Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Закономерности биологического действия и квантово-механические характеристики перспективных антисептических препаратов как основа новых принципов их выбора

РГВ од

- 9 ИЮП

На правах рукописи

Баркова Наталья Петровна

ЗАКОНОМЕРНОСТИ БИОЛОГИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ И КВАНТОВО-МЕХАНИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ПЕРСПЕКТИВНЫХ АНТИСЕПТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ КАК ОСНОВА НОВЫХ ПРИНЦИПОВ ИХ ВЫБОРА

14-00-16 - патологическая физиология 14-00-25 - фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Иркутск - 1997г.

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте медицины труда и экологии человека ВСКц СО РАДО к филиале М 5 Института Биофизики МЗ Р©

Научные консультанты академик РАМН академик РАЫН

С.й.Колесник Е.Д.Гольдбер

Официальные оппоненты г док-хор медицинских наук, профессор доктор медицинских наук, профессор доктор биологических наук, профессоЕ

Л.Г.Миллер

В.В.Бенемзне

И.Н.Гутнкк

Ведущее учреждение - Московская Медицинская Академия имени И.М.Сеченова

Залита диссертации состоится "_"_ 1997 г.

б___часов на заседании диссертационного Совета

д 00i.4i.0i ГУ "Восточно-Сибирский научный центр Сибирского Отделения Российской академии медицинских наук (684003, г.Иркутск, ул.Тимирязева,16)

С диссертацией можно ознакомиться б библиотеке ГУ "Восточно-Сибирский научный центр" по адресу ; 664003, г.Иркутск, ул.Тимирязева, 16

Автореферат разослан "__ 19Э7 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета, кандидат медицинских наук

Л.Ф.Шолохоз

Общая характеристика работы

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМ. Известно, что около 357. всех нозологических единиц (по международной классификации причин заболеваний) вызываются микробами; из имеющихся в природе 2500 видов микробов 1300 могут быть причиной заболеваний человека (Афиногенов Г.Е.,1979). Проблема усугубляется изменчивостью микрооганиз-мов, появлением лекарственно-резистентных форм бактерий и вирусов, снижением эффективности антибиотикотерапии, а также особенностями изменений регуляторньк и метаболических реакций макроорганизма.

I В последние десятилетия в работах отечественных и зарубежных исследователей отмечается, что внутрибольничные инфекции регистрируются у 4-57. госпитализированных больных, и примерно 3% больных умирают от них (Прозоровский C.B. и др.,1989; Воск В. V. ,1982).

Эпидемиологический анализ показывает, что тенденции развития общества ведут к потенциальному накоплению факторов, способствующих росту числа случаев гнойных воспалительных процессов (Брусина Е.Е. и др.,1985; Бураковский В.И.,1987). Это определяет особую патофизиологическую значимость рассматриваемой проблемы.

Лечение и профилактика таких типовых патологических процессов тесно связаны о аффективным обеззараживанием использующихся предметов и расходных материалов. По сути дела, ни одна сфера деятельности в здравоохранении не может обойтись без применения антисептических средств.

Применение эффективных и безвредных антисептиков в нужных дозировках, формах и условиях может. предотвратить совокупный урон, исчисляемый триллионами рублей.

Однако, полностью удовлетворяющих потребителей антисептиков в стране практически нет. Известные препараты либо заведомо мало эффективны, либо теряют активность из-за" привыкания" к ним микроорганизмов, либо остродефицитны и дорогостоящи, либо физико -химические свойства не допускают их широкого использования; Многие дезосредства обладают резким и неприятным запахом, необратимо портят обрабатываемые предметы и т.д. Многие из до сих пор применяемых препаратов высокогоксичны и опасны - обладают аллергенным, органоспецифическим, эмбрио- и гонадотоксическим, мутагенным, канцерогенным действием, негативно влияют на репродуктивную функцию.

Это еще раз подчеркивает актуальность синтеза антисептиков нового поколения и их всесторонней квалифицированной оценки.

И еще одна сторона проблемы представляется безусловно актуальной - это развитие направления исследований по прогнозированию биологической активности (токсичности и опасности) химических веществ по стереохимическим, квантовамеханическим характеристикам их молекулярной структуры. Успешное решение этих задач ускорит и уточнит традиционную токсикологическую оценку, позволит вести целенаправленный синтез антисептических препаратов с заранее заданными свойствами, не извращающими, а коррелирующими течение типового патологического процесса.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ. На основе исследований особенностей изменения основных функциональных показателей макро- и микроорганизма, физико-химических свойств молекулярной структуры научно обосновать выбор перспективных антисептических препаратов, удовлетворяющих современным требованиям по фармакологическому действию, безвредности, экономичности, экологичности и конкурентоспособности.

Для решения целевой установки работы необходимо было выполнить следующие задачи:

1. Провести анализ и сравнительные экспериментальные исследования 73-х новых антисептических средств для отбраковки мало эффективных и токсичных образцов и выбора антисептиков, отвечавших одновременно всему перечню требований, предъявляемых к современным препаратам.

2. Провести исследования микробиологической активности, токсичности и опасности с учетом возможных отдаленных, генетических и иных специфических эффектов действия перспективных антисептиков - 6-ти производных полигексаметиленгуанидина.

3. Установить основные механизмы биологического действия полит ексаметиленгуанидинов на макро- и микроорганизм.

; 4. Разработать дифференцированные, многоуровневые критерии основных показателей доклинической оценки антисептических препаратов для объективного сопоставления свойств, перспективности промышленного производства и практического применения.

5. Провести теоретические исследования молекулярной структуры антисептиков, полигексаметиленгуанидинового ряда и расчеты энергетических, квантовомеханических свойств. Наработать семейства математических моделей для экспрессного и высокоточного прогнозирования биологической активности. Наметить перспективы и предложить технологии создания антисептиков нового поколения.

6. Разработать новые нетрадиционные формы и способы применения антисептиков в медицине и других сферах деятельности человека.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ.

- Впервые установлены закономерности действия производных полигексаметиленгуанидина на макро- и микроорганизм на уровне клеточных мембран.

- Впервые доказано, что наличие и выраженность гемолитического эффекта у антисептиков полигексаметиленгуанидинового ряда зависит от химической природы функциональных групп, входящих в структуру молекулы.

- Впервые разработаны критерии качества антисептических средств, включающие микробиологические, токсикологические, технико-экономические, экологические и другие свойства

- Впервые в токсикологии и фармакологии использован комплексный показатель качества, представляющий собой среднегеометрическую совокупность наиболее важных свойств антисептика, ранжированных в шкале предпочтительности.

- Впервые установлено влияние аниона на характер изменения линейности структуры полигексаметиленгуанидина, конформацию молекулы, меру нейтрализации заряженных иминогрупп гуанидина, на химическую активность и токсические свойства.

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И НАУЧНО - ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ.

Экспериментальное изучение биологического действия перспективных антисептиков на уровне макро- и микроорганизма позволило доказать, что гуанидинсодержащие препараты обладают избирательной токсичностью для микроорганизмов, которая обусловлена их влиянием на уровне клеточных мембран.

Разработанные критерии и комплексный показатель качества могут быть использованы при выборе и оценке новых биологически активных препаратов, обладающих различным фармакологическим действием.

Предложенный метод прогнозирования токсичности подигекса-метиленгуанидиновых антисептиков по квактовомеханическим показателям химической структуры может быть использован и для предварительной оценки параметров токсикометрии других классов химических соединений, представляющих фармакологический интерес.

Выполненная работа имеет важное теоретическое и практическое значение. В частности, выраженная эффективность новых антисептических препаратов класса полигексаметиленгуанидинов в отно-

шеяии широкого спектра патогенной микрофлоры (включая грампози-тивную, грамнегативную, дро^жеподобную, грибковую и др.) послужила основанием рекомендовать их для дальнейшего внедрения в медицинскую практику и другие отрасли народного хозяйства в качестве антисептирувдих и дезинфицирующих средств.

Полученные результаты используются в научно-исследовательской работе и в учебных курсах по токсикологии, фармакологии, биологии в высших учебных заведениях.

ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ. По результатам научных исследований производных полигексаметиденгуанидина представлены отчеты в ИЗ га, Госкомитет Санэпиднадзора РФ, Госстандарт РФ, Главное управление ветеринарии Минсельхоза РФ и др., были получены разрешения на использования препаратов.

На основании токсикологических, санитарно-химических и физико-химических исследований утверждены МЗ СССР и РФ Методические указания (2)

На препараты и способы их получения и применения получено 5 патентов.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Основные результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на:

- IX Международном Симпозиуме по целенаправленному изысканию лекарственных веществ, Рига, 1991г.;

- Координационном Совете III ГУ при Минздраве СССР, Москва, 1990г.;

- Координационном Совете III ГУ при Минздраве СССР, Ленинград, 1991г.;

- Объединенной научной сессии НИИ ВУЗов медико-биологического профиля, Иркутск, 1990г.;

- IV Международном Россииско-Японском Медицинском Симпозиуме, Иркутск, 1996г.;

- расширенном заседании Президиума СО ВСНЦ РАМН, Иркутск, 1996г. и др.

