Автореферат и диссертация по медицине (14.00.52) на тему:Взаимосвязь возрастных изменений функций коры надпочечников и пинеальной железы и надежности антиоксидантной ферментной защиты у самок макак резусов

На правах рукописи

ШМАЛИЙ Алла Вячеславовна

ВЗАИМОСВЯЗЬ ВОЗРАСТНЫХ ИЗМЕНЕНИЙ ФУНКЦИЙ КОРЫ НАДПОЧЕЧНИКОВ И ПИНЕАЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ И НАДЕЖНОСТИ АНТИОКСИДАНТНОЙ ФЕРМЕНТНОЙ ЗАЩИТЫ У САМОК МАКАК РЕЗУСОВ

14.00.53 - геронтология и гериатрия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург - 2007

003173880

Работа выполнена в ГУ НИИ медицинской приматологии РАМН (г. Сочи)

Научный руководитель:

доктор биологических наук Гончарова Надежда Дмитриевна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Кветной Игорь Моисеевич

доктор медицинских наук, профессор Соллертинская Татьяна Николаевна

Ведущая организация:

ГУ «Научно-исследовательский психоневрологический институт им В. П. Бехтерева» ФАЗСР, г Санкт-Петербург

Защита состоится «_»_2007 года в «_» часов на

заседании Диссертационного совета Д 601.00101 при Санкт-Петербургском институте биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН (197110, Санкт-Петербург, пр Динамо, 3)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН

Автореферат разослан «_»_2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук, доцент

Козина Л. С.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы В настоящее время свободным радикалам кислорода или так называемым активным формам кислорода (АФК) и его активным продуктам, таким как гидроксильный радикал, пероксид водорода и пероксинитрит отводится важная роль в механизме старения Предложенная в 50-е годы XX столетия Д Харманом свободнорадикальная теория старения [Harman D, 1956] нашла подтверждение в работах многочисленных исследователей за рубежом и в нашей стране [Bolzan A D et al, 1997, Хавинсон В X с соавт, 1999, Анисимов В H, 2000, Анисимов В H с соавт, 2000, Арутюнян А В с соавт, 2000, Кольтовер В К, 2000, Хавинсон В X , Мыльников С В , 2000, Дубинина F Е , 2006, Анисимов В H , 2007, Kozina L S et al, 2007]

АФК участвуют в различных физиологических процессах [Green D R, Reed J С , 1998, Кулинский В И, 1999, Allen R G, Tresini M , 2000, Chandra J et al, 2000, Ткачук В А, 2002, Северин Е С , 2003, Дубинина Е Е , 2006] Однако в случае гиперпродукции АФК могут вызывать повреждение или разрушения клеток, вступая во взаимодействие с основными компонентами клеток и вызывая окислительную модификацию липидов, белков и нуклеиновых кислот Кроме того, инициируя окисление биомолекул, они способствуют образованию других свободнорадикальных соединений [Арутюнян А В с соавт, 2000, Кольтовер В К, 2000, Ткачук В А , 2002, Северин Е С , 2003, Дубинина Е Е, 2006, Kozina L S et al, 2007]

Для защиты клеток от повреждающего действия АФК в организме существует специальная система антиоксидантных ферментов (АОФ), таких как супероксидцисмутаза (СОД), глутатионпероксидаза (ГП), каталаза, глутатионредуктаза (ГР), глутагионтрансфераза (ГТ), которые контролируют концентрацию АФК, что чрезвычайно важно для осуществления клетками и тканями их физиологических функций

В связи с вышеизложенным, важное значение представляет решение вопроса о регуляции активности ферментов, контролирующих уровень АФК в клетках, прежде всего ферментов антиоксидантной защиты В литературе имеются сведения о том, что активность антиоксидантных ферментов регулируется эндокринной системой [Guemoun L et al, 1991, Antolin I et al, 1996, Bolzan AD et al, 1997, Ещенко H Д с соавт, 1998, Reiter R J et al, 2000, Mayo J С et al, 2002, Manda К, Bhatia A L, 2003, Туктанов H В , 2004, Никитченко Ю В с соавт 2005, Ещенко H Д с соавт, 2007] Однако практически отсутствует информация о роли гипоталамо-гипофизарно-адреналовой системы (ГГАС) в регуляции активности АОФ в физиологических условиях

В то же время, исследованиями, проведенными ранее в нашей лаборатории, было выявлено, что в процессе старения у человека и обезьян в плазме периферической крови

формируется выраженный стероидный дисбаланс, который играет важную роль в развитии возрастных инволютивных процессов и возрастной патологии [Анциферова H Д, 1997, Гончарова H Д, 1997а, 19976, Goncharova N D, Lapin В. А, 2000,2002, Goncharova N D et al, 2000, Гончарова H Д с соавт, 2002, Гончарова H Д, Лапин Б А., 2005] В частности, было отмечено резкое снижение при старении продукции дегидроэпиандростерона (ДГА) и дегидроэпиандростерон сульфата (ДГАС), что приводит к выраженному увеличению соотношения в крови молярных концентраций кортизола (F) и ДГА, ДГАС, т е F/ДГА+ДГАС — биомаркера старения организма и развития возрастной патологии

С другой стороны, известно, что у человека и обезьян кортизол и ДГА (ДГАС), являются ключевыми регуляторами клеточного апоптоза, митозов, воспаления и других важных физиологических процессов, в которых АФК предположительно также играют важную роль [Spencer N F. L et al, 1995, Schmidt M et al, 2000, Wang M J et al, 2001, Scheller К. et al, 2003, Schwartz A G, Pashko L L, 2004, Butcher S К. et al, 2005, Long F et al, 2005, Schmidt A J et al, 2005] Однако имеется мало информации о регуляции продукции или утилизации АФК m vivo с помощью кортикосгероидов Более того, большинство исследований в этой области были выполнены на клеточных культурах или при введении фармакологических доз гормонов лабораторным грызунам [Pereira В et al, 1995, Scheller К. et al, 2003, Long F. et al, 2005, Schmidt A. J at al, 2005] Между тем, приматы существенным образом отличаются от грызунов по их гормональной регуляции и, кроме того, уникальны в отношении секреции ДГАС [Homsby Р J, 1995, Анциферова Н. Д, 1997, Goncharova N D, Lapin В А., 1999, Гончарова H Д с соавт, 2002, Соллертинская Т H с соавт, 2003, Гончарова Н. Д, Лапин Б А., 2005, Соллертинская Т H с соавт, 2007] Таким образом, касаясь таких проблем, как гормональная регуляция и гормональная заместительная терапия, целесообразно в качестве модели использовать лабораторных приматов, нежели лабораторных грызунов

Важное значение представляет также изучение в эксперименте на лабораторных приматах регулирующего влияния пинеальной железы на активность АОФ. Это обусловлено тем, что такого рода исследования на приматах отсутствуют, а имеющиеся в литературе данные о стимулирующем влиянии мелатонина на активность ряда ферментов антиоксидантной защиты, были получены в эксперименте на мелких лабораторных животных В то же время проводить экстраполяцию данных, полученных в эксперименте на грызунах, на человека вряд ли правомерно Это обусловлено тем, что основное физиологическое значение мелатонина связано с регуляцией циркадных ритмов различных физиологических процессов, приведение их в соответствие с природным ритмом свет-темнота (день-ночь) [Чазов Е И, Исаченков В А, 1974, Гончарова H Д с соавт, 2002,

Хавинсон В X, Голубев А Г, 2002, Венгерин А А, 2005, Кветная Т В с соавт, 2005, ОопсЬагоуа N О й а1,2005, Анисимов В Н, 2007,1 ончарова Н Д с соавт, 2007, Когта Ь в е! а1, 2007] Известно, что грьиуны, в отличие от человека и приматов, ведут ночной образ жизни В этой связи представляется актуальным изучение роли мелатонина в регуляции активности АОФ на модели лабораторных приматов

Целью настоящей работы явилось изучение регулирующего влияния ГГАС и пинеальной железы на активность ферментов антиоксидантной защиты и особенностях этого регулирующего влияния при старении па модели лабораторных приматов - самок макак резусов (М ти1айа)

Основные задачи исследования

1 Исследовать влияние ГГАС на уровень активности антиоксидантных ферментов - СОД, ГР, ГЦ, ГТ в эритроцитах периферической крови у самок макак резусов разного возраста в базалышх условиях с учетом циркадного ритма активности ГГАС

2 Исследовать реакцию ГГАС и АОФ на острое психоэмоциональное стрессорное воздействие, произведенное в разное время суток у самок макак резусов разного возраста и изучить корреляции между динамикой уровня кортикостероидных гормонов в плазме крови и активности АОФ в ответ на стрессорное воздействие

3 Изучить активность АОФ (ГР, ГП, ГТ) в эритроцитах периферической крови у самок макак резусов разпого возраста в ответ на введение АКТГ и дексаметазона.

4 Исследовать корреляции между характером циркадных изменений уровня мелатонина и активностью АОФ (ГР, ГП, ГТ) в эритроцитах периферической крови у самок макак резусов разного возраста.

