Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Закономерности изменений уровня неоптерина и некоторых показателей иммунитета у пациентов со злокачественными опухолями

оозоео1вэ

На правах рукописи

РИНЧИНОВ Зорикто Цыбиюкапович

ЗАКОНОМЕРНОСТИ ИЗМЕНЕНИЙ УРОВНЯ НЕОПТЕРИНА И НЕКОТОРЫХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ИММУНИТЕТА У ПАЦИЕНТОВ СО ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫМИ ОПУХОЛЯМИ

14.00.16. - патологическая физиолошя

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

? и май 2007

ЧИТА - 2007

003060169

Работа выполнена в ГОУ ВПО "Читинская государственная медицинская академия Росздрава"

Научный руководитель:

доктор медицинских наук,

профессор Хышиктуев Баир Сергеевич

Официальные оппоненты.

доктор медицинских наук,

профессор Цыбиков Намжил Нанзатович

кандидат медицинских наук Каюков Владимир Александрович

Ведущая организация: ГУ НЦ клинической и экспериментальной медицины СО РАМН (г Новосибирск)

Защита диссертации состоится "J9 " мая 2007 г в 900 часов на заседании диссертационного совета Д 208 118 01 при ГОУ ВПО "Читинская государственная медицинская академия Росздрава" (672090, г Чита, ул Горького, 39а)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО "Чигинс-кая государственная медицинская академия Росздрава"

Автореферат разослан 'У/ " cu^ltuj 2007г

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 208 118 01 кандидат медицинских наук, доцент Í (У'-' " Кузьмина О.В.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. В структуре причин смертности населения по России и в мире онкологическая патология занимает 3-е место после сердечно-сосудистых заболеваний и травм ("Государственный доклад о состоянии здоровья населения Российской Федерации за 2004 год")

С начала 90-х годов XX века в России ежегодно регистрируют более 400 тысяч злокачественных новообразований При этом наблюдается ежегодный рост абсолютного числа больных с впервые установленным диагнозом, что обусловлено не только истинным подъемом заболеваемости, связанным, в том числе и с ухудшением экологической обстановки, качества жизни, постарением населения, но и заметным улучшением выявляемости заболеваний В структуре смертности от онкологических заболеваний около 30% занимают лица трудоспособного возраста Ежегодно в стране более 120 тысяч человек признаются инвалидами по этой причине, что свидетельствует о чрезвычайно высокой значимости ранней диагностики, профилактики и лечения этих заболеваний ("Государственный доклад о состоянии здоровья населения Российской Федерации за 2003 год")

В связи с этим поиск новых методов ранней и дифференциальной диагностики, критериев прогноза злокачественных опухолей, а также установление новых закономерностей, характерных для злокачественного роста, является весьма актуальным В этом плане перспективными выглядят исследования, связанные с изучением неоптеринового статуса В настоящее время нео-птерин рассматривается как маркер активации клеточного иммунитета (Свиридов Е А, Телегина ТА , 2006, Насонов Е JI и соавт, 2000, Орлова О В , Манцаева РБ , Шевченко О П, 2006, Шевченко О П, Олефиренко ГА , Орлова О В , 2000, Murr С et al, 2002) Это связано прежде всего с тем, что измерение биологически более инертного метаболита для дополнительной оценки состояния клеточного звена иммунитета представляет максимальный интерес Особенно акцентируется ют факт, что изменение его концентраций в крови отражает совместное действие различных цитокинов на популяцию моноцитов/макрофагов, стимулированных у-интерфероном (Шевченко О П, Олефиренко ГА , Орлова О В , 2000, Shmkel С et al, 2001) Наряду с интер-фероном-гамма (ИФ-у) фактор некроза опухолей-а (ФНО-а) является мощным костимулятором синтеза неоптерина (Насонов Е Л и соавт, 2000, Barak М , Gruener N, 1991, Henderson D С , Rippm J J , 1995), а экзогенный неопте-рин стимулирует синтез ФНО-а макрофагами (Barak М , Gruener N , 1991) Это особенно важно, учитывая фундаментальную роль ФНО-а в иммунопатологии злокачественного перерождения (Аутеншлюс АН и соавт, 2005, Бабышкина Н Н, 2006, Симбирцев А С , 2004, Рыдловская А В , Симбнрцев

А С, 2005)

Из данных литературы известно, что уровень неотггерина повышается при многих онкологических заболеваниях (раке поджелудочной железы, легких, печени, яичников, молочной железы) (Reibnegger G et al, 1991, Conrad F et al, 1984, Kawasaki H et al, 1988, Lewenhaupt A et al, 2001, Marth С et al, 1994, Murr С et al, 1999, Skog AL et al, 2002, Mehchar В et al, 2006) Наиболее высокие концентрации отмечены у больных с опухолями кроветворной системы - с неходжкинскими лимфомами и множественными миеломами (Свиридов Е А , Телегина ТА, 2005)

Однако, мы не обнаружили работ, в которых бы рассматривались взаимоотношения между уровнем неоптерина и цитокинами, влияющими на его продукцию, и другими показателями - онкомаркерами, факторами неспецифической резистентности при злокачественных новообразованиях

Кроме того, существующие методы определения неотерина - это им-муноферментный, радиоиммунный анализы, а также высокоэффективная жидкостная хроматография, не нашли пока широкого применения в клинической практике вследствие либо своей дороювизны, либо сложности проведения анализа, а также необходимости специфического оборудования и других факторов (Орлова О В , Манцаева Р Б , Шевченко О П , 2006, Свиридов Е А , Те-легинаТА ,2005)

На основании вышеизложенного, нами сформулирована цель исследования- установить закономерности изменений уровня неоптерина и его взаимоотношения с цитокинами (ИФ-у, ФНО-а), системой комплемента, онко-маркером (РЭА) и показателем эндотоксикоза у пациентов со злокачественными новообразованиями

Для достижения поставленной цели последовательно решались следующие задачи-

1 Разработать способ определения неоптерина в сыворотке крови

2 Изучить концентрацию неоптерина у пациентов с раком желудка, толстого кишечника, молочной железы и почки до и после хирургического лечения

3 Исследовать концентрацию цитокинов (ИФ-у, ФНО-а), влияющих на продукцию неоптерина, а также уровень раково-эмбрионального антигена, молекул средней массы, и выявить особенности изменений в комплементарном статусе при злокачественных опухолях

4 Оценить характер корреляционных взаимоотношений между величинами неоптерина, с одной стороны, и значениями цитокинов, раково-эмбриональ-ного антигена, молекул средней массы, параметрами системы комплемента - с другой

Научная новизна. Впервые разработан высокочувствительный ВЭЖХ

метод определения неоптерива в биологических жидкостях с использованием УФ-детектора

Приоритетным в работе является раскрытие закономерностей изменений уровня неоптерина во взаимосвязи с некоторыми показателями иммунитета у пациентов со злокачественными образованиями Установлено, что при онкопатологии желудочно-кишечного тракта наблюдается стимуляция синтеза ФНО-а, приводящая к повышению уровня ИФ-у, который усиливает продукцию неоптерина, что является свидетельством активации клеточного иммунитета Показано, что оперативное лечение рака желудка снижает интенсивность синтеза неоптерина на фоне уменьшения продукции ИФ-у и ФНО-а Хирургическое лечение рака толстого кишечника приводит к усилению ИФ-у-независимого пути синтеза неоптерина При раке молочной железы рост уровня неоптерина обусловлен стимулирующим эффектом, прежде всего, фактора некроза опухолей-а, а после удаления злокачественного очага высокий уровень неоптерина поддерживается за счет активации его синтеза интер-фероном-а Обнаружено, что при раке почки содержание неоптерина не изменяется на фоне повышенной продукции ИФ-у

Теоретическая и практическая значимость. В ходе исследования был проведен сравнительный анализ методов экстракции неоптерина и показана высокая селективность твердофазного способа, что позволяет определять неоптерин с помощью УФ-детектора

Полученные результаты расширили представление о роли нарушений нео-птеринового статуса при злокачественных опухолях, что может быть использовано для разработки способов прогноза и ранней диагностики метастазов при онкологических заболеваниях

Установлено, что у пациентов при всех изученных локализациях злокачественного процесса происходит активация комплемента, главным образом, за счет альтернативного пути Корреляционные взаимосвязи между продукцией неоптерина и показателями системы комплемента носят разнонаправленный характер, однако общими являются отрицательные связи между содержанием неоптерина, с одной стороны, и уровнем С5а и СЗа - с другой

Подана заявка на изобретение "Способ определения неоптерина в крови" №2006106029, приоритет от 26 02 2006

Материалы работы внедрены в учебный процесс на кафедрах биохимии, патологической физиологии

Положения, выносимые на защиту 1 Разработанный метод определения неоптерина является простым, нетрудоемким, чувствительным и воспроизводимым по сравнению с имеющимися аналогичными методами

2 Продукция неоитерина и характер его взаимоотношений с уровнем цитоки-нов (ИФ-у и ФНО-а) определяется локализацией злокачественного процесса Хирургическое лечение онкологических больных оказывает различное влияние на вышеуказанные показатели

3 Изменения комплементарного статуса у пациентов со злокачественными новообразованиями свидетельствуют о преимущественной активации альтернативного пути

