Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Роль окислительного стресса в прогнозе исходов программ экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов

На правах рукописи

ПРОРУБЩИКОВА Мария Юрьевна

РОЛЬ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА В ПРОГНОЗЕ ИСХОДОВ ПРОГРАММ ЭКСТРАКОРПОРАЛЬНОГО ОПЛОДОТВОРЕНИЯ И ПЕРЕНОСА ЭМБРИОНОВ

14.03.03 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

7 НОЯ 2013

Иркутск - 2013

005537227

005537227

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук.

Научные руководители: доктор медицинских наук

член-корр. РАМН, профессор Колесникова Любовь Ильинична

доктор медицинских наук,

профессор Сутурина Лариса Викторовна

Официальные оппоненты:

Власов Борис Яковлевич, доктор медицинских наук, профессор (Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Иркутская государственная сельскохозяйственная академия» Министерства сельского хозяйства РФ, профессор кафедры неорганической, органической и биологической химии)

Кулинич Светлана Ивановна, доктор медицинских наук, профессор (Государственное бюджетное образовательное учреждение дополнительного профессионального образования «Иркутская государственная медицинская академия последипломного образования» Министерства здравоохранения РФ, заведующая кафедрой акушерства и гинекологии) Ведущая организация:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет Минздрава России» (Томск)

Защита состоится »1сОХ£Ь*Я 2013 г. в_часов на заседании диссертационного совета Д 001.038.02 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук по адресу: 664003, г. Иркутск, ул. Тимирязева, 16.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения «Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

Автореферат разослан « » 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор

Шолохов Леонид Федорович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность

Проблема бесплодия имеет не только медико-биологическое, но и важное социальное значение. Частота бесплодных браков в Иркутской области составляет в среднем 19,56 % (Кузьменко Е.Т., 2005; Кузьменко Е.Т., Сутурина JI.B. и др., 2005; Колесникова Л.И., Сутурина Л.В., Лабыгина А.В., 2007; ШипхинееваТ.И., Сутурина Л.В., 2010), что превышает определенный группой экспертов ВОЗ 15%-й критический уровень. Части супружеских пар для преодоления бесплодия необходимо применение вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ). Основу этих методов составляет метод экстракорпорального оплодотворения (ЭКО), но эффективность данной процедуры составляет в среднем 37,8 % (Корсак B.C., 2010). Изучению факторов, влияющих на исходы ЭКО, посвящено большое число исследований в отечественной и зарубежной литературе. Однако в большинстве исследований рассматривается влияние только гормонального статуса на исходы программы экстракорпорального оплодотворения. В качестве потенциальных предикторов неудач ЭКО рассматривается повышение уровня андрогенов (Xia P., Younglai E.V., 2000) и снижение концентрации эстрадиола (Artini P.G., Battaglia С. et al„ 1994; Teissier M.P., Chable et al„ 2000).

Известно, что окислительный стресс негативно влияет на качество яйцеклеток и их оплодотворение, а также на развитие эмбрионов и вынашивание беременности (Хрулева Н.В., 2011; Balaban В., Urman В., 2006; Revelli А., Piane L.D. et al„ 2009; Teissier M.P., Chable H. et al„ 2000). Но ряд исследователей указывают на то, что активация процессов перекисного окисления липидов необходима для нормального оплодотворения и развития эмбриона (Agarwal A., Saleh R.A. et al., 2003; Akande A.V., Asselin J. et al„ 2000).

Интерес представляет сосудистый эндотелиапьный фактор роста (СЭФР), влияющий на ангиогенез и, вследствие этого, оказывающий влияние на содержание кислорода в фолликулярной жидкости (ФЖ) (Monteleone P., Giovanni Artini P., 2008). Можно предположить, что увеличение концентрации СЭФР во время стимуляции овуляции наблюдается в ответ на гипоксию фолликулов. В проспективном исследовании показана зависимость между увеличением уровня СЭФР в ФЖ и низкой частотой оплодотворения (Malamitsi-Puchner А., Sarandakou А., 2001). Кроме того, высокий уровень СЭФР в ФЖ связан с плохой морфологией эмбрионов (Asimakopoulos В., Abu-Hassan D., 2008), а повышение уровня СЭФР в сыворотке крови у женщин, включенных в программу ЭКО, может являться основным предрасполагающим фактором неудачных попыток ЭКО (Волкова Л.В., Аляутдина О.С., 2011; Van Blerkom J., Antczak M., 1997).

При этом мало внимания уделяется интегральной оценке гормонально-метаболических показателей в различных биосубстратах женщин с бесплодием в зависимости от исходов программы ЭКО. Таким образом, изучение основных гормональных и метаболических предикторов эффективного применения экстракорпорального оплодотворения у женщин с бесплодием представляет собой актуальную проблему. Приведенные данные свидетельствуют о целесообразности проведения исследований по изучению роли гормональных нарушений и

окислительного стресса в прогнозе программы экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов в полость матки. Все вышеизложенное послужило основанием для определения цели и задач данной работы.

Цель: установить влияние основных гормональных нарушений и показателей системы перекисного окисления липидов — антиоксидантной защиты на эффективность применения ЭКО при женском бесплодии.

Задачи:

1. Выявить закономерности изменений перекисного окисления липидов и антиоксидантной защиты в сыворотке крови и фолликулярной жидкости у женщин с бесплодием с различными исходами ЭКО.

2. Определить содержание стероидных гормонов, СЭФР и ИФР-1 в фолликулярной жидкости у женщин с учетом результатов ЭКО.

3. Установить взаимозависимость гормональных нарушений и показателей системы перекисного окисления липидов — антиоксидантной защиты при прогнозе исходов ЭКО и их диагностическую значимость.

4. Разработать математическую модель прогноза исходов программ ЭКО и ПЭ.

Научная новизна

Получены новые данные о характере изменений процессов пероксидации липидов и состояния антиоксидантной защиты у пациенток с бесплодием и неэффективным применением методов ВРТ: впервые установлено, что при неудачном применении ЭКО в фолликулярной жидкости после стимуляции овуляции отмечается накопление субстратов и продуктов пероксидации липидов и повышение общей антиокислительной активности. В сыворотке крови у этих пациенток увеличено содержание гормоно-подобного жирорастворимого антиоксиданта ретинола и относительное повышение уровня свободного тестостерона.

