Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Закономерности изменений окислительного стресса и системы глутатиона у мужчин репродуктивного возраста с бесплодием

На правах рукописи

ВАНТЕЕВА Ольга Андреевна

ЗАКОНОМЕРНОСТИ ИЗМЕНЕНИИ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА И СИСТЕМЫ ГЛУТАТИОНА У МУЖЧИН РЕПРОДУКТИВНОГО ВОЗРАСТА С БЕСПЛОДИЕМ

14.03.03 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

5 ДЕК 2013

Иркутск —2013

005543233

005543233

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

Научный руководитель:

доктор медицинских наук,

член-корр. РАМН, профессор Колесникова Любовь Ильинична

Официальные оппоненты:

Лабыгина Альбина Владимировна — доктор медицинских наук (Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук, руководитель лаборатории гинекологической эндокринологии).

Саловарова Валентина Петровна - доктор биологических наук, профессор (Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Иркутский государственный университет», заведующая кафедрой физико-химической биологии биолого-почвенного факультета).

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр клинической и экспериментальной медицины» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук, г. Новосибирск

Защита состоится «26» декабря 2013 г. в "/С ^часов на заседании диссертационного совета Д 001.038.02 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук по адресу: 664003, г. Иркутск, ул. Тимирязева, 16.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотекеФедерального государственного бюджетного учреждения «Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

Автореферат разослан « ЛЗ » ноября 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских нау] профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

На фоне тенденции к общему снижению рождаемости в развитых странах проблема бесплодия в семье приобретает не только медицинский, но и социальный аспект (Кулаков В.И., Лопатина Т.В., 2006; Лещенко О.Я., 2011). Частота бесплодия в России по данным эпидемиологических исследований составляет от 8,2 до 19,6 % (Кузьменко Е.Т., 2008). Актуальным является изучение патофизиологических механизмов бесплодия как у женщин, так и у мужчин.

По данным ряда авторов (Гаспаров A.C., 2000; Гребешева И.И., 2000; Гун-даров И.А., 2001; КорнееваИ.Е., 2003; ЛабыгинаА.В., 2010; Kolesnikova L.I. et al., 2012) частота бесплодного брака составляет 10-15 % от общего числа супружеских пар и не имеет тенденции к снижению. Традиционно ответственность за неудачу в наступлении беременности падает на женщину. В действительности обращает на себя внимание рост удельного веса мужского фактора. За последние двадцать лет он изменился с 30 до 50 % и продолжает расти, поэтому исследование репродуктивной функции мужчин является актуальной задачей (Корякин М.В., Акопян A.C., 2000; McLachlan R., deKrester D., 2001; НишлагЭ., 2005; Аляев Ю.Г., Григорян В.А., Чалый М.Е., 2006; Долгов В.В., 2006; Соловьева Ю.А., 2009; Колесникова Л.И. и др., 20126).

Известно много причинных факторов, нарушающих репродуктивное здоровье мужчин, среди которых можно выделить избыточную массу тела, ассоциирующуюся с нарушением функционирования такой неспецифической системы как перекисное окисление липидов и антиоксидантная защита (ПОЛ-АОЗ) (Furukawa S. etal.,2004;AgarwalA., Said Т.М., 2004; Sallmen M., 2006; Сафроненко A.B., 2008; Rytter E. et al., 2010; Колесникова Л.И. и др., 2010).

Распространенность избыточного веса в России, хотя пока она и не привлекает слишком большого внимания, уже стала социально-экономической и демографической проблемой, требующей решения. По оценкам ВОЗ, Россия занимает 13 место среди 30 развитых стран по уровню распространенности избыточной массы тела, которая негативно влияет не только на физическое состояние здоровья, но и на социальную активность индивидов (Сутури-на Л.В., Колесникова Л.И., 2001; Бессен Д.Г., 2004; Ильин В.П. и др., 2004; Колесникова Л.И. и др., 2007; Загарских ЕЛО., 2011). Наличие избыточного веса сопряжено с рядом хронических заболеваний, таких как диабет, гипертония, хронические заболевания сердца и печени (Мельниченко Г.А., Роман-цова Т.И., 2004; Flegal K.M. et al., 2005; Caballero В., 2007; Keski-Rahkonen А. et al., 2007). Чем больше жировой ткани, тем ниже количество тестостерона

и его активность. У большинства мужчин с повышенным весом нарушается углеводный и жировой обмен, это нарушение также подавляет половую функцию (Jensen Т.К. et al., 2004).

Взаимосвязь избыточного веса и бесплодия у мужчин может быть обусловлена различными причинами, такими как уровень гормонов, образ жизни и питание, перегревание яичек, вызванное избытками жировых тканей в этой области, а также изменение активности системы ПОЛ-АОЗ, которая является важной метаболической характеристикой для обоих изучаемых состояний (Agarwal А. et al., 2004; Хлякина О.В., 2011). Вместе с тем, конкретные детали состояния ПОЛ-АОЗ в контексте взаимосвязи избыточного веса и бесплодия у мужчин изучены недостаточно, что сдерживает разработку оптимальных режимов воздействия на редокс-системы мужчин с целью решения проблемы инфертильности.

При патологических состояниях в организме баланс в системе ПОЛ-АОЗ изменяется, приводя к развитию окислительного стресса (Меныцикова Е.Б., Ланкин В.З., Зенков Н.К., 2006). Дисбаланс этой системы сопровождает или является причиной более двухсот заболеваний у человека (Зенков Н.К., Ланкин В.З., Меныцикова Е.Б., 2001; Меньшикова Е.Б. и др., 2008). В литературе последнего десятилетия имеются данные, свидетельствующие о том, что важным патогенетическим звеном при развитии мужского бесплодия (независимо от этиологии) является наличие окислительного стресса (Agarwal А., Sushil Р., 2005; Agarwal А„ Probhakaran S.A., Sikka S.C., 2007; Agarwal А., Makker К., Sharma R., 2008; Tremellen К., 2008; Быкова M.B., 2008; Сухих Г.Т., Божедомов В.А., 2009; Дашиев Б.Г., 2011; Колесникова Л.И. и др., 2011а; Колесникова Л.И. и др., 20126).

