, описанной В.К.Соломаткным '1973) с некоторыми изменениями и добавлениями: выраливаниэ :ультуры Клостридиум перфрингене типа С проводили в течение I часов. Фаголизат-вакцину г^тозили < добавлением 10$ бяктери-фага в кокц нтрадии 10"®, после 8-часового роста культуры, родолкительность действия бактериофага составила 2,5 часа е словиях термостата при температуре 37°С.

. Оценку эффективности предлагаемых препаратов проводили свиноводческих хозяйствах, неблагополучных по аназр 5ноП нтеротоксемии.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ.ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Изучение эпизоотологии анаэробной энтеротоксемик свиней и установление этиологического фактора заболевания

На основе комплекса клинически ., эпизоотологических, па-тологоанатомичзсклх, бактср! о логических и токсикологических исследования установлено, что анаэробная энтеротоксемия свине1 имеет б ряде хозяйств зоны Среднего Поволжья довольно широкое распространение, особенно в крупных свиноводческих комплексах (табл. 2.1 Л).

В- последнем случае это определяется более благоприятными условиями проявления и развития инфекционного процесса (большая концентрация животных на ограниченных площадях, отсутствие естественных условий обитания, несбалансированность рациона кермлония, неудовлетвор1телышй микроклимат. И как следствие - снижение естественной резистентности, возможность более длительного сохранения возбудителя во внешней среде).

2.1.1. Данные о частоте ваделяемости возбудителя анаэробной энтерохоксемии из субстратов внешней среды и органов павших поросят в оазличных свиноводческих хозяйствах Ульяновской, Куйбюевской областей и Татарской ССР

Название материала

:Ь«делс: :

К-во :но кулсОтнесены к типу:и.™_„

и сел. :тур Йл:-:"еток

проб ¡перфри: « : р .сиген

гнгенс : " : °

:ныб

I , Органы паввих .. спросят (содержимое кисеч-

ника, орыхеечные л/узлы) 216 ¿59/20 - 207 52

2.Субстраты внепнеп среды (сточные воды, каловые массы, почва) 287 97 37 60

Из таблицы явствуе., что частота выделения Клостридиум по рф ринге не в -соледуемых источниках сравнительно высокая. Пр стом наиболызий удельный вес падает на выделение Клостридиум перфрингенс типа С.

В то кэ время следует отметить, что из органов паг'нх поросят наряду с возбудителем анаэробной энтеротоксгмии в ряде случаев выделяли и знтеро-патогенный итамм ¿. ■

Анализ результатов исследований также показал, что ведущим этиологическим фактором анаэробной энтеротоксемии свиней является Клостридиум перфрингенс типа С.

Анализируя напи и литературные данкы' (§ильд и Гибеон, [955; Сент Иваньи, Сабо, 1951; Берне и Мун, 1954; Катич, 1965; (оч, 1965; Моттиос и др., 1968; Ф.И.Каган я З.И.Солсматин, [966, Г971, 1972 ) по частоте выделения Клостридиум перфрингенс разных типов при анаэробной энтеротоксемии свиней, моя-ю считать, что Клостридиум перфрингеяг типа С является <"пе-(ифическим возбудителем этого заболевания.

2.2. Выделение бактериофагов Клостридиум перфрингенс из различных субстратов я из учение явления ли ? огеник

Несмотря на установленную в на^их исследованиях значп-'ельнуи распространенность возбудитзля анаэробной онтероток-:емии свинств различных естественных субстратах, Еыделзпие юрфрингеш,-фагов оказалось достаточно слокгоя задачей, труд-ость решения которой обуславливалась прзхде зеего биологичзе-ими особенностями зтих микроорганизмов. Этим з определенной тепени и можно объяснить то обстоятельство, что сведения о актериофагах, активных в отношении Клостридиум перфрингенс, граничиваются единичными сообаежями.

Результаты напих исследований показали, что перфрннгене-аги выделяются из многих естественных источников (табл.2.2.1). сего из 287 проб естественных субстратов выделечо ЮЗ пзе-1та пер^рин^^.нс-фагов различных типов.

2.2.1. Частота выделения перТ'рннгенс-фагоз различных типов из разных естественных субстратов

(сследуеиые

1сточники .'ф'-»1

Перфрингенс-фаги типов

всего: д.:всего: % :всего: % :вс^го: %

9 : 10

I.Сточные |ды свиновод.