ПУБЛИКАЦИИ. Всего автор имеет 42 научных труда. По материалам диссертации опубликовано 22 работы, в том числе 1 монография, 5 патентов, Методические указания МЗ СССР и РФ, оформлено 7 заявок на изобретение.

Диссертационная работа выполнена в рамках реализации Государственной программы "Обеспечение социальной гарантии населения", раздел 6 "Программы улучшения лекарственного обеспечения", а также Федеральной Научно-технической программы "Создание новых

лекарственных средств и изделий" в НИИ медицины труда и экологии человека ВСНЦ СО РАМН и филиале N 5 Института биофизики МЗ РФ.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЙЕ НА ЗАЦИТУ:

1. Общим в механизме биологического действия производных по-лигексаметиленгуанидиноваго ряда на макро - и микроорганизм является мембранотокеический эффект.

2. Гибель микроорганизма обусловлена особенностями действия химической структуры полигуанидин-антисептиков на уровне клеточных мембран и нарушением гликолитических процессов микробной клетки.

3. На фоне мембранотокоического действия политексаметиленгу-анидина на макроорганиам установлен гемолитический эффект, выраженность которого зависит от природы функциональных групп, входящих в структуру молекулы.

4. Комплексный показатель качества - методический прием для сопоставления физико - химических, микробиологических, токсикологических, технико - экономических свойств, перспективности промышленного производства антисептических препаратов.

5. Лучшими из имеющихся в настоящее время отечественных и зарубежных образцов являются антисептики класса полигексамети-ленгуанидина, из которых самый перспективный и высокоэффективный - фогуцид.

8. Анион - индикатор конформационных связей в структуре по-лигексаметиленгуанидина, который регулирует токсические свойства гуанидиновой группы.

7. Зависимость "химическая структура - биологическое действие" в свете квантовомеханических показателей позволяет прогнозировать токсичность производных подигексаметиленгуанидинов, с помощью чего можно создавать детоксицированные конъюгаты - антисептики нового поколения.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация состоит ив Введения, главы "Методы исследования", шести глав собственных исследований, заключения, выводов, списка использованной литературы и приложений.

Автор счел целесообразным использовать монографический стиль изложения материала.

Объем диссертации изложен на страницах, содержит 43 таблицы и 25 рисунков. Список использованной литературы включает 184 отечественных и 81 зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследовании являются 73 антисептика, синтезированные в различных учреждениях страны. Из них с 29-ю препаратами проведены микробиологические и токсикологические исследования по скрининговой прграше. Семь антисептиков подлежали исследованиям по полной программе (острый, подострый, хронический эксперимент, оценка отдаленных и специфических эффектов действия ). Параметрические характеристики образцов препаратов соответствовали нормативно - технической документации (ТУ 10-09-481-87, ТУ 6-09-11-90, ТУ 12-09-296-88, ТУ 11-09-25-89, ТУ 64-0112-8-93).

Экспериментальные исследования выполнены на 6230 белых беспородных крысах, 1830 белых мышах ( нелинейных, а также линии СБА С57/816), 1850 морских свинках светлой масти, 84 кроликах породы "Шиншилла", к испытаниям привлекались 12 штатных испытателей - добровольцев.

Все исследования и испытания выполнены в соответствии с Методическими указаниями, утвержденными Минздравом СССР и РФ; требованиями Фармакологического Комитета, рекомендациями ВОЗ. Основные из них:

: - Руководящие методические материалы по экспериментальному, и клиническому изучению новых лекарственных средств ( издание официальное ), МЗ СССР, Фармкомитет, М., 1980-1989гг., 4.1-6.

- Сборник унифицированных методических указании по доклиническому и клиническому испытанию лекарственных средств (ч.1-П), СЭВ, ПК ( здравоохранения), М.- 1987г.

- ГОСТ 6-001-71 "Организация и порядок проведения Государственных испытаний средств измерения".

- Требования оистемы "Джи-эл-пи" (GLP)- Добротной лаборатории практики" (Fed Red., 41 (225), 51206, 1076).

В острых и подострых токсикологических экспериментах использованы животные разного вида, пола и возраста, включая новорожденных и старых. Пути введения препаратов в организм - внут-рижелудочный и кожный.

Площадь апплицироваяия при изучении местного раздражающего действия составляла: для белых крыс - 16 см2, морских свинок -25 см2, кроликов - 56 см2; при изучении резорбтивного общетоксического действия площадь апплицирования соответствовала 127. от площади поверхности тела животного.

Воздействие на кожу осуществляли открытым способом на предварительно выстриженные участки, дозированно на единицу площади

и массы тела подопытных животных.

Условия острых опытов при кожном пути поступления антисептиков в организм предусматривали 8-ти часовую фиксацию подопытных животных с последующим удалением препаратов о кожи и при экспозиции - 1 день. Регистрацию результатов производили по окончании экспозиции через 1 час и затем через 24, 48 и 72 часа.

Подострые и хронические эксперименты предусматривали 4-х часовую фиксацию животных при экспозиции соответственно 1 месяц и 4 месяца (5-ый - восстановительный).

Контрольные животные находились в идентичных условиях экле- . римента. На соответствующие участки кожи (или.внутрь желудка) наносили (или вводили) соответствующие растворители исследуемых веществ (вода, подсолнечное масло).

Среднесмертельные дозы расчитаны по методу Литчфильда -Вилкоксона (1979), Кербера (1962).

Оценку местного раздражающего действия проводили в соответствии с Методическими указаниями "К обоснованию предельно-допустимого уровня загрязнения кожи химическими веществами" (1987), и разработанными наш Методическими указаниями "Токсико-лого-гигиенические исследования полимерных материалов и изделий из них" (1988).

При оценке результатов учитывали не только визуальное (выраженность эритемы, инфильтрацию и отек), но и функциональное состояние кожных покровов по оценке липидного обмена, кислотно-щелочного равновесия, гистологических исследований.

Для изучения проницаемости кожи нами были разработаны методы индикации исследуемых препаратов и утверждены на Химической секции Института биофизики (Москва, 1989, 1990).

Исследования аллергенных свойств проведены с помощью комплексной сенсибилизации (Алексеева О.Г. о ооавт.,1980; Бережная Н.М. о соавт.,1986) с использованием скарификационных аллергоди-агностических реакций кожи (Бруевич Г.С.,1982; Черноусов А.Д., 1972).

В работе использован набор методик, позволяющий определить характер и степень функциональных изменений под влиянием испытуемых антисептических препаратов в организме животных.

Оценку общего состояния подопытных животных осуществляли по их внешнему виду, динамике прироста массы тела. Функциональное состояние нервной системы исследовали по суммационно - подпоро-говому показателю (Павленко С.М.,1975), поведенческим реакциям,

функциональным пробам (Елизарова О.Н.,1972).

В периферической крови изучен количественный состав содержания гемоглобина, эритроцитов, ретикулоцитов, эозинофшшов, .расчитана дейтаграмма и цветной показатель (Идельсон Н.Ф. и др., 1975; Бейер В.А.,1973).

Индуцирующую способность исследуемых препаратов на обменные процессы в организме подопытных животных оценивали по биохимическим показателям сыворотки крови и органов: альбуминам плазмы крови, малоновому диальдегиду (Портяная Н.И. и др., 1990)., активности щелочной и кислой фосфатаз (Меньшиков В.А., 1982), пе-роксидазы (Попов Г.А., 1978), гидроперекиси липидов, аданин- и аспартатаминотрансферазы (Портяная Н.И., 1990), свободного и связанного холестерина (Комаров Ф.И. и др.,1986), общего белка (Вапцаров И., 1978) и общих липидов (Еиотест "Общие липиды"), активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Меньшов В.В., .1987), содержания сульфгидрильных групп (Соколовский В.В. и др., 1973), кислотной и осмотической резистентности эритроцитов, стабильности липопротёиновых комплексов, активности Ма~\ К+- АТФазы (Sel-dak S., 1978), сывороточного железа (Биотест).

Иммунный ответ организма оценивали по определению бактерицидной активности крови (Isekuiz A.C., 1979) и фагоцитозу (Клем-парскаяН.Н., 1978; Фролова М.А., 1979).

Для оценки морфофункционального состояния внутренних органов использовали ряд гистологических и гистохимических методов. В частности, определяли активность моноаминооксидазы (Лупа X., 1970), кислой и щелочной фосфатазы (Беретан М., 1965), лактатде-гидрогенаэы (Меркулов Г.А., 1969), сукцинатдегидрогеназы (Пирс Э, 1962), а также содержание гликогена, нейтральных липидов (Мецдер Д., 1980), нуклеиновых кислот (Соколовский В.В., 1971).

Состояние детоксицирующей системы на уровне организма оценивали. по длительности сна после внутрибрюшного введения гексе-нала (60 мг/кг массы животного).

Способность организма кумулировать исследуемые соединения изучали на уровне 1/2, 1/5, 1/10, 1/50 DLso и оценивали по классификации Медведя Л.М.

Для оценки потенциальной мутагенной и канцерогенной активности антисептиков использовали тест Эймса на индикаторных штаммах Salmonella Typhimurium ТА97, ТА98,• а также микроядерный тест на полихроматофильных эритроцитах при субхроническом отравлении крыс самцов - гибридов первого поколения. Эмбрио - и гонадоток-

сическое действие изучали согласно Методическим указаниям и рекомендациям (1984, 1985).