Исходя из вышеизложенного, целью настоящего исследования явилось изучение особенностей изменений активности процессов липопероксидации, ферментативных и неферментативных звеньев антиоксидантной защиты у мужчин репродуктивного возраста с бесплодием в зависимости от индекса массы тела для обоснования рекомендаций по коррекции нарушенного анти-оксидантного статуса.

В соответствии с поставленной целью последовательно решались следующие задачи:

1. оценить интенсивность процессов перекисного окисления липидов в крови мужчин репродуктивного возраста с бесплодием в зависимости от индекса массы тела (ИМТ);

2. определить общую антиокислительную активность крови (ОАА) и ее некоторые компоненты в крови мужчин репродуктивного возраста с бесплодием в зависимости от индекса массы тела;

3. исследовать активность ферментативного звена антиоксидантной системы-гаутатионпероксидазы (GPO), гаутатионредуктазы (GR), гаутатион-4

S-трансферазы (GST), супероксиддисмутазы (СОД) - в крови мужчин репродуктивного возраста с бесплодием в зависимости от индекса массы тела;

4. оценить уровень окислительного стресса у мужчин с бесплодием с помощью интегральных показателей;

5. обосновать рекомендации по коррекции нарушенного антиоксидант-ного статуса с учетом выявленных особенностей в системе гаутатиона у мужчин репродуктивного возраста с бесплодием.

Научная новизна

Впервые система шутатиона изучена в достаточно полном объеме, исследованы глутатионзависимые ферменты - глутатионредуктаза, гаутатион-пероксидаза и глутатион-Б-трансфераза.

Впервые установлено, что у мужчин с бесплодием с нормальным значением индекса массы тела по сравнению с фертильными мужчинами отмечается значительное накопление содержания первичных, вторичных и третичных продуктов ПОЛ, что характеризует развитие окислительного стресса в данной группе. В отличие от группы мужчин с бесплодием с нормальной массой тела в группе бесплодных мужчин с ИМТ = 25,0-29,9 регистрируется увеличение уровней диеновых конъюгатов (ДК) и активных продуктов тиобарбитуровой кислоты (ТБК-АП). Приоритетными данными является обнаружение двукратного увеличения содержания общих липидов у мужчин с ИМТ = 25,0-29,9 по сравнению с мужчинами группы с ИМТ = 18,5-24,9.

В отличие от контрольной группы у мужчин с бесплодием с нормальной массой тела выявлено увеличение уровня общей антиокислительной активности крови, концентрации а-токоферола на фоне снижения активности СОД. Система АОЗ у мужчин с бесплодием с избыточной массой тела по сравнению с фертильными мужчинами характеризуется повышением уровня ОАА крови, ассоциированным со снижением концентрации ретинола, восстановленного гаутатиона и активности СОД.

Выявлены новые данные, которые свидетельствуют о снижении содержания восстановленного гаутатиона (GSH) у мужчин с бесплодием (ИМТ = 18-25), в сочетании со снижением активности ферментов - глутатионредук-тазы и гаутатионпероксидазы-и повышением уровня активности гаутагион-S-трансферазы по сравнению с группой контроля. В группе мужчин с ИМТ = 25,0-29,9 по сравнению с фертильными мужчинами отмечаются те же самые соотношения компонентов ферментативного звена, за исключением стабильного уровня G5T; концентрация восстановленного глутатиона снижается, а окисленного (GSSG) - повышается. У мужчин с бесплодием с повышенным индексом массы тела по сравнению с мужчинами с бесплодием с нормальным индексом наблюдается увеличение уровня GSSG со снижением активности глутатион-8-трансферазы.

Впервые в группах мужчин с бесплодием с различным ИМТ использованы интегральные показатели - коэффициент окислительного стресса (КОС) и степень окисленности липидов (СОЛ), отражающие суммарную активность исследуемых параметров и скорость процесса липопероксидации.

Теоретическая и практическая значимость

Результаты диссертационной работы раскрыли новые механизмы участия системы ПОЛ-ЛОЗ в формировании феномена бесплодия, ассоциированного с избыточной массой тела, что в перспективе может стать фундаментом для разработки новых методических подходов для лечения этого сочетанного патологического состояния. Применение интегральных показателей, которые являются более чувствительными при оценке нарушений антиоксидантного статуса и развития окислительного стресса по сравнению с отдельными показателями, у мужчин с бесплодием является целесообразным для назначения метаболической коррекции выявленных нарушений. Комплексное изучение всех продуктов ПОЛ и антиоксидантов дает возможности для персонифицированного подхода к коррекции.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Окислительный стресс при бесплодии у мужчин наиболее выражен в группе пациентов с избыточной массой тела.

2. В группе бесплодных мужчин с нормальной массой тела окислительный стресс формируется за счет интенсификации процессов ПОЛ на стадии образования КД-СТ, а в группе с избыточной массой тела - на стадии образования ДК и ТБК-АП.

3. В системе антиоксидантной защиты у мужчин с бесплодием выявлен дисбаланс тиолдисульфидной системы, который проявляется снижением содержания восстановленного шутатиона, активности шутатионзависимых ферментов и увеличением концентрации окисленной формы шутатиона. В группе мужчин с повышенным индексом массы тела отмечается также снижение содержания эндогенных антиоксидантов в крови - ретинола и а-токоферола.