13япств 101 б , 5,9 ЪН 33,7

5

б

Продолжение табл.2.2.1.

3 : 4

6 : 7 : 8 : 9 : Ю

2. Фека- _ лии свиней 76

3. Почза с территории свиновод, хозяйств 40

4. Культуры Клостридиум перфрянгенс 70

5 б.б

10 25,0 -

- 24 31,6 -

2,5

Итого

9 12,9 2 2,9 И 15,7 I 1,4 287 30 10,4 2 0,7 70 24,4 I 0,3

Анализ данных таблицы свидетельствует, что частота внде-летя пзрфрингенг-фагоз находится в зависимости как от их типа, тале и вида источника выделения. Например, перфрингенс-фаг таги. С выделен из сточных вод в 33,7;«, типа А - 5,9$ случаев, из экскрементов свиней эти показатели соответственно равны 31,6 и 5,6?. Обращал на себя внимание тот факт, что Клос-тридиум перфрингонс типа А наиболее часто выделяется из почвы терр;;тор!И свиноводческих хозяйств и летних лагерей - 25/?. Частоте, выделения бактериофага Клостридиум пер5рингенс типов В ;; Д по сравнения с таковой других типов фагов была наименьшей г, состагила соответственно 2,9 и 1,4$, причем единственным источником их выделения была культура Клостридиум перфрин Г'-че, что указывает на незначительную роль в эпизоотологии анаэрошой антеротоксеши возбудителя Клостр1диум перфринганс отих типов.

Обобщая результаты отих исследований, необходимо подчеркнуть, что наибольший процент выделения бактериофагов падает на перфрингенс-фаг типа С.

При изучении явления лизоюиж* у культур Клостридиум пер фр:нгенс 7Становлено, ч о подавляющее большинство их является лигогенными - '3 из 39 культур, что составляет 58,9$. Однако псрфоингенс-^ага, выделенные из лизогенных культур, отличалис: узким диапазонои литического действия, то есть лизировали тол!

ко те штаммы из которых они'были выделены, С другой стороны, такие фаги могли быть уопепно использованы пр1 фаготияизации культур Клострчдну« перфрингенс, что очень важно при эпизоото-логическом обследовании хозяйств («//.^-¿/ь л. к'с&аь»/ , 1949; Н.Я.Сирбиладзе, 1958 и др.).

Электронномикроскопическое исследование морфологии вири-онов перфрингенс-фагов показала, что они имеет булавовидную форму и состоят из головки и хвостового отростка. Эта форма является наиболее распространенной. В то же время наблидались и фаги, не имевшие хвостового отростка.

2.3. Дитическая активность и типоспецифичность выделенных пзрфрингенс-фагов

При изучении особенностей проявления лнтического действия перфрингенс-чфагов использовали различные питательные среды (МППБ, 1,5^-ний МПА и пластинчатый кровяной агар). Исследованиями установлено,' что всо взятые в опыт перфринген'с-фагд типов А и С проявляли на этих средах выраженнув литическуа активность в отношении тест-культур.

С целью выявления специфичности литического действия выделенных штаммов использовали 80 музейных и 60 эпизоотических атамнов (табл. 2.3.1).

2.3.1. Специфичность литического действия перфринге нс-фагов

• Пер}рингенс-<!:ап1 типов

Вид IКол-во

микроорганизмов :птаммов .. л .о

т всего : %■ • всего : %

Кл.перфрин.'енс типа А Кл,перфрингенс типа С Кл.путрификус Кл.септикун

30 26 89

30 - -' 28 - 93

10 - - - _ 10

Как видно из таблицы, пер$р(нгенс-< гги визировали только гомологичные культуры. Если перфрингенс-фаг типа А лавировал 89% культур, то тип С - 93$.

В опыт по изучении типоспецифичности литического действия перфрингенс-фагов было взято 40 музейных и 60 эпизоотических штаммов Клостридиум перфрингено. Оказалось, что пер-фрингенс-фаги лизировали только и-ямкы своего типа (табл. 2.3.2).