5 Изучить эффекты эпиталона на базальную активность АОФ в эритроцитах периферической крови у старых самок макак резусов

Основные положения, выносимые на защиту

1 Для молодых самок макак резусов характерно существование выраженного циркадного ритма уровней И и ДГАС в плазме периферической крови в базальных условиях, тесно коррелирующего с циркадным ритмом активности СОД При старении наблюдается существенное сглаживание циркадных ритмов, как для активности СОД, так и для кортикостероидов

2 В ответ на острое стрессорное воздействие происходит увеличение активности как ГГАС, так и активности АОФ (главным образом ГР) Степень их активации зависит от времени суток в послеполуденное и вечернее время стресс-реактивность ГТАС и ГР выше, чем в утренние часы При старении циркадный ритм стресс-реактивности ГГАС и активности АОФ сглаживается

3 Существуют выраженные возрастные различия в стресс-реактивности ГГАС и активности ГР в ответ на стрессорное воздействие нанесенное в послеполуденное время (15 00 ч) - у молодых животных величина подъема уровня Р и ДГАС, а также активности ГР существенно выше по сравнению со старыми животными

4 Введение эпиталона старым животным приводит к повышению концентрации мелатонина в крови в вечернее время и снижению интенсивности перекисного окисления липидов и увеличению активности глутатионзависимых антиоксидантных ферментов (ГП, ГР, ГТ)

5 Макаки резусы - перспективная модель для изучения проблем возрастных изменений функций ГГАС, пинеальной железы и надежности системы антиоксидантной защиты, а также для тестирования фармакологических препаратов, направленных на коррекцию возрастных нарушений эндокринных функций и системы антиоксидантной защиты

Научная новизна работы. Впервые выявлено существование выраженного суточного ритма активности СОД в эритроцитах периферической крови у молодых самок макак резусов, который тесно коррелирует с суточными изменениями концентрации кортикостероидов в плазме крови. При старении происходит сглаживание суточного ритма уровней Б и ДГАС в периферической крови и наблюдается тенденция к сглаживанию суточного ритма для СОД

Впервые установлено, что в ответ на острое стрессорное воздействие, резко возрастает активность эритроцитарной ГР При этом выявлена тесная корреляция между динамикой уровня кортикостероидов (р и ДГАС) в периферической крови и динамикой активности ГР Более того, установлено, что более выраженный ответ со стороны ГГАС и активности ГР, наблюдается при нанесении стрессорного воздействия в 15 00, чем в 9 00 При старении происходят нарушения в циркадном ритме стресс-реактивности ГГАС, что сопровождается сходными нарушениями в стресс-реактивности ГР

В ответ на введение АКТГ и дексаметазона происходят изменения в активности ГР, которые коррелируют с динамикой концентрации кортикостероидов в плазме крови

10-дневный курс эпиталона в дозе 10 мкг на животное в сутки старым животным приводит к стимулированию пинеальной секреции мелатонина в ночное время Увеличение уровня мелатонина в ночное время сопровождается увеличением активности глутатионзависимых антиоксидантных ферментов (ГР, ГП, ГТ) и понижением интенсивности процессов перекисного окисления липидов В связи с этим можно полагать, что эпиталон является перспективным препаратом для коррекции антиоксидантной защиты у старых субъектов

Теоретическое и практическое значение работы. Результаты исследования вносят существенный вклад в понимание основных закономерностей нарушений функции ГГАС, пинеальной железы и системы антиоксидантной защиты при старении и роли этих нарушений в формировании возрастных инволютивных процессов, а также развития возрастной патологии

Обосновано использование макак резусов в качестве адекватной биологической модели для изучения проблем физиологического старения человека и возрастной патологии

Большое теоретическое и практическое значение представляют данные о существовании циркадного ритма активности эритроцитарной СОД и об участии ГГАС в регуляции этого процесса

Как практический, так и теоретический интерес представляют полученные данные о подъеме активности эритроцитарной ГР в ответ на острое стрессорное воздействие, а также о существовании циркадного ритма в стресс-реактивности ГР, тесно коррелирующем с циркадным ритмом в стресс-реактивности ГГАС При старении циркадные ритмы стресс-реактивности ГР и ГГАС сглаживаются, но выявляются выраженные возрастные различия в стресс реактивности как ГР, так и ГТАС - ответ на стресс в 15 00 выше у молодых животных по сравнению со старыми животными Выявленное понижение активности ГР у старых животных в условиях стресса в послеполуденное и вечернее время может иметь важные патофизиологические последствия В частности, понижение активности ГР способствует понижению уровня восстановленной формы глутатиопа, нарушению редокс гомеостаза эритроцитов, надежности антиоксидантной защиты и процессов регенерации гемоглобина В результате возможно нарушение физико-химических свойств эритроцитов, приводящих к нарушению подвижности эритроцитов, гемолизу, нарушению доставки кислорода тканям, испытывающим повышенную потребность в кислороде в условиях острого психоэмоционального стресса.

Теоретический и практический интерес представляют полученные данные о восстанавливающем эффекте эпиталона на нарушающуюся с возрастом надежность ферментов антиоксидантной защиты и о существовании тесной корреляции этого эффекта эпиталона с его восстанавливающим эффектом на продукцию мелатонина у старых животных Теоретическое значение обусловлено важностью этих данных для понимания функциональных взаимосвязей, существующих между пинеальной железой и системой антиоксидантной защиты Практическое значение представляет перспективность клинического применения эпиталона для коррекции возрастных нарушений функции пинеальной железы и системы антиоксидантной ферментной защиты

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на научно-практической Конференции «Медицина будущего» (Краснодар-Сочи, 2002), конференции «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека» (Смоленск, 2003), Ш конференции молодых ученых России «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2003), IV Национальном конгрессе геронтологов и гериатров Украины (Киев, 2005), I съезде физиологов стран СНГ (Дагомыс, 2005), V всероссийском конгрессе эндокринологов «Высокие медицинские технологии в эндокринологии» (Москва, 2006), Всероссийской конференции «Перспективы фундаментальной геронтологии» (Санкт-Петербург, 2006), VII международном симпозиуме «Биологические механизмы старения» (Харьков, 2006), VIII Конгрессе международного общества по адаптивной медицине (Москва, 2006), всероссийской научной конференции «Перспективные направления использования лабораторных приматов в медико-биологических целях» (Сочи-Адлер, 2006), VI Европейском конгрессе международного общества геронтологии и гериатрии (Санкт-Петербург, 2007) По материалам диссертации опубликовано 17 научных работ

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 113 страницах, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов и 2-х глав собственных исследований Список цитированной литературы включает 59 отечественных и 71 зарубежных источников Работа иллюстрирована 10 рисунками и 18 таблицами

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Общая характеристика экспериментальных животных

Объектом исследования явились 46 клинически здоровых самок макак резусов (Macaca mulatto), массой тела 3,5 - 7,5 кг, содержащихся в питомнике ГУ НИИ медицинской приматологии РАМН (г Сочи-Адлер) В зависимости от возраста животные были разделены на две группы Первую группу составили 24 животных в возрасте 6-8 лет (молодые половозрелые животные), вторую - 22 животных в возрасте 19-26 лет (старые животные)

Все эксперименты проходили в летне-осеннее время (июнь-сентябрь) в период с 2003 г по 2005 г включительно В это время года, как правило, для самок макак резусов не характерно наличие овариально-менструальных циклов Животные обычно находились в вольерах или клетках с групповым содержанием, а на время эксперимента были отсажены в индивидуальные метаболические клетки в изолированную комнату с контролируемым освещением (свет с 6 до 18 часов) и температурой воздуха (от 20 до 25°С) Животные получали сбалансированное питание в виде брикетированного корма, изготавливаемого по технологии западногерманской фирмы Altromin (Германия), а также дополнительно хлеб,

яйца, свежие овощи, фрукты Вода была доступна в неограниченном количестве До проведения экспериментов животные проходили курс адаптации к условиям пребывания в метаболических клетках и процедуре взятия крови не менее 4-х недель

Описание экспериментов

1 Изучение активности ферментов глутатионзависимой антиоксидантной системы в эритроцитах периферической крови в базальныхусловиях с учетом циркадного ритма активности гипоталамо-гипофизарно-адреналовой системы Для изучения базального уровня активности глутатионзависимых антиоксидантных ферментов (ГП, ГР и ГТ) с учетом циркадного ритма активности гипоталамо-пшофизарно-адреналовой системы взятие образцов крови у самок макак резусов разного возраста проводили либо 2 раза в сутки (10 00 ч и 22 00 ч), либо 3 раза в сутки (10 00 ч, 16 00 ч и 22 00 ч) Всего в эксперименте было использовано 34 животных, в том числе 17 молодых и 17 старых животных В полученных образцах крови определяли уровень кортизола, ДГАС, СОД и активность глутатионзависимых антиоксидантных ферментов 2 Изучение возрастных особенностей динамики уровня кортикостероидных гормонов в плазме и активности глутатионзависимых антиоксидантных ферментов в эритроцитах периферической крови в условиях острого психоэмоционального стресса Для изучения возрастных особенностей динамики уровня кортикостероидных гормонов в плазме и активности глутатионзависимых антиоксидантных ферментов в эритроцитах периферической крови в условиях острого стресса всего было использовано 20 животных, из них 10 молодых и 10 старых животных Острый психоэмоциональный стресс моделировали путем 2-х часовой нежесткой иммобилизации животных в метаболических клетках Ограничение подвижности достигалось путем перемещения подвижной задней стенки клетки и прижатия животного к передней стенке метаболической клетки Тело и конечности животного не были жестко зафиксированы Стрессорному воздействию животных подвергали дважды с учетом времени суток либо в 9 00 ч, либо в 15 00 ч, при этом промежуток времени между двумя воздействиями составлял 2-3 недели Взятие образцов крови производили до (0) и через 30, 60, 120 и 240 минут после начала иммобилизации В полученных образцах крови определяли уровень кортизола, ДГАС и активность глутатионзависимых антиоксидантных ферментов

10 I

3 Изучение динамики уровня кортикостероидов в плазме периферической крови I и активности глутатионзависимых антиоксидантных ферментов в эритроцитах

при введении адренокортикотропного гормона Адренокортикотропный гормон (АКТГ) (1-39) (фирмы SIGMA, США) вводили 4 самкам макакам резусам (2 молодые и 2 старые) в дозе 5 ЕД/кг массы тела внутримышечно в 15 00 Взятие образцов крови проводили непосредственно перед введением препарата (0), а также через 15, 30, 60, 120 и 240 минут после введения АКТГ В полученных образцах крови определяли уровень кортизола и активность глутатионзависимых антиоксидантных ферментов