Апробация работы

Материалы диссертации представлены и обсуждены на Всероссийской научно-практической конференция студентов и молодых ученых с международным участием, посвященной 65-летИю СНО ЯГМА «Актуальные вопросы медицинской науки», Ярославль, 20-22 апреля, 2011, ХЕХ Россий-скомнациональном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 23-27 апреля, 2012), 8-ой международной крымской конференции «Окислительный стресс и свободнорадикальные патологии» (Судак, Украина, 22-28 сентября, 2012), 9-ой международной Крымской конференции «Окислительный стресс и свободнорадикальные патологии» (Судак, Украина, 16-25 сентября, 2013). 6

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 13 научных работ, в том числе 8 в журналах и изданиях, рекомендуемых ВАК Минобразования и науки РФ.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 111 страницах машинописного текста и состоит из введения, 3 глав, заключения, выводов и списка литературы. Текст диссертации иллюстрирован 20 таблицами и 3 рисунками. Список литературы включает 236 наименований, из них -131 на русском и 105 - на иностранных языках.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

По результатам клинико-лабораторного обследования были сформированы следующие группы для исследования состояния процессов ПОЛ-АОЗ: 60 мужчин с бесплодием разделены на 2 группы: 1 -ая группа с ИМТ = 18,5-24,9 ± 1,9 кг/м2 в возрасте 29 ± 0,63 года (л = 30); 2-ая группа с ИМТ = 25,0-29,9 ± 2,5 кг/м2 в возрасте 27 ± 0,63 года (п = 30). Контрольную группу составили практически здоровые мужчины с ИМТ = 18,5-24,9 ± 1,7 кг/м2 в возрасте 30 ± 0,69 года (п = 40) с доказанной фертильностью на момент исследования. Индекс массы тела рассчитывался по G. Вгеу (1978): масса тела, кг / рост, м2. Основополагающим методом диагностики мужского бесплодия явилось исследование эякулята, которое проводилось согласно документу «Руководство ВОЗ по лабораторному исследованию эякулята и спермо-цервикального взаимодействия» (ВОЗ, 2001) двукратно с минимальным интервалом 2 недели. В ходе клинического обследования пациентов, состоящих в бесплодном браке, установлены причины бесплодия согласно рекомендациям ВОЗ (WHO, 1993). Чаще были диагностированы воспаление придаточных половых желез, варикоцеле и изолированная патология семенной плазмы.

В качестве материала для исследований использовались сыворотка крови и гемолизат, приготовленный из эритроцитов. Забор крови проводился из локтевой вены, в соответствии с общепринятыми требованиями. Получение информированного согласия на участие в проводимом исследовании являлось обязательной процедурой при включении мужчин в одну из групп. В работе с больными соблюдались этические принципы, предъявляемые Хельсинкской Декларацией Всемирной медицинской ассоциации (World Médical Association Déclaration of Helsinki (1964,2008 ред.)).

Все мужчины прошли комплексное обследование у различных профильных специалистов (уролог, андролог, невропатолог, терапевт и др.), в результате чего были сформированы группы сравнения.

Критерии включения в группу с бесплодием:

• возраст от 22 до 37 лет;

• неспособность зачать ребенка в течение 1 года и более;

• патозооспермия;

• информированное согласие пациента на исследование.

Критерии включения в контрольную группу:

• возраст от 22 до 37 лет;

• реализованная фертильная функция;

• нормозооспермия;

• отсутствие на момент обследования острого заболевания или обострения хронического заболевания;

• информированное согласие пациента па исследование.

Критерия исключения:

• несоответствие критериям включения;

• наличие тяжелых соматических заболеваний;

• эндокринное бесплодие.

Группы мужчин с бесплодием были сопоставимы по всем признакам, отличались только по значению индекса массы тела.

Методы исследования

Лабораторные методы исследования. Интенсивность процессов и содержание субстратов липопероксидации в плазме оценивали по уровню общих липидов (OJJ, г/л); степень ненасыщенности плазмы (двойные связи, усл. ед., диеновые конъюгаты, мкмоль/л) по И.А. Волчегорскому с соаэт. (1989) и по В.Б. Гаврилову, Н.И. Мишкорудной (1983); концентрацию кетодиенов и сопряженных триенов (усл. ед.), а также уровень активных продуктов тиобарбитуровой кислоты (мкмоль/л) по В.Б. Гаврилову с соавт. (1987). Параллельно в плазме определяли общую антиокислительную активность (усл. ед.) (Клебанов Г.И. с соавт., 1989), концентрацию ретинола и а-токоферола (мкмоль/л) по Р.Ч. Черняускене с соавт. (1984). В эритроцитарном цитолизате в условных единицах определяли активность СОД (Misra Н.Р., Fridovich I., 1972), концентрацию (ммоль/л) восстановленного и окисленного глутати-она (Hissin P.Y., Hilf R., 1976); активность глутатионзависимых ферментов (мкмоль в мин/л) определяли по А.И. Карпищенко (2002).

Для оценки состояния липопероксидации был использован коэффициент степени окисленности липидов (СОЛ), который рассчитывается как соотношение уровня продукта к содержанию предыдущего интермедиата; для оценки степени окислительного стресса был использован коэффициент окислительного стресса (КОС) (Матвеев С.Б., Пахомова Г.В., Кифус Ф.В., 2005; Пат. 2011617323 РФ, 2011; Kolesnikova L.I. et al„ 2013).