Получены новые данные о значимости изученных гормонально-метаболических показателей для прогноза результатов ЭКО у женщин с бесплодием.

Теоретическая и практическая значимость

Впервые при неудачах ЭКО у женщин с бесплодием установлена роль оксидативного стресса с накоплением продуктов пероксидации липидов в фолликулярной жидкости и одновременной неэффективной активацией антиоксидантной защиты.

Впервые установлены особенности взаимодействия гормональной и метаболической систем при различных исходах ЭКО у женщин с бесплодием.

Предложен метод многофакторного анализа для эффективного прогноза результатов ЭКО на основании изучения субстратов и продуктов пероксидации липидов, антиоксидантной защиты и уровня гормонов.

Положения, выносимые на защиту:

1. Основными гормонально-метаболическими предикторами неудач ЭКО у обследованных женщин с бесплодием являются: гиперандрогенемия, накопление

субстратов и продуктов пероксидации липидов в фолликулярной жидкости с одновременным повышением общей антиоксидативной активности.

2. При отрицательных результатах ЭКО отсутствует ингибирующее воздействие на активность процессов пероксидации липидов общей антиокислительной активности фолликулярной жидкости и ряда антиоксидантов сыворотки крови (системы глутатиона, СОД и АОА).

3. Многофакторный анализ с оценкой уровней общего и свободного тестостерона, ДГЭА, двойных связей, диеновых коньюгат, ретинола в сыворотке крови и эстрона, эстрадиола, диеновых коньюгат и ретинола в фолликулярной жидкости позволяет прогнозировать неудачу ЭКО у обследованных женщин с бесплодием с точностью 89,6 %.

Апробация работы

Материалы диссертации представлены и обсуждены: на V конгрессе Всемирной ассоциации репродуктивной медицины (WARM, 2010), форуме Ovarian club I (Барселона, 2011), 15 Конгрессе репродукции человека (Венеция, 2013), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» (Чита, 2013), форуме Ovarian club III (Париж, 2013), XIV Всероссийском научном форуме «Мать и дитя 2013» (Москва, 2013).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ: из них в журналах и изданиях, рекомендуемых ВАК Минобразования и науки РФ - 4, в тезисах докладов на конференциях всероссийского и международного уровней - 6.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 93 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждениях, заключения, выводов, списка литературы (89 отечественных и 63 иностранных источника). Текст диссертации иллюстрирован 25 таблицами, 10 рисунками в виде диаграмм и концептуальных схем.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Обследовано 78 женщин с установленным диагнозом «Бесплодие». Всем пациенткам проведена процедура экстракорпорального оплодотворения. Индукцию овуляции проводили по общепринятым схемам с использованием агонистов (диферелин) или антагонистов (оргалутран) гонадотропин-рилизинг гормона и рекомбинантных гонадотропинов (пурегон, гонал-ф). Средняя курсовая доза гонадотропинов в первой группе составила 1724,12 ± 547,82 ME и 1902,17 ± 713,94 ME - во второй соответственно (р> 0,05). В качестве триггера овуляции использовали овитрель в дозе 250 мкг (6500 ME). Число полученных в результате стимуляции суперовуляции ооцитов было 8,65 ± 5,94 и 6,98 ± 3,77 соответственно в основной группе и группе сравнения (р > 0,05). Пункцию фолликулов прово-

дили на 14,05 ± 1,8 день менструального цикла через 35 часов после введения триггера овуляции (овитрель). Перенос эмбрионов осуществлялся на 5 сутки культивирования. Подтверждение наступления беременности проводилась через 2 недели после переноса эмбрионов по результату ХГЧ и результатам УЗИ (наличие плодного яйца в полости матки) через 4 недели после переноса эмбрионов. В зависимости от исхода программы ЭКО пациентки были разделены на две группы. В первую группу - основную, вошли 34 женщины с клинически подтвержденной беременностью после проведения процедуры экстракорпорального оплодотворения. Во вторую - группу сравнения, 44 пациентки, у которых беременность после ЭКО не наступила. Основная группа и группа сравнения были статистически однородны, средний возраст пациенток был 31,26 ± 3,93 год и 32,97 ±4,17 года, соответственно, продолжительность бесплодия составила 5,93 ± 3,51 лет в основной группе и 7,2 ± 3,93 лет в группе сравнения (р > 0,05). Нами не выявлено различий между группами по частоте родов, медицинских абортов, самопроизвольных выкидышей и эктопических беременностей.

Сбор информации проводился путем изучения первичной медицинской документации: медицинских карт амбулаторного больного, выписок из историй болезни. Перед вступлением в программу ЭКО пациентки проходили обследование согласно приказу Минздрава РФ от 26 февраля 2003 г. № 67 «О применении вспомогательных репродуктивных технологий в терапии женского и мужского бесплодия».

В день проведения трансвагиналыюй пункции (ТВП), женщинам проводили забор крови из локтевой вены, натощак. Фолликулярную жидкость получали при пункции доминантных фолликулов во время ТВП под контролем УЗИ с помощью специальных пункционных игл.

Диеновые конъюгаты (ДК, мкмоль/л), кетодиены и сопряженные триены (КД и CT, у.е.), двойные связи (Дв. св., у.е.) определяли спекгрофотометрическим методом (Волчегорский И.А. с соавт., 1989). Содержание ТБК-активных продуктов ПОЛ (малоновый диальдегид - МДА, мкмоль/л) определяли флуорометрически по методу Гаврилова В.Б., Гавриловой А.Р. и Мажуль JI.M. (1987). Измерения активности супероксиддисмутазы (СОД, у.е.) (Misra Н.Р., Fridovich I., 1972) проводили на спектрофлюорофотометре Shimadzu RT-5000 (Япония) при X = 320 нм. Оценку общей антиокислителыюйной активности (АОА, у.е.) крови проводили по методу Г.И. Клебанова с соавт. (1988) на спектрофотометре СФ-56 (Россия). Определение а-токоферола (мкмоль/л) и ретинола (мкмоль/л) проводили флуо-риметрическим методом (Черняускене Р.Ч., Варшкявичене 3.3., Грибаускас П.С., 1984) на спектрофлюорофотометре Shimadzu RT-5000 (Япония). Измерения содержания восстановленного (GSH, моль/л) и окисленного (GSSG, моль/л) глутатиона проводили флуориметрическим методом (Hissin P.Y., Hilf R., 1976) на спектрофлюорофотометре Shimadzu RT-5000 (Япония) при ХЕх = 350 нм и АЕш = 420 нм.