4 Изучение динамики уровня кортизола в плазме периферической крови и активности

глутатионзависимых антиоксидантных ферментов в эритроцитах при введении дексаметазона Для изучения влияния дексаметазона на уровень кортизола и активность глутатионзависимых антиоксидантных ферментов дексаметазон фосфат (фирмы KRKA, Словения) вводили в 9 00 ч внутримышечно из расчета 0,5 мг на 1 кг массы тела животного Всего в эксперименте участвовало 20 животных, из них 10 молодых и 10 старых животных Взятие образцов крови производили дважды до начала введения дексаметазона (0) и через 6 часов после введения препарата. В полученных образцах крови определяли активность глутатионзависимых антиоксидантных ферментов

5 Изучение суточной динамики уровня мелатонина в плазе крови и его корреляции с циркадным ритмом активности ферментов гпутатионзависимой антиоксидантной системы в эритроцитах периферической крови у самок макак резусов в различные возрастные триоды У 8 самок макак резусов (4 молодых и 4 старых) в базальных условиях проводили взятие крови 3 раза в сутки в 10 00, 16 00 и 22 00 В полученных образцах крови определяли уровень мелатонина и активность глутатионзависимых антиоксидантных ферментов (глутатионпероксидазы, глутатионредуктазы и глутатионтрансферазы)

6 Влияние эпиталона на активность антиоксидантных ферментов и уровень мелатонина в крови у старых самок макак резусов В эксперименте было использовано 7 старых самок макак резусов Всем животным вводили эпиталон в течение 10 дней в дозе 10 мкг на одно животное в сутки, внутримышечно Эпиталон - тетрапептид Ala-Glu-Asp-Gly, синтезированный на основе аминокислотного состава эпиталамина в Санкт-Петербургском институте биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН [ЬСузник Б И с соавт, 1998, Khavmson V Kh, 2002] Взятие образцов крови производили дважды в сутки в 10 00 и в 22 00 до начала введения препарата

и на 10-й день введения В полученных образцах крови определяли уровень мелатонина, интенсивность люминолзависимой перекисной хемилюминесценции и активность глутатионзависимых антиоксидангаых ферментов

Определение концентрации гормонов в плазме периферической крови, активности супероксиддисмутазы, люминолзависимой перекисной хемилюминесценции и глутатионзависимых антиоксидантных ферментов в гемолизате эритроцитов самок

макак резусов

Взятие образцов крови (2,5-3 мл) проводили из локтевой или бедренной вены с использованием гепарина или ЭДТА в качестве антикоагулянтов Кровь брали у обезьян натощак, на холоду, и, немедленно после взятия, центрифугировали при 3000 об/мин, +4°С в течение 15 мин Плазму отделяли от эритроцитарной массы и, после предварительной обработки эритроцитарной массы, оба компонента хранили при -70°С до проведения анализа

Содержание кортизола, ДГАС и мелатонина в плазме крови определяли иммуноферментными методами с использованием коммерческих наборов (кортизол — «Алкор-Био», Санкт-Петербург, ДГАС —«ОБЬ», США) Уровень мелатонина определяли не позже, чем через 1 месяц после взятия образцов крови иммуноферментяым методом, включающим предварительную очистку гормона на хроматографических колонках, с помощью набора реактивов «МеЫошп-ЕЫБА» (1ВЬ, ФРГ) Коэффициент вариации уровня гормонов в пределах одной реакции для каждого образца крови не превышал 10 %, разных реакций - не превышал 15 %

Для измерения активности АОФ и перекисной хемилюминесценции (ПХЛ) непосредственно перед измерением эритроцитарную массу подвергали гемолизу Активность СОД определяли полярографическим методом в эритроцитах [И^о А , ЯойЬо О , 1975] Интенсивность перекисной хемилюминесценции, отражающей образование супероксидного и гидроксильного радикалов, определяли в эритроцитарной массе с использованием хемилюминометра после добавления в реакционную смесь люминола. Для инициации свечения вводили перекись водорода, интенсивность свстосуммы выражали в условных единицах [Прокопенко В М с соавт., 1997, Арупонян А В с соавт, 2000] Активность ГП, ГР и ГТ определяли кинетическими спектрофотометрическими методами [Арутюнян А В с соавт, 2000] Уровень общего белка определяли в гемолизате эритроцитов по методу Лоури [Пустовалова Л М, 1999] Активность ГР выражали в нмоль НАДФН/мин/мг белка, ГП - в ммольОвН/мин/ мг белка, ГТ - в мкМ ОБДНБ/мин/мг белка.

Статистическую обработку результатов экспериментов проводили общепринятыми статистическими методами с использованием дисперсионного анализа (АЫОУА), метода Стьюдента, корреляционного и регрессионного анализа.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Суточные изменения активности аптиоксидантных ферментов н гнпоталамо-гипофизарно-адрсналовой системы

Анализ проведенных исследований указывает на существование ярко выраженных циркадных изменений в активности эритроцитарной СОД с максимумом в 10 00 ч и минимумом в 22 00 ч (тайл 1), которые согласуются с данными других авторов, изучавших циркадные ритмы СОД в крови здоровых женщин [Бш^й Я. й а1, 2003] и результатами, полученными при изучении циркадного ритма генной экспрессии СОД на крысах [МагОп V е1 а1,2003]

Таблица 1

Суточная динамика концентрации кортизола и дегидроэпиандростерон сульфата в плазме и супероксиддисмутазы в эритроцитах периферической крови самок макак резусов

разного возраста в различное время суток (М±т, п = 4 для каждой возрастной группы)

Время суток, час Концентрация гормонов Активность фермента

Г ДГАС СОД

нмоль/л % нмоль/л % ммоль/мг белка %

Молодые животные (6-8 лет)

10 00 ИЗО ±60 100 1350 ±200 100 10,0 ±0,15 100

16 00 760±150 67 ± 11 899 ±90 67 ±9 7,7 ± 0,8** 78,5 ±2,7

22 00 760 ± 89* 67 ± 14 810 ±38* 60 ±9 6,5 ± 0,6** 66,5 ± 5,0*

Старые животные (20-27 лет)

10 00 980 ±50 100 324 ± 50 "** 100 10,3 ± 0,2 100

16 00 805 ±150 82 ±10 308 ±30 "** 92 ±10 8,9 ±1,1 86,4 ± 13

22 00 758 ± 90 77 ± 12 310 ±90"** 94 ±22 7,8 ± 0,4** 76,0 ± 4

Примечание * - Р<0,05, ** - Р<0,01 - по отношению к соответствующим значениям в 10 00 ч, - Р<0,01 - возрастные различия

Циркадные изменения активности СОД тесно коррелируют с суточной динамикой уровней кортизола (г=0,92±0,11) и ДГАС (г=0,991±0,2) в плазме крови у молодых животных

При старении сглаживаются циркадные ритмы активности СОД, кортизола и ДГАС, но при этом сохраняется тесная корреляция между суточными изменениями СОД и кортизола (г=0,715±0,13) Можно предположить, что кортикостероиды играют важную роль в регуляции активности СОД у обезьян, и надежность этой регуляции снижается с возрастом

Достоверных циркадпых изменений в активности глутатионзависимых антиоксидантных ферментов выявлено не было (табл 2)

Таблица 2

Активность глутатионпероксидазы, глутатионредуктазы и глутатионтрансферазы в эритроцитах крови у самок макак резусов разного возраста в различное время суток _ (М±т, п = 4 для каждой возрастной группы)_

Время суток Активность ферментов

гп, ммольОвП/мим/ мгбелка ГР, нмоль НАДФН/мин/мг белка ГТ, мкМ ОЯДНБ/мин/мг белка

Молодые животные (6-8 лет)

10 00 0,51 ±0,04 0,40 ± 0,09 2,63 ± 0,70

16 00 0,62 ±0,13 0,40 ± 0,12 4,22 ± 0,51

22 00 0,54 ± 0,03 0,40 ± 0,06 3,79 ± 0,46

Старые животные (20-27 лет)

10 00 0,61 ±0,06 0,62 ±0,11 2,84 ± 0,52

16 00 0,66 ± 0,05 0,51 ±0,14 3,38 ±0,94

22 00 0,63 ± 0,05 0,59 ±0,06* 3,2 ± 0,28

Примечание * - Р<0,05 - по отношению к соответствующим значениям у молодых животных

Однако, как видно из таблицы 2, активность ГР у старых животных по сравнению с молодыми животными была достоверно выше (Р<0,05) в 22 00 ч и претерпевала тенденцию к повышению в ЮООчи 1600ч Повышение активности ГР у старых животных может отражать нарушение баланса между восстановленной и окисленной формами глутатиона в сторону увеличения концентрации окисленной формы глутатиона, обусловленное, возможно, активизацией свободнорадикальных процессов в эритроцитах при старении

Установленное нами отсутствие значимых циркадных изменений в активности ферментов ГАС находятся в противоречии с данными некоторых авторов [Coto-Montes А, et al, 2001, Hardeland R et al, 2005], утверждающих, что активность глутатионзависимых антиоксидантных ферментов претерпевает выраженные изменения в течение суток Минимальные значения ГР, ГП и ГТ этими авторами выявлялись в утренние часы, а максимальные - в вечернее время Это различие может быть связано с тем, что представленные данные были получены на мелких лабораторных животных, которые существенным образом отличаются от приматов по образу жизни (относятся к «ночным» животным), характеру функционирования ГГАС, ряду других эндокринных систем и, по-видимому, гормональной регуляции антиоксидантных процессов

Изучение циркадных и возрастных особенностей реакции гипоталамо-гипофизарно-адреналовой системы в глутатионзависимой аптиоксидантной системы на острое психоэмоциональное воздействие В результате проведенных исследований было обнаружено существование выраженного циркадианного ритма в реакции ГГАС у молодых самок макак резусов в ответ

на острое психоэмоциональное стрессорное воздействие - 2-х часовую мягкую иммобилизацию В ответ на стресс в послеполуденное время (15 00) увеличение концентрации Р и ДГАС в периферической крови было существенно выше по сравнению с увеличением концентрации кортикостероидов в утренние часы (9 00) (табл 3)