Статистические методы исследования. Статистический анализ данных проводили с применением программы Statistica 6.1 Statsoft Inc., США (право-8

обладатель лицензии ФГБУ РАМН «Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека» Сибирского отделения РАМН). Данные представлены в виде среднегрупповых значений показателей и среднеквадратичного отклонения (М ± а, где М - среднее арифметическое, а - стандартное отклонение). Для оценки статистически значимых различий полученных данных использовали критерий Стъюдента. Выбранный критический уровень значимости принимался менее или равным 5 % (Р < 0,05). Анализ взаимосвязей показателей проводили методом ранговой корреляции Спирмена. Анализ межгрупповых различий для двух независимых выборок по каждому из ненормально распределенных количественных признаков проводили непараметрическим критерием Колмогорова-Смирнова (К^ез^. Критерий %2 использовался для анализа межгрупповых различий по качественным признакам.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Показатели системы ПОЛ-АОЗу мужчин с бесплодием с нормальной массой тела и в группе практически здоровых фертильных мужчин

Результаты исследования процессов перекисного окисления липидов у фертильных мужчин и пациентов с бесплодием с нормальной массой тела представлены на рисунке 1. Содержание субстратов с ненасыщенными двойными связями и концентрация общих липидов у мужчин с бесплодием с нормальным ИМТ значимо не отличаются от показателей контрольной группы. Концентрация первичных продуктов окисления ДК в крови пациентов с бесплодием с нормальной массой тела по сравнению с контрольными значениями выше на 23,81 %. Уровень промежуточных продуктов - КД-СТ в крови достоверно превышает контрольные показатели на 53,33 %. Содержание 7£7^-активных продуктов также достоверно выше, чем в контрольной группе на 24,21 %, что характеризует активацию процессов ПОЛ. Накопление продуктов липопероксидации свидетельствует о напряженной работе защитных сил клетки.

Уровень общей антиокислительной активности в сыворотке крови мужчин с бесплодием с ИМТ = 18,5-24,9 (рис. 2) достоверно отличается и превышает контрольные значения на 22,21 %. Содержание а-токоферола в крови мужчин с бесплодием так же повышено на 22,82 %. Альфа-токоферол выполняет несколько функций, дающих в совокупности антиоксидантный эффект. Являясь ловушкой радикалов витамин Е активно участвует в блокировке процессов липопероксидации, и повышение его концентрации, возможно, связано с избыточным образованием свободных радикалов в процессе ПОЛ. Активность супероксиддисмутазы в группе мужчин с нормальной массой тела снижена по сравнению с контрольным значением. Снижение активно-

9

сти СОД уменьшает инактивацию супероксидного радикала, что приводит к нарастанию степени окислительного стресса.

60

50 40 30 20 10 о -10

ол

ДвСв

дк

КД-СТ ТБК-АП

Рис. 1. Относительные величины показателей процессов липопероксидации в крови у мужчин с бесплодием и нормальной массой тела (0 - уровень показателей контрольной группы, принятый за 100 %; * - уровень значимости < 0,05).

40,00 30,00 20,00 10,00 0,00 -10,00 -20,00 -30,00 -40,00 -50,00 -60,00

r S X

,о

С? с

Рис. 2. Относительные величины показателей системы АОЗ в крови у мужчин с бесплодием и нормальной массой тела (0 - уровень показателей контрольной группы, принятый за 100 %; * - уровень значимости < 0,05).

При исследовании глутатионзависимых ферментов у мужчин с бесплодием (ИМТ = 18,5-24,9) и в группе контроля установлено, что достоверно снижена на 53,41 % активность глутатионредуктазы и на 51,44 % - активность глутатионпероксидазы. Глутатион-Б-трансферазная активность на 31,52 % выше в группе бесплодных мужчин. Повышение активности GST можно объяснить истощением пула GPO, т.к. в нормально функционирующей клетке эти два фермента работают совместно. Восстанавливая GOT они

предупреждают прогрессирование пероксидации и появление ее вторичных метаболитов. При снижении активности глутатионпероксидазы, глутати-онтрансфераза мобилизуется и ее активность увеличивается. СБТ является важным компонентом антиоксидантной защиты от реакционных эндогенных метаболитов, образующихся при окислительном стрессе. Снижение активности глутатионредуктазы возможно связано с ее активным участием в процессе биорегенерации окисленного глутатиона, количество которого возрастает при окислительном стрессе.

Показатели системы ПОЛ-АОЗу мужчин с бесплодием с избыточной массой тела и в группе практически здоровых фертильных мужчин

У мужчин из группы с бесплодием с избыточной массой тела содержание субстратов с ненасыщенными двойными связями сопоставимо с показателями контрольной группы. Уровень общих липидов в крови у мужчин с избыточной массой тела (рис. 3) в 1,9 раза превышает значения контрольной группы. Содержание первичных продуктов окисления -ДК-в крови мужчин с ИМТ = 25,0-29,9 достоверно выше в 1,7 раза по сравнению с контрольными показателями. Уровни промежуточных продуктов в крови -КД-СТ- достоверно значимо не отличались друг от друга. При этом отмечена дальнейшая активация процессов пероксидации липидов, о чем свидетельствует увеличение концентрации конечных П^-активных продуктов у пациентов с избыточной массой тела в 1,4 раза.

*

*

*

с )Л ПАПК ДК КД-СТ ТБК-АП

Рис. 3. Относительные величины показателей процессов липопероксидации в крови у мужчин с бесплодием и избыточной массой тела (0 - уровень показателей контрольной группы, принятый за 100 %; * - уровень значимости < 0,05).

Такая активация процессов ПОЛ предполагает значительное напряжение антиоксидантной системы у исследуемых пациентов. Общая антиокислитель-

ная активность крови характеризует суммарную активность ингибиторов радикального окисления и определяет ее буферную емкость. Этот показатель включает большое количество антиоксидантов различной природы. Уровень ОАА в группе мужчин с ИМТ = 25,0-29,9 достоверно превышает показатель контрольной группы на 39,79 % (рис. 4).

В процессе ПОЛ снижается также активность ферментов антиоксидант-ной защиты, в частности, супероксидцисмутазы. Одновременно уменьшается количество практически всех водо- и жирорастворимых антиоксидантов. В крови мужчин с избыточной массой тела активность СОД (1,76 ± 0,06 против 1,82 ± 0,07) и концентрация ретинола ниже показателей контрольной группы на 21,74 %.