Определение концентрации тестостерона (Тс, нМ/л), тестостерона свободного (Тс св., пМ/л), дигидротестостерона (ДГТ, пг/мл), дегидроэпиандро-стерона (ДГЭА, нг/мл), дегидроэпиандростерон-сульфата (ДГЭА-с, мкМ/л), андростендиона (нМ/л), эстрадиола (Э2, нМ/л) и эстрона (Э1, пг/мл) проводили с использованием ИФА-анализатора «Multiskan EX» (Китай) и наборов производства России (Тс, ДГЭА-с, Э2), Канады (ДГЭА, Э1, ДГТ, Тс св.), Германии

(андростендион). Определение инсулиноподобного фактора роста-1 (ИФР-1, мкг/л) и сосудистоэндотелиального фактора роста (СЭФР, пг/мл) проводили с использованием ИФА-анализатора «Multiskan EX» (Китай) и наборов производства Великобритании (ИФР-1) и Австрии (СЭФР).

Процедуры статистического анализа выполнялись с помощью статистических пакетов SAS 9.3, STATISTICA 10 и SPSS-21. Проверка нормальности распределения количественных признаков в отдельных группах сравнения проводилась с использованием критериев Шапиро - Уилкса, Колмогорова - Смирнова. Анализ межгрупповых различий для двух независимых выборок по каждому из ненормально распределенных количественных признаков проводили с использованием непараметрических критериев: Манна- Уитни (U), критерия серий Вальда - Вольфовица (W-W test) и Колмогорова - Смирнова (K-S test). Для всех количественных признаков в сравниваемых группах производилась оценка средних арифметических и среднеквадратических (стандартных) ошибок среднего. Критическое значение уровня статистической значимости при проверке нулевых гипотез принималось равным 0,05. Критерии х2 и Z использовались для анализа межгрупповых различий по качественным признакам. Анализ взаимосвязей показателей проводили методом ранговой корреляции Спирмена. Для характеристики диагностической значимости показателей системы ПОЛ - АОЗ определяли их чувствительность, специфичность, прогностическую ценность положительного и отрицательного результатов (Котельников Г.П., Шпигель A.C., 2000).

Чувствительность биохимических тестов определялась, как доля лиц с неблагоприятными исходами ЭКО, у которых отмечался позитивный результат, по формуле: D / (В + D), где D - истинно положительные случаи, когда неблагоприятный исход совпадает с положительным результатом, а В - ложноотрицательные случаи, когда у женщин с неудачей ЭКО получен отрицательный результат.

Специфичность—это вероятность отрицательно результата у лиц с благоприятным исходом ЭКО, данный показатель определялся по формуле: А / (А + С), где А - истинно-отрицательные случаи, когда благоприятный исход ЭКО совпадал с отрицательным результатом теста, а С — ложноположительные случаи, когда истинное отсутствие неудачи ЭКО совпадает с положительным результатом теста.

Прогностическая ценность положительного результата показывает, насколько высока вероятность неудачи после ЭКО у лиц с положительным результатом и вычисляется по формуле: D / (С + D), прогностическая ценность отрицательного результата—насколько низка вероятность благоприятного исхода ЭКО у пациентов с отрицательным результатом, для ее вычисления используется формула: А/ (А+В).

Для анализа взаимосвязи между одним качественным признаком, выступающим в роли зависимого, результирующего показателя, и подмножеством количественных и качественных признаков, использовалась модель логистической регрессии с пошаговым алгоритмом включения и исключения предикторов. Результаты оценки уравнений логистической регрессии представлены набором коэффициентов регрессии, достигнутыми уровнями значимости для каждого коэффициента, а также оценкой показателя согласия (Concordant) фактической принадлежности пациента к той или иной из групп, и теоретической принадлежности, полученной по уравнению логит-регрессии.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Результаты исследования процессов пероксидации липидов и антиоксидантной защиты у бесплодных женщин с различными исходами программ ВРТ

Проведено исследование процессов перекисного окисления липидов и антиоксидантной защиты у женщин с бесплодием в зависимости от результатов программ экстракорпорального оплодотворения.

Интенсивность процессов перекисного окисления липидов оценивали по содержанию его продуктов - по показателю ненасыщенности субстратов пероксидации - сопряженным двойным связям (Дв.св.), диеновых конъюгатов (ДК), кето-диенов и сопряженных триенов (КД и СТ), а также по содержанию ТБК-активных продуктов (ТБК-АП) ПОЛ в сыворотке крови и фолликулярной жидкости.

При исследовании состояния перекисного окисления липидов в сыворотке крови женщин с различными исходами экстракорпорального оплодотворения нами выявлены следующие особенности. Содержание двойных связей и диеновых коньюгат в первой и второй группах было статистически равнозначно. Также не отличался уровень ТБК-активных продуктов ПОЛ (табл. 1). Разница концентраций кетодиенов и сопряженных триенов между группами значима по двум непараметрическим критериям - по критерию Вальда- Вольфовица = 0,03) и Колмогорова - Смирнова < 0,05) (рис. 1).

При исследовании процессов ПОЛ в фолликулярной жидкости выявлено, что содержание кетодиенов и сопряженных триенов и ТБК-активных продуктовов ПОЛ было статистически незначимо (табл. 2). Показатели двойных связей и диеновых коньюгат в группе сравнения были достоверно выше, нежели в основной группе. На гистограмме (рис. 2) видно, что более высокий уровень двойных связей в группе женщин с неудачами после программы экстракорпорального оплодотворения ОеМ-Ш = 0,05, рК-Б < 0,05).