Таблищ 3

Динамика концентрации кортизола и дегидроэгогаадростерон сульфата в плазме периферической крови у молодых самок макак резусов в ответ на иммобилизацию, начатую в разное время суток 15 00 и 9 00

Время, мин Концентрация гормонов

Р ДГАС

нмоль/л | % нмоль/л | %

Начало иммобилизации — 15 00

0 715 ± 19 ''** 100 530 ± 90 100

30 1177 ±60*** 165 ±6 640 ±90 121 ±5

60 1420 ± 70 *** 199 ±10"** 850±160 161 ±3 "***

120 1960 ± 90 *** "** 274 ± 16 "*** 1140 ±240 215 ±9"**

240 1610± 180 ** "* 225 ±31 "** 680 ±130 129 ±8

Начало иммобилизации - 9 00

0 935 ±39 100 660 ±120 100

30 1380 ±99** 148 ±9 780± 160 118±9

60 1340 ± 100 * 144 ±8 800 ±130 121 ±4

120 1410 ±45 *** 150± 8 850± 110 129 ±12

240 1050 ±70 112 ± 4 734 ± 140 111 ± 12

Примечание * - Р<0,05, ** - Р<0,01, *** - Р<0,001 - по отношению к соответствующим

значениям до начала стрессорного воздействия,

"* - Р<0,05, "** - Р<0,01, "*** - Р<0,001 - циркадианные различия

Непосредственной причиной существования циркадианных ритмов в стресс-реактивности коры надпочечников, по-видимому, является более высокая стресс-реактивность АКТГ в 15 00 по сравнению с 9 00 [ОопсЬагоуа N Б , 2006, Гончарова Н Д с соавт 2006]

На острое стрессорное воздействие реагировала не только ГГАС, но и глутатионзависимая антиоксидантная система эритроцитов В работе впервые показано, что в ответ на острое психоэмоциональное стрессорное воздействие увеличивается активность ГР, и степень ее увеличения в значительной мере определяется тем, в какое время суток животные были подвергнуты стрессу Наиболее выраженное увеличение активности ГР у молодых животных отмечалось в ответ на стрессорное воздействие в 15 00 (табл 4)

15

Таблица 4

Дипамика активности глутатионпероксидазы, глутатионредуктазы и глутатионтрансферазы

в эритроцитах крови молодых самок макак резусов в ответ на иммобилизацию, начатую

в разное время суток 15 00 и 9 00 _ (М±т, п = 4 для каждой возрастной группы)_

Фермекг Время, мин

0 30 60 120 240

Начало иммобилизации — 15 00

ГП, MTGSH/mhh мг/ белка 0,74 ± 0,04 0,83 ± 0,04 0,81 ±0,03 0,73 ± 0,06 0,82 ±0,03

ГР, нмоль НАДФН/мин/ мг белка 0,30 ±0,07 0,50 ±0,09 0,80 ± 0,06** 0,84 ±0,10** 0,94 ± 0,20*

ГТ, мкМ GSflHB/MHH/Mr белка 4,24 ± 0,57 4,20 ±0,28 3,80 ±0,10 3,30 ±0,19 3,85 ±0,19

Начало иммобилизации - 9 00

ГП, mtGSH/mhh/mt белка 0,64 ± 0,12 0,50 ±0,18 0,55 ± 0,13 0,69 ±0,15 0,62 ±0,12

ГР, нмоль НАДФН/мин/ мг белка 0,56 ±0,05"* 0,59 ±0,05 0,70 ±0,08 0,70 ±0,18 0,69 ± 0,09

ГТ, мкМ G S ДНБ/мин/мг белка 4,70 ±0,50 3,90 ±0,20 4,91 ± 0,64 4,41 ±0,37 4,09 ±0,19

Примечание * — Р<0,05, ** — Р<0,01 — по отношению к соответствующим значениям до начала стрессорного воздействия,1)ф - Р<0,05 - циркадианные различия

В ответ на стрессорное воздействие в 15 00 повышение активности ГР, аналогично концентрациям F и ДГАС, было выше, нежели на стресс в 9 00 Высокая степень корреляции между динамикой концентрации кортикостероидов и активности ГР в ответ на стрессовое воздействие в 15 00 (г= 0,85 ± 0,09 для ГР и F, г= 0,91±0,06 для ГР и ДГАС) указывает на зависимость активности ГР от функции ГТАС

Соответствие между активностью ГР и концентрациями кортикостероидов отмечалось на протяжении всех исследуемых 4-х часов Причем на протяжении первых 2-х часов величина коэффициента корреляции приближалась к 1 (г=0,96±0,02 для ГР и F и г=0,95±0,02 для ГР и ДГАС в ответ на стрессорное воздействие в 15 00 ч) Если бы речь шла не об эритроцитарной ГР, а ГР других тканей, можно было бы думать о стимулирующем влиянии кортикостероидов на экспрессию гена ГР Однако, поскольку в зрелых эритроцитах нет ни ядра, ни митохондрий, и количественный набор ферментов заранее определен [Metzler D Е, 1977], то стимулирующий эффект кортикостероидов на активность ГР эритроцитов скорее всего обусловлен эффектом кортикостероидов повышать уровень глюкозы в крови и соответственно активность глюкозо-6-фосфатдегвдрогеназы, ключевого фермента пентозофосфатного цикла - основного источника NADPH в клетке Как известно, активность ГР абсолютно зависима от NADPH [Preville X et al, 1999, Baek S -H et al, 2000, Mäher P, 2005] В соответствии с этим предположением находится выявленная нами тесная корреляция между динамикой активности ГР и уровня глюкозы в крови в ответ на острое

стрессовое воздействие, с одной стороны, а также глюкозы и соотношения кортяизол/ДГАС, с другой стороны (рис. 1).

9п

ч о 8

7

1 Я ? 6

1 Е 5

Я II 4 8 51 3

2 » 5

Г

ъ-

Стресс, 15.00

— —

30 60 120 Время (мин)

Рис. 1. Динамика уровня глюкозы, отношения молярных концентраций кортизол/дегидроэпиандростерон сульфат в плазме и активности глутатионредуктазы в эритроцитах крови у молодых самок макак резусов в ответ на иммобилизацию, начатую к 15.00 (М±т, п = 4).

Примечание: * - Р<0,05, ** - Р<0,01 стрессового воздействия (0).

по отношению к соответствующим значениям до начала

При старении у обезьян наблюдалось сглаживание циркадианного ритма в стресс-реактивности ГР, что происходило параллельно с нивелированием циркадианных ритмов в стресс-реактивности Г, ДГАС (табл. 5, 6). Эти данные также свидетельствуют в пользу важной роли ГГАС в регуляции активности ГР в условиях стресса.

Таблица 5.

Динамика концентрации кортизола и дегидроэпиандростерон сульфата в плазме периферической крови старых самок макак резусов в ответ на иммобилизацию, начатую в разное время суток: 15.00 и 9.00

Концентрация гормонов

Время, мин Р ДГАС

нмоль/л 1 % нмоль/л 1 %

Начало иммобилизации - 15.00

0 740 ± 60 100 59 ±29 100

30 1060 ±29** 140 ± 10 93 ±35 158 ± 80

60 1340 ± 126 ** 180±7 95 ±35 161 ±80

120 1446 ±80*** 195 ±20 128 ±30 217 ±90

240 1160± 120 * 159 ±30 57 ± 20 '>" 97 ±20

Начало иммобилизации - 9.00

0 800 ± 77 100 133 ±50 100

30 1080± 80 * 135±8 ¡68 ±70 126 ±8

60 1155 ±60* 144 ±8 168 ±60 126 ±2

120 1530 ± 150 ** 190 ±7 187 ± 78 140 ± 19

240 1070 ±96 134 ± 10 290 ± 90 218 ±50

Примечание: * — Р<0,05, ** — Р<0,01, *** - Р<0,001 - по отношению к соответствующим значениям до начала стрсссориого воздействия; "* - Р<0,05 — циркадианные различия.

Таблица б

Динамика активности глутатионпероксидазы, глутатионредуктазы и глутатионтрансферазы в эритроцитах крови старых самок макак резусов в ответ на иммобилизацию, начатую в разное время суток: 15.00 и 9.00

Фермент Время, мин

0 30 60 120 240

Начало иммобилизации —15.00

ГО, miGSH/mhh мг белка 0,71 ± 0,07 0,66 ± 0,05 0,82 ± 0,06 0,75 ± 0,06 0,83 ± 0,06

ГР, нмольНАДФН/мин мг белка 0,52 ±0,10 0,61 ±0,10 0,66 ± 0,26 0,68 ± 0,08 0,60 ±0,10

ГТ, мкМ GSJJHB/mhh мг белка 3,12 ±0,37 3,22 ± 0,45 3,18 ± 0,65 3,46 ± 0,34 3,07 ± 0,49

Начало иммобилизации - 9.00

ГП, mtGSH/mhh мг белка 0,58 ±0,10 0,38 ±0,04 0,55 ±0,19 0,66 ±0,17 0,99 ±0,15

ГР, нмоль НАДФН/мин мг белка 0,55 ± 0,06 0,58 ± 0,05 0,64 ± 0,09 0,63 ±0,14 0,90 ±0,10*

ГТ, мкМ 08ДНВ/мип мг белка 3,43 ± 0,3 4,13 ±0,52 2,9 ± 0,33 2,58 ±0,15 4,49 ± 1,02

Примечание: * - Р<0,05 - по отношению к исходному уровню (0 мин).

В работе были выявлены также выраженные возрастные различия в стресс-реактивности кортикостероидов и ГР в 15.00. У старых животных реакция р, ДГАС и ГР была существенно ниже по сравнению с животными молодого возраста (рис. 2, 3, 4).

20-27 пет

МЮ

1600 1400 £ 1200 1 10Ю | 800 I 800

...... 2Ск27лв

Рис. 2. Динамика концентрации кортизола в плазме периферической крови самок макак резусов разного возраста в ответ на иммобилизацию, начатую в 15.00 (M±m, п = 4 для каждой возрастной группы).