Снижение концентрации ретинола обусловлено участием витамина в антиоксидантной защите. Благодаря наличию сопряженных двойных связей в молекуле, ретинол как эффективный антиоксидант взаимодействует со свободными радикалами различных видов и одновременно значительно усиливает антиоксидантное действие а-токоферола, обеспечивая его стационарный уровень. Статистически значимое уменьшение содержания ретинола в крови у пациентов регистрировали одновременно с увеличением содержания а-токоферола.

В группе мужчин с бесплодием и избыточной массой тела по сравнению с группой контроля установлено статистически значимое снижение концентрации восстановленного глутатиона на 20,08 % и увеличение на 20,38 % содержания окисленного глутатиона. Возможно, быстрое включение СБН в процессы антиоксидантного окисления понижает его концентрацию в гемолизате и не приводит к накоплению. Снижение уровня восстановленного глутатиона ведет к повышению доступности мембраны для токсического воздействия продуктов перекисного окисления липидов, а увеличение содержания окисленного глутатиона является результатом снижения антиоксидантной защиты клеток. Повышение содержания СЯЯС в крови, в свою очередь, может вызвать окисление тиоловых групп белков и их инактивацию, что приведет к ускорению развития окислительного стресса.

При исследовании ферментов глутатионового ряда установлено достоверно значимое снижение активности глутатионредуктазы на 56,77 % и глутати-онпероксидазы на 56,22 % по сравнению со значениями контрольной группы. Недостаток восстановленного глутатиона, который является субстратом для глутатионпероксидаз, приводит к снижению активности ОРО в эритроцитах мужчин с бесплодием. Глутатионредуктаза, восстанавливающая окисленный глутатион, находится в угнетенном состоянии. Активность глутатионтранс-феразы практически не изменилась.

Рис. 4. Относительные величины показателей системы АОЗ в крови у мужчин с бесплодием и избыточной массой тела (0 - уровень показателей контрольной группы, принятый за 100 %; * - уровень значимости <0,05).

Показатели системы ПОЛ-АОЗ у мужчин с бесплодием с различными ИМТ

При сравнении уровней субстратов окисления у бесплодных мужчин с различными индексами массы тела (рис. 5) установлены незначительные различия в содержании двойных связей. А важный показатель липидного обмена, общие липиды, достоверно выше в 1,9 раза у мужчин с избыточной массой тела, что отражает нарушение их обмена веществ. Повышение уровней ТБК-реактантов и диеновых конъюгагов в сыворотке крови (на 10,94 % и 25,10 % соответственно) в группе с ИМТ = 25,0-29,9 свидетельствует не только об интенсивности метаболизма продуктов ПОЛ, что хорошо известно в клинике многих заболеваний, но, вероятно, и о более медленной детоксикации этих веществ в организме. Повышение промежуточных продуктов НОЯ-КД-СТъ 1,5 раза у мужчин с нормальной массой тела показывает, что и в этой группе процессы евободнорадикально1 о окисления протекают интенсивно.

Активация процессов липопероксидации у мужчин с избыточной массой тела развилась за счет недостаточности антиоксидантной защиты крови. Так, концентрация ретинола в этой группе снижена на 26,03 %, а-токоферола—на 15,55 % и на 23,50 % снижена активность глутатион-Б-трансферазы по сравнению с показателями мужчин с нормальной массой тела (рис. 6). У бесплодных мужчин с высоким ИМТ содержание СЯН практически не отличается от аналогичного параметра инфертильных мужчин с нормальным ИМТ. Важно отметить, что этот феномен наблюдается на фоне повышения содержания 77>Л"-реактантов. Содержание окисленного гаутатиона статистически значимо повышено на 15,35 % в группе мужчин с избыточной массой тела. Повышение концентрации СББС, вероятно, неслучайно и может быть объяснено наличием

у окисленного глутатиона дополнительных функций, которые реализуются при повышении ИМТ, особенно в ассоциации с бесплодием.

60 50 40 30 20 10 0 -10 -20 -30 •40

_ОЛ

ДаСй

дк_

КД-СТ__1ЕКгАП_

Рис. 5. Относительные величины показателей процессов липопероксидации в крови у мужчин с бесплодием с различными индексами массы тела (0 - уровень показателей группы с ИМТ = 18,5-24,9, принятый за 100 %; * - уровень значимости < 0,05).

20,00 15,00 10,00 5,00 0,00 -5,00 -10,00 -15,00 -20,00 -25,00 -30,00

_°__° & &

#-

© .

«О

Рис. 6. Относительные величины показателей системы АОЗ в крови у мужчин с бесплодием с различными индексами массы тела (О - уровень показателей группы с ИМТ = 18,5-24,9, принятый за 100 %; * - уровень значимости < 0,05).

Использование интегральных показателей для оценки окислительного стресса у мужчин с бесплодием

Коэффициент степени окисленности липидов (СОЛ) применяется для оценки скорости перекисного окисления липидов на разных этапах реакций ПОЛ. Расчет количественного отношения образующихся токсичных веществ пероксидации к продуктам предыдущей стадии реакции позволяет оценить скорость окислительных процессов. Оценка коэффициента СОЛ, предло-

женная в работе Биленко М.В. (1989) проводится по соотношению величины светопоглощения липидного экстракта при 232 нм к ее величине при 220 нм: СОЛ, =ДК/Дв.св.

В работе использовалась подобная оценка степени окисленности ли-пидов, а также предложенные ранее расчеты СОЛ на последующих этапах липопероксидации (Натяганова Л.В., 2010):

сол2 = кд-ст/дк

СОЛ3 = ТБК-АП /КД-СТ

Результаты оценки степени окисленности липидов на трех стадиях процессов липопероксидации у мужчин с бесплодием по сравнению с показателями контрольной группы представлены в таблице 1.