2.3.2. Типиспецифичность литического действия перфрингенс-

фагов

Перфри нгенс-фаги

Культуры Клостридиум перфрингенс

типы

кол-во штаммов

В

С

Д

всего;

;лизи-

рова-но

всего;й13И ;всего;лизи ;всего;лизи-всего-рова:всего:рова:вссго:рова-

:но : :но : :но

40 -. 40

10

40

3 40

10

I

На основании результатов исследования типоспецифичности литического действия выделенные перфрингенс-фагм подразделены на 3 группы. I) характеризующееся строгой типоспецифич-ностьв (8 штаммов); 2) обладающие ограниченной типоспецифпч-ностыо (20 втанмов); 3) не проявляющие типоспецифичности (9 итаммов).

Все это позволило в соответствии с требованиями, гредъ-являемыми к производственниц птаммаы, целенаправлено селекционировать те перфрингенс-фаги, которые проявляли наибольшую лита ческу» активность в отнолении возбудителей анаэробной эн-теротоксемии свиней.

2.'*. Адсорбция, длительность латентного пегиода развития и урожайность перфрингенс-фагов

Адсорбционные свойства бактериофагов представляет собой, как известно, важный этап взаимодействия их с бактериальным хозяином. В паиих исследованиях в течение 5-иипутного контакта адсорбировалось 89^ фаговых частиц группы АД5-С-1 и 95$ группы АД$-А-5. Наименьпая адсорбционная активность отмечалась у штаммов АД1-А-5 и АД$-С-8, однако такое различив к^ж-ду штаммами находилось на грани первого уровня достоверности 0,05).

Значительное отличие бактер)офап1 этих типов имели и по продолжительности латентного периода, а также по урожайности (табл. 2.4.1).

2.4.1. Латентный период внутриклеточного развития и урожайность перфршгекс-фагов

Фаги

Латентный период внутри клеточного развития, мин

Урожайность фага на одну инфицированную бактериальную клетку, кор_пускул_

АД1-А-5 25-30 160-180

АДФ-А-Ю чо-ьг 120-161

А|Ф-А-14 50-52 100-128

АДФ-А-15 36-39 - 105-107

АД5-С-1 37-39 233-239

АДФ-С-4 54-56 150-175

АД5-С-8 62-65 110-140

АЙ-С-Ю 70-72 140-195

Анализ данных таблицы свидетельствует, что наиболее коротким перю^сн внутриклеточного развития отличались бактериофаги типа АД5-С-1 и АД5-А-5 - соответственно 37-39 и 25-30 ш.нут. Характерно, что фзгк этих типов проявил! наибольшую урожайность на одну бактериальную истку. Згот показатель у них б'-л равен соответственно 233-239 и 150-1СО корпускул.

Таким образом, определением параметров в системе "фаг-клетка" выявлено, что наилучшими репродуктивный свойствами

обладали селекционированные нами ытам у перфрингенс-фагов АДФ-С-1 и АДФ-А-5, характер1зуюп;иеся и коротким периодом внутриклеточного развития.

Эти отличительные особенности указанный выше фагов и определили возможность использования их в дальнейших исследованиях по конструированию диагностических и лечебно-профилактических препаратов.

2.5. Отношение перфрингенс-фагов к термическим и и химическим факторам

Следует прежде всего отметить, что вопрос влияния различных факторов на биологические свойства перфрингенс-фагов не был предметом специального исследования. В наших опытах в качестве факторов инактивации было использовано тепловое воздействие и влияние различных антисептиков (фенол, формалин и мертиолят),

В процессе исследования были выявлены нижние и верхние пороги термоинактивации бактериофагов (табл. 2.5.1).

2.5.1. Порога термоинактивации перфринге нс-фагов

Штаммы

Пороги термоинактивации, град.

фагов НИЖНИЙ верхний

АДФ-А-5 . 56 71

АДФ-А-Ю 64 69

АДФ-А-14 62 69

АДФ-А-15 60 69

АДФ-С-1 60 69

АДФ-С-4 54 59

АДФ-С-8 64 73

АДФ-С-Ю 64 70

Из данных таблицы видно, что показатели нижнего и верхнего порога термоинактивации птамма А1Ф-С-1 и АД^-А-5, которые были отобраны нами как наиболее активные по проявлению литичес-кого действия и урожайности, составили соответственно 60 и 69,

56 и 71 °С. Необходимо подчеркнуть, что ¡эти штаммы фагою не уступают другим итаммам фагов как по верхнему, так и по нижнему порогу термоинактивации (Р70.05).