Примечание: ** - Р<0,01 - возрастные различия.

1В00 1400 1200 'S 1000

1 soo

Рис. 3. Динамика концентрации дегидроэпиандростерона сульфата в плазме периферической крови самок макак резусов разного возраста в ответ на иммобилизацию, начатую в 9.00 (M±m, п = 4 для каждой возрастной группы).

Примечание: * - Р<0,05, ** - Р<0,01 - возрастные различия.

400

350

я" 300

6 250

ISO

ь 100

50

|—■— frß лет ¡---а--- 20-27 лет

Время (мин)

Время (мин)

Рис. 4. Динамика активности глутатионредуктазы в эритроцитах крови самок макак резусов разного возраста в ответ на иммобилизацию, начатую в разное время суток (М±т, % от исходного уровня).

Примечание: ** — Р<0,01 — возрастные различия.

Аналогичные возрастные различия были выявлены и для АКТГ [Goncharova N. D. et al. 2006; Goncharova N. D., 2006]. В утренние часы существенных возрастных различий в реакции на стресс, как для кортикостероидов, так и для ГР и других ферментов ГАС выявлено не было и даже не наблюдалась тенденция к более высокому подъему уровня кортизола и ГР. Однако следует отметить, что выраженные возрастные различия отмечались как для базальных уровней ДГАС, так и для значений ДГАС, регистрируемых в плазме крови в ответ на стрессорное воздействие, не зависимо от времени суток. Выраженное понижение уровня ДГАС неоднократно отмечалось нами и другими авторами, как у самок макак резусов, так и других видов обезьян, а также у человека [Goncharova N. D., Lapin В. А., 1999; Гончарова Н. Д. с соавт., 2002; Гончарова Н. Д. с соавт., 2003; Гончарова Н. Д., Лапин Б. А., 2005; Гончарова Н. Д., Смелкова С. А., 2007]. Снижение при старении продукции ДГАС

приводит к выраженному увеличению соотношения между молярными концентрациями F и ДГАС в крови, которое рассматривается как один из основных биомаркеров старения и важного фактора старения организма и развития возрастной патологии [Goncharova N D, 1997, Goncharova N D, Lapin В A, 2002] Не исключено, что резкое увеличение этого соотношения у старых обезьян может лежать в основе выявленных возрастных изменений в активности ГР В пользу этого предположения свидетельствуют литературные данные о понижении с возрастом уровня восстановленного глутатиона и соотношения GSH/GSSG в различных тканях грызунов, а также в плазме периферической крови у человека [Jones D Р et al, 2002, Manda К, Bhatia A L 2003, Rebnn I et al, 2003, Wang H et al, 2003], a также активности G6PD [Beckman К В , Ames В N, 1998]

Возрастные нарушения в стресс-реактивности ГР могут иметь важные патофизиологические последствия как для функционирования эритроцитов, так и всего организма в целом В частности, мепее выраженный подъем активности ГР у старых животных в условиях острого стрессового воздействия может привести к нарушению процессов генерации восстановленного глутатиона, нарушению соотношения восстановленной и окисленной форм глутатиона и редокс гомеостаза эритроцитов в целом Эти изменения неизбежно приводят к понижению надежности системы антиоксидантной защиты, увеличению уровня АФК в эритроцитах и активизации процессов перекисного окисления липидов Активация перекисного окисления липидов может сопровождаться гемолизом эритроцитов и, естественно, снижением надежности процессов транспорта кислорода к тканям, испытывающим повышенные потребности в кислороде в условиях психологического стресса.

В ответ на введение АКТГ происходило увеличение выработки кортизола, также как и при остром стрессорпом воздействии И, также как и при остром стрессе, прослеживалась тенденция к увеличению активности эритроцитарной глутатионредуктазы (табл 7)

Таблица 7

Динамика уровня кортизола в плазме периферической крови и активность глутатионредуктазы и глутатионпероксидазы в эритроцитах самок макак резусов разного возраста в ответ на введение адренокортикотропного гормона в 15 00

Время (мин)

ДО 15 30 60 120 240

Кортизол, нмоль/л 550 ±90 655 ±105 750 ±76 855 ± 86 905 ± 109 578 ±40

ГР, имояьНАДФН/мин/мг белка 0,78 ± 0,08 0,87 ±0,12 0,9 ± 0,08 3,83 ± 0,06 0,74 ± 0,08 0,73 ± 0,07

ГП, mtGSH/мин/мг белка 0,24 ±0,04 0,22±0,01 0,27± 0,06 0,27+0,04 0,34 ±0,1 0,35± 0,05

Как известно, АКТГ гипофиза стимулирует выработку кортизола пучковой зоной коры надпочечников Его введение вызывает увеличение уровня кортизола в периферической крови, сходное с изменениями концентрации Б при остром иммобилизационном стрессе Увеличение концентрации кортизола в крови, в свою очередь, по видимому, приводило к увеличению активности эритроцитарной глутатионредуктазы Следует отметить, что максимальное повышение уровня Г достигало всего лишь 64 % (через 120 мин после введения АКТГ), а увеличение активности ГР проявляло лишь тенденцию к увеличению Эти данные согласуются с результатами экспериментов по моделированию острого психоэмоционального стресса. Иными словами, подъем уровня К в результате введения АКТГ недостаточно высок для выраженного подъема активности эритроцитарной ГР

При введении дексаметазона наблюдалась тенденция к увеличению активности эритроцитарной глутатионредуктазы у молодых самок макак резусов через 6 часов после введения препарата (табл 8)

Таблица 8

Динамика уровня глутатионредуктазы, глутатионпероксидазы и глутатионтрансферазы

в эритроцитах самок макак резусов в ответ на введение дексаметазона фосфата _ (М±т, п = 12 для молодых животных, п= 14 для старых животных)_

Возраст ГР, нмоль НАДФН/мин/мг белка ГП, мтСвН/мин/мт белка ГТ, мкМ ОвДНЕ/мин/мг белка

до 6ч до 6ч ДО 6ч

6-8 лет 0,64 ± 0,06 0,81 ±0,06* 0,51 ±0,05 0,54 ± 0,05 3,39 ±0,37 3,66 ±0,31

21-26 лет 0,77 ± 0,07 0,69 ± 0,07 0,54 ± 0,05 0,48 ± 0,04 3,7 ± 0,4 3,28 ± 0,22

Примечание * - Р<0,05 - по отношению к значениям до введения дексаметазона

В то же время у старых самок макак резусов не наблюдалось существенных изменений в активпости глутатионредуктазы Введение дексаметазона какого-либо эффекта на активность других антиоксидантных ферментов (глутатионпероксидазы и глутатионтрансферазы) не оказывало

Повышение активности ГР у молодых животных через 6 часов указывает на возможность стимулирующего влияния высоких концентраций дексаметазона, обладающего сходной с кортизолом глюкокортикоидным эффектом на активность ГР Известно, что максимальные концентрации дексаметазона в крови после внутримышечного введения отмечается через 6 - 8 ч [Михайлов И Б , 2001] Отсутствие повышения активности ГР через 6 ч у старых животных можно объяснить нарушением всасывания в кровь дексаметазона вследствие нарушения тургора кожи и кровоснабжения мышц Результаты эксперимента с введением АКТГ также указывают на возможное участие кортикостероидов в регуляции активности ГР эритроцитов

Возрастные изменения активности пинеальной железы и глутатионзавнсимая антиоксндантная система

Концентрация мелатонияа подвергалась выраженному суточному ритму. При этом концентрация мелатонина у животных обеих возрастных групп в 22.00 ч. была максимальной и статистически достоверно выше, чем в 10.00 ч (Р<0,001). Минимальное содержание мелатонина регистрировалось у обезьян, независимо от возраста в 16.00. Гак в 22.00 ч уровень мелатонина у молодых обезьян составлял 87,6 ± 6,9 пг/мл, а у старых животных -56,8 ± 4,6 пг/мл (рис. 5). Однако, следует отметить, что у старых обезьян уровень мелатонина в крови в 22.00 ч был достоверно ниже (Р<0,001) по сравнению с концентрацией мелатонина у молодых животных (рис. 5). Таким образом, циркадный ритм мелатонина у старых обезьян становится менее выраженным.

—-6-8 лет ....... 20-27 лет

100 90 80

I ™

с 60 х

| 50 -£

Is 40 -I 30 20 10

10.00 16.00 22.00 Время суток (часы)

Рис. 5. Концентрация мелатонина в плазме периферической крови в различное время суток

у самок макак резус разного возраста (М±т, пг/мл) (п=4 для каждой возрастной группы).

Примечание: *** - Р<0,001 - по отношению к соответствующим значениям у молодых обезьян;

'»*** . р<0,001 по отношению к 10.00.

Выявленная суточная динамика концентрации мелатонина в плазме периферической крови у обезьян согласуется с ранее полученными в нашей лаборатории данными для макак резусов [Гончарова Н. Д. с соавт., 2001; 2002; Goncharova N. D. et al., 2005; Венгерин А. А., 2005; Гончарова Н. Д. с соавт., 2007; Гончарова Н. Д., Смелкова С. А., 2007], а также результатами исследований других авторов, изучавших циркадные ритмы мелатонина у старых крыс [Хавинсон В. X. с соавт., 2003; Reiter R. J., 2002; Kozina L. S. et al., 2007] и сравнима с аналогичными показателями у людей [Touitou Y., Haus Е., 2000; Ferrari Е. at al., 1996, 2001; Reiter R. J. et al., 2002; Коркушко В. Б. с соавт., 2006].

Выраженное сходство макак резусов и человека отмечалось и в направленности изменений концентрации мелатонина в периферической крови при старении. Выявленное понижение уровней мелатонина у старых животных хорошо согласуется с данными

многочисленных исследований по старению человека [Touitou Y., Haus Е., 2000; Ferrari Е. at al., 1996, 2001; Reiter R. J. et al., 2002; Кветная Т. В. с соавт., 2005; Коркушко В. Б. с соавт., 2006].