Таблица 1

Степень окисленности липидов (СОЛ) у мужчин с бесплодием и различными индексами массы тела (М ± а)

Группа СОЛ 1 % по отношению к контролю СОЛ 1 % по отношению к контролю СОЛ ] %по отношению к контролю

М±0 М±а М ± а

Контроль 0,28 ±0,11 100 0,73 ±0,52 100 0,20 ±0,12 100

Бесплодие, ИМТ = 18,5-24,9 0,36 ±0,14* +28,6 0,87 ± 0,49 + 19,2 0,17 ±0,18 -15,0

Бесплодие, ИМТ = 25,0-29,9 0,54 ±0,23* +92,9 0,42 ±0,18* -42,5 0,21 ±0,09* +5,0

Примечание: * - уровень значимости < 0,05.

Как свидетельствуют полученные расчеты, коэффициент СОЛ] у мужчин с бесплодием по отношению к показателям группы контроля увеличивается, то есть интенсивность окисления Дв.св. до ДК у обследованных пациентов снижается. Интенсивность процессов ПОЛ на первой стадии липопероксидации невысока.

Степень окисления липидов на второй стадии процесса липопероксидации, вычисленная по формуле КД-СТ / ДК, превышает контрольные показатели у пациентов с бесплодием и нормальной массой тела на 19,2 %. Замедление процессов ПОЛ на промежуточной стадии у пациентов с ИМТ = 18,5-24,9 свидетельствует о накоплении у них недоокисленных продуктов пероксидации.

Процессы окисления липидов у пациентов на следующей стадии, вычисленные по формуле ТБК-АП / КД-СТ, свидетельствуют о более высокой скорости окисления метаболитов у мужчин с нормальной массой тела и, соответственно, уменьшении их содержания по сравнению с контролем. Данный вывод иллюстрируется уменьшением коэффициента СОЛ3 в данной группе на 15,0 %. В то же время, в группе мужчин с избыточной массой тела интенсив-

ность окисления на этом этапе замедляется, о чем свидетельствует коэффициент СОЛ3, превышающий контрольные показатели на 5,0 %. Более активные реакции процессов липопероксидаций у пациентов с ИМТ = 18,5—24,9, по сравнению с пациентами с избыточной массой тела, можно расценивать как наличие компенсаторных реакций, поддерживающих процессы ПОЛ-АОЗ у пациентов с относительно более легкой формой патологического процесса.

Таким образом, полученные результаты демонстрируют, что у мужчин с бесплодием с нормальным индексом массы тела активация ПОЛ наиболее выражена на стадии образования промежуточных продуктов липопероксида-ции —КД-СТ, а у пациентов с повышенным индексом — на стадии образования конечных продуктов — ТБК-АП.

С целью индивидуальной оценки окислительного стресса у мужчин с бесплодием использовали формулу расчета коэффициента окислительного стресса (КОС) (Матвеев С.Б., Пахомова Г.В., Кифус Ф.В., 2005; Пат. 2011617323 РФ, 2011).

Для расчета в формуле величины КОС используются следующие показатели ПОЛ-АОЗ: содержание Дв. св. (усл. ед.),Д/С (мкмоль/л), КД-СТ (усл. ед.), ТБК-АП (мкмоль/л), а-токоферола (мкмоль/л), ретинола (мкмоль/л), восстановленного глутатиона (ммоль/л), активность СОД (усл. ед.):

кос (Щв.св.Щв.св.п)^ЩКЩКп)НЩ-СТ1/КД-СТп)^(ТБК-АП1/ТБК-АПп)) ((СОДУСОДп)К(Е1/Еп)*(А!/АП)Х (СЯЮ/СЯНи)

где 1 — уровни показателей обследуемого пациента; п - уровни показателей контрольной группы.

При КОС > 1 регистрируют развитие окислительного стресса.

В формуле рассчитывается отношение показателей системы ПОЛ-АОЗ пациента с мужским бесплодием к среднегрупповым показателям контрольной группы. Эта формула разработана как для индивидуальной оценки состояния системы ПОЛ-АОЗ у конкретного пациента так и для оценки среднегрупповых показателей.

В норме коэффициент окислительного стресса стремится к условной 1 (Натяганова Л.В., 2010). Значение КОС > 1 рассматривается как нарастание степени окислительного стресса. Чем больше величина коэффициента окислительного стресса, тем более интенсивны процессы пероксидации липидов, и менее эффективна система АОЗ у обследуемых пациентов.

В качестве примера приведены показатели, рассчитанные для группы пациентов с уже известным диагнозом. Несмотря на выявленные общие тенденции в процессах формирования окислительного стресса у мужчин с бесплодием, в каждом конкретном случае применение этой формулы позволяет определить индивидуальные особенности процессов ПОЛ-АОЗ у конкретного пациента. Примеры расчета коэффициентов окислительного

стресса у пациентов с бесплодием с различными индексами массы тела представлены ниже.

Пример № 1

Константин К., 26 лет (индекс массы тела = 18,5-24,9)

Дв. св. - 3,22 усл. ед.;ДК- 1,60 мкмоль/л; КД-СТ-0,62 усл. ед; ТБК-АП

- 2,32 мкмоль/л; СОД- 1,46 усл. ед.; а -токоферол - 6,92 мкмоль/л; ретинол

- 0,67 мкмоль/л; йБН— 2,24 ммоль/л.

к _ ((3,22/2,60)х(1,60/1,47)х(0,62/0,45)х(2,32/1,90) _ 2,20 =3 & ~ ((1,46 /1,86) х (6,92 / 8,85) х (0,67/0,69) х (2,24 / 2,15) 0,61 '

КОС = 3,6 усл. ед.