Определение антимикробных свойств препаратов in vitro проводили с помощью метода "зон" на питательной среде Коростылева, мясопептонном агаре с использованием различных штаммов микроорганизмов: Staph!lococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Serratia marcencens, Proteus vulgaris, Candida albicans и др. (Тима-ков Б.Д., 1983; Клемпарская H.H., 1987). Часть препаратов оценивали электронномикроскопически (Hevalier I, 1992); определяли сумму SH -зависимых ферментов, белкового и липидного обмена (Рубцова С.Л., 1983; Lelaporn А. et. al., 1994; Rüssel A.D. et. al., 1995).

Оценку токсикологических параметров и микробиологических свойств наиболее перспективных и высокоэффективных антисептических препаратов проводили в сравнении с известным зарубежным аналогом - хлоргексидинбиглюконатом - близким по структуре с - поли-гексаметиленгуанидинами и завоевавшим рынки всего мира.

Расчеты квантовомеханических показателей молекулярной структуры полигексаметиленгуанидинов проводили в соответствии со справочными данными физико-химических констант, а также на основе анализа литературных данных и дополнительных расчетов (Ор-вильТомас Дж.,1984; Вудворт Р.,1981; Герцберг Г.,1981; Грей Г,1979; розенберг Е.А.,1974; Краснов К.С.,1979; Эткин П.,1970 и ДР.)

В математических исследованиях использовали теорию планирования эксперимента (Адлер Ю.П.,1976), метод главных компонент, (Гублер Е.К. ,1978), шаговый дискриминантный анализ (Копанев В.А'., 1988; и др., 1983). Математическое программное обеспечение включало пакет прикладных программ системы обработки медицинской информации ( ППП СОМИ, P3S, PIVS, Р4М, P2R, Р7М).

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ Н ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Согласно государственной стандартизации (ГОСТ 15467-79), разработанной Советом Экономической Взаимопомощи, качества какой" либо продукции; в частности, антисептика, понимаемое как совокупность всех его свойств, определяющих его пригодность удовлетворять заданные потребности и отвечающих необходимым требованиям многоаспектно и многокритериально.

Неотчуждаемыми составляющими комплекса требований, предъяв-

ляемых к антисептическому средству, являются: гарантированная безвредность для человека в условиях применения и производства-, высокая бактерицидная активность в отношении широкого спектра патогенной микрофлоры; доступность сырья для организации промышленного производства; технологичность; невысокая стоимость; определенные физико - химические, гигиенические и потребительские свойства.

Перспективные антисептики должны быть универсальными: губительно действовать на вирулентную грамположительную, грамотрица-тельную дрожжеподобную, плесневую, грибковую микрофлору, но не разрушающими естественный микробный эписомапьный биотоп, не теряющими активность в биосредах (гнойном содержимом ран, лимфе).

В фармакологическом смысле перспективные антисептики должны обладать избирательной токсичностью ( быть ядами в отношении микроорганизмов и мало токсичными для теплокровных животных и человека).

Поскольку антисептические препараты, как правило, используются не системно, а местно, то преимущество при выборе получают малолетучие, полярные, ионизируемые антисептики, обладающие свойствами электролитов, низким значением коэффициентов в системе масло-вода, слабовыраженными липофильными свойствами, низкой всасываемостью в вакуолизированных слоях кожи; вещества, при синтезе или промышленном производстве которых практически исключено образование высокотоксичных микропримесей.

Селективный отбор предварительных исследований предусматривал использование следующих разработанных нами критериев пригодности антисептиков:

- Эффективная бакгериостатическая концентрация в отношении клинических штаммов Staph.aureus, Pseudomonia aeruginosa - не более 100 мкг/мл;

- Среднесмертельные концентрации при внутрижелудочном введении в организм - более 500 мг/кг ( не ниже III класса - вещества умеренно и малотоксичные ).

- Среднесмертельные концентрации при кожном пути поступления в организм - более 2500 мг/кг ( не ниже IV класса - вещества малотоксичные).

- Минимальная действующая доза (порог острого действия) при кожном пути поступления в организм - более 100 мг/кг.

- Интенсивность кожно - раздражающего действия - не более 0,5 балла (слабовыраженная кратковременная очаговая эритема) на

площади не Солее 20Х поверхности кожи, подвергавшейся воздействию антисептика.

- Порог ощущения запаха ( обонятельный коэффициент) - не менее 5.Oil.О см3, интенсивность запаха - не более 3-х баллов при отсутствии защитных рефлекторных реакций.

- Кожно-оральный коэффициент - не менее 3.

- Коэффициенты видовой, половой чувствительности, возрастных различии в чувствительности - не менее 3.

- Коэффициент кумуляции при внутрижелудочном введении в организм - от 4-х и выше (слабовыраженная кумуляция, отсутствие кумуляции). Дополнительное условие: уменьшение кумулятивных свойств при снижении ежедневно вводимой дозы.

- Метаболиты, продукты биотрансформации антисептика не должны- быть токсичнее, чем основное вещество (класс опасности не ниже Ш-го).

- Отсутствие дерматогенного действия, свойств кожных аллергенов.

- Отсутствие влияния на генеративную функцию, а также отсутствие других отдаленных последствии избирательного действия (зона специфического действия меньше единицы).

- Ориентировочный безопасный уровень воздействия при накожном нанесении - не ниже 0,002 мг/см2.

Но задачи отбора и всестороннего изучения перспективных антисептиков требуют наряду с этим качественной детализации оценочных шкал каждого отклика (свойства, признака, параметра, показателя) имманентных качеству, и последующего обобщения.

Из многих признаков, характеризующих качество антисептика, нет абсолютно универсального и только один (скалярный, обобщенный) может служить мерой качества препарата. Но каждый показатель (отклик) имеет свои размерность и свой физический смысл. Объединить различные отклики, агрегировать их, свернуть векторные критерии в скалярный - это значит, прежде всего, ввести для каждого показателя безразмерную шкалу, искусственную метрику. Шкала должна быть однотипной для всех объединяемых откликов -только это делает их сравнимыми, пригодными для обобщающей свертки.

Одним из наиболее удобных способов построения обобщенного показателя качества является функция желательности Харрингтона. В основе ее лежит идея преобразования натуральных значений частных откликов в безразмерную шкалу предпочтительности (рис.1).

п / п - / П

п 1/п

( П сЮ 1-1 1-1

сНШ)

0.80

0.63

0.37

0.20

0.00

фогуцид

полигвксаметиленгуанид: акрилзамещенные пирана

хлоргексидин биглюкона нитгх&ураки

ПАВ-чвтвертичные

аммониваиэ основания

триазикы

дитиокарбаматы-

хинолины дифенилбензоаты

дистананты

крешшйртутьоргакическз

сила-граны

станилтиосиланы станоксаны

У1

т cut т рвгоз «»сит .-'сит

КВР, КПЧ, КВЧ ВДУ, мг/дм3

Рио.1.Качество антисептиков в шкале предпочтительности

Реперкы&и точками для перекодировки в шкалу желательности (с!^) каких-либо измеренных в эксперименте показателей частных свойств антисептика (уО служат Государственные стандарты, требования Фармкомитета, гигиенические классификации потенциальной и реальной опасности химических веществ, данные Методических указаний, утвержденных МЗ СССР и РФ, справочные данные среднестатистической, динамической биологической нормы. Если хотя бы одно свойство антисептика, одна частная желательность равна нулю, то функция тоже будет равна нулю. С другой стороны Б - 1 тогда и только тогда, когда все <11-1.

Предложенный способ является статистически эффективным и позволяет проводить операции определения величин различий между объектами, измерять равенства отношений величин, допускает вычисления показателей сигмального отклонения, средней, коэффициентов корреляции, вариации и т.д. Кривая функция желательности может использоваться как номограмма, поскольку это легко и оперативно. Она обладает такими свойствами как непрерывность, монотонность, статистическая эффективность и адекватность.

Из рис.1 видно, что из 73 антисептиков, принадлежащих к 14 различным классам химических соединений лучшими являются производные полигексаметиленгуанидина (ПГМГ), в полной мере отвечающие предъявляемому комплексу требований.

Микробиологическая активность ПГМГ-антисептиков представлена в табл.1.

Таблица 1

Микробиологическая активность производных ПГМГ (минимально подавляющие концентрации, мкг/мл)

Вид микроорганизмов Производные ПГМГ по аниону

хлорид амино-бенэоат фосфат глюконат хлоргекси-дин биглзо-конат

Staph, aureus 0.6 0.6 0.3 0.4 2.0

Ps. aeruginosa 9.7 9.0 6.2 7.8 25.0

Serrata marcens. 12.0 12.0 10.0 10.0 30.0

Proteus vulg. 1.2 1.2 0.6 1.2 1.5

Candida albicans 10.0 11.0 8.0 10.0 15.0

Klebsiella pneumon. . 0.2 0.2 0.1 0.1 0.6

E. coll 0.3 0.2 0.1 0.2 1.1

Salmonella l.v. 18.0 20.0 15.0 22.0 40.0

Это далеко не полный перечень микроорганизмов, на которые действуют подигуанидиновые антисептики. Однако, и отсюда видно, что они по широте и силе бактериостатического действия не уступают лучшему зарубежному образцу - хлоргексидинбиглюконату.