Как представлено на гистограмме (рис. 3), отличия в содержании диеновых коньюгат в группах обусловлены большим количеством пациенток с уровнем ДК более 1,0 мкМ/л у женщин с отсутствием беременности после ЭКО (47,06 % против 86,36 % соответственно,^ = 0,02).

Таким образом, у женщин с не наступившей беременностью после ЭКО наблюдается активация процессов ПОЛ с накоплением субстратов перекисного окисления как в сыворотке крови, так и в фолликулярной жидкости.

Активность системы АОЗ оценивали по общей антиоксидативной активности (АОА), содержанию токоферола и ретинола, супероксиддисмутазы (СОД), глутатиона окисленного (0550) и восстановленного (ОЗН) в сыворотке крови.

При анализе полученных данных выявлено, что активность глутатиона окисленного и восстановленного, супероксиддисмутазы, общей антиоксидативной активности и токоферола была статистически равнозначна (табл. 1). Содержание ретинола было достоверно выше во второй группе, что говорит об активации ферментативного звена антиоксидантной защиты в ответ на накопление продуктов ПОЛ в сыворотке крови (рис. 4). В первой группе пациенток, у которых беременность наступила, концентрация ретинола более 0,5 мкМ/л наблюдалась у 35,29 % женщин, во второй группе с неудачами ЭКО - у 63,64 % (ръ = 0,045). 8

Показатели системы ПОЛ - ЛОЗ, гормональные показатели и факторы роста в сыворотке крови

Показатели 1 группа, п = 34 2 группа, л = 44

Дв. св., у.е. 2,39 ± 1,06 2,68 ± 0,95

ДК, мкМ/л 1,76 ±0,69 1,83 ± 0,69

КД и СТ, у.е. 0,83 ± 0,39 0,85 ± 0,62

ТБК-АП, мкМ/л 1,03 ± 0,34 1,19 ± 0,57

АОА, у.е. 9,30 ± 2,48 8,14 ± 3,35

Токоферол, кМ/л 6,98 ± 1,79 6,94 ± 1,79

Ретинол, мкМ/л 0,47 ±0,12 0,56 ± 0,17

СОД, у.е. 1,74 ± 0,14 1,71 ± 0,12

СБН, мкМ/л 2,25 ±0,28 2,26 ± 0,33

ввБС, мкМ/л 2,02 ± 0,32 2,03 ± 0,35

1 группа, л = 33 2 группа, п = 40

Тс, нМ/л 3,03 ± 1,59 3,10 ± 1,76

ДГЭА, нг/мл 7,26 ±2,53 9,01 ± 6,28

ДГЭА-с, мкМ/л 6,46 + 3,38 7,06 ± 3,52

Эстрадиол, нМ/л 2,49 ±2,14 2,83 ± 2,61

Эстрон, пг/мл 11 02,59 ± 618,14 1169,15 ± 637,09

Андростендион, нМ/л 5,27 ± 2,30 5,63 ± 2,28

ДигидроТс, мкМ/л 344,45 ± 94,56 405,48 ± 259,41

Тс св., пМ/л 3,08 ± 2,84 4,61 ± 3,34

ИФР-1, мкг/л 116,56 ± 33,20 117,42 ± 35,81

1 группа, п = 17 2 группа, л = 23

СЭФР, пг/мл 138,49 ± 69,33 166,62 ± 156,96

1. Мл

-0,2 0,2 0.6 1,0 1,4 1,8 2.2 -0,2 0,2 0,6 1,0 1,4 1,8 2.2 0,0 0,4 0,8 1,2 1,6 2,0 2,4 0,0 0.4 0,8 1,2 1,6 2,0 2,4

группа. 1 (п=34)

группа: 2 (п=44)

КД и СТв сыв. крови, у.е

Рис. 1. Гистограмма распределения показателей кетодиенов и сопряженных триенов (у.е.) в сыворотке крови.

0.5 1,5 2,5 3,5 4,5 5,5 0,5 1,5 2,5 3.5 4,5 5.5

группа: 1 (п=34) группа: 2 (п=44)

Дв.св. в ФЖ., у.е.

Рис. 2. Гистограмма распределения показателей двойных связей (у.е.) в фолликулярной жидкости.

группа: 1 (п=34) группа: 2 (п=44)

ДК в ФЖ. мкМ/л

Рис. 3. Гистограмма распределения показателей диеновых коньюгат (мкМ/л) в фолликулярной жидкости.

Показатели системы ПОЛ-ЛОЗ, гормональные показатели и факторы роста в фолликулярной жидкости

Показатели 1 группа, п = 34 2 группа, п = 44

Дв. св., у.е 1,58 ± 1,12 1,93 ± 1,17

ДК, мкМ/л 1,29 ± 0,73 1,52 ± 0,74

КДиСТ, у.е. 1,08 ± 0,64 1,16 ± 0,57

ТБК-АП, мкМ/л 1,25 ±0,62 1,36 ± 0,76

АОА, у.е. 5,79 ±1,75 6,80 ±2,14

Токоферол, мкМ/л 6,94 ± 3,60 6,49 ± 2,60

Ретинол, мкМ/л 0,48 ± 0,16 0,48 ± 0,18

Тс, нМ/л 57,00 ± 9,63 57,07 ± 13,23

ДГЭА, нг/мл 46,63 ± 3,25 47,28 ±2,91

ДГЭА-с, мкМ/л 9,16 ±4,14 9,45 ± 3,32

Эстрадиол, нМ/л 33,67 ± 1,72 33,71 ± 1,69

Эстрон, пг/мл 2654,27 ± 250,51 2742,02 ± 179,80

Андростендион, нМ/л 15,40 ± 5,93 17,14 ± 5,48

ДигидроТс, мкМ/л 1580,58 ± 680,91 1794,38 ± 737,75

Тс св., пМ/л 58,75 ±45,46 59,67 ± 32,90

ИФР-1, мкг/л 84,55 ± 23,13 84,70 ± 22,37

1 группа, п = 13 2 группа, п = 22

СЭФР, пг/мл 1658,32 ± 796,33 2036,18 ± 854,25

В фолликулярной жидкости определяли общую антиоксидативную активность (АОА), концентрацию токоферола и ретинола.