Прггмер № 2

Сергей Б., 28 лет (индекс массы тела = 25,0-29,9)

Дв. св. -2,12 усл. ед.;ДЛ"-2,20 мкмоль/л;КД-СТ-0,60 усл. ед; ТБК-АП -3,19 мкмоль/л; СОД- 1,81 усл. ед.; а -токоферол - 8,77 мкмоль/л; ретинол

- 0,49 мкмоль/л; С$Н - 1,58 ммоль/л

кос _ ((2,12/2,60)х (2,20/1,47)х (0,60/0,45)х (3,19/1,90) = 2,75 = £ 4 ((1,81/1,82)х(8,77/8,85)х(0,49/0,69)х(1,58/2,15). 0,51 '

КОС = 5,4 усл. ед.

Сравнивая приведенные выше примеры, мы можем отметить, что протекание процессов ПОЛ-АОЗ различается. В примере № 2 достаточно высокое значение числителя дроби (прооксидантная составляющая = 2,75) обусловлено относительно высокими значениями отношений ДЮ/ДКп и ТБК-АПИ ТБК-АПп, что отражает не только более высокое, по сравнению с примером № 1, содержание первичных и вторичных продуктов пероксидации, но и более низкую интенсивность протекания реакций липопероксидации. На этих этапах, возможно, было бы целесообразным применение препаратов, содержащих антиоксидантные ферменты. В примере № 1 приведенная в знаменателе антиоксидантная составляющая (0,61) немного ниже контрольных значений, именно она в данном случае определяет высокое значение КОС, несмотря на то, что значения концентрации восстановленного глутатиона и ретинола практически на уровне контроля. Возможно, это объясняется дисбалансом концентрации жирорастворимого витамина а-токоферола и активности супероксиддисмутазы. Приведенная формула позволяет оценить, какие изменения происходят на каждом этапе процесса липопероксидации.

При оценке среднегрупповых показателей КОС у мужчин с бесплодием (табл. 2) установлено статистически значимое увеличение данного параметра в обеих группах. У мужчин с избыточной массой тела коэффициент превышает контрольный показатель на 333,16 %, что говорит о более тяжелой степени окислительного стресса.

Таблица 2

Коэффициент окислительного стресса (КОС) у мужчин с бесплодием и различными индексами массы тела (М ± с)

Группа КОС % по отношению

М±о к контролю

Бесплодие, ИМТ = 18,5-24,9 2,74 ± 1,83* 174,0

Бесплодие, ИМТ = 25,0-29,9 4,33 ±2,27* 333,16

Примечание: * - уровень значимости < 0,05.

Мужчины с бесплодием ИМТ= 18,5-24,9 кг/м2

гдк

| ТБК-АП

Т ОАА

<£_а-токофердд>

<Ц_СЗРО>

Окислительный стресс

ч/

Мужчины с бесплодием ИМТ = 25,0-29,9 кг/м2

КОС

РЕПРОДУКТИВНЫЕ НАРУШЕНИЯ

Рис. 7. Концептуальная схема изменений активности процессов ПОЛ-АОЗ у мужчин с бесплодием.

Таким образом, с помощью расчета коэффициента окислительного стресса можно оценивать нарушение баланса в системе ПОЛ-АОЗ у пациентов с бесплодием. Кроме того, расчет величины КОС целесообразно использовать для оценки эффективности антиоксидантной терапии при инфертильности мужчин.

На основании вышеизложенного была сформулирована концептуальная схема изменений состояния процессов ПОЛ-АОЗ у мужчин при бесплодии с различными индексами массы тела, отражающая некоторые стороны патогенеза данного сочетанного патологического состояния (рис. 7). Общим механизмом патогенеза бесплодия в обеих группах является развитие окислительного стресса с накоплением продуктов липопероксидации на фоне увеличения уровня общей антиокислительной активности крови и снижения концентрации восстановленного глутатиона, а также активности ферментов. У мужчин с нормальным индексом массы тела отмечается повышение концентрации а-токоферола и активности шутатион-Б-трансферазы. В группе мужчин с избыточной массой тела установлено снижение концентрации ретинола и значительное увеличение уровня окисленной формы глутатиона.

ВЫВОДЫ

1. У мужчин с бесплодием с нормальным ИМТ установлено увеличение первичных на 23,81 %, вторичных на 53,33 % и конечных продуктов ПОЛ на 24,21 % по сравнению с аналогичными показателями контрольной группы.

2. У инфертильных мужчин с высоким ИМТ по сравнению с фертиль-ными мужчинами отмечается увеличение уровней ДК на 65,31 %, ТБК-реактантов на 39,47 % и общих липидов крови на 91,91 %.

3. Для мужчин с бесплодием с нормальным индексом массы тела характерно увеличение уровня ОАА на 22,21 %, концентрации а-токоферола на 22,82 %, и снижение активности СОД на 6,04 % в отличие от фертильных мужчин.

4. Система АОЗ у мужчин с бесплодием с избыточной массой тела характеризуется повышением уровня ОАА на 39,79 %, снижением концентрации ретинола на 21,74 % по сравнению с аналогичными показателями контрольной группы.

5. У мужчин с бесплодием (ИМТ = 18,5—24,9) снижение содержания восстановленного глутатиона на 15,35 % сочетается со снижением активности ферментов — глутатионредуктазы на 53,41 %, гпутатионпероксидазы на 51,44 % и повышением активности глутатион-Б-трансферазы на 31,52 % по сравнению с показателями контрольной группы.

6. В группе мужчин с бесплодием (ИМТ = 25,0-29,9) по сравнению с фер-тильными мужчинами отмечается снижение активности глутатионредуктазы на 56,77 % и глутатионпероксидазы на 56,22 %, на фоне стабильного уровня глутатион-8-трансферазы. Концентрация восстановленного глутатиона в группе с бесплодием снижена на 20,08 %, а окисленного повышена на 20,3 8 %.