Из всех испытанных антисептиков, наиболее пригодными для консервирования указанных выше фагов при сохранении их биологических свойств (5 лет наблюдения) оказался мертиолят в разведении 1ЛОООО (0,0Ш.

Примечательно, что этот препарат в 0,01$-ной концентрации был успеано применен и для консервирования бактериофагов других видов микроорганизмов (С.П.Заева, 1945: Ю.А.Арутюнов, 1965; Н.Ф.Быстрый, 1971; С.В.Ленев, 1988).

2.6. Антигенные и серологические свойства пзрфрингенс-фагоз

Результаты исследований, проведенных в этом направлении, показали, что перфрингенс-фаги АДФ-С-1 и АД5-А-5 обладали хорошо выраженными антигенными свойствами. При иммунизации кроликов обеспечивали образование фагонейтралнзуодих антител в достаточно высоких титрах (1:3200).

Нейтрализующая активность антисывороток, полученных к пэрфрингенс-фагам вьяеуказанных типов, составляла соответственно 98,8 и 98$ уже после 5-минутного контакта фага с антисывороткой. По этому показателю птаммы АДФ-С-1 и АДФ-А-5 достоверно отличались от других итаимов этого типа (Р^ 0,010,001).

Данные перекрестных реакций перфрингенс-фагов АД5-С-1 и АДФ-А-5 с гомологичными и гетерологичными сывороткам- свиде-• тельствуют о том, что эти фаги являются обособленными серологическими типами, не вступающими в перекрестную реакцию с антисыворотками других типов.

2.7. Использование"перфсингенс-фагоп для индикации и типизации возбудителей анаэробной энтеротоксемии СЕинея

Для индикации возбудителя инфекции применяли реакцию нарастания титра фага - Р.Н.Ф. (В.Ф.Тикаков, Д.И.Гольдфарб, 1962). Сущность метода состоит в том; что при наличии в- материале • искомого возбудителя добавленный к ней гомологичный фаг, воту-

-гч -

пая во взаимодействие с возбудителем, размножается, т.е. происходит увеличение его концентрации, что указывает на прюутствие возбудителя.

Исследование проводили при искусственной контаминации с использованием индикаторного бактериофага АДФ-С-1 и эталонной культуры Клостиридиум перфрингенс С ВТ. Всего проведено 45 опытов.

Применение Р.Н.Ф. для индикации возбудителя анаэробной знтеротоксемии свиней в патологическом материале от павших поросят и в других естественных субстратах показало, что этот метод дает возможность выявлять сравнительно небольшое количество клеток (ЮООО) и при этом в течение относительно короткого периода времени без выделения чистой культуры.

Учитывая достаточно высокую чувствительность и специфичность Р.Н.Ф., следует полагать, что этот метод может быть успешно использован при окспресс-диагностике анаэробной знтеротоксемии свиней.

Обобщая наши и результаты других исследований по использованию зтой реакции для индикации различного вида микроорганизмов, например возбудителя сибирской язвы (Я.Е.Коляков,

B.Г.Байрак, 1962), паратифа (В.И.Кузнецова, 1969; В.Ф.Ганви-кин, 1984), можно говорить о определенной универсальности этого метода диагностики инфекционных болезней.

Для установлемя типовой принадлежности возбудителя анаэробной знтеротоксемии свиней применяли различные питательные среды - жидкую (Китт-Тароцци) и плотную (глюкозно-кровяной агар) среди, а тысже двухолойный агар (по Грациа). При этом использовали 100 культур Клостридиум перфрингенс типов А, В,

C, 1 и бактерюфаги АДФ-С-1 и АДФ-А-5. Во всех случаях были получены положительные результаты. Например, в опыте с применением перфрингенс-фагов типа А и С наблюдался лизис только гомологичных культур (п - 40).

Испытание, проведенные центральной лабораторией ГУВ СССР и в ВГККИ ветеринарных препаратов, подтвердили пр!годность пер-фрингенс-фагов А и'С для типизации .культур Клостридиум перф-рингено (акт от 24 мая 1989 г.). Все это дало возможность рекомендовать эти фаги д*я типизации возбудителя анаэробной эн-

теротоксемии свиней ("Методические указания по типизации возбудителей анаэробной энтеротоксекии свиней типоспецифически-ки (индикаторными) бактериофагами Клостридиум перфрингенс типов А и. С" (АДФ-А и АДФ-С) утвержден« ГУВ СССР 10 июля 1990 г.).