Активность ПГМГ - антисептиков зависит от многих причин: от химической структуры препарата (например, по действию на кишечную палочку отдельные представители гуанидинсодержащего ряда различаются в 117 раз), а также от химического состава и строения микробных клеток.

Структурно-химическая мозаичность оболочки бактерий обеспечивает интегративные функции клеток по селективному отбору молекул.

В клеточных стенках грамположительных и грамотрицательных бактерий имеются пептидогликаны. У грампозитивной флоры они многослойны и диаминопиелгаовая кислота у них заменена лизином, а тейхоевые кислоты через фосфодиэфирнне связи присоединены к молекулам мурамоЕай кислоты. У граынегативкой флоры пептидогдиканы однослойны и с ними связаны липополисахариды, липопротеины, фос-фолипкды, через которые устанавливаются коммуникативные связи клетки (1?езсЬ К., 1982; Брего Ь., 1978 и др.).

Грамположительные бактерии имеют в 10 раз меньше липидов. Из-за выраженного анионного характера, который обусловлен наличием тейхоевых и тейхуроновых кислот, заметно увеличивается скорость проникновения в клетку ионизированной гексаметиленовой группы, входящей в структуру молекулы полигуанидинов. Поэтому антибактериальный эффект производных ПГМГ на грампозитивную флору достигается в разведении 1:2 млн. и более.

Липиды клеточной стенки грамотрицательных бактерий сильно затрудняют проникновение гидрофильных веществ. Поэтому-то для достижения эффекта требуются, как мы видим из таблицы 1, более высокие концентрации.

С цитоплазматической мембраной связана активность ряда ферментных систем (дегидрогеназной, фосфатазной, цитохромной и др.). Транспортные белковые молекулы цитоплазматической мембраны обеспечивают быстрый переход извне в клетку структурно родственных веществ (замечу., что аминокислоты лизин, аргинин структурно родственны полигуанидинам).

Диссоциируя в водной среде, полигуанидины выступают в качестве основания за счет трех иминогрупп, необратимо деполяризуют липополисахариды, расщепляют сложноэфирную связь в липидах

ЛПС. в результате происходит детерминация функциональной активности всей микробной клетки. Экспериментально доказано снижение активности суммы БН-зависимых ферментов (гексокиназы, лактатде-гидрогеназы, гликогидролазы и др.), что приводит к угнетению гликолитических процессов в микробной клетке.

В общем виде механизм бактерицидного действия производных ПГМГ можно представить следующим образом:

- гуанидиновые поликатионы адсорбируются на отрицательно заряженной поверхности бактериальной клетки (этот эффект зависит от величины ионного заряда, следовательно, от молекулярных блоков в полимере);

- полигуанидины диффундируют через стенку клетки (этот процесс зависит от величины поверхностной активности, липофильнос-ти, растворимости в воде, молекулярного объема диффундирующей частицы); ■

- полигуанидины связываются о кислотными фосфалтидами, белками цитоплаэматической мембраны, что приводит к ее разрыву (эффект зависит от концентрации и молекулярного веса антисептика);

- результатом этого является блокада гликолитических ферментов дыхательной системы, потеря патогенных свойств и гибель микробной клетки.

Говоря о выборе бактерицидных препаратов, следует прежде всего учитывать оценку их токсичности и опасности для теплокровных животных и человека.

По согласованному мнению международной группы экспертов (Принципы и методы оценки токсичности химических веществ, 1985) токсичность не может быть определена без учета количества введенного или абсорбированного вещества, пути, по которому данное вещество попало в организм, типа и характера действия и времени, необходимого для его проявления. При этом, безопасность определяется как практическая уверенность в том, что данное вещество не вызовет никаких повреждений, если используемое количество и способ применения вещества соответствует предписанным. Показателями порога вредности следует считать достоверные отклонения от контроля, но также от исходных величин реакций комплекса наиболее чувствительных к тому или иному воздействию физиологических систем, находящихся на границе между физиологическими колебаниями, физиологической мерой защиты и патологическим процессом.

, Экспериментально установлено, что полигуанидины всасываются

через неповрежденные кожные покровы. Однако в силу низкой величины коэффициента распределения масло/вода, скорость трансэпи-дермальной, трансфоликулярной пенетрации этих соединений невелика и составляет 1.5 мкг/см2-час. Скорость всасывания тем выше, чем больше доза нанесенного на кожу препарата. Однако транску-танная резорбция ПГМГ происходит, в основном, в первые 5-30 минут.

Об общем характере биологического действия полигуанидинов на макроорганизм свидетельствует однонаправленность изменения показателей интоксикации.

Полигуанидины мембранотропны, что обусловлено их физикохи-мическиыи свойствами, наличием катионных полигуалидиновых группировок, придающих детергентность, поверхностную активность антисептикам и характеризуется нарушением функции К+ - насоса путем снижения активности АТФ-азы и нарушения стабильности ли-попротеиновых комплексов (табл.2), в основе чего лежит изменение свободно - радикальных процессов перекисного окисления липидов (рис.2)

Таблица 2.

Влияние производных ПГМГ на состояние клеточных мембран (путь введения - внутрижелудочный)

Определяемые показатели Доза антисептика, мг/кг

. 1/2 0Ь5О 1/10 0Ь50 1/50 ВЬБО Контроль

Активность Иа*, К+ -

АТФ - авы в эритроцитах 3.980+ 4.100+ 4.460+ 4.60±

(мкмоль неорганического Р 0.110* 0.150* 0.170 0.18

на мл суспензии эритроци-

тов в час)

Стабильность липопротеи- 0.115± 0.107± 0.093+ 0.091+

новых комплексов сыворот- 0.004* 0.005* 0.005 0.004

ки крови (г липидов на л)

Примечание:'* - достоверные отклонения при р<0.05

Политексаметиленгуанидины "авидны" к клеткам крови, печени и почек.

Этим обусловлена:

- гепатотропность, диагносцируемая по блокированию синтеза

плазмоспецифического фермента - лецитинхолестерин-ацилтрансфера-зы, этерификации холестерина, снижение активности аланин- и ас-партатаминотрансферазы, снижением гликогенообразующей функции (рис.3).

- нефротоксичность, морфологически проявляющаяся мелкоочаговой дистрофией эпителия извитых канальцев почек, клиническими признаками нефрита, увеличением содержания хлоридов и белка в моче.

- гемолитический эффект, как результат мембранотоксического действия, установленный в наших экспериментах только на уровне высоких доз при внутрижелудочном введении и высоких поглощенных доз в условиях хронического воздействия.

МДА МДА МДА

ПОЛИСЕПТ ФОГУЦИД ПШГ ГПКЖОК/

Рис.2. Состояние окислительно-восстановительных процессов в условиях воздействия антисептиков на уровне максимально переносимой дозы (путь введения - внутрижелудочный) Условные обозначения: ВДА - малоновый диальдегид;

ГЦЛ - гидроперекись липидов;

ЩФ - щелочная фосфатаза;

П - пероксидаза;

К - каталаза.

Поскольку все нарушения эритрона обусловлены такими патогенетическими факторами, как недостаточная продукция эритроцитов и повышенное их разрушение, то патологическая схема нарушений в данном случае может иметь следующий вид:

149, 1»'

«а

4« 21 О

Ш%

М(%

1 2 Э 4 С ш.

Связанный холестерин

13 3*5 нк.

Свободный холестерин

МОЮДЬ/МЛ.Ч«

1 2 3 4 » мм.

Аланинаминагрансфераза

♦ пгмг 1шнм/иг,ч1е ♦ ПГМГ

гаерад * т х»«рм

Ш ПГМГ II'- ■ В -ПГМГ

фосфл фмфгг

—А—ппиъш —А—ПГМГтв

иит «Ж 1- ПИП

о.« о

1:341 мм.

Аспаргатаминсярансфераза

Общие липиды

11,5

и од

1» »■»

»

и

. I*

ж

пмг

хпорм

пгмг

фмфгг

ПГМГтв

К0И1Т КТ-

О 12 3 4«

Общие белки

РИС .3 Изменение показателей функции печени в условиях хронического воздействия ПГМГ антисептиков на уровне 1/10<ЮЬ» при кожном пути поступления в организм

Схема развития гемолитического эффекта при воздействии полигексаметиленгуанидинов на уровне макроорганиэма

На первой стадии развития, когда происходит недостаточная продукция эритроцитов, наблюдается включение компенсаторного механизма, результатом которого является увеличение скорости продукции эритроцитов. Поэтому в крови обнаруживается абсолютное увеличение числа ретикулоцитов, которое отмечено в условиях хронического эксперимента на уровне воздействия 1/100 ИЬбо в течение всех сроков наблюдений (рис.4).

Вторая стадия характеризуется укорочением срока жизни эритроцита, обусловленным в основном повреждением мембраны эритроцитов с ингибированием активности эритроцитной глюкозо-б-фосфатде-гидрогеназы (рис.5).

Известно, что кислород и другие лиганды присоединяются к группе гема, насыщая шестую координационную валентность атома железа (Корнеши-Боуден Э.,1985).