Анализ возрастных изменений интенсивности перекисного окисления липидов позволяет выявить увеличение ПХЛ у ряда старых животных, по сравнению с молодыми животными (рис. 6).

6-8 лет 20-27 лет

Возраст живстных

Рис. 6. Интенсивность перекисной хемилюминесценции в эритроцитах периферической крови у самок макак резус разного возраста в 10.00 (М±т, пг/мл) (п=7 для каждой возрастной группы).

Примечание: ** - Р<0,01 - по отношению к соответствующим значениям у молодых животных.

Это указывает на возможность повышения интенсивности свободнорадикапьных процессов у старых животных. Возможно, активизация свободнорадикапьных процессов может быть вызвана понижением продукции мелатонина у старых животных. Мелатонин, как известно, оказывает выраженное антиоксидантное действие.

Для того, чтобы проверить это предположение был проведен эксперимент с введением эпиталона старым животным и была проведена оценка влияния этого препарата на интенсивность ПХЛ и уровень мелатонина в периферической крови. Ранее было показано стимулирующее влияние эпиталона на продукцию мелатонина у старых обезьяп [Гончарова Н. Д. с соавт., 2001; 2002; Goncharova N. D. et al., 2005; Венгерин А. А., 2005; Гончарова Н. Д. с соавт., 2007]. Введение эпиталона в течение 10 дней приводило не только к восстановлению продукции мелатонипа в крови у старых животных в 22.00 (Р<0,05) (рис. 7), но и понижению интенсивности ПХЛ (табл. 8), и увеличению активности глутатионзависимых антиоксидантных ферментов - статистически достоверному увеличению активности ГП (Р<0,01) и тенденции к увеличению ГР и ГТ (табл. 8).

1000 2200 Время суток (Ч1СЫ)

Рис 7 Влияние эпиталона на концентрацию мелатонина в плазме периферической крови старых самок макак резусов (М±т, п=7)

Примечание * - Р<0,05 по отношению к значениям до введения эпиталона

Таблица 8

Влияние эпиталона (10 мкг/сутки/животное, в/м, в течение 10 дней) на характер изменения активности глутатионпероксидазы, глутатионредуктазы, глутатионтрансферазы и перекисной хемилюминесценции в эритроцитах периферической крови старых самок

макак резусов в 10 00

__(М±т)(п=7)__

гп, MrGSH/иин мг белка ГР, нмоль НАДФН/мин мг белка ГТ, мкМ GSÄHB/mhh мг белка ПХЛ х 103УЕ/мг белка

До введения эпиталона

0,69 ± 0,04 0,41 ±0,13 2,0 ±0,21 28,6 ±4,1

На 10-й день введения эпиталона

0,9 ±0,01*» 0,69 ±0,13 2,4 ±0,26 15,6 ±1,8*

Примечание * - Р<0,05, ** - Р<0,01 по отношению к значениям до введения эпиталона

Выявленное повышение уровня мелатонина и активности антиоксидантных ферментов согласуется со статистически достоверно значимым (Р<0,05) снижением интенсивности перекисной хемилюминесценции, отмечавшееся на 10-й день введения эпиталона (табл 8) Полученные результаты можно объяснить стимулирующим влиянием эпиталона на пинеальную секрецию мелатонина и антиоксидантным эффектом последнего В свою очередь антиоксидантный эффект мелатонина может быть обусловлен его стимулирующим влиянием на активность антиоксидантных ферментов

Таким образом, проведенные исследования указывают на антиоксидантный эффект эпиталона, обусловленный его стимулирующим влиянием на секрецию мелатонина и увеличением активности глутатионзависимых антиоксидантных ферментов Выявлена способность эпиталона снижать интенсивность ПХЛ и тем самым тормозить интенсивность процессов свободнорадикального окисления, позволяет рассматривать его в качестве перспективного препарата для коррекции возрастных нарушений интенсивности свободнорадикальных процессов

ВЫВОДЫ

1 У молодых самок макак резусов существует выраженный циркадный ритм активности эритроцитарной СОД с максимальной активностью в 10 00 ч и минимальной в 22 00 ч, который тесно коррелирует с уровнями кортизола и ДГАС в плазме периферической крови При старении происходит сглаживание циркадных ритмов активности СОД в эритроцитах и уровня кортизола и ДГАС в плазме периферической крови

2 Активность эритроцитарной ГР закономерно увеличивается в ответ на острое стрессорное воздействие Степень увеличения активности ГР у молодых животных зависит от времени суток и определяется стресс-реактивностью ГГАС При старении происходит сглаживание циркадных ритмов реакции ГР на острое стрессорное воздействие при одновременном сглаживании стресс-реактивности ГГАС

3 Активность эритроцитарной глутатионредуктазы увеличивается в ответ на введение АКТГ и дексаметазона

4 Курс эпиталона (10 дней в дозе 10 мкг/жявотное/сутки) старым животным приводит к увеличению уровня мелатонина в плазме периферической крови в ночное время, повышению активности глутатионзависимых антиоксидантных ферментов и нормализации интенсивность перекисного окисления лшшдов

5 Макаки резусы - перспективная модель для изучения проблем взаимосвязи возрастных изменений эндокринных функций и надежности антиоксидантной защиты, а также для тестирования фармакологических препаратов, направленных на коррекцию возрастных нарушений как эндокринных функций, так и системы антиоксидантной защиты

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1 Полученные данные дают основание полагать, что нормализация гормонального статуса у лиц с преждевременным или ускоренным старением может привести к восстановлению надежности антиоксидантной защиты организма. Этот подход рекомендуется использовать при разработке клинических схем, направленных на профилактику процессов преждевременного старения

2 Эпитапон рекомендуется использовать в гериатрической практике для коррекции возрастных нарушений антиоксидантной ферментной защиты

3 Полученные результаты могут быть использованы при чтении курса лекций по геронтологии, эндокринологии, нормальной и патологической физиологии

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Антиоксидантные ферменты и индуцированная перекисная хемшпоминисценция в эритроцитах крови у лабораторных приматов в различные возрастные периоды влияние гормонов коры надпочечников /НД Гончарова, А В Шмалий, Т Н Богатыренко, В Н Варфоломеев, В К Кольтовер, А В Арутюнян, В М Прокопенко!/ Альманах «Геронтология и гериатрия» -2006 -Вып 5 - С 97-101

2 Возрастные особенности циркадных ритмов активности пшоталамо-гапофизарно-адреналовой системы и глутатионзависимой антиоксидантной системы у лабораторных приматов /Н Д Гончарова, Т Э Оганян, А В Шмалий, Б А Лапин// Научные труды I съезда физиологов СНГ - Сочи, Дагомыс, 2005 -Т 1 -С 173

3 Гипоталамо-гипофизарно-адреналовая система (ГГАС) циркадные ритмы, стресс, старение / Н Д Гончарова, С А Смелкова, А В Шмалий, Т Э Оганян // Высокие медицинские технологии в эндокринологии Матер V Всеросс контр эндокринологов — Москва, 2006 - С 9

4 Гончарова Н Д Возрастные особенности циркадного ритма активности гипотапамо-гипофизарно-адреналовой системы и глутатионзависимой антиоксидантной системы у лабораторных приматов /Я Д Гончарова, Т Э Оганян, А А Венгерин, А В Шмалий II //Тез докл IV Национального конгресса геронтологов и гериатров Украины - Киев, 2005 -С 17-18

5 Гончарова Н Д Гипоталамо-гипофизарно-адреналовая система и антиоксидантные ферменты циркадные ритмы, стресс и старение /Я Д Гончарова, А В Шмалий// Перспективные направления использования лабораторных приматов в медико-биологических целях Матер Всеросс научной конф - Сочи—Адлер, 2006 - С 258 -263

6 Гончарова Н Д Изучение взаимосвязи возрастных изменений эндокринных функций и свободнорадикальных процессов на модели обезьян /Я Д Гончарова, А В Шмалий, В М Прокопенко // Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины матер Ш-ей конференции молодых ученых России - Москва, 2003 - С 28

7 Пептидная коррекция возрастных нарушений функции эпифиза у обезьян / Н Д Гончарова, А А Венгерин, А В Шмалий, В.Х Хавинсон // Успехи геронтологии — 2003 -Т 12 -С 121-128

8 Стресс, биологические ритмы, старение нейроэондокринные аспекты /Я Д Гончарова, С А Смелкова, В Ю Маренин, А В Шмалий, Б А Лапин// Перспективы фундаментальной геронтологии Всерос конф - Санкт-Петербург, 2006 - С 35-36

9 Шмалий А В Глутатионзависимая антиоксидантная система у самок макак резусов при стрессе и введении дексаметазона /А В Шмалий, Н Д Гончарова// Научн труды I съезда физиологов СНГ - Сочи, Дагомыс, 2005 -Т 1 - С 217

10 Шмалий А В Влияние стресса и введение дексаметазона на активность глутатионзависимой антиоксидантной системы у самок макак резусов/ А В Шмалий, Н Д Гончарова// Биологические механизмы старения тез докл VII международного симпозиума - Харьков, 2006 - С 39-40

11 Шмалий А В Влияние эпиталона на возрастные изменения эндокринной функции пинеальной железы и активность ферментов антиоксидантной защиты у самок макак резусов/ А В Шмалий, Н Д Гончарова, Л С Козина// Перспективные направления использования лабораторных приматов в медико-биологических целях Матер Всеросс научн конф - Сочи-Адлер, 2006 - С 293 -298

12 Шмалий А В Влияние эпиталона на уровень мелаюнина в плазме периферической крови и активность антиоксидантных ферментов и перекисной хемилюминесценции в эритроцитах старых самок макак резусов// А В Шмалий, Н Д Гончарова, В М Прокопенко/1 Фундаментальные и прикладные проблемы медицины и биологии в опытах на обезьянах Матер Междунар научной конф - Сочи-Адлер, 2007 - С 297 -302