2.8 Изыскание лечебно-профилактического бактериофага и испытание е^э эффективности при анаэробной энтеротоксеичи свиней

Из всех выделенных перфрингенс-фагов был отобран птамм фага АДФ-С-1, как обладающий более высокой скоростью репродукции, выраженной адсорбционной способностью, относительно коротким латентным периодом внутриклеточного развития и широким спектором литического действия з отношении эпизоотических птаммов Клостридиум перфрингенс типа С.

Препарат фага перед использованием проверяли на стер»ль-ность и безвредность путем посева на питательные среды СМГТПБ, МПА) и введения подопытным животным.

Лечебно-профилактическую эффективность бактериофага испытывали как в экспер»ментальнцх (комиссионно при участии представителей ГУЗ СССР) условиях на 54 новорожденных поросятах до получения ими молозива, так и непосредственно в свиноводческих хозяйствах, неблагополучных по анаэробной энтеротоксе-мии, на 328 поросятах (табл. 2.8.1).

Из данных таблицы видно, что в группе поросят, получивших бактер<офаг, сохранность была выше на I1б$*по сравнений с контролем.

Результаты применения бактериофага с лечебной целью показали, что высокая сохранность поросят наблюдается лиаь пр) введении бактериофага в первые 2-3 часа пос э заражения.

Сопоставляя данные назих опцтоз с результата!« исследователей (Г.П.Кондратенко, 1950; В.И.Белинсгла.' Р.П.Воронов-, Г.Н.Катошина и др., 1982) по использованию бактериофагов для лечения и профилактики различных зараэних болезней, можно отметить следующуа закономерность: введение фагов в инфицированный организм дает меньиий эффект, чем до заражения.

2.8.1. Эффективность применения бактериофага Клостридкум перфрингенс типа С с профилактической целью при анаэробной энтеротоксекии свиней

Наименование хозяйства

Опоросилось¡Получено: Способ и доза свиноматок :поросят : назначения

: : бактериофага

Сохранность поросят к 7-днев-ноиу возрасту_

Всего : % сохранена I свино-: ности : матку

Учхоз Ульяновского СХИ

Опытная I5

Контрольная 10

Совхоз "Хмелевский"

Опытная 20

Контрольная 10

го £Л

146 Перорально по 1'Ю 96,0 10 мл

103 Однократно 85 82,0

182 169 92.0

94 72 76,0

9.6 8,5

8.4 7.2

Положительные результаты наших исследования послужили основой для разработки "Временного наставления по применении бактерисфапа против анаэробной энтеротокоемии свиней" (Згт-вездено ГУВ СССР в 1991 г.). .

В опытах с использованием кроликов _(п » 12), подсвинков (п = 8) и супоросных свиноматок (п = 20) установлена безвредность препаратов.

С использованием этого штамма были изготовлены ГОА фор-молвакшжа и фаголизат-вакцина. Указанные вакцины обладали выраженными иммуногенмнки свойствами. Так, сыворотка крови 2-кратно иммунизированных ГОЛ вакциной свиноматок содержала антитоксические антитела 0,8 А.Е в I ем3, т.е. нейтрализовала 80 МСЛ токсина Клостридиум перфршгенс типа С. В сыворотке крови свиноматок, привитых фаголизат-вакциной, эти показатели были соответственно равны 0,9 А.Е и 90 МСД.'Сыворотка крови поросят, полученных от иммунизированных ГОЛ фор-молвашшой и фаголиэат-вакциной, содержали 0,3!1 А.Е в I сн", т.е. в обоих случаях наблюдался колостералышй иммунитет одинаковой напряженности.

2.9. Изготовление и сравнительное изучение эффективности ГОА вакцин» и оаголизат-вакцины против анаэробной аитеротоксемии

свиней

Для конструирования вакцин был отобран токсигенный атамм Клостидиум перфрингеис типа С, выделенный от поросят, павяих от анаэробной оитеротоксснли. Указанный птанм в дальнейшем после всестороннего изучения его биологических свойстт получил как производственный чтакм наименование С-3' й ьоаел в коллекция культур михреорганкэмоэ в ВГ1И1.