Апробация работы. Основные положения диссертации и результаты исследований доложены и обсуждены на V Всероссийской университетской научно-практической конференции молодых ученых и студентов по медицине (Тула, 2006), на X международной конференции "Теоретические проблемы химии поверхности, адсорбции и хроматографии" (Москва - Клязьма, 2006), на совместном заседании кафедр биохимии, нормальной физиологии, патологической физиологии, общей химии Читинской государственной медицинской академии с участием сотрудников НИИ экологии при ГОУ ВПО ЧГМА (Чита, 2007)

Структура н объем работы. Диссертация изложена на 108 страницах машинописного текста, иллюстрирована 7 рисунками и 23 таблицами и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, двух глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 32 отечественных и 166 зарубежных источников

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Клиническая характеристика обследованных групп

Программа исследовании включала ряд этапов, на каждом из которых в соответствии с поставленными задачами обследована необходимая репрезентативная выборка лиц

Характеристика контрольной группы

В контрольную группу вошли 20 человек обоего пота (11 мужчин и 9 женщин), которые по результатам клинического, лабораторного, обследований отнесены к группе здоровых лиц Возрастная амплитуда колебалась в пределах от 19 до 54 лет, при этом средний возраст составлял 34,3 года

Характеристика клинических групп

Клиническая часть работы выполнялась на базе областного онкологического диспансера г Читы в период с 2004 по 2006 гг

Нами обследовано 78 пациентов, страдающих онкологической патологией, из них 31 больной раком желудка (РЖ), 16 - толстого кишечника (РТК), 20 - молочной железы (РМЖ) и 11 - почки (РП) Исследования выполнялись

до и после оперативного лечения

Для установления диагноза и характеристики нозологических форм рака мы пользовались международной классификацией по системе ТЫМ и гистологической классификацией

В группе больных раком желудка (п=31) преобладали мужчины (58,1%) Средний возраст пациентов - 60,6 года Среди них больные с поражением ан-тралыюго отдела органа составили 38,6%, а у 61,4% местом повреждения было тело желудка, причем 66,5% опухолей локализовались в нижней трети Согласно международной классификации распределение пациентов по стадиям злокачественного процесса выглядело следующим образом у 46,7% злокачественное новообразование выявлено на 2-й, а у 53,3% - на стадии За Макроскопическая картина характеризовалась преобладанием язвенно-ин-фильтративной формы Данная форма обнаружена у 26 пациентов (83,9%) По-липовидная форма рака выявлена у 3 пациентов (9,7%), по одному случаю - с блюдцеобразной и грибовидной формами (3,2%) Гистологический тип опухоли у всех обследованных данной группы - аденокарцинома с различной степенью дифференцировки в 79% случаев - умереннодифференцированный, 13% - низкодифференцированный, 8% - высоко дифференцированный

В группе больных раком толстого кишечника (п=16) преобладающее число составляли женщины (56,3%) Средний возраст пациентов - 64,1 года У этих пациентов регистрировались поражения различных отделов ободочной кишки (9 наблюдений - 56,3%) Из них у 4-х патологический процесс локализовался в ее восходящем отделе, у 2-х в области печеночного угла, а в 3-х случаях местом повреждения была сигмовидная кишка Разные участки прямой кишки оказались одинаково чувствительны к возникновеншо опухоли (в 3-х случаях - в среднеампулярном, в 2-х - в ректосигмоидном, в 2-х - в верх-неампулярном отделах) У всех больных злокачественная опухоль обнаружена на стадии 2а (68,8%) и 26 (31,2%) Изучение макропрепаратов позволило сделать следующий вывод чаще всего встречалась язвенно-инфильтратив-ная форма (62,5%) Реже обнаруживался рак других вариаций полиповндная форма выявлена у 3 пациентов (18,8%), грибовидная у 2 (12,5%), циркулярная только у 1 больного (6,2%) Гистологически для опухолей у всех больных характерны аденокарциномы с различной степенью дифференцировки наибольший процент (77%) случаев приходился на умереннодифференцированный рак, меньше всего (6,2%) - на низкодифференцированный, в 16,8% обнаруживались высоко дифференцированные аденокарциномы

В группе больных раком молочной железы (п=20) средний возраст составлял 55,4 года У 11 из них опухолевый процесс выявлен на стадии 2а, у 9 - на стадии 26 Гистологически у всех пациенток диагностирован инфильтри-

рующий протоковый рак

В группу больных раком почки (n=l 1) вошли 9 мужчин (81,2%) и 2 женщины (18,2%) Средний возраст составил 63,7 года У 7 из них выявлена 1 стадия поражения, у 4 пациентов - 2 стадия Гистологическое исследование выявило у всех пораженных почечно-клеточный рак

Диагноз обследованным больным был выставлен на основании клинико-анамнестических данных, подтвержденных лабораторно-инструментальными методами исследования Всем пациентам забор крови проводился дважды в момент поступления в стационар для проведения хирургического лечения и перед выпиской из стационара

У всех обследуемых выявлялись уровни неоптерина методом ВЭЖХ анализа с УФ и фшоориметрической детекцией (Дутов А А и соавт, 2006) Установление концентраций ФНО-а, ИФ-у ираково-эмбрионального антигена проводили методом твердофазного ИФА с применением наборов реагентов ЗАО "Вектор-Ьест" (г Новосибирск) Для определения общей гемолитической активности классического пути активации комплемента использовали метод Л В Козлова и соавт (1982) Для выявления величин С1-ингибитора, СЗа, С5а и фактора Н в сыворотке крови использовали метод твердофазного ИФА с применением наборов реагентов ООО "Цитокин" (г Санкт-Петербург) Изучение величин молекул средней массы проводили способом, предложенным НИ Габриэляном (1984)

Анализ полученных данных проведен с помощью метода вариационнои статистики с определением различий по критерию Стыодента, корреляционные зависимости устанавливались по коэффициенту Пирсона Статистический обсчет выполнялся на компьютере IBM Pcntium-4 пакетом "Microsoft Excel professional for Windows XP"

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Разработка н оптимизация ВЭЖХ метода определения неоптерина

Для разработки твердофазной экстракции (SPE) неоптерина мы использовали сорбент картриджа "Диапак-П" ("БиоХимМак", Москва), так называемый сверхсшитый полистирол из фрагментов стиролдивинилбензола Работы выполнялись в соответствии с "generic" протоколом фирмы "Waters" (США) Изначально картриджи с 30 мг сорбента промывали 1 мл метанола и 1 мл воды Затем наносили 100 нг стандарта неоптерина в 1 мл воды и 0,1 мл реагента Fe-ЭДТА После промывали сорбент 1 мл воды и высушивали под вакуумным насосом в течение 2 минут

Для определения наилучшего соотношения компонентов элюента была проведена серия экспериментов, в результате которых выявлена наиболее

эффективная экстракция (99%) при следующем варианте 1 мл смеси ацето-нитрил - метанол - вода (1 1 1, v/v/v)

На следующем этапе исследований определяли оптимальную долю воды в элюенте Оказалось, что чем меньше воды и объем элюировашгя, тем меньше процент экстракции, причем оптимальная элюирующая смесь для неопте-рина в нашем эксперименте выглядела таким образом ацетонитрил - метанол - вода (111, v/v/v)

Далее эксперименты были направлены на выявление оптимального объема элюата, который составил 1 мл Определение режима промывки сорбента (стандартное элюирование 1 мл смеси ацетонитрил - метанол - вода, 111, v/v/v) дало следующие результаты максимальный процент экстракции (85%) достигался при промывке водой с 5% метанолом

ВЭЖХ анализ неоптерина в сыворотке в предложенном нами варианте после SPE с применением УФ- и флюориметрической детекции выглядит следующим образом

Стандарты Базовый раствор стандарта неоптерина готовили на теплом растворе 0,01М NaOH в концентрации 100 нг/мкл и хранили в темноте в холодильнике при+2 С Рабочий стандарт готовили, разбавляя базовый водой 1 99 (v/v) - конечная концентрация 1 нг/мкл

Реагенты Для получения полностью окисленного стабильного неоптерина готовили реагент Fe-ЭДТА по методу J J Rippin (1992), которую хранили при комнатной температуре 18-22°С

Обработка сыворотки В полипропиленовую пробирку отбирали 1 мл сыворотки, добавляли 100 мкл реагента Fe-ЭДТА и выдерживали 20 мин при комнатной температуре

Экстракция Картридж с 30 мг стиролдивинилбензола промывали последовательно 1 мл хлороформа и 1 мл этанола, далее регенерировали и кондиционировали 1 мл метанола и 1 мл воды Далее самотеком пропускали через картридж 1 мл сыворотки с реагентом Fe-ЭДТА и промывали 1 мл воды, далее высушивали под вакуумом не менее 5 мин Элюировали неоптерин 1 мл смеси ацетонитрил-метанол-вода (111, v/v/v) и упаривали элюент досуха в термостате при 85°С Сухой остаток растворяли в 100 мкл элюента и 20 мкл этого раствора, эквивалентного 0,2 мл сыворотки, вводили в петлю инжектора