7. Окислительный стресс, оцененный при помощи КОС наиболее выражен в группе мужчин с избыточной массой тела; по сравнению со значением КОС группы с ИМТ = 18,5-24,9 он повышен на 58,0 %.

8. Пациентам с бесплодием при коррекции нарушенного антиокси-' дантного статуса может быть рекомендовано добавление к базовой терапии антиоксидантных препаратов с учетом индивидуальных изменений в системе ПОЛ-АОЗ.

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в журналах и изданиях, рекомендуемых ВАК Минобрнауки РФ

1. Коэффициент окислительного стресса у мужчин репродуктивного возраста при бесплодии / Л.И. Колесникова, O.A. Толпыгина (O.A. Вантее-ва), H.A. Курашова и др. // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. - 2011. - № 5 (81). -С. 72-75.

2. Окислительный стресс при бесплодии у мужчин репродуктивного возраста / Л.И. Колесникова, O.A. Толпыгина (O.A. Вантеева), Л.А. Гребенкина и др. // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. - 2011. - № 5 (81). - С. 76-79.

3. Толпыгина O.A. (Вантеева O.A.) Роль глутатиона в системе антиокси-дантной защиты / O.A. Толпыгина (O.A. Вантеева) // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН.-2012.-№2(84).-С. 171-173.

4. Особенности состояния антиоксидантной системы у здоровых лиц основных этнических групп Прибайкалья / Л.И. Колесникова, М.А. Дарен-ская, Л.А. Гребенкина и др. // Вопросы питания. - 2012. - № 3. — С. 46-51.

5. Взаимосвязь некоторых компонентов антиоксидантной защиты и гормональных показателей при бесплодии у мужчин / Л.И. Колесникова, H.A. Курашова, O.A. Толпыгина (O.A. Вантеева) и др. // Бюлл. ВСНЦ СО РАМН. - 2012. - № 3 (85), Ч. 1. - С. 25-28.

6. Динамика изменений некоторых компонентов системы перекисного окисления липидов и антиоксидантной защиты у военнослужащих первого года службы / Л.И. Колесникова, H.A. Курашова, O.A. Вантеева и др. // Вестник Российской Военно-медицинской академии. — 2013, — № 2. - С. 105—108.

7. Глутатион как важнейший компонент тиолдисульфидной системы в патогенезе бесплодия мужчин с избыточной массой тела/ Л.И. Колесникова, O.A. Вантеева, H.A. Курашова, Б.Я. Власов // Вестник Российской академии медицинских наук. — 2013. — № 7. — С. 9—12.

8. Вантеева O.A. Анализ состояния системы антиоксидантной защиты у мужчин с бесплодием различных этнических групп / O.A. Вантеева, H.A. Курашова,Б.Г. Дашиев// Бюлл. ВСНЦ СО РАМН.-2013,-№4.-С. 102-105.

Публикации в прочих изданиях

9. Курашова H.A. Изучение про- и антиоксидантнош статуса мужчин с различными вариантами спермограмм русской и бурятской популяций / 20

H.A. Курашова, Б.Г. Дашиев, O.A. Толпыгина (O.A. Вантеева) // Актуальные вопросы медицинской науки: материалы Всерос. научно-практ. конф. студентов и молодых ученых с межд. участием, посвящ. 65-летию СНО ЯГМА, 20-22 апреля 2011 г. - Ярославль, 2011. - С. 36.

10. Состояние антиоксидантного статуса мужчин русской и бурятской популяции при наличии патоспермии / H.A. Курашова, Л.И. Колесникова, O.A. Толпыгина (O.A. Вантеева) и др. // Человек и лекарство: материалы конгресса, 23-27 апреля 2012 г. - М., 2012. - С. 132.

11. Активность процессов перекисного окисления липидов - анти-оксидантной защиты при бесплодии у мужчин репродуктивного возраста / Л.И. Колесникова, O.A. Толпыгина (O.A. Вантеева), H.A. Курашова и др. // Человек и лекарство: материалы конгресса, 23-27 апреля 2012 г. - М., 2012. -С. 312.

12. Оценка процессов липопероксидации у мужчин при бесплодии с помощью коэффициента окислительного стресса / O.A. Толпыгина (O.A. Вантеева), Л.И. Колесникова, H.A. Курашова и др. // Человек и лекарство: материалы конгресса, 23-27 апреля 2012 г. - М., 2012. - С. 216.

13. Вантеева O.A. Окислительный стресс при бесплодии у мужчин репродуктивного возраста различных этнических групп / O.A. Вантеева, Л.И. Колесникова, H.A. Курашова // Окислительный стресс и свободно-радикальные патологии: материалы девятой межд. Крымской конф., 16-25 сентября 2013 г. - Судак, 2013.-С. 13.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АОЗ — антиоксидантная защита

• Дв.св. — двойные связи

ДК — диеновые коньюгаты

ИМТ — индекс массы тела

КД-СТ - кетодиены и сопряженные триены

КОС — коэффициент окислительного стресса

ОАА — общая антиокислительная активность

OJI — общие липиды

ПОЛ - перекисное окисление липидов

СОД — супероксиддисмутаза

СОЛ — степень окисленности липидов

ТБК-АП - активные продукты тиобарбитуровой кислоты

GPO — глутатионпероксидаза

GR — глутатионредуктаза

GSH — глутатион восстановленный

GSSG — глутатион окисленный

GST - глутатион-Б-трансфераза

Подписано в печать 20.11.2013. Бумага офсетная. Формат 60x84'/-Гарнитура Тайме. Усл. печ. л. 1,0 _Тираж 100 экз. Заказ 101-13._

РИОНЦРВХ СО РАМН (Иркутск, ул. Борцов Революции, 1. Тел 29-03-37. E-mail: arleon58@gmail.com)