2.9.1. Розультэ.ты испытания опытной серп» ГОА формолвакшша и фаголизат-вакцяни против анаэробной знтерй'токсекйЬг сеи"сЯ в свинокомплексе совхоза "Россия" :

Испытание опытных а ер.! а вакцин в условиях неблагополучного хозяйства по анаэробной энтеротокоемии свиней такке показало их сравнительно'высокую эффективность (табл.2.9.1.1).

2.9.1.1. Результаты испытания опытной серий ГОА формолвакцини.и фаголизат-вакцины против анаэробной энтеротоксемии свиней в свинокомплексе совхоза "Россия" Ульяновского района Ульяновской области

Сохранность поросят ¡с„.ноя к^отгему _;^яя

Название ¡Количество биопрепарата ¡опоросившихся свиноматок

Получено ¡Сохранность поросят к поросят : 7-дневному возрасту

всего

;на I :свино-: матку

.раннос-.маТку

-г живая

еох •яа I :масса, Есего ;свино ¡ кг

:ти:маТКУ:

Фаголизат-вакцина

ГОА вакцина

Контрольная группа (без вакцины

Ктость

1« 185

10

1468 10.4 1906 10,5

104 10,4 0+0,1

1342 1820

91 95

9,5 9,4

1204 1563

82 82

8,5 8,4

6,47 6,49

85 82 8,5 9+13 1,0-0.«

го

со

61 60 6,1 5,67

2? 2,4-2,3 0,8-0,8

2.9.1.2. Результаты применения вакцины против анаэробной энтеротоксемии СЕИней

Название хозяйства и группы

:Количест-:во опоро-¡сившихся :СБИнома-:ток

Получено Сохранность поросят к: Сохранность поросят к поросят : 7-дневному возрасту :_отъему

•.Средняя :жигая

всего :на I : всего сох-:на I : всего 'Л сохран-:на I :масса, :свино-: :раннос:сЕино-: -< :ности :свино- : кг

:матку : :ти :матку : : :матку :

Учхоз Ульяновского СХИ

Опытная 90 948

Контрольная 20 207

Совхоз "Россия"

Опытная 1706 I596I

■ Контрольная 44 469

10,5 10,5

375 163

9,3 14990 10,6 385

92,3 78,7

93,9 82

9,7 8,0

794 144

83,7 69,6

8,7 13812 82,8 8,75 280 59,7

8,8 7.1

7,74 6,36

б,66 6,15

6,58 5,67

I

О*

I

Разность

11,2-13,6

14,1-23,1

0,51-0,91

Сохранность поросят, привитых этим/ вакцинами, била на 22% выше, чем в контроле.

После получения положительных результатов по использованию опытных сер!й препаратов был налажен производственный выпуск (Краснодарская биофабрика)'Г0А формолвакцины. Испытанием этой вакцины в условиях хозяйств/на свинокомплексах выявлены достаточно высокие её иммуно^нные свойства (табл.2.9.1.2).

2.0.2. Результаты прженения вакцины

Как вытекает из данных таблицы, сохранность поросят к 7-дневному возрасту и к отъему была выше по сравнению с контролем соответственно на 12,4 и 18,6$.

ГУЗ СССР утвердил в 1989 году "Наставление по применению вакцины против энтеротоксемии свиней".

Только за 1989-90 гг. в свиноводческих хозяйствах различных районов Ульяновской области этой вакциной привито 44226 супоросных свиноматок.

В заключение следует отметит, что применение ГОА формолвакцины в неблагополучных по анаэробной энтеротоксемии хозяйствах дает существенный экономический эффект (на I руб. затрат 6,31 руб.).

3. ВЫВОДЫ

I. Разработаны научно-практические основы оптимизации выделения и сел :щии наиболее активных штаммов фагов Клост-ридиум перфрингенс, возбудителей анаэробной энтеротоксемии свиней, и создания диагностических и лечебно-профилактических препаратов при этой инфекции.

'2. Установлено значительное распространение анаэробной энтеротоксемии свиней в хозяйствах зоны Среднего Поволжья, что .подтверждает и дополняет сведения о её значении в патологии сельскохозяйственных животных и определяет необходимость усовершенствования методов диагностики, профилактики и лечения.

3. При комплексно« исследовании хозяйств с оазличной технологией выявлена наибольшая заболеваемость животных в условиях крупных специализированных свиноводческих комплексов.