Хроматография Использовали аналитическую колонку 100 4 мм с Ди-асфер С16 5 мкм с предколонкой 4 3 мм С|в ("Phenomenex", США) Варианты иденшфикации УФ-детекция при 350 нм, ФЛЮ-детекция при ех350-ет430 нм, щели по 10 нм Элюент ацетонитрил - вода (1 99, v/v), скорость потока 600 мкл/мин, давление около 40 бар Время удерживания неоптерина - 3,63

мин При ФЛЮ-детекции 10 нг стандарта неоптерина обусловливают пик высотой 83 mV, при УФ - 22 mV Чувствительность при флюориметрической детекции в 3,8 раза выше, чем при УФ

Оценка воспроизводимости метода На следующем этапе нами была произведена оценка воспроизводимости метода определения неоптерина с УФ-детекцией С этой целью в течение месяца исследовалось содержание неоптерина в рабочем стандартном растворе с концентрацией 1 нг/мкл (20 определений) Были получены следующие данные - 0,95±0,04 (М±ст), рассчитанный коэффициент вариации равнялся 4,21%, что свидетельствует о хорошей воспроизводимости метода Кроме того, был изучен в двух параллелях уровень неоптерина у 20 здоровых доноров обоего пола (11 мужчин и 9 женщин) в возрасте от 19 до 54 лет В первой и второй параллели были получены следующие результаты (М±а) 9,44±1,72 и 9,86±1,61 ммоль/л, а коэффициент вариации составлял соответственно 18,2% и 16,3% Относительно высокие значения данного коэффициента объясняются, вероятно, различным конститутивным уровнем неоптерина у здоровых индивидуумов

Закономерности измененнй уровня неоптерина н содержания цитокинов у пациентов со злокачественными новообразованиями

С помощью разработанного нами метода хроматографического анализа изучена концентрация неоптерина у больных с впервые диагностированными опухолевыми процессами в различных органах до и после проведения хирургического лечения

Предварительное исследование значений данного вещества у здоровых лиц разного возраста и пола не обнаружило достоверных отличий, обусловленных этими факторами, что также подтверждается работами G Reibnegger et al, (1998), N Radunovic et al, (1999), H Schennach et al, (2002)

Анализ результатов у больных с разными стадиями морфологическими формами раков и степени дифференцировки опухолей внутри одной нозологической формы значимых различий в концентрации неоптерина не выявил Это позволило сравнить данные величины, не учитывая влияния вышеперечисленных факторов

Наличие злокачественного процесса приводило к повышеншо продукции неоптерина у всех обследуемых пациентов, за исключением лиц, страдающих раком почки (табл 1) Так, его значения возрастали на 70,9% (р<0,001), 101,6% (р<0,001) и 62,5% (р<0,001) по сравнению с контролем при раке желудка, толстого кишечника и молочной железы соответственно Следовательно, уровень данного метаболита при указанных локализациях достоверно превышал таковой при раке почки Как видно из таблицы 1, наибольшее содержа-

Таблица 1

Содержание неоптерина, ИФ-у, ФНО-а в сыворотке крови у онкологических больных до и после хирургического лечения (М±ш)

Обследуемые группы Неоптерин (нмолъ/л)

До лечения После лечения

Контроль (п=20) 9,44±0,39

Рак желуцка (п=31) 16,13±0,43* 11,5410,48*, **

Рак толстого кишечника (п=16) 19,03+0,97* 24,8310,80*, **

Рак молочной »елезы (п=20) 15,34+0,54* 14,22Ю,62*

Рак почки (п=11) 9,76+0,85 5,88+0,67*, **

ИФ-у (пг/мл)

До лечения После лечения

Контроль (п=20) 12,8310,83

Рак желудка (п=31) 30,2б±3,19* 15,2212,77**

Рак толстого кишечника (п=1 б) 31,67+3,29* 16,5112,57**

Рак молочной железы (п=20) 21,4312,69* 22,4412,19*

Рак почки (п=11) 24,5312,03* 19,03+1,26*,**

ФИО-а (т/мл)

До лечения После лечения

Контроль (п=20) 2,74+0,46

Рак желудка (п=31) 5,85+0,27* 3,2410,44**

Рак толстого кишечника (п=16) 6,14+0,49* 4,06+0,66**

Рак молочной железы (п=20) 4,1510,46* 4,38+0,71

Рак почки(п=11) 3,86±0,59 5,70+0,51", **

Примечание * - достоверные различия по сравнению с контролем, ** - достоверные различия между показателем до и после лечения, достоверность различий между группами больных указана в тексте

ние птерина было характерным для пациентов с РТК, цифры которого были на 18,0% (р<0,01) и 24,1% (р<0,001) больше, чем у больных РЖ и РМЖ соответственно Подобное явление, по всей вероятности, обусловлено усилением процессов реабсорбции неоптерина в толстом кишечнике и, главным образом, возросшей продукцией ИФ-у (см ниже)

Хирургическое лечешге вызвало неоднозначный эффект После операции на желудке содержание неоптерина значимо уменьшилось на 28,5%, (р<0,001), но не достигало уровня здоровых лиц Оперативное вмешательство на толстом кишечнике провоцировало дальнейший рост цифр изучаемого соединения, которые составляли 130,5% (р<0,001) от таковых до лечения Необходимо отметить, что маммэктомия не влияла на содержание неоптери-

на в сыворотке крови, а оперативное лечение больных раком почки приводило к снижению его величин почти на 40% (р<0,001), причем они были также статистически значимо ниже таковых у здоровых лиц

Было бы некорректно рассматривать изменения концентрации неоптери-на при любых физиологических и патологических процессах без изучения факторов, влияющих на его продукцию Среди них главным индуктором его синтеза является интерферон-у, который активирует ключевой фермент в цепочке превращения гуанозинтрифосфата в неоптерин (БЬнИаки Н, 2002)

В меньшей степени регулируют его секрецию ФНО-а и другие цитоки-ны, причем первый вызывает опосредованную суперинду кцию интерферон-зависимого синтеза неоптерина (Свиридов Е А, Телегина ТА , 2005)

Увеличение концентрации ИФ-у относительно контрольной группы зарегистрировано во всех исследуемых группах онкологических больных на момент поступления в стационар (табл 1) Наиболее значимый подъем величин данного лимфокина обнаружен в группах с РЖ и РТК Их значения возрастали на 135,9% (р<0,05) и на 146,8% (р<0,05) по сравнению с контролем соответственно У больных раком молочной железы и почки цифры ИФ-у были также выше таковых у здоровых лиц, но они достоверно были меньше, чем у пациентов с РЖ и РТК При злокачественном поражении молочной железы содержание ИФ-у составляло 70,7% (р<0,05) и 67,7% (р<0,05) от его значений при РЖ и РТК соответственно, а при РП - 81,0% (р<0,05) и 77,5% (р<0,05) соответственно

После проведенного хирургического лечения уровень данного цитокина у пациентов с РЖ и РТК резко уменьшался почти в 2 раза (р<0,001 и р<0,001) по сравнению с исходными значениями и не отличался от величин контрольной группы Незначительное, но достоверное падение этого показателя наблюдалось улиц с раком почки, а удаление злокачественного очага в молочной железе никаким образом не сказывалось на продукции ИФ-у Необходимо подчеркнуть, что у пациентов этих двух групп содержание данного лимфокина значительно превышало контрольные цифры (табл 1)

Несколько похожая направленность сдвигов была зарегистрирована нами при изучении содержания ФНО-а (табл 1) Повышение его концентрации в 2,1 (р<0,01), 2,2 (р<0,05) и 1,5 (р<0,05) раза по сравнению с контролем зарегистрировано при раке желудка, толстого кишечника и молочной железы соответственно

При локализации опухолевого процесса в почке отмечалась лишь тенденция к росту этого цитокина, при этом его цифры были статистически значимо меньше на 34,0% (р<0,01) и 37,1% (р<0,01), чем у пациентов с РЖ и РТК соответственно Аналогичная закономерность была характерна и для

больных РМЖ - уровень ФНО-ос составлял лишь 70,9% (р<0,001) и 67,6% (р<0,001) от такового при раке желудка и колоректальном раке соответственно

Хирургическое лечение у пациентов с раком толстого кишечника вызвало снижение цифр ФНО-а на 66,1% (р<0,05) и достоверно не отличалось от величин контроля Подобный эффект наблюдался и при лечении рака желудка У этих пациентов его уровень снизился на 55,4% (р<0,01) В группе больных раком почки наблюдалась обратная картина Оперативное лечешге вызвало повышение продукции ФНО-а на 46% (р<0,05) по сравнению с величинами до лечения и статистически значимо превышало контрольные цифры на 108% (р<0,01). Концентрации изучаемого цитокина у больных, прооперированных по поводу РМЖ, оставались в тех же самых пределах, что и до лечения (табл 1)

Особый интерес представляют корреляционные взаимоотношения между величинами неоптерина с одной стороны, и содержанием ИФ-у и ФНО-а -с другой (рис 1)

У здоровых лиц уровень неоптерина положительно коррелировал лишь с продукцией ИФ-у (г = 0,39, р<0,05), что вполне закономерно, учитывая то, что последний является основным стимулятором его синтеза