13 Характер эндокринных дисфункций при старении /Н Д Гончарова, Т Э Оганян, А А Венгерин, А В Шмалий И Медицина будущего Сб матер в научно-практической конф -Краснодар-Сочи, 2002 - С 88

14 Age-related changes of some endocrine functions and free- radical processes ш monkeys / N D Goncharova, A V Shmalij, В A Lapin, V M Procopenko // Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека матер конференции - Смоленск, 2003 -С 85-86

15 Correlation between activity of antioxidant enzymes and circadian rhythms of corticosteroids in Macaca mulatta monkeys of different age IN D Goncharova, A V Shmaliy, T N Bogatyrenko, V К Koltover//Experimental Gerontology -2006 - Vol 41 -P 778-783

16 Impact of aging on the hypothalamic-pituitary-adrenal axis and antioxidant enzymes responsiveness to stressors IN D Goncharova, A V Shmaliy, S A Smelkova, В A Lapin I! International society for adaptive medicine (ISAM) VIII world congress - Moscow, 2006 - P 64-65

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АОФ - антиоксидантные ферменты

АКТГ - адренокортикотропный гормон

АФК - активные формы кислорода

ГАС - глутатионзависимая антиоксидантная система

ГО - глутатионпероксидаза

ГР - глутатионредуктаза

ГТ - глутатионтрансфераза

ГГАС - гиноталамо-гипофизарио-адреналовая система

ДГА - дегидроэпиандростерон

ДГАС - дегидроэпиандростерон сульфат

ПХЛ - перекисная хемилюминесденция

СОД - супероксиддисмутаза

К - кортизол

Шмалий А В Взаимосвязь возрастных изменений функций коры надпочечников и пинеальной железы и надежности антиоксидантной ферментной защиты у самок макак

резусов//Автореф дис канд мед наук 14.00 53-СПб,2007 -26с_

Подписано в печать 28 09 2007 Формат 60*84 1/16 Бумага офсетная Печать офсетная Печ л 1,0

_Тираж 100 экз Заказ /¿^_

Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии Издательства СПбГЭТУ «ЛЭТИ» Издательство СПбГЭТУ «ЛЭТИ» 197376, С -Петербург, ул Проф Попова, 5

Актуальность проблемы. В настоящее время свободным радикалам кислорода отводится важная роль в механизме старения. Предложенная в 50-е годы XX столетия Д. Харманом свободнорадикальная теория старения [Harman D., 1956] нашла подтверждение в работах многочисленных исследователей за рубежом и в нашей стране [Гусев В. А., Панченко J1. Ф., 1997; Papa S., Skulachev V. P., 1997; Кольтовер В. К., 2000; Cadenas Е., Davies К. J. А., 2000; Хавинсон В. X., с соавт., 2003; Анисимов В. Н., 2003; McCord J. М., Edeas М. А., 2005; Дубинина Е. Е., 2006; McCann S. М., et al., 2006].

Свободные радикалы кислорода (супероксидный радикал 02"~ и его производные: гидроксильный радикал, пероксид водорода и пероксинитрит, или активные формы кислорода (АФК) - образуются преимущественно в митохондриях как побочный продукт окислительного фосфорилирования [Sohal R. S., Weindruch R. 1996; Harman D., 1998; Cadenas E., Davies K. J. A., 2000; Johnson R. M. et al., 2005; Дубинина E. E., 2006]. АФК образуются из кислорода в реакциях, катализируемых НАДФН-зависимыми оксидазами [GeisztM., 2006].

АФК участвуют в различных физиологических процессах, в частности АФК используются нейтрофнлами и макрофагами для уничтожения микробных клеток, разрушения старых или иммунологически несовместимых клеток, а также способствуют уничтожению злокачественных клеток и клеток, поврежденных вирусами. Остеокласты применяют активные формы кислорода для разрушения функционально ненужных участков костной ткани. Перекись водорода необходима для синтеза йодтиронинов в щитовидной железе [Кулинский В.И., 1999; Ткачук В. А., 2002; Северин Е. С., 2003; Дубинина Е. Е., 2006]. АФК регулируют процессы деления клеток, апоптоза, сигнальной транедукции [Green D. R. Reed J. С., 1998; Allen R. G., Tresini M., 2000; Chandra J., et al., 2000; Дубинина E. E., 2006].

Однако в случае гиперпродукции АФК могут вызывать повреждения или разрушения клеток, т.е. свободные радикалы будут оказывать деструктивные эффекты в организме. Это происходит из-за того, что активные формы кислорода весьма агрессивны и легко вступают во взаимодействие с основными компонентами клеток, вызывая окислительную модификацию липидов, белков и нуклеиновых кислот. Кроме того, инициируя окисление биомолекул, они способствуют образованию других свободнорадикальных соединений (например, индуцируют процессы свободнорадикального окисления липидов) [Арутюнян А. В. с соавт., 2000; Кольтовер В. К., 2000; Ткачук В. А., 2002; Северин Е. С., 2003; Дубинина Е. Е., 2006].

В организме существует специальная система антиоксидантных ферментов (АОФ), преимущественно супероксиддисмутаза (СОД), глутатионпероксидаза (ГП), каталаза, глутатионредуктаза (ГР), глутатион-S-трансфераза (ГТ), которые контролируют концентрацию супероксидных радикалов, пероксида водорода и их активных продуктов, что чрезвычайно важно для осуществления клетками и тканями их физиологических функций.

В связи с вышеизложенным, важное значение представляет решение вопроса о регуляции активности ферментов, контролирующих уровень АФК. В литературе имеются немногочисленные сведения о том, что активность антиоксидантных ферментов регулируется эндокринной системой. В частности, в экспериментах на мелких лабораторных животных была выявлена способность мелатонина стимулировать синтез СОД и ферментов глутатионзависимой антиоксидантной системы, таких как глутатионпероксидаза и глутатионредуктаза [Antolin I., et al., 1996; Reiter R. J. et al., 2000; Mayo J. C. et al., 2002; Manda K., Bhatia A. L., 2003]. Выявлено понижение активности СОД у женщин в постменопаузе [Guemouri L., et al., 1991; Bolzan A. D. et al., 1997]. Поскольку в этот период характерно отсутствие функциональной активности яичников можно полагать, что понижение активности СОД у пожилых женщин обусловлено выраженным снижением уровня эстрогенов в данный период, т. е. можно думать о стимулирующем эффекте эстрогенов на активность СОД.

Имеются данные о возможной роли тиреоидных гормонов в регуляции активности АОФ [Ещенко Н. Д. с соавт., 1998; Туктанов Н. В., 2004; Никитченко Ю. В. с соавт., 20056; Ещенко Н. Д. с соавт., 2007]. Однако практически отсутствует информация о роли гипоталамо-гипофизарно-адреналовой системы (ГТАС) в регуляции активности АОФ в физиологических условиях.

В то же время, исследованиями, проведенными ранее в лаборатории эндокринологии ГУ НИИ медицинской приматологии РАМН, было выявлено, что в процессе старения у человека и обезьян в плазме периферической крови формируется выраженный стероидный дисбаланс, который играет важную роль в развитии возрастных инволютивных процессов и возрастной патологии [Анциферова Н. Д., 1997; Гончарова Н. Д., 1997а; 19976; Goncharova N. D., Lapin В. А., 2000; 2002; Goncharova N. D. et al., 2000; Гончарова Н. Д. с соавт., 2002; Гончарова Н. Д., Лапин Б. А., 2005]. В частности, было отмечено резкое снижение при старении продукции дегидроэпиандростерона (ДГА) и дегидроэпиандростерона сульфата (ДГАС), что приводит к выраженному увеличению соотношения в крови молярных концентраций кортизола (F) и ДГА, ДГАС, т. е. (Р)/ДГА+ДГАС - биомаркера старения организма и развития возрастной патологии.

С другой стороны, известно, что кортикостероиды, для человека и обезьян, в первую очередь кортизол, являются ключевыми регуляторами клеточного апоптоза, митозов, воспаления и других важных физиологических процессов в которых АФК предположительно также играют важную роль [Scheller К. et al., 2003; Butcher S. К. et al., 2005; Long F. et al., 2005; Schmidt A. J. et al., 2005]. Появляется все больше данных, указывающих на важную роль адреналовых андрогенов в регуляции тех же самых физиологических процессов, в регуляции которых участвует F и АФК [Spencer N. F. L. et al., 1995; Schmidt M. et al., 2000; Wang M. J. et al., 2001;

Butcher S. К. et al., 2005]. В частности, имеются данные, что ДГА и ДГАС ингибируют процессы воспаления, канцерогенез, атеросклероз, по крайней мере, частично, путем ингибирования НАДФН-зависимого формирования свободных радикалов кислорода [Schwartz A. G., Pashko L. L., 2004]. Однако имеется мало информации о регуляции продукции или утилизации АФК in vivo с помощью кортикостероидов. Большинство исследований в этой области были выполнены на клеточных культурах или при введении фармакологических доз гормонов лабораторным грызунам [Pereira В. et al., 1995; Scheller К. et al., 2003; Long F. et al., 2005; Schmidt A. J. at al., 2005]. Между тем, приматы существенным образом отличаются от грызунов по их гормональной регуляции и уникальны в отношении секреции ДГАС [Hornsby P. J., 1995; Анциферова Н. Д., 1997; Goncharova N. D., Lapin В. А., 1999; Гончарова Н. Д. с соавт., 2002; Соллертинская Т. Н., с соавт., 2003; Гончарова Н. Д., Лапин Б. А., 2005 Соллертинская Т. Н., с соавт., 2007]. Таким образом, касаясь таких проблем, как гормональная регуляция и гормональная заместительная терапия, предпочтительнее использовать лабораторных приматов в качестве модели.