В фолликулярной жидкости определено статистически значимое повышение общей антиоксидативной активности во второй группе, которое происходит за счет большего числа женщин с неблагоприятными результатами ЭКО с показателями активности АОА более 6 у.е. (35,29 % в первой группе женщин с наступившей беременностью после ЭКО против 68,18 % во второй группе, рг = 0,03) (рис. 5).

Для оценки коэффицента окислительного стресса (КОС) у женщин с бесплодием использовалась модифицированная формула расчета КОС (патент РФ № 2011617323):

„ (ДЮ / ДКп) х (КК и СП / КД и СТп) х (ТТБ - АШ / ТБК - АПп))

КОС. —--—

{СОД1 / СОДп)х (ОЭШ / ввНл) х (Е1 / Еп) х (А1 / Ап)

1 - уровни показателей обследуемых пациентов;

п — уровни показателей контрольной группы;

при КОС > 1 регистрируют развитие окислительного стресса.

В формуле рассчитывается отношение показателей системы ПОЛ - АОЗ у пациенток, проходящих процедуру ЭКО к среднегрупповым показателям системы ПОЛ - АОЗ, определенным в середине менструального цикла у женщин контрольной группы (Гребенкина Л.А., 2007).

Для расчета КОС по данной формуле использовались следующие показатели ПОЛ-АОЗ контрольной группы: ДКп = 1,08 мкмоль/л, КД и СТп = 0,14 у.е, ТБК—АПп = 1,07 мкмоль/л, активность СОДп = 1,64 у.е., ОБНп = 2,16 ммоль/л, а-токоферола (Еп) = 9,41 мкмоль/л, ретинола (Ап) = 1,47 мкмоль/л.

При подсчете коэффициента выявлено развитие окислительного стресса у пациенток обеих групп, но в группе женщин с неудачами после ЭКО дисперсия КОС выше (рис. 6), чем в основной группе (р$< 0,0001).

Рис. 4.

0.1 0,3 0,5 0,7 0.9 1,1 0,1 0,3 0,5 0,7 0.9 1.1

0,2 0.4 0.6 0.8 1.0 1,2 0,2 0,4 0,6 0.8 1,0 1,2

группа: 1 (п=34) группа: 2 (п=44)

Ретинол в сыв. крови, мкМ/л

Гистограмма распределения показателей ретинола (мкМ/л) в сыворотке крови.

1 2 3 4 5 6 7

9 10 11 12 13

группа: 1 (п=34)

группа: 2 (п=44)

АОА в ФЖ. у.е.

Рис. 5. Гистограмма распределения показателей антиоксидативной активности (у.е.) в фолликулярной жидкости.

группа: 1 (п=Э4] фуппа: 2 (п=44)

КОС

Рис. 6. Гистограмма распределения КОС.

Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют о возникновении окислительного стресса у пациенток обеих групп сравнения, но этот процесс в группах протекает по-разному. У женщин с неудачами после экстракорпорального оплодотворения накапливаются продукты пероксидации липидов в сыворотке крови и фолликулярной жидкости. При этом происходит активация антиоксидативной защиты у женщин той же группы за счет повышения концентрации ретинола в сыворотке крови и антиоксидативной активности в фолликулярной жидкости.

Основные гормональные показатели и факторы роста

в биосубстратах женщин с бесплодием с учетом результатов ЭКО

У женщин с бесплодием в сыворотке крови и фолликулярной жидкости определяли концентрации тестостерона (Тс), тестостерона свободного (Тс св.), дигидротестостерона (ДГТ), дегидроэпиандростерона (ДГЭА), дегидроэпи-андростерон-сульфата (ДГЭА-с), андростендиона, эстрадиола (Э2) и эстрона (Э1) инсулиноподобного фактора роста-1 (ИФР-1) и сосудистоэндотелиального фактора роста (СЭФР).

Разница концентраций факторов роста и большинства гормональных показателей между группами сравнения статистически незначима (табл. 1). Достоверно более высокое содержание свободного тестостерона в сыворотке крови наблюдается у женщин с отрицательными результатами ЭКО (рЦ = 0,02, рК-в < 0,05) (рис. 7).

Гормональные показатели и факторы роста в фолликулярной жидкости в группе пациенток с положительным результатом экстракорпорального опло-

дотворения и группой пациенток с неудачами после ЭКО статистически не отличались (табл. 2). Возможно это связано с малочисленностью групп.

Тс св. о сыв.крови, пМ/л

Рис. 7. Гистограмма распределения показателей свободного тестостерона (пМ/л) в фолликулярной жидкости.

Таким образом, в группе пациенток с неудачей ЭКО регистрируется гипер-андрогенемия с увеличением уровня свободных фракций тестостерона.

Результаты оценки взаимосвязей гормональных и метаболических показателей и их диагностической значимости при прогнозе исходов ЭКО

При проведении корреляционного анализа гормонально-метаболических показателей, в группе женщин с неудачами после процедуры экстракорпорального оплодотворения обнаружены значимые положительные корреляционные зависимости между показателями двойных связей и диеновыми коньюгатами в сыворотке крови (г = 0,86), кетодиены и сопряженные триены в свою очередь имеют положительную корреляцию с двойными связями в сыворотке крови (г = 0,71) и в фолликулярной жидкости (г = 0,45). Ретинол в сыворотке крови отрицательно коррелирует с ТБК-активными продуктами ПОЛ в сыворотке крови и эстриолом в фолликулярной жидкости (г = —0,52).

В группе женщин с положительным результатом после ЭКО наблюдаются множественные корреляционные зависимости между показателями, определенными в фолликулярной жидкости и сыворотке крови. У пациенток

с наступившей беременностью после ЭКО характерно наличие отрицательных корреляционных связей АОА, СОД и восстановленного глутатиона с продуктами пероксидации липидов сыворотки крови. Выявлены значимые взаимодействий между кетодиенами и сопряженными триенами и андрогенами (андростендиолом и дигидротестостероном) в фолликулярной жидкости (г = 0,5 и 0,46 соответственно). Также в фолликулярной жидкости выявлены положительные корреляции между общей антиоксидативной активностью и уровнями анростендиола, дигидротестостерона, свободного тестостерона (г = 0,47; 0,49; 0,54 соответственно). В сыворотке крови можно отметить отрицательную взаимосвязь между СЭФР и ДГЭА, ДГЭА-с, ДГТ (г = -0,76; -0,76; -0,72 соответственно).