При наличии злокачественного процесса в желудочно-кишечном тракте независимо от его локализации у больных до операции корреляционные зависимости характеризуются относительной однотипностью Так, значения ин-терферона-у положительно коррелировали как с цифрами неоптерина, так и с продукцией ФНО-а, при этом регистрировались средней силы связи Однако, у пациентов с колорекгальным раком еще фиксировалась обратная зависимость между содержанием птерина и фактора некроза опухолей-а Необходимо подчеркнуть, что хирургическое лечение рака желудка не изменяло картину корреляционных взаимоотношений, тогда как при РТК эти зависимости исчезали

Несколько иной характер связей между изучаемыми показателям?! существовал при РМЖ и РП Если до лечения в обоих случаях уровень неоптерина слабоотрицателыю коррелировал с продукцией ИФ-у, то у лиц с опухолью молочной железы регистрировалась слабая прямая связь между цифрами птерина и ФНО-а Напротив, при раке почки данная зависимость носила сильную обратную направленность, на этом фоне наблюдалась сильная положительная корреляция между величинами цитохинов Проведенное оперативное лечение пациентов с РМЖ изменяло направленность связи между значениями неоптерина и ИФ-у, а у больных РП сохранялась только эта зависимость

До лечения

РАК ЖЕЛУДКА

После лечения

До лечения РАК ТОЛСТОГО КИШЕЧНИКА После лечения

ИФ-у T=0,SB, р<0,05 Неоптерин

ИФ-у

т=0,62,

ФНО-а

До лечения

r=-0,5S, p<0,0S

РАК МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

ФНО-а

После лечения

ИФ-у г=-0,32, р<0,05 Неоптерин _ г=0,47, р<0,03^ ИФ-у

До лечения

г=-0,3б, р<0,05

РАК ПОЧКИ

ФНО-а

После лечения

Рис. 1. Схема корреляционных взаимоотношений между величинами нсопте-рина, интерферона-у, фактора некроза опухолей-а

При злокачественном процессе в желудочно-кишечном тракте стимуляция сшггеза ФНО-ос приводит к индукции генеза ИФ-у, ко горый усиливает продукцию неоптерина, что является свидетельством активации клеточного иммунитета Оперативное лечение рака желудка снижает интенсивность взаимоотношений в этой цепочке Хирургическое лечение РТК приводит к усилению ИФ-у-независимого пути синтеза неоптерина, вероятно, за счет влияния NK-клеток, активация которых возможна под действием ИФ-у и ФНО-а При РМЖ рост уровня неоптерина обусловлен стимулирующим эффектом прежде всего фактора некроза опухолей-а, а после удаленного злокачественного очага высокий уровень птерина поддерживается за счет активации его синтеза ин-терфероном-у, а возможно и аутоиндукгивным путем (Barak М, 1990) Как неблагоприятный прогностический признак следует рассматривать отсутствие роста продукции неоптерина при раке почки, хотя содержание ИФ-у повышается, но наличие отрицательной корреляционной связи между ними может

свидетельствовать, вероятно, о подавлении экспрессии гена ГТФ-цикл о гидролазы-1 (ключевого фермента в синтезе неоптерина) метаболитами злокачественного роста.

Закономерности изменении комплементарного статуса, содержания ра ко во-э морион ал ьного антигена и молекул средней массы у пациентов со злокачественными опухолями

Показатели комплементарного статуса в целом иллюстрируют обилие тенденции к активации системы комплемента в исследуемых клинических группах.

По сравнению со здоровыми ляиами в группах больных РЖ, РМЖ и РП активность КПК имела общую тенденцию к увеличению до лечения и последующему снижению после оперативного вмешательства, хотя и недостоверно в группе РМЖ (рис. 2).

у.е.

* - достоверные различия по сравнению с контролем; Т- достоверные различия между показателями до лечения и после

Рис. 2. Показатели активности КПК у онкологических больных до и после

хирургического лечения.

Наблюдаемые изменения связаны, вероятно, во-первых, с интенсивным образованием иммунных комплексов (в качест ве антигена - неопластические клетки), хронической активацией СК и потреблением компонентов системы; во-вторых, с последующим компенсаторным увеличением синтеза белков СК моноцитами/макрофагами и клетками печени. При РП общая гемолитическая активность по классическому пути до лечения увеличена в 1,5 раза (р<О,05), чем в контроле, но после удаления органа отмечается наиболее резкое падение активности КПК почти в 3 раза (р<0,01 >, видимо, обусловленное с ниже-

Ш До лечения и После лечения

I

Контроль

Рак. желудка р^к толстого Рак молочной

кишечника железы

ни ем продукции некоторых белков СК почками.

Нехарактерные для других групп изменения в общей комплементарной активности зарегистрированы в группе с РТК: до лечения активность КПК была снижена в 1,9 раза (р<0,01) по сравнению с контролем, тогда как после оперативного вмешательства увеличилась в 2,2 раза (р<0,001), относительно контроля - в 1,3 раза (р<0,05), и достигала максимальных величин исследуемого параметра. Подтверждения найденных нами результатов мы в известной литературе не обнаружили.

Дня оценки степени активации комплемента нами были определены уровни анафилатокс ин ов СЗа и С5а в крови исследуемых больных. Указанные молекулы недолго циркулируют в кровотоке и взаимодействуют со своими рецепторами на различных клетках, в том числе и макрофагах.

Содержание СЗа компонента комплемента (рис. 3) во всех клинических группах значительно увеличено относительно контроля (в 6-9 раз), прячем особой разницы в этом показателе и до, и после лечения в группах не отмечено.

Контроль Ракжелулка Р.1Н п.л-тер^н молочной жш,гоы Раи почки

кншсчнчкв

! Ш До лечения к После лечения I

* - достоверные различия по сравнению с контролем; у - достоверные различия между показателями до лечения и после

Рис. 3. Содержание СЗа компонента комплемента в сыворотке крови у онкологических больных до и после хирургического лечения.

И только в группе больных с РЖ заслуживает внимания достоверное снижение уровня СЗа компонента (р<0,01) после проведенного лечения, причем полученные цифры данного продукта активации СК оставались почти в 6 раз больше контрольных значений.

Содержание в крови продукта действия ферментативного комплекса С5-

конвертазы С5а компонента комплемента во всех группах достоверно выше показателя контроля, но не намного (в 2-3,5 раза) по сравнению с СЗа. Как известно, биологическая активность С5а в сто раз превышает таковую СЗа. Изменения уровней данного апафилатоксина в группах до и после лечения не имели достоверных различий. Исключением явилисьлиии, концентраций дан-кого компонента у пациентов, прооперированных по поводу РМЖ. Данные величины снизились в 1,8 раза (р<0,05) и достигли контрольных пределов (рис. 4).

Контроль Рак желудка Рак толстого Рак молочной рак почки

кишечника желёзы

Ш До лечения Я После лечения |

* - достоверные различия по сравнению с контролем; ч- - достоверные различия между показателями до печения и после

Рис. 4. Содержание С5а компонента комплемента в сыворотке крови у онкологических больных до и после хирургического лечения.

Количество С1-ингибитора на фоне активации комплемента аномально увеличено во всех группах как до, так и после проведенного лечения по сравнению с контролем (рис, 5). С1-ингибитор не препятст вует адекватной активации комплемент, но блокирует жидко фазную, хроническую или чрезмерную активацию этой системы на л ¡обой мишени. Так как мы наблюдаем в общей картине тенденцию к именно последним вариантам событий, то почти в 4 раза увеличенные концентрации подтверждают версию о гиперактивации комплемента и имеющемся напряженном синтезе данного белка.

Но в отличие от предыдущих аналитов уровень фактора Н (рис. 6) во всех группах наоборот примерно в 3 раза ниже, чем содержание данного фактора в контроле (р<0,001), и после лечения его концентрации практически не изменяются. В принципе данный факт дает право судить о степени активации АПК, поскольку фактор Н является кофактором фактора I, функция которого

И До лечения Й После лечения

* - достоверные различия по сравнению с контролем; Т- достоверные различия между показателями до лечения и после

Рис. 5. Содержание С1-ингибитора комплемента в сыворотке крови у онкологических больных до и после хирургического лечения.

мкг/ил

Контроль Рак жеяулка Рак толстого Рак молочной Рак почки

кишечники железы

Н До лечений Ш После лечения

* - достоверные различия по сравнению с контролем; ▼ -достоверные различия между показателями до лечения и после

Рис. 6, Содержание фактора Н в сыворотке крови у онкологических больных до и после хирургического лечения.