III

Рис.4 Изменения показателей красной крови в динамике хронического апшащирования производных ПГМГ в дозе 1/100 DLCUTso Зависимость " Доза - время - эффект". (% отклонений от контрольных значений) Условные обозначения: I - полисепт;

II - ПГМГ гдюконапг, III- фогуцид.

ЭР - эритроциты; ЦП - цветной показатель; Hb - гемоглобин; Re - ретикулоциты.

Иминогруппы гуанидина в молекуле ПГМГ вследствие высокой активности и наличия выраженного отрицательного заряда занимают свободную валентность Ре и могут способствовать вытягиванию металла с образованием устойчивого комплекса.

Чем меньше мера нейтрализации иминогрупп в гуанидине, тем больше выход железа из гема. Только у полисепта на всех уровнях воздействия максимально переносимых доз (рис.5) отмечено значимое снижение количества сывороточного железа, изменение осмотической и кислотной резистентности эритроцитов. В хроническом эксперименте этот процесс сопровождается устойчивым изменением показателя гемоглобина во все сроки наблюдений (рис.4).

в «

-те

-15 -50

% еллемм!

ПОЛИСЕГГТ

•/. тмит!

«ОГУфД

г» тлммя!

1ГГ

"В*-

До» «т 0150

v»

V«

пгкг тютонАТ

НОР ИКР

вг-вз> асж

Рис.5. Изменение показателей, характеризующих гемолитическое действие производных ПГМГ в условиях однократного внут-рижелудочного введения максимально переносимых доз. Условные обозначения: Г-БФ - глюкоза-6-фосфатдегидрогеназа;

СЖ - сывороточное железо;

ОР - осмотическая резистентность;

КР - кислотная резистентность.

Для ПГМГ глюконата и, в большей степени, для фогуцида эти изменения отмечены только на уровне 1/2, а для глюконата и 1/10 ОЬбо, а в динамике хронического эксперимента изменения показателя гемоглобина носят нестабильный эпизодический характер. В реальных же условиях применение ПГМГ-антисептиков факт установления гемолитического эффекта не представляет какой-либо угрозы макроорганизму, т.к. безопасные, но терапевтически эффективные дозы препаратов, используемых системно, находятся значительно ниже уровня, на котором могут наблюдаться признаки развития анемии.

Для подтверждения факта избирательной токсичности производных полигексаметиленгуанидина в отношении патогенной микрофлоры приведу обшую схему механизма действия ПГМГ- антисептиков на уровне макро- и микроорганизма (рис.6)

Проявленные патогенетические реакции, включающие нарушение биологических мембран, свидетельствовали о нарушении механизмов регуляции метаболических процессов на уровне макро- и микроорганизма. В результате - у теплокровных наблюдается нарушение обменных процессов, а для микрофлоры - блокада ферментов дыхательной системы, потеря патогенных свойств и гибель.

Значимость влияния и избирательная токсичность ПГМГ антисептиков в отношении микроорганизмов подтверждается и величиной фактора надежной безопасности (СЗРНЭЬбо/ЕОюо) > равной в среднем 3667 (во столько раз полигексаметиленгуанидины токсичнее для патогенной микрофлоры, чем для теплокровных животных и человека).

Результаты исследований подтвердили, что интенсивность токсического действия полигуанидинов есть функция от дозы и времени воздействия.

Для иллюстрации этого приведу некоторые, имеющие прогностическое значение, наиболее информативные и адекватные уравнения регрессии, связывающие токсические эффекты действия антисептиков с дозами и временем их накожного воздействия.

Прогностические зависимости "доза-время-зффект" при хроническом эпикутанном воздействии гуанидинсодержащих антисептиков

х1 - доза накожного воздействия в хроническом эксперименте -

1/10000; 1/1000; 1/100 Ш.50сиЬ ; х2 - время воздействия 1, 2, 3, 4 месяца).

и

11Ш к

Е

иПП4ПI

адсорбция на

поверхности

КЛСТКИ

Г

I

разрушение ФЦЭ связен

вэаимоаеиствие с фосфолипиданн

взаинодснствнс с фосфолнпидани

ж.

взаимодеиствие со структур н о р о д ств е н-ными белками

сЛПС

а

биологическая мембрана микроорганизма

дезорганизация окислительно-восстановительных реакций

угнетение процессов гликолиза

Снижение активности БН-зависнных ферментов

нарушение

стабильности

ЛПК

адсорбция на

поверхнастм

клетки

нарушение функции К,Ма-насоса

снижение активности АТФ-азы

взаимодеиствие с фосфолипиданн

1

биологическая мембрана макроорганизма__

дезорганизация акисяи-тедьно-восстано в ительных реакций

нарушение функции нервной системы

изменение мщва

периферической крови

ротеря патогенных свойств]

-111 X -

ГИБЕЛЬ

нарушение фикции почек

гемодннаннческне нарушения в печени

ИЗМЕНЕНИЕ СОСТОЯНИЯ ОБМЕННЫХ ПРОЦЕССОВ

Рис.6 Схека токсического действия полигексаметиленгуанидинов на макро- и микроорганизм

ПГМГ глюконат

1. Гемоглобин - 15.10+3.31/Х1Х2-0.004/Х1гХ22

№-0.37, ^-0.14, Р=9.5, б- 3.7)

2. Ретикулоциты - 2.20+0.ОО8Х1Х2-0.014Х13Х23/Юб-0.Об/хахг

№=0.92, ^-0.85, Г= 22, б= 8.8)

3. Лейкоциты - 3.84+0.165»^1Х2-0.01Х13Х23/10б

№«0.90, К2«0.81, Р-238, б- 8.0)

4. Эоэикофилы = 67.80+34.2/Х1Х2-1.5^1X2-0.1Х13Х23/Юб-

-О.ОЗ/Х1Х2

№=0.77, 1г2=0.55, Г- 56, б- 5.0)

5. Лимфоциты = 79.50- 0.1X1X2-6.2/Х12Х22+0.2Х13Х23/106

№=0.92, И2=0.84, Р=20б, б= 5.0)

6. Фагоцитарная = 21.58-0.28/^1X2+0.02Х13Х2Э/10б активность №-0.37, Р2«0.14, Г-9.4, 6=16.3)

ПГМГ хлорид (полисепт) IX

№=0.37, I?2 -0.73, Р-176, 6=9.1)

1. Эритропения - 5.43-0.015Х1Х2+0.11Х13Х23/10б

2. Цветной = 0.85+0.004X1X2-0.ОЗХ13Х23/Юб показатель №=0.87, 1?2-0.75, Г-180, 6=11.1)

3. Сегментно- = 12.00+2.13/Х1Х2+1.361^1X2-0.37Х13Х23/Ю6 ядерные №=0.90, 1^=0.82, Р=171, 6=11.6) нейтрофилы

4. Палочко- = -0.016+0.02/(^1X2-0.004Х13Х23/106 ядерные №=0.60, ^=0.49, Р= 56, 6=92.0) нейтрофилы

5. Фагоцитарная «= 20.40+4.27/Х1Х2-0.19Х13Х23/10б

активность №=0.55, 1?2-0.31, Р= 26, 6=20.0)

6. Массовый коэффициент (почки)

а

1.22-а.005Х12Х22+0.02Х13Х23/106

(1?=0.53, И2-0.30, Г-5.6, 6= 9.1)

7. Хлориды = 7.86-0.046X1X2-0.004Х12Х22+0.61Х13Х23/106

в моче (1?-0.54, Н2=0.30, Р-16.0, 6=68.0)

ПГМГ фосфат (фогуцид)

1. Лейкоциты = 3.10+2.960X1X2-0.03Х12Х22/Ю3+0.26(/^1Х2-2/Х12Х22

(1?=0.66, И2-0.43, Г= 22, 6-13.6)

2. Холестерин = 101.2+1.2X1X2-0.004Х13Х23/103-13.7/Х1Х2 связанный (]?-0.57, И2-0.32, Г- 18, 6-35.0)

3. Холестерин = 113.4+1.65Х12Х22-0.005Х13Х23/103 свободный (К-0.В4, И2-0.41, Р» 11, 6=31.0)

4. АКТИВНОСТЬ = 206.5-27.3/Х1Х2"0.001Х13Х23 пероксидазы (¡?-0.В1, 1?2=0.38, Г- 10, 6=13.4)

5. Фагоцитарная = 3.53-4.02/Х1Х2+ЗХ12Х22 активность (Р-0.53, 1^-0.28, Р- 23, 6-26.1)

6. СПП = 6.815-0.639/Х1Х2

(И-0.58, И2-0.34, Г» 15.1, 6=7.7)

Обращает на себя внимание и то, что выраженность признаков интоксикации определяется не только дозой и временем воздействия, но также и химической структурой антисептика.

Так, если при хроническом воздействии полисепта глубина и выраженность изменения диагностически значимых показателей может быть классифицирована как развитие истинно патологического процесса, то модификация молекулы полисепта (замена хлорид-иона на фосфат или глюконат) существенно "смягчает" токсичность.

В сравнении с полисептом детоксицированные конъюгаты фосфат и глюконат в 2.9-3.5 раза менее токсичны по действию на систему кроветворения, печень и нервную систему, не вызывают значимого изменения показателей фагоцитарной и бактерицидной активности крови.