При сравнении корреляционных связей, можно отметить, что при неудачах ЭКО отсутствуют отрицательные корреляционные связи КД и СТ с восстановленным глутатионом и СОД сыворотки крови, а также между общей антиокислительной активностью сыворотки крови и содержанием в нем ТБК-АП пероксидации липидов.

При определении значимости показателей системы ПОЛ-АОЗ для прогноза результатов ЭКО определяли их чувствительность, специфичность.

Для выбора пороговых значений изучаемых показателей, нами проанали-зированны гистограммы (рис. 1-6).

У женщин с отсутствием беременности после ЭКО обнаружение повышения уровня ретинола (выше 0,53 мкМ/л) в сыворотке крови является тестом с низкой чувствительностью (0,45). Однако только у 32 % женщин с беременностью этот показатель превышает 0,53 мкМ/л (специфичность 0,68). Показатели КД и СТ (более 0,81 у.е.) в сыворотке крови характеризуются низкой чувствительностью (0,41), но достаточной специфичностью (0,62). Увеличение уровня свободного тестостерона более 3,95 пМ/л является тестом с низкой чувствительностью (0,41), но достаточной специфичностью (0,79) (табл. 3).

Таблица 3

Диагностическая значимость показателей в сыворотке крови у женщин с бесплодием

Показатели Чувствительность Специфичность Прогностическая ценность положительного результата Прогностическая ценность отрицательного результата

Повышение уровня ретинола в сыворотке крови более 0,53 мкМ/л 0,45 0,68 0,56 0,53

Повышение уровня КД и СТ в сыворотке крови более 0,81 у.е 0,41 0,62 0,58 0,45

Повышение уровня Тс.св. в сыворотке крови более 3,95 пМ/л 0,41 0,79 0,72 0,51

Повышение уровня двойных связей (более 0,88 у.е.) и диеновых коньюгат (более 0,82 мкМ/л) в фолликулярной жидкости имеет чувствительность, равную 1, т. е. у всех пациенток с отрицательным результатом ЭКО наблюдалось более высокое содержание вышеперечисленных продуктов ПОЛ. Однако, специфичность данных тестов низкая и составляет 0,32 и 0,25 соответственно. Также у женщин с неудачами после ЭКО в 68 % случаев уровень АОА в фолликулярной жидкости превышает 6,06 у.е. (чувствительность 0,68). Частота повышения этого показателя у пациенток, забеременевших после программы ЭКО, составляет 35 % (специфичность 0,65) (табл. 4).

Таблица 4

Диагностическая значимость показателей ПОЛ-АОЗ в фолликулярной жидкости у женщин с бесплодием

Показатели Чувствительность Специфичность Прогностическая ценность положительного результата Прогностическая ценность отрицательного результата

Повышение уровня Дв.св. в ФЖ более 0,88 у.е. 1,0 0,32 0,66 1,0

Повышение уровня ДК в ФЖ более 0,82 мкМ/л 1,0 0,25 0,63 1.0

Повышение уровня АОА у.е. в ФЖ более 6,06 у.е. 0,68 0,65 0,71 0,61

Таким образом, все показатели, определенные в фолликулярной жидкости имеют большую чувствительность по сравнению с показателями в сыворотке крови.

Математическое прогнозирование эффективности программ

ЭКО и ПЭ у женщин с нарушениями репродуктивной функции

Для анализа взаимосвязи между одним качественным признаком, выступающим в роли зависимого, результирующего показателя, и подмножеством количественных и качественных признаков, использовалась модель логистической регрессии с пошаговым алгоритмом включения и исключения предикторов.

На основе данных получено уравнение логистической регрессии, представленное в таблице 5. Логистическая регрессия — это разновидность множественной регрессии, общее назначение которой состоит в анализе связи между несколькими независимыми переменными (называемыми также регрессорами или предикторами) и зависимой переменной. В данном исследовании в качестве зависимой переменной выступает наступление беременности после проведения процедуры ЭКО и ПЭ, к независимым относятся показатели ПОЛ и АОЗ, гормональные показатели, перечисленные выше.

Уравнение логистической регрессии

Parameter DF Estimate Standard Error Wald Chl-Square Pr > ChiSq Standardized Estimate

Intercept 1 -40,8816 13,8117 8,7612 0,0031

Тс в сыворотке крови 1 -0,7286 0,3083 5,5855 0,0181 -0,6718

ДГЭА в сыворотке крови 1 0,2675 0,1288 4,3107 0,0379 0,7377

Тс св. в сыворотке крови 1 0,4523 0,1692 7,1458 0,0075 0,7977

Э2 в ФЖ 1 0,7239 0,3025 5,7256 0,0167 0,4916

Э1 в ФЖ 1 0,00342 0,00177 3,7369 0,0532 0,4164

Дв. св. в сыворотке крови 1 1,8275 0,7118 6,5907 0,0103 0,9237

ДК в сыворотке крови -1,8540 0,8568 4,6816 0,0305 -0,6474

Ретинол в сыворотке крови 1 11,4720 3,6334 9,9693 0,0016 1,0112

ДК в ФЖ 1 0,9708 0,5369 3,2693 0,0706 0,4099

Ретинол в ФЖ 1 -5,8275 2,7677 4,4331 0,0352 -0,5601

Важным показателем качества модели является процент конкордации (Percent Concordant). Этот показатель равен доле наблюдений, правильно переклассифицированных в отдельные подгруппы зависимого показателя с помощью уравнения логистической регрессии. Чем ближе этот показатель к 100 %, тем выше качество данной модели. Сила связи между фактической принадлежностью к анализируемым подгруппам зависимого признака, и принадлежностью предсказанной по уравнению логит-регрессии, оценивается специальным коэффициентом D-Зомера (Somers' D). Данный показатель равен 0 при полном несовпадении, и 1 при полном совпадении. Всего было получено порядка ста уравнений логит-регрессии, из которых производился отбор уравнений, имеющих самые высокие значения (более 80-90 %) этого показателя. Ранжирование выделенных предикторов по степени связи с зависимой переменной производилось путем сортировки предикторов по модулю стандартизованных коэффициентов регрессии. Для интерпретации структуры уравнений использовались результаты анализа таблиц сопряженности и результаты сравнения центральных мер для групп зависимого признака.