заключается в контроле жидко фа зной активации СЗ компонента при инициации альтернативного каскада активации комплемента, т.е. по сути является ингибитором СЗ-кониертазы. Совокупность вышеперечисленных фактов, таких как повышенные концентрации С1 -ингибитора, молекул СЗа, С5а и низкие

значения фактора Н, указывает на активацию комплемента в пользу его альтернативного варианта

Исследованные показатели СК неоднозначно коррелировали с продукцией неоптерина При РЖ до лечения имеющаяся взаимосвязь средней силы с отрицательным знаком между неоптерином и С5а усиливалась после лечения, но не намного Кроме того, в этой же группе связь между неоптерином и С1 -ингибитором средней силы меняла знак с"+" до лечения на "-" после, причем с той же силой Во второй группе больных (с РТК) сильная отрицательная связь между продукцией неоптерина и уровнем СЗа не менялась ни до, ни после госпитализации, отрицательная связь средней силы неоптерина с фактором Н исчезала после лечения, но появлялась средней силы положительная связь между неоптерином и С1 -ингибитором При РМЖ корреляционная связь средней силы и отрицательного значения между уровнем неоптерина и активностью КПК исчезала после лечения, зато появлялась сильная отрицательная связь с С1-ингибитором Обращает на себя внимание положительная корреляция средней силы между неоптерином и активностью КПК при РП до и после лечения, хотя связь неоптерина и С1-ингибитора меняла свой знак после операции по удалению почки

Таким образом, корреляционные связи между продукцией неоптерина и показателями СК носили довольно разнонаправленный характер, но все же нам удалось уловить некоторые общие тенденции при РЖ и РТК отрицательная связь средней силы между уровнями неоптерина и анафнлотоксинов (С5а, СЗа) соответственно сохранялась и после лечения Кроме того, в группе с РП положительная средней силы корреляция между неоптерином и активностью КПК оставалась почти неизменной К продуктам активации комплемента на большинстве клеток организма человека, в том числе и моноцитах/макрофагах, имеются высокоспецифичные рецепторы Связывание с ними приводит к активации тех же макрофагов, изменяется их функциональное состояние, что отражается на их способности к фагоцитозу, индукции свободнорадикально-го окисления и продукции макрофагальиых цитокинов и неоптерина

Изменение содержания раково-эмбрионального антигена и молекул средней массы обследуемых групп больных носит однонаправленный неспецифический характер (табл 2) Так, уровень раково-эмбрионального антигена у пациентов с РЖ, РТК, РМЖ и РП до лечения был выше в 2,0 (р<0,05), 2,7 (р<0,05), 2,2 (р<0,05) и в 2.6 раза (р<0,05) соответственно, чем в контроле Различий между группами в содержании РЭА не выявляются После проведенных операций данные показатели резко уменьшаются, достигая контрольных величин, причем статистически значимо только у пациентов с РТК, РМЖ и РЖ в 2,1 (р<0,05), в 2 (р<0,05), в 1,5 (р<0,05) раза соответственно,

Таблица2

Содержание раково-эмбрионального антигена и молекул средней массы у онкологических больных до и после хирургического лечения (М±т)

Обследуемые группы ЮА нг/мл МСМед опт плотности

До лечения После лечения До лечения После лечения

Контроль (п=20) 1,86±0,23 0,28+0,04

Рак желудка (гс=31) 3,65+0,47* 2,43+0,24** 0,81+0,03* 0,76+0,03*

Рак толстого кишечника (п=1б) 4,97+0,87* 2,42±0,43** 0,79+0,05* 0,80+0 04*

Рак моточной железы (п=20) 4,08+0,83* 2,14±0,76** 0,/5±0,03* 0,74+0,03='

Рак почки (п=11) 4,87±1,23* 4,14+0,56* 0,81 ±0,05* 0,79+0,04"

Примечание * - достоверные различия по сравнению с контролем, ** - достоверные различия между показателем до и после лечения, достоверность различий между группами больных указана в тексте

тогда как нефрэктомия у больных с РП практически не изменила величины данного антигена сыворотки крови По всей видимости, это связано, прежде всего, с хирургическим вмешательством, в результате которой удалена ма-лигнизированная ткань, продуцирующая данный онкомаркер

Содержание молекул средней массы, характеризующих степень эндоток-сикоза при поступленииу больных РТК и РМЖ превышало контрольные цифры более чем в 2,6 раза (р<0,001), а у пациентов с РЖ и РП в 2,8 раза (р<0,001), что трактовалось наличием 2-3 степени эндотоксикоза После лечения при выписке данные показатели практически не отличались от таковых до проведенного хирургического лечения (табл 2)

Таким образом, резюмируя вышеприведенные данные можно констатировать следующее во-первых, нами разработан способ высокоэффективной жидкостной хроматографии с применением твердофазной экстракции и УФ-детекции неоптерина, позволивший нам определить уровень данного метаболита в сыворотке крови онкологических больных, во-вторых, нами выявлено, что при данных нозологических формах рака наблюдается увеличение концентрации неоптерина, гиперпродукция которого моноцитами/макрофаги тесно связана с активаторным влиянием ИФ-у и ФНО-а Данный факт косвенно свидетельствует об активации клеточного иммунитета при злокачественных опухолях В-третьих, хирургическое лечение онкологических больных оказывает различное влияние на вышеуказанные показатели, в-четвертых, изменения комплементарного статуса у пациентов со злокачественными новообразованиями свидетельствуют о преимущественной активации алыернатив-

ного пути, в-пятых, рост концентрации раково-эмбрионального антигена и

молекул средней массы при всех локализациях рака носит неспецифический

характер и является общей закономерностью злокачественного процесса

ВЫВОДЫ

1 Разработан метод высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения неоптерина в сыворотке крови с использованием УФ-детекщга, характеризующийся высокой воспроизводимостью и чувствительностью

2 У больных со злокачественным поражением желудочно-кишечного тракта (рак желудка, колоректальный рак) и молочной железы регистрируется повышение содержания неоптерина в сыворотке крови, что свидетельствует об активации моноцитарно-макрофагшшюго звена иммунитета При раке почки уровень неоптерина не изменяется

3 Хирургическое лечение обследуемых больных приводит к снижению концентрации неоптерина только у лиц с раком желудка и почки, при раке толстого кишечника его продукция еще больше усиливается, у пациентов с раком молочной железы остается на прежнем уровне

4 У больных раком желудка, колоректальным раком гиперпродукция неоптерина сопряжена с активаторным влиянием ИФ-у и ФНО-а, уровень которых значительно возрастает. Наличие злокачественного процесса в молочной железе приводит к росту значений неоптерина за счет стимулирующего эффекта, прежде всего, ФНО-а, после хирургического лечения высокое содержание неоптерина поддерживается за счет активации его синтеза ИФ-у

5 У всех онкологических больных подъем уровня СЗа, С5а, С1 -ингибитора и фактора Н свидетельствует о преимущественной активации комплемента альтернативным путем Рост концентрации раково-эмбрионалыюш антигена и молекул средней массы при всех локализациях рака носит неспецифический характер и является общей закономерностью злокачественного процесса

6 Корреляционные взаимоотношения между изучаемыми параметрами у больных с опухолями желудочно-кишечного тракта характеризуются относительной однотипностью (значения ИФ-у положительно коррелируют как с цифрами неоптерина, так и с продукцией ФНО-а), тогда как при раке молочной железы и раке почки эти зависимости носят разнонаправленный характер Хирургическое лечение изменяет картину корреляционных взаимосвязей между уровнем неоптерина и содержанием цитокинов, за исключением пациентов с раком желудка

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Для определения уровня неоптерина в биологических объектах с целью оценки активности клеточного иммунитета может быть использован ВЭЖХ метод с УФ-детекцией и предварительной твердофазной экстракцией неоптерина

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1 К вопросу об альтернативном подходе к диагностике неопластических процессов / Б С Хышиктуев, П Б Цыдендамбаев, 3 Б Жамсаранов, 3 Ц Рин-чинов // Акт пробл клинич и эксперим мед , Всеросс науч -практ конф , посвящ 50-летию ЧГМА, Чита, 1-2 октября 2003 г - Чита ИИЦ ЧГМА, 2003 - С 372-373

2 Ринчшюв 3 Ц Статус белков системы комплемента в ликворе больных с травмами и опухолями ЦНС // Региональная наука тенденции и перспективы развития "Аспирантские чтения - 2004" - сборник материалов докладов V научной конференции молодых ученых, посвященный 85-летию Самарского государственного университета - Самара, 2004 - С 450-451

3. Состояние белков системы комплемента у больных раком желудка / 3 Ц Ринчинов, Р Ю Хлобыстин, А Н Страмилов, П Б Цыдендамбаев // Материалы V Всеросс университетской науч -практ конф мол ученых и студ по медицине - Тула, 2006 - С 198-199

4 ВЭЖХ анализ неоптерина в сыворотке крови и моче с УФ- и флюориметри-ческой детекцией / А А Дутов, Д А Никитин, 3 Ц Ринчинов, П П Тереш-ков, А А Федотова, П.Б Цыдендамбаев // Теоретич проблемы химии поверхности, адсорбции и хроматографии X междунар конф - М - Клязьма, 2006 - С 295

5 ВЭЖХ определение неоптерина в биологических жидкостях для рутинного клинического использования / А А Дутов, Д А Никитин, 3 Ц Ринчинов, IIП Терешков, П Б Цыдендамбаев, А А Федотова // Журнал физической химии, 2007, Т 81, №3 - С 1-3

6 HPLC Determination of Neoptenn in Biological Liquids for Clinical Purposes / A A Dutov, D A Nikitin, Z Ts Rmchinov, et al // Russian Journal of Physical Chemistry A -2007 - Vol 81, No 3, - P421-423

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АПК - альтернативный путь активации комплемента

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

ИФ-у - интерферон гамма

КПК - классический путь активации комплемент а

РЖ - рак желудка

РМЖ - рак молочной железы

РП - рак почки

РТК - рак толстого кишечника

РЭА - раково-эмбриональный антиген

СК - система комплемента

ФНО-а - фактор некроза опухолей альфа

ЭДТА - этилендиаминотетрауксусная кислота

SPE - (solid phase extraction) твердофазная экстракция

Лицензия ИД №03077 от 23 10 00 Подписано в печать 20 04 07 Бумага офсетная Формат 60 х 84 7,6 Уел печ л-1,0 Тираж 100 Заказ № 542007

Отпечатано в информационно-издательском центре ЧГМА 672090, Чита, ул Горького, 39а

Актуальность проблемы

В структуре причин смертности населения по России и в мире онкологическая патология занимает 3-е место после сердечно-сосудистых заболеваний и травм [7].