Если изменения гематологических и биохимических показателей у полиоепта носят достаточно устойчивый характер и их отклонения на большинстве сроков наблюдения в дозе 1/100 БЬбо выходят за пределы физиологической нормы, то для конъюгатов фосфата и глга-коната порог резорбтивного действия установлен не потому, что при этом развиваются клинические манифестации интоксикации, а лишь по явлению привыкания, компенсации .с недостаточно ясным прогнозом меры напряжения и возможных сроков срыва адаптации при продолжительном воздействии.

Подобные закономерности найдены и при оценке кожно-раздра-жающего действия (рис.7). Несмотря на общий характер эффекта, выраженность эпидермальных реакций, глубина функциональных изменений (состояние липидного, водно-солевого обмена, активной реакции кожи) определялась природой аниона-заместителя. Замечу, что у фосфата и глюконата исчезают свойства кожного аллергена, характерные для хлорида.

Следует отметить также, что анализ динамики изменений ди-агностичности значимых показателей в хроническом эксперименте выявил отсутствие материальной и функциональной кумуляции фогу-цида и ПГМГ глюконата.

Таким образом, по экспериментально установленным параметрам токсикометрии (табл.3) лучшим антисептическим препаратом, включая микробиологические, технико-экономические и физико-химические свойства, является фогуцид.

Поскольку все производные ПГМГ структурно схожи и имеют гексаметиленовую, гуанидиновую группу, а выраженность токсического эффекта различна, необходимо установить: каким образом анион влияет на молекулу в целом и химическую активность полигуани-динов и возможность прогнозирования токсичности с целью создания детоксицированных конъюгатов.

Формула молекулы ПГМГ имеет следующий вид:

[- Ш - С - Ш - (СН2)б- ]п . где : 1? - НС1; ОН"; Н3РО4; - С7Н7Ш2;- СеНюОб

част от э проявления ' прниако« рмдраиакия кожх.%

20 00 4000 9000 вООЭ 13000 12000 14000 10000

Рис.7 Частота проявлений "Дерматита раздражения" и интенсивность реакции при 30-кратном апплицированИи гуанидинсодержащих антисептиков.

Условные обозначения: I- ПГМГ хлорид;

II- ПГМГ аминобензоат;

III-ПГМГ фосфат;

IV- ПГМГ ппоконат; мг/кг- суммарная доза антисептика.

Таблица 3

Сводные данные по параметрам токсичности и опасности солей § полигексаметиленгуанидина при кожном пути поступления в организм

(в сравнении с хлоргексидин биглюконатом)

Параметры токсикометрии

ПГМГ ПГМГ ПГМГ гид- Хлоргек-

Фосфат, глюконат рохлорид, сидин би-

фогуцид полисепт глюконат

13800.00 15500.00 8900.00 11700.00

1.00 1.01 1.20 1.20

1.92 1.89 3.30 1.90

1.20 1.19 1.20 1.20

8.00 4.10 9.80 4.40

2500.00 3170.00 1020.00 1803.00

1.50 1.50 1.50 10.30

1500.00 2500.00 1000.00 1000.00

80.00 500.00 50.00 20.80

500.00 н/о 250.00 400.00

10.00 15.00 8.00 9.00

1380.00 1053.00 1250.00 1300.00

5.50 6.30 10.00 11.17

150.00 167.00 125. СЮ 111.00

4.30 4.80 2.65 4.00

не обнар. не обнар. слабое не обнар.

не обнар. не обнар. не обнар. не обнар.

не обнар. не обнар. не обнар. не обнар.

не обнар. не обнар. не обнар. не обнар.

не обнар. не обнар. не обнар. н/д

не обнар. не обнар. не обнар. н/д

<1 <1 <1 н/д

5000.00 6250.00 1667.00 750.00

0.62 1.30 0.17 0.48

IV IV IV IV

малотокс. малотокс. малотокс. малотокс.

Среднесмертельная доза, мг/кг Коэффициент видовой чувствительности Коэ( х зициент возрастных различий в чувс-ти Коэффициент половых различий в чувс-ти Кожно-оральный коэффициент (DLpero,мг/кг)

Скорость трансэпидер.резорбции,мкг/см/час Порог острого действия, мг/кг Порог кожно-раздражающего действия, мг/кг Порог нейротоксического действия, мг/кг Порог хронического общего токсического

действия, мг/кг Зона биологического действия Зона острого действия Зона хронического действия Коэффициент кумуляции cut

Аллергенное действие (1/2-1/20 DL50) Гонадотропное действие (500 мг/кг) Влияние на астральный цикл (l/lODLsoc ) Эмбриотоксическое действие I/IODL50,LimCh Мутагенное действие (LimCh) Канцерогенное действие (l/10DLsoper os) Зона специфического действия Certain safety factor Предельно допустимый уровень (ПДУ),мг/дм^ Класс токсичности (опасности)

Примечание : * - параметры токсичности, неудовлетворяющие критерию пригодности

Влияние одной группы на другую зависит от полимерной конфигурации молекулы и одновременно полимерность соединения определяет реакционную способность внутри структуры.

Гексаметиленовая цепь имеет прочные г-связи между атомами углерода и активна за счет подвижности водородных атомов, что создает благоприятные условия для возникновения водородных связей и Ван-дер-Ваальсового взаимодействия внутри полимэра.

Гуанидиновая группа, выполняющая роль четвертичного аммония и несущая в целом положительный заряд, имеет запас свободной валентности за счет неподеленных пар электронов у каждого атома азота. Поэтому, отдельно взятая иминогруппа выполняет роль основания. Если их не нейтрализовать, то, попадая в клетку, они захватывают все положительно заряженные частицы, образуя устойчивые комплексы. Этим, по-видимому, и объясняется гемолитический эффект полигуанидинов. Свободная валентность у атома углерода в гуанидиновой группе придает ей еще более токсические свойства за счет образования трех я-связей. Введение аниона снижает химическую активность гуанидина.

Малые молекулы (СЬ-, ОН") оттягивают на себя энергетическую активность гуанидина, создавая в ней напряжение. Индуцированный электроноакцепторный эффект, высокая энергия связи между анионом и иминогруппой затрудняет атаку ферментов по этому участку молекулы. Токсическое действие приобретает пролонгированный характер, что подтверждается наличием кумулятивной способности у по-лигуанидин-хлорида.

Введение фосфата и глюконата изменяет геометрическое строение гуанидина. Отдавая заряд на нее, плотность равномерно распределяется по всем направлениям к иминогруппам, происходят внутримолекулярные взаимодействия, молекула приобретает спиральный вид, часть иминогрупп блокируется, токсичность снижается. Таким образом, складывается хорошо сбалансированная система:

- аакильная группа выполняет роль проводника;

- гуанидиновая - обеспечивает бактерицидность;

- анион контролирует токсический эффект гуанидина.

В целом, химическая и биологическая активность полигуанидинов определяется конформационной способностью молекулы, комплементарной рецепторам мембранных структур клетки. Комплементар-ность обеспечивается не только стерическим соответствием, но и вполне определенным пространственным распределением зарядов на функциональных группах молекулы полигуанидина, ее полярностью,

величиной энергии овязи, активной тс-электронной системой аниона, индексом свободной валентности гуанидина, общим объемом молекулы, величиной внутримолекулярного взаимодействия.

Вышеперечисленные квантовомеханические показатели легли в основу построения математических моделей, позволяющих прогнозировать параметры токсичности, определяющие класс опасности, возможность хронической интоксикации и гигиенические регламенты.

ПРОГНОСТИЧЕСКИЕ УРАВНЕНИЯ ЗАВИСИМОСТЬ " ХИМИЧЕСКАЯ СТРУКТУРА-БИОЛОГИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ"

Ш-50рег °3,Г/КГ = 2.17 + 0.038иал.ивд.+ 0.174иок.+ 0.116ЕП + + 0.023иПодн-" 0.446РГ - ОЛОЗБв" О.ООбЕдв (Я = 0.803, б = 14%);

0Ь50°и1;.Г/КГ - 12.96 + 0.5иор.+ 0.28ЕП + 0.11иЭЛ.инд.+ + 0.0711полн.- 1.357РГ - О.ЗБв - 0.02Едв (И = 0.784, б - 5.4%);

'сит

рег оз

1СШ1

сиЪ

■ 3.11 + 0.028иПолн.+ О.ИЗЕп + 0.18биор.+ О.ООЭЕдв " 0.1253е + О.ОЗШэл.инд. (Н = 0.757, б =.12.4%);

» 3.87 + 0.027иПОлн.+ 0.179иОр + 0.098ЕП +

+ 0.03биЭд.инд.- 0.505РГ- 0.007Едв (R = 0.784, б - 5.8%);

ПДУ,мг/дм2 - 0.23 + 0.164иор.+ О.ОЭЗЕп + О.ОЗгиэд.инд.-- 0.34РГ (I? = 0.873, б = 21.7%).