Как видим, большинство предикторов имеют статистически значимые коэффициенты регрессии (Standardized Estimate) (табл. 5). При этом стандартизованные коэффициенты, представленные в последнем столбце, говорят о доминирующем влиянии двух предикторов - двойных связей и витамина А в сыворотке крови. При данном наборе предикторов процент конкордации равен 89,6 %, коэффицент D-Зомера 0,79.

Также уравнение логит-регрессии можно представить в следующем виде:

Р = —40,88 — 0,73 х V3 + 0,27 * V4 + 0,45 * VIO + 0,72 х V16 + 0,003 *V17 + 1,83 х V23- 1,85 х V24+ 11,47 х V29 + 0,97 х V34-5,83 х V39, где:

Р - величина, которая вычисляется для конкретного пациента по уравнению логит-регрессии,

-40,88 — свободный член, V3 - тестостерон в сыворотке крови, V4 - ДГЭА в сыворотке крови, V10 -Тс. св. в сыворотке крови, V16 — Э2 в ФЖ, V17-31 в ФЖ,

V23 — Дв.св. в сыворотке крови, V24 — ДК в сыворотке крови, V29 — ретинол в сыворотке крови, V34 - ДК в ФЖ, V39 - ретинол в ФЖ.

Чем больше р, тем больше вероятность отрицательного результата процедуры ЭКО. При этом у женщин с наступившей беременностью после экстракорпорального оплодотворения значение р, в основном, принимает отрицательное значение.

Приведем примеры.

Пациентка М, 31 год с диагнозом: Бесплодие первичное, абсолютный трубный фактор. Продолжительность бесплодия 4 года. Женщина прошла лечение бесплодия методом ЭКО и ПЭ. Через 4 недели после переноса эмбрионов на УЗИ обнаружено плодное яйцо в полости матки. Рассчитаем значение р для данной пациентки.

р = 40,88 - 0,73 х 0,85 + 0,27 х 6,19 + 0,45 х 1,53 + 0,72 х 33,59 + 0,003 х 2861 + 1,83 х 2,9-1,85 х 0,66 + 11,47 х 0,36 + 0,97 х 1,32-5,83 х 0,83 =-1,72

Прогностически благоприятное значение р = —1,72 подтверждается положительным исходом процедуры ЭКО.

Пациентка П., 30 лет с диагнозом: Бесплодие первичное, трубно-перитоне-альная форма. Продолжительность бесплодия 4,5 года. Данной пациентке также проведено лечение бесплодия методом ЭКО и ПЭ, но беременность не наступила.

Р = -40,88—0,73 х 1,39 + 0,27 х 7,04 + 0,45 х 3,05 + 0,72 х 34,94 + 0,003 х 2917 + 1,83 х 4,40- 1,85 х 2,82 + 11,47 х 0,50 + 0,9 х 1,00-5,83 х 0,35 = 2,84

У пациентки П. значение р = 2,84, что указывает на неблагоприятный прогноз исхода программы ЭКО.

Таким образом, с помощью данной модели можно прогнозировать исходы программ экстракорпорального оплодотворения.

На основании полученных результатов нами предложена концептуальная схема основных закономерностей, влияющих на исходы ЭКО у женщин с бесплодием (рис. 8). 18

Гормональная система

СТИМУЛЯЦИЯ СУПЕРОВУЛЯЦИИ

Изменения в сыворотке крови

Повышение Тс. св. (относительно групп сравнения)

Изменения в фолликулярной жидкости

Система ПОЛ - АОЗ

Повышение КД и СТ Повышение ретинола

Отсутствие взаимосвязи продуктов ПОЛ и системы глутатиона

Повышение Дв. св. Повышение ДК

Активация АОА

ГИПЕРАНДРОГЕНЕМИЯ ОКСИДАТИВНЫЙ СТРЕСС

НЕУДАЧА ПОСЛЕ ЭКО

Рис. 8. Основные предикторы, влияющие на исходы ЭКО.

Таким образом, нами установлено, что наряду с гиперандрогенемией, предикторами неудач ЭКО у женщин с бесплодием является активация процессов ПОЛ и антиокислительной системы в сыворотке крови и фолликулярной жидкости с развитием выраженного окислительного стресса.

ВЫВОДЫ

1. В подгруппе пациенток с неудачей ЭКО увеличена доля женщин с повышенным уровнем в фолликулярной жидкости диеновых коньюгат более 1,0 мкМ/л (47,06 % против 86,36 %, рг = 0,02) и двойных связей (р\\МУ = 0,05, ЯК-Б < 0,05).

2. Среди женщин с отрицательным результатом ЭКО чаще повышен уровень в сыворотке крови ретинола более 0,5 мкМ/л (35,29 % против 63,64 %,ръ = 0,045) и кетодиенов и сопряженных триенов = 0,03, рК-Б < 0,05).

3. В группе обследованных с неблагоприятными исходами ЭКО в сравнении с пациентками с наступившей беременностью увеличена АОА фолликулярной жидкости за счет женщин с антиокислительной активностью более 6 у.е. (35,29 % против 68,18 %, рг = 0,03).

4. У пациенток с неудачей ЭКО регистрируется гиперандрогенемия с увеличением уровня свободных фракций тестостерона (р1} = 0,02, /Ж-Я < 0,05).

Содержание стероидных гормонов, ИФР-1, СЭФР в сыворотке крови и фолликулярной жидкости статистически не отличалось.