С начала 90-х годов XX века в России ежегодно регистрируют более 400 тысяч злокачественных новообразований. При этом наблюдается ежегодный рост абсолютного числа больных с впервые установленным диагнозом, что обусловлено не только истинным подъемом заболеваемости, связанным, в том числе и с ухудшением экологической обстановки, качества жизни, постарением населения, но и заметным улучшением выявляемости заболеваний. В структуре смертности от онкологических заболеваний около

30% занимают лица трудоспособного возраста. Ежегодно в стране более 120 тысяч человек признаются инвалидами по этой причине, что свидетельствует о чрезвычайно высокой значимости ранней диагностики, профилактики и лечения этих заболеваний [6].

В связи с этим поиск новых методов ранней и дифференциальной диагностики, критериев прогноза злокачественных опухолей, а также установление новых закономерностей, характерных для злокачественного роста, является весьма актуальным. В этом плане перспективными выглядят исследования, связанные с изучением неоптеринового статуса. В настоящее время неоптерин рассматривается как маркер активации клеточного иммунитета [21, 16, 19, 27, 138]. Это связано прежде всего с тем, что измерение биологически более инертного метаболита для дополнительной оценки состояния клеточного звена иммунитета представляет максимальный интерес. Особенно акцентируется тот факт, что изменение его концентраций в крови отражает совместное действие различных цитокинов на популяцию моноцитов/макрофагов, стимулированных у-интерфероном [27, 105]. Наряду с интерфероном-гамма (ИФ-у) фактор некроза опухолей-а (ФНО-а) является мощным костимулятором синтеза неоптерина [16, 39, 91], а экзогенный неоптерин стимулирует синтез ФНО-а макрофагами [39]. Это особенно важно, учитывая фундаментальную роль ФНО-а в иммунопатологии злокачественного перерождения [24, 8,22,20].

Из данных литературы известно, что уровень неоптерина повышается при многих онкологических заболеваниях (раке поджелудочной железы, легких, печени, яичников, молочной железы) [136, 59, 160, 121, 98, 128, 189]. Наиболее высокие концентрации отмечены у больных с опухолями кроветворной системы - с неходжкинскими лимфомами и множественными миеломами [21].

Однако мы не обнаружили работ, в которых бы рассматривались взаимоотношения между уровнем неоптерина и цитокинами, влияющими на его продукцию, и другими показателями - онкомаркерами, факторами неспецифической резистентности при злокачественных новообразованиях.

Кроме того, существующие методы определения неоптерина - это иммуноферментный, радиоиммунный анализы, а также высокоэффективная жидкостная хроматография, не нашли пока широкого применения в клинической практике вследствие либо своей дороговизны, либо сложности проведения анализа, а также необходимости специфического оборудования и других факторов [19, 21].

На основании вышеизложенного, нами сформулирована цель исследования: установить закономерности изменений уровня неоптерина и его взаимоотношения с цитокинами (ИФ-у, ФНО-а), системой комплемента, онкомаркером (РЭА) и показателем эндотоксикоза у пациентов со злокачественными новообразованиями.

Для достижения поставленной цели последовательно решались следующие задачи:

1. Разработать способ определения неоптерина в сыворотке крови.

2. Изучить концентрацию неоптерина у пациентов с раком желудка, толстого кишечника, молочной железы и почки до и после хирургического лечения.

3. Исследовать концентрацию цитокинов (ИФ-у, ФНО-а), влияющих на продукцию неоптерина, а также уровень раково-эмбрионального антигена, молекул средней массы, и выявить особенности изменений в комплементарном статусе при злокачественных опухолях.

4. Оценить характер корреляционных взаимоотношений между величинами неоптерина, с одной стороны, и значениями цитокинов, раково-эмбрионального антигена, молекул средней массы, параметрами системы комплемента - с другой.

Научная новизна

Впервые разработан высокочувствительный ВЭЖХ метод определения неоптерина в биологических жидкостях с использованием УФ-детектора.

Приоритетным в работе является, раскрытие закономерностей изменений уровня неоптерина во взаимосвязи с некоторыми показателями иммунитета у пациентов со злокачественными образованиями. Установлено, что при онкопатологии желудочно-кишечного тракта наблюдается стимуляция синтеза ФНО-а, приводящая к повышению уровня ИФ-у, который усиливает продукцию неоптерина, что является свидетельством активации клеточного иммунитета. Показано, что оперативное лечение рака желудка снижает интенсивность синтеза неоптерина на фоне уменьшения продукции ИФ-у и ФНО-а. Хирургическое лечение рака толстого кишечника приводит к усилению ИФ-у-независимого пути синтеза неоптерина. При раке молочной железы рост уровня неоптерина обусловлен стимулирующим эффектом, прежде всего, фактора некроза опухолей-а, а после удаления злокачественного очага высокий уровень неоптерина поддерживается за счет активации его синтеза интерфероном-у. Обнаружено, что при раке почки содержание неоптерина не изменяется на фоне повышенной продукции ИФ-У

Теоретическая и практическая значимость

В ходе исследования был проведен сравнительный анализ методов экстракции неоптерина и показана высокая селективность твердофазного способа, что позволяет определять неоптерин с помощью УФ-детектора.

Полученные результаты расширили представление о роли нарушений неоптеринового статуса при злокачественных опухолях, что может быть использовано для разработки способов прогноза и ранней диагностики метастазов при онкологических заболеваниях.

Установлено, что у пациентов при всех изученных локализациях злокачественного процесса происходит активация комплемента, главным образом, за счет альтернативного пути. Корреляционные взаимосвязи между продукцией неоптерина и показателями системы комплемента носят разнонаправленный характер, однако общими являются отрицательные связи между содержанием неоптерина, с одной стороны, и уровнем С5а и СЗа - с другой.

Подана заявка на изобретение «Способ определения неоптерина в крови» №2006106029, приоритет от 26.02.2006.

Материалы работы внедрены в учебный процесс на кафедрах биохимии, патологической физиологии.

Положения, выносимые на защиту:

1. Разработанный метод определения неоптерина является простым, нетрудоемким, чувствительным и воспроизводимым по сравнению с имеющимися аналогичными методами.

2. Продукция неоптерина и характер его взаимоотношений с уровнем цитокинов (ИФ-у и ФНО-а), определяется локализацией злокачественного процесса. Хирургическое лечение онкологических больных оказывает различное влияние на вышеуказанные показатели

3. Изменения комплементарного статуса у пациентов со злокачественными новообразованиями свидетельствуют о преимущественной активации альтернативного пути.

Апробация работы

Основные положения диссертации и результаты исследований доложены и обсуждены на V Всероссийской университетской научнопрактической конференции молодых ученых и студентов по медицине (Тула, 2006), на X международной конференции «Теоретические проблемы химии поверхности, адсорбции и хроматографии» (Москва - Клязьма, 2006), на совместном заседании кафедр биохимии, нормальной физиологии, патологической физиологии, общей химии Читинской государственной медицинской академии с участием сотрудников НИИ экологии при ГОУ ВПО ЧГМА (Чита, 2007).

Структура и объем работы

Диссертация изложена на 108 страницах машинописного текста, иллюстрирована 7 рисунками и 23 таблицами и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, двух глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 32 отечественных и 166 зарубежных источников.

ВЫВОДЫ:

1. Разработан метод высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения неоптерина в сыворотке крови с использованием УФ-детекции, характеризующийся высокой воспроизводимостью и чувствительностью.

2. У больных со злокачественным поражением желудочно-кишечного тракта (рак желудка, колоректальный рак) и молочной железы регистрируется повышение содержания неоптерина в сыворотке крови, что свидетельствует об активации моноцитарно-макрофагального звена иммунитета. При раке почки уровень неоптерина не изменяется.

3. Хирургическое лечение обследуемых больных приводит к снижению концентрации неоптерина только у лиц с раком желудка и почки, при раке толстого кишечника его продукция ещё больше усиливается, у пациентов с раком молочной железы остается на прежнем уровне.

4. У больных раком желудка, колоректальным раком гиперпродукция неоптерина сопряжена с активаторным влиянием ИФ-у и ФНО-а, уровень которых значительно возрастает. Наличие злокачественного процесса в молочной железе приводит к росту значений неоптерина за счет стимулирующего эффекта, прежде всего, ФНО-а; после хирургического лечения высокое содержание неоптерина поддерживается за счет активации его синтеза ИФ-у.

5. У всех онкологических больных подъём уровня СЗа, С5а, С1-ингибитора и фактора Н свидетельствует о преимущественной активации комплемента альтернативным путем. Рост концентрации раково-эмбрионального антигена и молекул средней массы при всех локализациях рака носит неспецифический характер и является общей закономерностью злокачественного процесса.