ПДУ(МГ/ДМ2) = 0.142БЬ50си^ + 0.1451Сишо^ (Р> = 0.923; б = 26.2%)

ПДУ(МГ/ДМ2) = 0.067ЕП + 0.13иор + 0.025и3л.инд. + 0.0850Ь50реГ 03 + О.ОЗОЬ50С^ " 0.57 (И - 0.910; б - 18.8%)

ВДУ(мг/дм2) • О.ОЭЗЕп + 0.163иор + 0.032иэл.инд. + 0.037БЬ5ос^ - 0.65 (И - 0.901; б - 18.37.)

В прогностической токсикологии принято руководствоваться определенными принципами (Крас-овский Г.Н., Саноцкий И.В.):

- Согласно принципу логичности, приоритетность отдается приемам прогнозирования, основанным на использовании показателей, которые находятся между собой в непосредственной логической патогенетической зависимости.

- Согласно принципу предпочтительности (при наличии обширной информации о веществе и возможности расчета параметров его хронического действия), рекомендуется использовать более надежные и значимые характеристики вещества (прежде всего показатели токсикометрии, затем квантовомеханические, далее физико-химические), в первую очередь использовать уравнения для отдельных классов соединений.

- Согласно принципу оптимизации, если результаты, расчитан-ные по трем различным уравнениям, близки между собой, следует использовать наименьшее из них, прогностические расчеты должны продолжаться до получения 2-3 совпадающих величин.

- Согласно принципу соответствия, ожидаемая точность прогнозируемой величины должна соответствовать ее целевому назначению. Прогнозирование безвредных для человека уровней веществ должно проводиться только с использованием точных и высоконадежных прогностических приемов.

Уравнения, представленные выше, отвечают всем перечисленным принципам.

Используя прогностические уравнения можно определить токсичность еще не существующих гуанидинсодержавдх веществ. В результате такой работы из сотен вариантов могут быть найдены структуры, представляющие исключительный интерес.

В то же время квантовомеханический подход имеет свои ограничения. Например, токсические свойства некоторых аэрозолей дезинтеграции в значительной мере обусловлены дисперсностью, размерами частиц, а не химической структурой. То же относится к веществам с различным строением кристаллических решеток, изомерам. Вообще химическая структура гораздо более разнообразна, чем ответные реакции организма, которые в процессе эволюционного развития приобрели стереотипный, стандартный или неспецифический характер. •

Не только молекулярная структура, но и физико-химические свойства вещества безусловно влияют на его биологическую активность . Но они "вторичны" (отклик, а не фактор), ибо зависят от химической структуры.

Верно, что изменение физико-химических свойств меняет скорость поступления вещества в организм, его накопление, распределение и элиминацию. Но верно и то, что "доступные" физико-химические константы слабо характеризуют химическую реакционноспо-собность вещества и, следовательно, его токсичность.

В работе установлено, что в группе даже одного класса соединений практически все корреляции физико-химических констант с токсичностью оказались либо слабыми и недостоверными, либо практически малоценными. Физико-химические константы целесообразнее и корректнее использовать при оценке опасности, т.е. не способности, а вероятности вредного действия в реальных условиях применения вещества.

Конечно, точное представление о мере токсичности и опаснос-ти^ещества может дать только токсикологический эксперимент. Однако, проведение токсикологических экспериментов одного препарата по полной программе с учетом возможных специфических, отдаленных последствий требует более 4-х лет. Это не отвечает современным императивным требованиям по ускорению токсикологической оценки, увеличения числа исследуемых веществ.

Важным результатом работы является доказательство того, что именно природа аниона определяет характер изменения линейности структуры ПГМГ, меру нейтрализации положительно заряженных ими-ногрупп гуанидина, а отсюда химическую активность и токсичность антисептика. Подбором соответствующих анионов можно создавать "детоксицированные конъюгаты", достигая, например, 15-кратного снижения токсичности без существенной утраты ими биоцидных свойств.

Полученные результаты свидетельствуют, что рассчитав кван-томеханические параметры молекул, с высокой степенью надежности можно получить научно обоснованные представления о химической активности (токсичности) антисептиков гуанидинового ряда. Надежность оценок обеспечивается не только статистическими критериями, но и тем, что прогноз производится в группе одного класса соединений, а также установленным соответствием теоретических представлений и экспериментальных данных.

Необходимость данной работы подтверждается уже сейчас, ког-

1

Ис слсдав яхт ял шучтт тиоанпя 'хшогиаш пцпау)» &млиэгкская игашмга"

РмраЗопа

кртриэ

качества

Радпгг кзакх»эо-*псхавкче<»«з

Построение иаггеиэтпкБгсюп иодаяай

| Предварительные исследований

МШФ»»>гжякш

МПК^гоегйеп, бяжхсрво^до» а.%

М «пер о врг»

Сцдаксткртслькая дя»

[Построение ирнпдсиснргр показателя

I

Рагчит др»гн«зируеп1сйт«исичдост. Выв 04» кероккмштг» аренду асг я.

| Р«ХГСИГИДЯЦКИ Н ЦЬЖНЯД? ПДЛШИВМу аигезу"]

-| Ксиаваикш иссшдооандо перспективного првгирзтз

| Мннробнддоги'хяо^

Л

|Санмтарночшиич*еки* I 1

1

Опрвд«п*ни* епеетра антмиикробного ИЙСТДИИ-

Р ятраб о-хха пмтодоя

ИВД1КЩВ18 9СДС, ха

о ж них мкраэжх, »средах

Атаксиям гнчссжис^-

)Прод»данио акспармлвшга"

1&щл1М ^дддадтдгд] краниишигд!

лг

Изучение отдаяогных пос&едсгыни дсиствн*

Останов пен ив иеавнммва

токсического д*йстамя

I

Изучение епе-ццдшчаского дсисгеия

т) Ргираоотха шхйсническнх ретлядектав, тералевтагсескай дозы нт_ж.|^

- "Г" --

ВНЕДРЕНИЕ В ПРАКТИКУ

Рнс.8 Схема научного подхода к доклинической оценке антисептических препаратов

да получены положительные результаты применения полигуанидинов (в модификациях) при очистке оборотных вод в нефтехимии, деревообработке, хирургии, урологии, офтальмологии, в сочетании о другими препаратами, имеющими различное фармакологическое действие и т.п.

Таким образом, проведенные^комплексные исследования легли в основу разработки научного подхода к выбору антисептических препаратов, отвечающих современным требованиям (рис.8).

Предложенный научный подход позволяет значительно снизить трудоемкость, время, стоимость работ по определению санитарных стандартов, увеличить число оцениваемых веществ, исключить экспериментальные исследования высокотоксичных соединений, вести целенаправленный поиск и синтез антисептических препаратов нового поколения и открывает широкие возможности их эффективного использования.

ВЫВОДЫ

1. В патогенезе интоксикации полигуанидин-антисептиками на уровне макроорганизма ведущую роль играет мембраноксическое действие, в основе которого лежит нарушение стабильности липоп-ротеиновых комплексов, повреждение функции Ыа+, К+ насоса за счет снижения активности АТФ-азы, как следствие изменения свободно-радикальных процессов перекисного окисления липидов.

2. На фоне мембранотоксического аффекта ПГМГ-антйсептиков отмечено гемолитическое действие, установленное на уровне максимально-переносимых и высоких поглощенных доз в условиях длительного воздействия, которое характеризовалось изменением показателей, лежащих в основе повышенного разрушения и недостаточной продукции эритроцитов (сывороточного железа, осмотической и кислотной резистентности эритроцитов, активности глюкозо-6-фосфат-дегидрогенаэы, цветного показателя, количественного состава красной крови), что может быть причиной развития железо-В12-фо-лиеводефицитной анемии.

3. Мембранотоксический эффект, сопровождавшийся разрушением сложноэфирных связей в липидах и липополисахаридных комплексах цитоплаэматической мембраны микроорганизма, приводит к ингибиро-ванию факторов агрессии - плазмокоагулазы, гиалуронидазы, окислению БН-групп гликолитических ферментов, детерминации всей микробной клетки и, в конечном итоге, к ее гибели.

4. Проведенные комплексные сравнительные исследования 73-х антисептиков позволили разработать критерии качества современных бактерицидных средств, включающие определенные показатели эффективности, токсичности, широту спектра антимикробного действия, физико-химические и эстетические свойства, экономичность и доступность сырья для их синтеза, технологичность производства и экологическую безопасность. ■

5. Разработка и использование количественного комплексного показателя качества - функции Харрингтона и шкал спецификации, позволили в краткосрочных экспериментах вести селективный отбор исследуемых веществ, получить ориентировочные оценки токсичности и опасности, перспективности производства и применения и на основе этого выделить наиболее эффективный класс полимерных поверхностно активных поликатионов - производных полигексаметилен-гуанидина (ПГМГ).

6. Интенсивность биологического действия зависит от природы анионов-заместителей, подбором которых можно регулировать кван-товомеханические свойства гуанидинсодержадих антисептиков, а отсюда их химическую активность и токсичность, что позволяет создавать детоксицированные коныогаты в структуре ПГМГ.

7. На основе комплексных исследований доказано, что наиболее перспективным из производных ПГМГ является фогуцид, обладающий высотой микробиологической активностью в отношении широкого спектра патогенной микрофлоры.