5. Для обследованных пациенток с положительным результатом ЭКО характерно наличие отрицательных корреляционных связей АОА, СОД и восстановленного глутатиона с продуктами пероксидации липидов сыворотки крови, а также положительных взаимосвязей концентраций андростерона, дигидротестостерона и свободного тестостерона в фолликулярной жидкости с ее антиокислительной активностью.

6. При негативных результатах ЭКО отсутствуют отрицательные корреляционные связи КД и СТ с восстановленным глутатионом и СОД сыворотки крови а также между общей антиокислительной активностью сыворотки крови и содержанием в нем ТБК-АП пероксидации липидов.

7. Значимыми критериями прогноза неудач ЭКО являются: повышение в фолликулярной жидкости уровня ДК более 0,82 мкМ/л и АОА более 6,06 у.е. (чувствительность 1,0; 0,68 и специфичность 0,25; 0,65, соответственно).

8. В прогнозе отрицательного результата ЭКО чувствительность и специфичность повышения в сыворотке крови ретинола более 0,53 мкМ/л составляет 0,45 и 0,68 соответственно.

9. При использовании метода логистической регрессии определены значимые предикторы неудачи ЭКО у обследованных женщин — уровни общего и свободного тестостерона, ДГЭА, двойных связей, ДК, ретинола в сыворотке крови и эстрона, эстрадиола, ДК и ретинола в фолликулярной жидкости (точность правильной классификации 89,6 %).

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Определение уровня двойных связей, диеновых коньюгат и общей анти-оксидантной активности в фолликулярной жидкости пациенток с бесплодием может использоваться для прогнозирования исходов программы ЭКО.

2. Многофакторный анализ с оценкой гормональных показателей и компонентов системы ПОЛ — АОЗ у женщин с неудачами ЭКО в анамнезе может применяться в качестве дополнительного критерия прогнозирования и диагностики причин неудачи ЭКО.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Публикации в ведущих научных рецензируемых журналах,

определенных ВАК Минобрнауки РФ

1. ПрорубщиковаМ.Ю., КолесниковаЛ.И., СутуринаЛ.В. Состояние перекис-ного окисления липидов у женщин, проходящих процедуру экстракорпорального оплодотворения // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. - 2011. - № 5 (81). - С. 106-108.

2. Прорубщикова М.Ю., Сутурина Л.В., Колесникова Л.И. Микроокружение ооцита: обзор литературы // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. — 2011. — № 5 (81). — С. 220-223.

3. Прорубщикова М.Ю., Колесникова Л.И., СутуринаЛ.В. Состояние анти-оксидантной системы у женщин, проходящих процедуру экстракорпорального оплодотворения // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. - 2012. - № 3 (85) Часть 1. -С. 46-48.

4. Прорубщикова М.Ю., Колесникова Л.И., Сутурина Л.В. Показатели пе-роксидации липидов в сыворотке крови и фолликулярной жидкости пациенток с бесплодием и различными исходами экстракорпорального оплодотворения // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. - 2012. - № 3 (85) Часть 1. - С. 75-78.

Публикации в прочих изданиях

5. Kolesnikova L.I., Suturina L.V., Prorubshikova M.Yu. Is the oxidative streess one of IVF failure predictors? // The abstracts of the 5th Congress of the Word Association of Reproductive Medicine, 2010. - P. 11.

6. Suturina L.V., Kolesnikova L.I., Prorubshikova M.Yu. Lipid peroxidation and some antioxydants of blood serum and follicle liquid in women with IVF failure // The abstracts of the Ovarian club 1,2011. - http://comtecmed.com/oc/2011/Uploads/ assets/35_l.v. suturina.pdf

7. Suturina L., Kolesnikova L., Prorubshikova M. Antioxidant activity of follicle liquid and outcomes of ART // The abstracts of the 15th world congress on human reproduction, 2013. - P. 310.

8. Колесникова Л.И., Прорубщикова М.Ю., СутуринаЛ.В. Содержание половых стероидных гормонов в сыворотке крови у женщин, проходящих процедуру экстракорпорального оплодотворения в зависимости от результата программы // Тезисы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины», посвященные 60-летию Читинской государственной медицинской академии. -2013.-Т. 2.-С. 61-62.

9. Колесникова Л.И., Прорубщикова М.Ю., Сутурина Л.В. Математическое прогнозирование эффективности ЭКО у женщин с репродуктивными нарушениями // Материалы Всероссийской научно-пракгической конференции с международным участием «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины», посвященные 60-летию Читинской государственной медицинской академии. - 2013. - Т. 1С. 60-62.

10. Prorubshikova М. Prognosis of IVF efficcaty in women with salpingoperitoneal sterility //The abstracts of the Ovarian club III, 2013. - P. 53.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АОЗ - антиоксидативная защита

ВОЗ - Всемирная организация здравоохранения

ВРТ - вспомогательные репродуктивные технологии

Дв. св. - двойные связи

ДГЭЛ - дигидроэпиандростерон

ДГЭА-с - дигидроэпиандростерон сульфат

ДК - диеновые коньюгаты

ИФР-1 - инсулиноподобный фактор роста-1

КДиСТ - кетодиены и сопряженные триены

АОА - общая антиокислительная активность

ПОЛ - перекисное окисление липидов

СЭФР - сосудистый эндотелиальный фактор

СОД - супероксиддисмутаза

ТБК-АП - ТБК-активные продукты

ФР - факторы роста

ФЖ - фолликулярная жидкость

ЭКО - экстракорпоральное оплодотворение

Э1 - эстрон

Э2 - эстрадиол

єгн - глутатион восстановленный

бЭЭН - глутатион окисленный

К-Б - критерий Колмогорова-Смирнова

и - и-критерий Манна-Уитни

\ZV-W - критерий серий Вальда-Вольфовица

X2 - критерий Хи-квадрат

г - критерий зет

Подписано в печать 17.10.2013. Бумага офсетная. Формат 60х841/,6-Гарнитура Тайме. Усл. печ.л. 1,0 Тираж 100 экз. Заказ № 078-13._

РИО НЦ PBX СО РАМН (Иркутск, ул. Борцов Революции, 1.Тел 29-03-37. E-mail: arleon58@gmail.com)