6. Корреляционные взаимоотношения между изучаемыми параметрами у больных с опухолями желудочно-кишечного тракта характеризуются относительной однотипностью (значения ИФ-у положительно коррелируют как с цифрами неоптерина, так и с продукцией ФНО-а ), тогда как при раке молочной железы и раке почки эти зависимости носят разнонаправленный характер. Хирургическое лечение изменяет картину корреляционных взаимосвязей между уровнем неоптерина и содержанием цитокинов, за исключением пациентов с раком желудка.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проблема злокачественных новообразований остается актуальной в настоящее время, несмотря на прогресс в сфере технологий диагностики и лечения опухолей. За последнее десятилетие наблюдается тенденция снижения заболеваемости онкопатологией желудка, при высоком уровне (один из наиболее высоких в мире среди мужчин) все же произошла стабилизация заболеваемости новообразованиями легкого, трахеи и бронхов. В то же время отмечается рост заболеваемости населения России злокачественными новообразованиями толстого кишечника, кожи, мочевого пузыря, головного мозга, щитовидной железы. Среди мужчин регистрируется интенсивный рост заболеваемости злокачественными новообразованиями предстательной железы, среди женщин - молочной железы. В прошедшем десятилетии впервые за многие годы регистрируется рост заболеваемости среди женщин раком шейки матки, что свидетельствует в числе других причин и о свертывании программ ранней диагностики и профилактики этой патологии [6,7].

В настоящее время уже не вызывает сомнений, что биологические особенности малигнизированной ткани во многом определяют гетерогенность иммунологического ответа организма на опухолевые антигены [8]. Клеточный иммунитет играет одну из ведущих ролей в защите организма от вирусных, инфекционных, паразитарных, аутоиммунных заболеваний, в механизмах отторжении трансплантата, а также в противоопухолевых реакциях. Важную роль в реализации данного процесса принимают Т-лимфоциты и система моноцитов/макрофагов. Полноценный иммунный ответ обеспечен только активным взаимодействием клеток, которое осуществляется с помощью цитокинов -биологически активных веществ, секретируемых активированными клетками иммунной системы. Однако же, определение концентраций отдельных цитокинов не дает полной оценки состояния защитных систем. Это связано с относительно небольшим периодом полужизни цитокинов, которые в короткое время связываются со специфическими, высоко аффинными рецепторами, представленными на клетках-мишенях или циркулирующими в кровотоке. Кроме того, биологический эффект одного цитокина, как правило, реализуется совместно с действием других, поэтому величины индивидуальных представителей этих биологически активных веществ дают весьма ограниченные сведения только о взаимодействии между ними и иммунокомпетентными клетками. В связи с этим, измерение высвобождения биологически более инертного метаболита для дополнительной оценки клеточного звена иммунного ответа представляет максимальный интерес. В последние 10-15 лет, особое внимание уделяется определению уровня неоптерина. И в зарубежной и в отечественной литературе были подробно описаны имеющиеся к тому времени данные о неоптерине и клиническом значении анализа этого вещества. Особенно акцентировался тот факт, что изменение его концентраций в крови отражает совместное действие различных цитокинов на популяцию моноцитов/макрофагов, стимулированных у-интерфероном [27].

Как правило, у онкологических больных величины неоптерина определяются со стадией заболевания, но при некоторых формах злокачественных новообразований, например, при раке желудка, толстого кишечника и почки, такой закономерности не прослеживается [59]. При раке легких гипернеоптеринемия наблюдается в 75% случаев независимо от гистологического типа опухоли, причем концентрация неоптерина до лечения имеет прогностическое значение при аденокарциноме и мелкоклеточной форме. При раке печени уровень неоптерина коррелирует с размерами опухоли и имеет прогностическое значение [160]. Диагностическая чувствительность теста на неоптерин неодинакова при различных вариантах рака и составляет от 100% при поздних стадиях некоторых заболеваний крови до 20% при раке молочной железы [189]. Значимость статуса неоптерина для верификации и прогноза злокачественного новообразования не ниже, а в некоторых случаях даже выше, чем у специфических опухолевых маркеров, таких как раково-эмбриональный антиген, СА 19/9 или щелочная фосфатаза [59, 121]. В целом результаты динамического определения концентрации неоптерина свидетельствуют, что ее увеличение является важным признаком прогрессирования опухолевого процесса, метастазирования или прогностическим критерием летального исхода.

Проведенные нами наблюдения зафиксировали, что у больных с онкопатологией происходят выраженные изменения в продукции неоптерина и некоторых показателях иммунитета. Так, установлено, что у пациентов с впервые выявленным раком желудка и колоректальным раком до оперативного вмешательства уровень неоптеринемии достоверно выше по сравнению с подобным параметром здоровых людей. Полученные данные о содержании неоптерина при раке желудка и колоректальном раке совпадают с мнением других авторов. Повышение уровня неоптерина обнаружено у 40 % больных раком желудка и у 50% больных раком толстой кишки независимо от стадии заболевания [143]. У больных раком почки уровень этого птерина регистрировался в пределах цифр контрольной группы. Данный факт идет в противоречие с данными литературы. Так, в работе [136] повышение содержания неоптерина отмечено у 65 % больных раком почки, независимо от стадии болезни. Мы склонны объяснить это тем, что в данной выборке злокачественный процесс выявлен на 1 и 2 стадии, когда иммунологическая картина не столь развернута. Кроме того, возможно, это объясняется повышенной экскрецией данного птерина пораженной почкой.

Исследование продукции неоптерина позволило определить различия в содержании данного метаболита в сыворотке крови в финале послеоперационного периода. У больных раком желудка наблюдалось значительное понижение уровня неоптерина и даже вплоть до величин показателей здоровых лиц. Одни из наиболее существенных различий обнаружены в группе больных колоректальным раком. Отмечено весьма значительное повышение продукции неоптерина с высокой степенью разницы по сравнению с нормой и до проведенного лечения. В данном случае, вероятно влияние мощного ятрогенного эффекта оперативного вмешательства.

В группе больных раком молочной железы содержание неоптерина имело некоторую тенденцию к снижению, оставаясь однако, в пределах тех значений, что были до проведенного хирургического лечения. У пациентов прооперированных по поводу рака почки, продукция данного вещества резко снижалась и статистически значимо отличался как от цифр контроля, так и от значений неоптерина до проводимого лечения.

Полученные данные о содержании неоптерина в данных группах онкобольных совпадают с результатами других авторов. [189, 184]. Кроме того, отдельные исследователи утверждают, что как правило, уровень неоптерина коррелирует со стадией заболевания, при некоторых формах злокачественных новообразований, например, но при раке желудка, толстого кишечника и почки, такой закономерности не прослеживается [10].

Известно, что к центральным регуляторам иммунологического гомеостаза в организме относятся цитокины, обладающие чрезвычайно широким спектром биологических эффектов. При опухолевом росте нередко изменяется характер взаимодействий в системе «иммунокомпетентные клетки - цитокины», что может лежать в основе нарушений механизмов реализации противоопухолевой защиты организма. [3].

Известно, что а-ФНО посредством высокоаффинных рецепторов взаимодействует с большинством клеток [11]. Он участвует в формировании многих иммунобиологических феноменов в тканях организма, способен изменять реакции лимфоцитов при воспалении. Ему принадлежит важная роль в развитии антибактериального, антипаразитарного, антивирусного иммунитета и противоопухолевых реакций. а-ФНО является ключевым медиатором воспалительных процессов и клеточных иммунных реакций.

Нами установлено незначительное повышение уровня а-ФНО у всех исследуемых больных, но достоверно значимое увеличение наблюдалось только у больных раком желудка. Кроме того, проведенное хирургическое лечение практически не отразилось на продукцию этого пептида. Так Н. Н. Бабышкина и соавт. также не обнаружили статистически подтвержденных данных увеличения концентрации этого цитокина [3]. Совокупность полученных фактов указывает на достаточно низкий активационный потенциал клеток - продуцентов этих щггокинов у больных с онкопатологией.

Как известно, провоспалительный цитокин у-интерферон обладает широким спектром биологических эффектов: противовирусной и тумороцидной активности), активирует моноциты и макрофаги (продукцию цитокинов, кислородный метаболизм, экспрессию адгезивных молекул), NK-клетки (цитотоксичность), пролиферацию и дифференцировку Т-лимфоцитов, стимулирует созревание костномозговых клеток -предшественников моноцитов, подавляет опухолевый рост, размножение вирусов в клетках, пролиферацию, продукцию и секрецию противовоспалительных лимфокинов Tli 2 лимфоцитами (ИЛ-4, ИЛ-10 и др.), пролиферацию В-лимфоцитов и синтез Ig Е, пролиферацию соматических клеток, усиливает дифференцировку опухолевых клеток, противовирусную, противомикробную и антипаразитарную резистентность, тумороцидную активность ФНО-а и противовирусную активность а-интерферона, индуцирует антигенпрсзентацию [22].