Заболевание не имеет выраженной сезонности и в основном совпадает с периодом массовых опоросов.

Ведущим фактором в этиологии анаэробной энтеротоксемии поросят является Клостридиум перфрингенс типа С, получивший впоследствии название в коллекции микроорганизмов в ВГНКИ ветеринарных препаратов как С-3, отвечашеий требованиям производственных штаммов и иопользуемый в дальнейшем пр) изготовлении вакцин.

5. Выделенные из патологического материала павлих от анаэробной энтеротоксемии поросят и других естественных субстратов итаммы Клостридиум пзрфрингенс (326) характеризуются выраженными морфологическими и культуральнс-биохимическими свойствами, типичными для представителей этого рода микроорганизмов.

6. При исследовани!1 337 различных субстратов выделено 103 изолята пер|>рингенс-фагов, отличающихся неодинаковой ли-тической активностью и морфологической неоднородностью.

7. При изучении биологических свойств выделенных перф-рингенс-фагов (103) селекционированы 8 ытаммоа фагов. Из них ?. фага - АДФ-А-5 и АДФ-С-1 - отличаются от других фагов более активным взаимодействием с бактер1альным хозяином, коротким латентным перл од ом (35-39 мин), сравнительно высокой урожай-кость» (160-239 корпускул/мл) и отвечают требованиям производственных штаммов.

8. Пер{>р1нгенс-фаги АДФ-А-5 и АДФ-С-1 обладают выраженными антигенными свойствами, при иммунизации кроликов образуют фагоиеятралкзувяие антитела в достаточно высоких титрах (1:3200) и представляют собой обособленные серологические типы.

9. Обоснована возиожность использования перфрингенс-фагов СШ>-А-5 и АДЬ-С-1) для экспресс-диагностики анаэробной энтеротоксемии свинеа о выделением чистой куль.уры и без выделения её по реакции нарастания титра фага (Р.Н.Ф.). Указанные псрфрингенс-фаги особую ценность представляют для диффе,энии-ацми различных типов Клостридиум перфриигенс.

10. В эксперименте и в производственных условиях на новорожденных поросятах в неблагополучных хозяйствах по анаэробной эзтеротоксекли свиней установлена профилактическая оффектив-

ность фага АДФ-С-1 - повышение сохранности поросят до 25$.

11. Из выделенных культур Клостридиум перфрингенс типа 'С'сконструированы формол-гидроокисьалвминиевая и фаголизат-

вакцины. При производственном испытании установлена их безвредность и профилактическая эффективность. От вакцинированных свиноматок сохранность поросят была выше на 13-23%.

12. Сыворотка крови "иммунизированных формол-гидроокись-алюминиевой вакциной и фаголизат-вакциной животных обладает значительной нейтрализующей активностью к токсину Клостридиум перфрингенс типа С. У свиноматок й поросят этот показатель составляет соответственно 0,83; 0,90 и 0,34 А.Е.

13. Экономическая эффективность применения вакцины против анаэробной энтеротоксемии свиней составляет 6,31 руб. на I руб. затрат.

Практические предложения

1. Рекомендуем типоспецифические (индикаторные) бактериофаги Клостридиум перфрингенс типов А и С для типизации возбудителя анаэробной энтеротоксемии свиней.

ГУБ СССР в 1991 году утверждены "Методические указания по типизации возбудителя анаэробной энтеротоксемии свиней типрспецифи чески ми (индикаторными) бактериофагами Клостр1ди-ум перфрингенс типов А и С".

2. Для профилактики и терапии анаэробной энтеротоксемии свиней предлагав-■ бактериофаг Клострщиум пер1>р1нгенс типа С.

ГУБ СССР в 1991 году утверждено "Временное наставление по применении бактериофага против анаэробной энтеротоксемии свиней.

3. В целях специфической профилактики анаэробной энтеротоксемии свиней.рекомендуем использовать вакцину против энтеротоксемии свиней.

ГУВ СССР в 1991 году утверждено "Наставление по применении вакцины лротив энтеротоксемии свиней".

Список работ, опубликованных по тепе диссертации

1. Хайруллин И.:!. Изучение степени выделения Клостридиум перфрингенс при острых желудочно-кишечных расстройствах у поросят. РЖ ВНИИТЗИ сер. инфекционные болезни животных. 1981, »79-81, с.18.