8. Фогуцид - малотоксичный препарат (4 класс) при кожном и умеренно токсичный (3 класс) при внутрижелудочном пути поступления в организм; не кумулируется, не имеет половых, видовых, возрастных различий в чувствительности; не является кожным аллергеном; не вызывает специфических эффектов действия (эмбрио- и го-надотоксического, мутагенного, канцерогенного, влияния на репродуктивную функцию).

9. Изучена зависимость "химическая активность - биологическое действие" (токсичность), на основе чего расчитаны и предложены математические модели, с помощью которых (с погрешностью, не превышающей ЗОЛ) можно прогнозировать параметры, определяющие класс токсичности, меру опасности при длительном воздействии и гигиенические регламенты для производных ПГМГ по квантовомехани-ческим характеристикам молекулярной структуры.

10. Разработан подход к выбору и оценке новых антисептических препаратов, который позволяет увеличить количество оценивзе-

мых веществ, исключить ненужные эксперименты с заведомо высокотоксичными соединениями, снизить трудоемкость, время, стоимость работ по определению санитарных стандартов и вести целенаправленный синтез антисептиков нового поколения.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Используя широкий спектр антимикробного действия (в том числе в отношении грамнегативных антибиотико-резистентных штаммов), противогрибкового эффекта, катионоактивность фогуцида, а также установленное пролонгированное антимикробное действие препарата предложена методика ионофоретического лечения пиодермигов (фолликулит, панариций, фурункул, карбункул, гидраденит), пиаци-анозов.

2. Для профилактики внугрибольничных инфекций, гнойно-септических послеоперационных осложнений фогуциц может быть использован для стерилизации воздуха с помощью комплексного применения аэрозоля конденсации, пылеподавления и аэронов.

3. Учитывая активность полигуанидин - антисептиков в отношении анаэробной инфекции и низкую токсичность, препараты этого класса соединений могут быть аффективно использованы в хирургической практике.

4. Установленный экспериментально факт ингибирования поли-гексаметиленгуайидинами ферментов, инактивирующих антибиотики, они могут быть использованы для усиления антимикробной активности последних.

5. Разработанный научный подход может быть успешно использован для доклинической оценки биологически активных препаратов с различным фармакологическим эффектом и рекомендован для использования при составлении руководств по фармакологии и токсикологии.

Внедрение результатов исследования в практику

Промышленные разработки:

- с мая 1993г. создано крупнотоннажное производство фогуцида с высокой степенью очистки на У соль е- Сибирском химфармкомби-нате,в АО "Фарма-130", г. Покров;

- разработаны и согласованы с Госстандартом РФ ТУ 64-0112-8-93 "Фогуцид. Испытания по качеству и эффективности";

- подучен гигиенический сертификат, выданный Госкомитетом Ганэпиднадзора на препарат фогуцид - флокулянт (N 1в-11/897 от 29.07.94) для очистки питьевой воды централизованного водоснаО-кения;

- на Ивано-Франковском заводе органического синтеза с 1992 'ода налажено полупромышленное производство адгезивно - активно-'о модификатора резин AMP (разрешение МЗ РФ, приказ N 68-2211 от .5.09.92г.);

- изделия "Антиспид" разрешены МЗ РФ (N 34-3474 от )В.07.93г.) и приняты к производству на Волжском заводе "Ла-•екс";

- производные ПГМГ разрешены Госкомитетом Санэпиднадзора приказ N 51-1556 от 08.12.92г.) для очистки сточных вод и борь-(Ы с биообрастанием системы трубопроводов и теплообменной алпа-•атуры. Потребность только известных нам предприятий составила: [осковский автомобильный-завод им. Лихачева - 14.5 тонн в год исх. N 61-15-31 от 17.01.94г.), Департамент воздушного трансорта - 100 тонн (иЬх. N 24/11-12 от 17.01.94г.), Ангарская неф-ехимическая компания - 12.5 тонн (исх. N 32/31-04 от 6.09.94г.);

- полигесаметиленгуанидины разрешены для создания на их ос-ове антимикробных тканей (приказ N 15-6/31 от 22Л2.90г.);

- в качестве дезосредства полисепт и фогуцид разрешены На-альником Главного Санэпидуправления МЗ СССР и ТО (приказ N 1-6/26 от 20.12.94г.);

- фогуцид разрешен Главным управлением ветеринарии Минсель-оза РФ (приказ N 22-157 от 26.12.91г.);

- по заказу Кооперации Фарминдустрии разработано ПДК рабо-эй зоны дибугирина и бутилтиоуксусного альдегида. Материалы по 5основанию ПДК представлены к рассмотрению в Комиссию по ут-эрждению гигиенических регламентов химических веществ в 1994г.;

- по результатам исследований и испытаний получено разреше-is Федерального управления МБ ЭП Минздрава РФ на антисептичес-т аппретирующий состав с дибутирином для создания обуви с бак-грицидными свойствами: КМЦ 197. - В. 67 мг/см2 сухого альмиата, мушка "ТЕРРА" - 0,67 мг/с'м2, дибутирина - 1.34 мг/см2.

Список основный работ, опубликованных по теме диссертации

1. Новые подходы к оценке химических веществ в условиях

операторской деятельности./В кн.: Физиология экстремальных состояний и индивидуальная защита человека.- М. ,1986.-с.26-41.

2. Тест-нагрузка для оценки качества эвристического мышления в условиях воздействия химических веществ./В кн.: Физиология экстремальных состояний и индивидуальная защита человека.-М.,1986.-с.120-134.

3. Сравнительная токсикологическая оценка перспективных антисептиков для создания эффективного белья, используемого в гер-мообъемах./В кн.: Актуальные проблемы обеспечения работоспособности человека в условиях гермообъемов.- М., вып.1,

1987.-С.89-97.

4. Токсиколого-гигиеничеокие исследования полимерных материалов и изделий из них, предназначенные для использования в средствах индивидуальной защиты. Методические указания.- М.,

1988.- 89 с.(в соавт.).

5. Методические особенности одориметрических исследований газовыделений полимерных материалов о антимикробными добавками. /В кн.: Актуальные проблемы обеспечения работоспособности человека в условиях гермообъемов.- М., вып.2, 1989.- с.73-81.

6. Токсикологическая оценка перспективного антисептического препарата димер-2-бутилтиоакролеина./В сб."Всесоюзной конференции по химическому синтезу соединений. Вып.АН СССР.- Черноголовка; 1989.- с.51-52.

7. Токсикологические и санитарно-химические исследования перспективных солей полигексаметиленгуанидина.//Гигиена и санитария. -N2, 1989.- с.14-16.

8. Экспериментальное обоснование предельно - допустимых нормативов газовыделений из полимерных материалоы с антимикробными добавками с учетом их ольфактивного действия.//Гигиена и санитария.- N1, 1991.- с.14-17.

9. Поиск и оценка новых эффективных бактерицидных препаратов с целью выбора наиболее перспективных для создания антимикробного белья.//В сб. II Объединенной сессии НИИ и ВУЗов медико-биологического профиля.- Иркутск, 1990.- 0.185-188.

10. Сравнительная токсикологическая оценка эффективных бактерицидных препаратов.//В сб. IX Всесоюзного симпозиума по целенаправленному изысканию лекарственных веществ.- Рига, 1991.-C.96.

11. Долигексаметиленгуанидикы - эффективные и безопасные антимикробные препараты.//В сб. Научные труды IX Всесоюзного сим-

лозиума по целенаправленному изысканию физиологически активных веществ.- Рига, 1991.- о.96-97.

12. Антисептики нового поколения и их использование в офтальмологии.- Киев, 1994.- 21с.(с соавт.).

13. Применение фогуцида для целей дезинфекции (Методические оказания).- М., 1994.-17с.

14. Квантовомеханические характеристики и токсичность гуани-(инсодержащих антисептиков.//Гигиена и санитария.- N 4, 1995.38-42.

15. Применение солей полигексаметиленгуанидина в качестве штисептиков при анаэробной и смешанной инфекции.//В сб. IV Рос-:ийско-Японский международный медицинский симпозиум.- Иркутск, 996.- с.57.(с соавт.)

16. Экспериментальные данные к обоснованию ЦЦК пироксикама в ;оздухе рабочей зоны.//Медицина труда и промышленная экология.-4, 1996.- с.26-29.(с соат.)

17. Дезинфицирующее средство./Патент Российской Федерации N 727243 от 01.07.94 (с соавт.).

18. Мягкие контактные линзы с антисептическими- свойства-и./Свидетельство о выдаче Патента Украины совместно с Российс-ой Федерацией N 1258293 от 12.10.90 (с соавт.).

19. Анасгезиругащее и гемостатическое средство. Способ его олучения./Патент Российской Федерации N 94-004910 (005276) от г.09.95 (с соавт.).

20. Дезинфицирующее средство для гермообъемов./Авторское видетельство N 2012864 от 10.08.89 (с соавт.).

21. Средство для защиты древесины./Свидетельство о выдачи атента Российской Федерации N 95116053 от 22.09.95 (с соавт.).

22. Гидрооксиэтиленбифосфонат полигексаметиленгуанидина, обедающий антисептическими свойствами. Способ его получения./Сви-?телъство о ввдаче Патента N 96112501 от 17.09.96 (с соавт.).