Учитывая вышеизложенное, логичным выглядит выявленный нами подъём цифр ИФ-у у всех больных с онкопатологией в среднем более чем в 2 раза по сравнению с контрольной группой. После проведенного радикального хирургического лечения продукция данного лимфокина у больных раком желудка, почки, колоректальным раком значительно снижается, в отличие от значений ИФ-у у пациентов с РМЖ, которые оставались в их прежних границах. По всей видимости, циркуляция повышенного уровня этого провоспалительного цитокина в совокупности с показателями туморонекротического фактора-а свидетельствует о несостоятельности локальных иммунологических механизмов, и постоперативные изменения подтверждают напряженность работы системы иммунитета при исследуемой патологии.

Выяленные нами величины у-интерферона положительно коррелировали со значениями неоптерина у пациентов с раком желудка, почки как до, так и после оперативного лечения, обнаруженное явление имеет вполне логическое объяснение. Из данных литературы известно, что на анаболизм неоптерина в организме человека влияет высвобождающийся из Т-лимфоцитов и NK клеток у-интерферон, который активирует .ключевой фермент в цепочке превращения ГТФ в неоптерин. Так, в работе [122] in vitro было показано, что моноциты человека, стимулированные аллогенными или модифицированными клетками, выделяют в кулыуральную жидкость большое количество неоптерина. Дальнейшие опыты in vitro с участием Т-лимфоцитов и культуры макрофагов показали, что экскреция неоптерина является результатом комплексного взаимодействия клеток. В ответ на стимуляцию Т-клетки секретируют у-ИФ, который вызывает экскрецию неоптерина макрофагами. Клинико-лабораторные исследования подтвердили участие лимфокина в контроле за выделением неоптерина, поскольку заболевания, при которых происходит нарастание содержания интерферона, сопровождаются и повышенным уровнем птерина [35].

Таким образом, становится понятной выявленная взаимосвязь в продукции неоптерина и интерферона-у при аденокарциноме желудка и раке почек.

Наличие отрицательных корреляций между неоптерином и у-интерфероном у пациентов с колоректальным раком после лечения мы попытались объяснить следующим образом. Как было проиллюстрировано выше, активность ключевого фермента в синтезе всех птеридинов, в том числе и неоптерина, ГТФ циклогидролазы-I индуцируется у-ИФ. Но существует, так называемый, гамма-интерферон независимый путь синтеза неоптерина, который менее значим чем основной, но приводящий к умеренному увеличению его концентрации при бактериальных инвазиях.

Это связано со способностью пнрогенов, а именно липополисахаридов клеточной стенки бактерий, индуцировать снижение экспрессии ГТФ циклогидролазы-I регуляторным белком GFRP. Вышеназванный регулятор является активатором ГТФ циклогидролазы-I, с последующей генерацией всего спектра птеридинов в том числе и неоптерина [35]. Вероятно, имело место воздействие микробного пейзажа толстого кишечника липополисахарид ассоциированным путем на продукцию последнего в данной группе больных после оперативного вмешательства.

Стоит так же отметить, что основной механизм, провоцирующий невысокий рост концентрации неоптерина при острых бактериальных инфекциях, связан со способностью пнрогенов стимулировать продукцию у-ИФ Т-клетками, без вовлечения туморонекротического фактора-а, [58, 190, 159, 55, 91, 138], чего в данном случае не наблюдалось.

У больных раком молочной железы подобные взаимосвязи мало актуальны, поскольку уровень неоптерина был увеличен, но достоверно не отличался от цифр контроля. Возможно, это связано с тем, что в изучаемом варианте озлокачествления малигнизация гормонально зависима и, как известно, сопровождается фоновым увеличением секреции эстрогенов, и соответственно, гипосекрецией прогестинов. Поскольку последние по механизму действия сходны с глюкокортикостероидами, то возможно на производство неоптерина они воздействуют аналогичным образом. В главе I указано, что глюкокортикоиды селективно подавляют продукцию цитокинов Тх-1 профиля, в частности у-ИФ, антигенпрезентирующими и Т-клетками, приводя к сдвигу иммунного ответа по Тх-2 гуморальному пути с образованием всего спектра противовоспалительных цитокинов [70]. Также, оговаривается факт снижения экспрессии мРНК ГТФ ЦГ-1 в различных клетках организма, вызванном глюкокортикоидами [123, 81, 126, 85]. Следствием вышеописанных эффектов и является снижение уровня неоптерина в организме при применении данных гормонов [61]. Безусловно, этот вопрос заслуживает внимания, но так как отсутствуют достаточно четкие сведения из литературных источников, которые подтверждали бы либо опровергали бы высказанное предположение, мы полученные результаты оставляем без попыток их объяснения.

Механизмы функционирования системы комплемента при неопластических процессах недостаточно изучены. Роль комплементарной системы при опухолевых процессах без учета протеолитической активности плазмы была изучена рядом авторов. Полученные результаты весьма противоречивы: отмечены изменения значений некоторых компонентов комплемента при опухолевых процессах [17, 23, 119, 152].

Полученные нами результаты свидетельствуют о наличии общих тенденций в активации иммунологического процесса у онкологических больных. Обращает на себя внимание многократное увеличение концентрации отдельных компонентов системы: СЗа и С5а факторов на фоне относительно низкой гемолитической активности в классическом пути активации комплемента. Кроме того, значительный рост цифр С1-ингибитора во всех группах свидетельствует о напряженном регулировании процессов связанных с расходом первого компонента комплемента, и соответствующее снижение фактора Н косвенно указывают на активацию комплемента альтернативным путем, что совпадает с мнением других авторов. G. Pontoeri et al. [156] считают, что в основе этого явления лежит потребление компонентов CI, С4 и С2 иммунными комплексами при опухолях. Данные F. Praz et al. [158] регистрируют активацию альтернативного пути лимфоцитами больных хроническим лимфолейкозом в отличие от клеток при других формах лейкозов и нормальных лейкоцитов; причины этого явления окончательно не выяснены.

Неопластические процессы, особенно злокачественные, сопровождаются неспецифическими изменениями ферментативных систем организма человека. В норме протеазы играют существенную роль в обменных и регуляторных процессах. Механизмы протеолитического контроля высокоэффективны в клетке благодаря их структурной простоте и энергетической экономичности. Реакции протеолиза необратимы и одноступенчаты, и поэтому их результат всегда однозначен. Протеолитический контроль, являясь относительно самостоятельным регуляторным явлением, имеет точки сопряжения с эволюционно более поздними и динамичными сигнальными механизмами. Однако в нормоцитах именно этот процесс предопределяет итоговый ответ клетки на внешнее воздействие, включая цитокины и другие гуморальные регуляторные молекулы иммунной системы.

В злокачественно трансформированных клетках возможности протеолиза ограничены, он осуществляется лишь некоторыми каспазами, а активность протеосомы и действие лизосомальных ферментов направлены лишь на определенные субстраты. Повышение выявляемой активности трипсина, эластазоподобных протеиназ, коллагеназы и катепсинов регистрируется при опухолевых заболеваниях пищеварительного тракта, легких и других органов и тканей [161, 181]. Избирательность в активности различного рода систем протеолиза резко снижает эффективность ответа малигнизированной клетки на проапоптотический и антипролиферативный сигналы цитокинов. Активация протеаз при онкопатологии может приводить к усилению ферментативного расщепления цитокинов, хемокинов, антител, компонентов комплемента, что, безусловно, влияет на состояние защитных свойств организма - факторов адаптивного и врожденного иммунитета. [23, 171]. В этой связи недостаточная активность системы протеолиза в злокачественно трансформированных клетках следует рассматриваться как цитоплазматический механизм формирования иммунной толерантности.

Таким образом, депрессия антипролиферативной и проапопто-тической составляющих действия цитокинов и комплементарной системы на малигнизированные клетки достигается уменьшением выраженности и интенсивности реакций протеолиза, которые в свою очередь обеспечиваются активностью протеосомы и/или соответствующих каспаз. [3]

У всех больных рассматриваемого спектра онкопатологий выявлены повышенные концентрации раково-эмбрионального антигена. Падение величин РЭА после хирургической коррекции во всех группах, кроме больных раком почки, согласно традиционным представлением является показателем эффективности проводимого лечения. У пациентов с аденокарциномой желудка уровень РЭА коррелировал с производством неоптерина. По всей видимости, это связано прежде всего с оперативным вмешательством, в ходе которой удалена озлокачествленная ткань продуцирующая данный онкомаркер. К сожалению, данное вещество обладает низкой специфичностью и обычно для повышения прогностической ценности и чувствительности в диагностике различных форм рака требует сочетанного применения с другими органоспецифическими маркерами злокачественного перерождения.

Таким образом, разработанный способ высокоэффективной жидкостной хроматографии с применением твердофазной экстракции и УФ детекции неоптерина, позволил нам определить уровень данного метаболита в сыворотке крови онкологических больных. Кроме того, при данных нозологических формах рака наблюдается увеличение концентрации неоптерина, гиперпродукция которого макрофагами связана с активаторным влиянием ИФ-у и ФНО-а. Данный факт косвенно свидетельствует об активации клеточного иммунитета при злокачественных опухолях. Проведенное хирургическое лечение онкологических больных оказывает различное влияние на вышеуказанные показатели. Изменения комплементарного статуса свидетельствуют о преимущественной активации альтернативного пути, а рост концентрации раково-эмбрионального антигена и молекул средней массы при всех локализациях рака носит неспецифический характер и является общей закономерностью злокачественного процесса.