2. Хайруллин И.Н. Бациллоносительство Клостридиум nepi-р<нгенс у клинически здоровых свиней. РЖ ВНЙИТЭИ сер.Ветеш-нария, 1983, с.41.

3. Хайруллин И.Н., Какурина А.Г. Обсемененность мяса анаэробной микрофлорой //Ветеринария, 1982, S3, с.59.

4. Хайруллин И.Н. Изучение этиологии анаэробной энтеро-токсемии поросят // И АНИЙТЭЙ сер. Ветеринария, 1986, $6, с.30.

5. Хайруллин И.Н. '/лучение некротических и лепиптиназных свойств Клостридиум перфршгенс типа С, выделенных от больных и павпих поросят //К' ВШИТЗИ сер. Ветеринария, 1986, НО,

с.23.

6. Хопруллин И.Н., Улендеев А.И. Применение эмульгированной формолквасцовой вакцины из местных энтеропатогенных итаммов китсчноя палочки при отечной болезни поросят //Новое в краевой патологии сельскохозяйственных животных и птиц: Сб.науч.тр. /Ульяновск, 1986.

7.Хайруллин И.Н. Определение антибиотикочувствительности возбудителя анаэробной энтеротоксемии поросят Клостр1Диум перфрингенс типа С //И ВНИИТЭИ сер. Ветержар'я, 19Б8, '¿9, с.34.

8. Хайруллин И.П., Улендеев А.И. Вакцинопрофилактика отечной болезни поросят //НоЕое в краевой патологии сельскохозяйственных животных и птиц: Сб.науч. тр. /Ульяновск, 1986, с. 9-13.

9. Хайруллин И.Н., Тонков В_Д., Липатов A.M. К вопросу этиологии дизентерии свиней //Методы и средства диагнос.лш, профилактика и лечениз болезней mibothus: Сб.науч.тр. /Ульяновск, 1988, с. 4-6.

10. Бактериофаг анаэробной диагностический Клостридиум перфрингенс типов Д и С. Технические условия. Утв.Главным уп-

равлением ветеринарии СССР в 1990 году.

11. Временная инструкция по изготовлении и контролю бактериофага анаэробного диагностического. Утв. ГУБ СССР в

1990 году.

12. Временные методические указания по типизации возбудителей анаэробной энтеротоксемии свине^типоспецифическими (индикаторными) бактерюфагами К остридиум перфрингенс типа А и С. Утв. ГУВ СССР в 1990 году.

13. Бактериофаг против анаэробной энтеротоксемии свиней. Временное наставление. УТв. ГУВ СССР в 1991 году.

14. Временная инструкция по изготовлению и контролю бактериофага против анаэробной энтеротоксемии свиней.

15. Временное наставление по применению бактериофага против анаэробной энтеротоксемии свиней. Утв. ГУВ СССР в

1991 году.

16. Вакцина против анаэробной энтеротоксемии свиней. Временное наставление. Утв. ГУВ СССР в 1989 году.

17. Инструкция по изготовлению и контролю вакцины против энтеротовсемии свиней. Утв. ГУВ СССР, 1991г.

18. Наставление по применению вакцины против энтеротоксемии свиней..Утв. ГУВ СССР. 1991г.

19. Пгамм анаэробного'бактериофага Клостридиум перфрш-генс типа А. Заявка № 4780072ДЗ-142522 от 22.08.90г. Положительное решение.

20. Штамм анаэробного бактериофага Клостридиум перфр!н-генс типа С. 3. -.вка № 4795169ДЗ-23669 от 24.08.90г. Положительное решение.

21. Анаэробный диагностический фаг Клостридиум перфрин-инс типа С. Заявка № 4618252Д3-144723 от 25.01.91г. Положительное решение.

22. Лечебно-профилактический бактериофаг Клостридиум пер. фрингенс типа С. Заявка К 4827353Д3-056019 от 25.01.91 г.

Положительное решение.

23. Хайруллин И.Н. и др. Плакат "Анаэробная энтеротоксе-мия поросят. Заказ » 2560 УОППО, г. Ульяновск, 1000 экземпляров.

24. Отчет о научно-исследовательской работе "Диагностика, специфическая .профилактика и лечение анаэробной энтеротоксемии свиней". Ульяновск, 1990 г.

/