Важное значение представляет также изучение в эксперименте на лабораторных приматах регулирующего влияния пинеальной железы на активность АОФ. Это обусловлено тем, что такого рода работы на приматах отсутствуют, а имеющиеся в литературе данные о стимулирующем влиянии мелатонина были получены в эксперименте на мелких лабораторных животных (мыши, крысы). В то же время проводить экстраполяцию данных, полученных в эксперименте на грызунах, на человека вряд ли возможно. Это обусловлено тем, что основное физиологическое значение мелатонина связано с регуляцией циркадных ритмов различных физиологических процессов, приведение их в соответствие с природным ритмом свет-темнота (день-ночь) [Чазов Е. И., Исаченков В. А., 1974; Гончарова Н. Д. с соавт., 2002; Хавинсон В. X., Голубев А. Г., 2002; Венгерин А. А., 2005; Кветная Т. В. с соавт., 2005; Goncharova N. D. et. al., 2005; Анисимов В. Н., 2007;

Гончарова Н. Д. с соавт., 2007]. В то же время, как известно, грызуны, в отличие от человека и приматов, ведут ночной образ жизни. В этой связи представляется актуальным изучение роли мелатонина в регуляции активности АОФ на модели лабораторных приматов.

Целью настоящей работы явилось изучение регулирующего влияния ГГАС и пинеальной железы на активность ферментов антиоксидантной защиты и особенности этого регулирующего влияния в процессе старения на модели лабораторных приматов - макак резусов (М. mulatta).

Основные задачи исследования:

1. Исследовать влияние ГГАС на активность антиоксидантных ферментов (СОД, ГР, ГП, ГТ) в эритроцитах периферической крови у самок макак резусов разного возраста в базальных условиях с учетом циркадного ритма активности ГГАС.

2. Исследовать реакцию ГГАС и АОФ на острое психоэмоциональное стрессорное воздействие, произведенное в разное время суток у самок макак резусов разного возраста, и изучить корреляции между стресс-реактивностью кортикостероидных гормонов и АОФ.

3. Изучить активность АОФ (ГР, ГП, ГТ) в эритроцитах периферической крови у самок макак резусов разного возраста в ответ на введение АКТГ и дексаметазона.

4. Исследовать корреляции между характером циркадных изменений уровня мелатонина в плазме периферической крови и активностью АОФ (ГР, ГП, ГТ) в эритроцитах периферической крови у самок макак резусов разного возраста.

5. Изучить эффекты эпиталона (синтезирован в Санкт-Петербургском институте биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН) на базальную активность АОФ в эритроцитах периферической крови у старых самок макак резусов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Для молодых самок макак резусов характерно существование выраженного циркадного ритма активности СОД, тесно коррелирующего с циркадным ритмом уровней F и ДГАС в плазме периферической крови. При старении наблюдается существенное сглаживание циркадных ритмов, как для активности СОД, так и для кортикостероидов.

2. В ответ на острое стрессорное воздействие активируется как ГТАС, так и активность АОФ (главным образом ГР). Степень их активации зависит от времени суток: в послеполуденное и вечернее время стресс-реактивность ГГАС и ГР выше, чем в утренние часы. При старении циркадный ритм стресс-реактивности ГГАС и активности АОФ сглаживается. Выявлены выраженные возрастные различия при нанесении стрессового воздействия в 15.00: у молодых животных стресс-реактивность ГГАС и ГР выше по сравнению со старыми животными.

3. Введение эпиталона приводит к снижению интенсивности перекисной хемилюминесценции и увеличению активности глутатионзависимых антиоксидантных ферментов (ГП, ГР, ГТ) наряду с повышением концентрации мелатонина в вечерние и ночные часы в крови у старых самок макак резусов.

4. Макаки резусы - перспективная модель для изучения проблем возрастных изменений функций ГТАС, пинеальной железы и системы антиоксидантной защиты, а также для тестирования фармакологических препаратов, направленных как на коррекцию возрастных нарушений эндокринных функций, так и системы антиоксидантной защиты.

Научная новизна работы. Впервые выявлено, что существует выраженный суточный ритм активности СОД в эритроцитах периферической крови у молодых самок макак резусов, который тесно коррелирует с суточными изменениями концентрации кортикостероидов в плазме крови. При старении происходит сглаживание суточного ритма уровней F и ДГАС в периферической крови и наблюдается тенденция к сглаживанию суточного ритма активности СОД.

Впервые установлено, что в ответ на острое стрессорное воздействие резко возрастает активность эритроцитарной ГР. При этом выявлена тесная корреляция между динамикой уровня кортикостероидов (F и ДГАС) в периферической крови и динамикой активности ГР. Более того, установлено, что более выраженный ответ со стороны ГГАС и активности ГР наблюдается при нанесении стрессорного воздействия в 15.00, чем в 9.00. При старении происходят нарушения в циркадном ритме стресс-реактивности ГГАС, что сопровождается сходными нарушениями в стресс-реактивности ГР.

В ответ на введение АКТГ и дексаметазона происходят изменения в активности ГР, которые коррелируют с динамикой концентрации кортикостероидов в плазме крови. .

Десятидневный курс эпиталона в дозе 10 мкг/сутки старым животным приводит к увеличению активности ГП и тенденции к увеличению активности ГР и ГТ наряду с понижением интенсивности перекисной хемилюминесценции, отражающей ослабление процессов образования АФК в эритроцитах.

Теоретическое и практическое значение работы. Результаты исследования вносят существенный вклад в понимание основных закономерностей нарушений функции ГГАС, пинеальной железы и системы антиоксидантной защиты при старении и роли этих нарушений в формировании возрастных инволютивных процессов, а также развития возрастной патологии.

Обосновано использование макак резусов в качестве адекватной биологической модели для изучения проблем физиологического старения человека и возрастной патологии.

Большое теоретическое и практическое значение представляют данные о существовании циркадного ритма активности эритроцитарной СОД и об участии ГГАС в регуляции этого процесса.

Как практический, так и теоретический интерес представляют полученные данные о подъеме активности эритроцитарной ГР в ответ на острое стрессорное воздействие, а также о существовании циркадного ритма в стресс-реактивности ГР, тесно коррелирующего с циркадным ритмом в стресс-реактивности ГГАС. При старении циркадианные ритмы стресс-реактивности ГР и ГГАС сглаживаются, но выявляются выраженные возрастные различия в стресс реактивности как ГР, так и ГГАС - в ответ на стресс (в 15.00 выше у молодых животных по сравнению со старыми животными). Выявленное понижение активности ГР у старых животных в условиях стресса в послеполуденное и вечернее время может иметь важные патофизиологические последствия. В частности, понижение активности ГР способствует понижению уровня восстановленной формы глутатиона, нарушению редокс гомеостаза эритроцитов, надежности антиоксидантной защиты и повышению интенсивности ПОЛ. В результате этих изменений возможно нарушение физико-химических свойств плазмалеммы эритроцитов и нарушение их подвижности. Последнее может приводить к нарушению доставки кислорода к тканям, испытывающим повышенную потребность в кислороде в условиях острого психоэмоционального стресса.

Эпиталон - перспективный препарат для коррекции нарушений надежности антиоксидантной ферментной защиты у старых индивидуумов.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на научно-практической Конференции «Медицина будущего» (Краснодар-Сочи, 2002), конференции «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека» (Смоленск, 2003), III конференции молодых ученых России «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2003), IV Национальном конгрессе геронтологов и гериатров Украины (Киев, 2005), I съезде физиологов стран СНГ (Дагомыс, 2005), V Всероссийском конгрессе эндокринологов «Высокие медицинские технологии в эндокринологии» (Москва, 2006), Всероссийской конференции «Перспективы фундаментальной геронтологии» (Санкт-Петербург, 2006), VII международном симпозиуме «Биологические механизмы старения» (Харьков, 2006), VIII Конгрессе международного общества по адаптивной медицине (Москва, 2006), Всероссийской научной конференции «Перспективные направления использования лабораторных приматов в медико-биологических целях» (Сочи-Адлер, 2006), VI Европейском конгрессе международного общества геронтологии и гериатрии (Санкт-Петербург, 2007). По материалам диссертации опубликовано 16 работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 126 страницах, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов и 2-х глав собственных исследований. Список цитированной литературы включает 68 отечественных и 148 зарубежных источников. Работа иллюстрирована 8 рисунками и 17 таблицами.

102 ВЫВОДЫ

1. У молодых самок макак резусов существует выраженный цнркадный ритм активности эритроцитарной супероксиддисмутазы с максимальной активностью в 10.00 ч и минимальной в 22.00 ч, который тесно коррелирует с уровнями кортизола и дегидроэпиандростерона сульфата в плазме периферической крови. При старении происходит сглаживание циркадных ритмов активности супероксиддисмутазы в эритроцитах и уровня кортизола и дегидроэпиандростерона сульфата в плазме периферической крови.

2. Активность эритроцитарной глутатионредуктазы закономерно увеличивается в ответ на острое стрессорное воздействие. Степень увеличения активности глутатионредуктазы у молодых животных зависит от времени суток и определяется стресс-реактивностью гипоталамо-гипофизарно-адреналовой системы. При старении происходит сглаживание циркадных ритмов реакции глутатионредуктазы на острое стрессорное воздействие при одновременном сглаживании стресс-реактивности гипоталамо-гипофизарно-адреналовой системы.

3. Активность эритроцитарной глутатионредуктазы увеличивается в ответ на введение АКТГ и дексаметазона.

4. Курс эпиталона (10 дней в дозе 10 мкг/животное/сутки) старым животным приводит к увеличению уровня мелатонина в плазме периферической крови в ночное время, повышению активности глутатионзависимых антиоксидантных ферментов и снижению интенсивности перекисной хемилюминесценции.

5. Макаки резусы - перспективная модель для изучения проблем взаимосвязи возрастных изменений эндокринных функций и надежности антиоксидантной защиты, а также для тестирования фармакологических препаратов, направленных на коррекцию возрастных нарушений, как эндокринных функций, так и системы антиоксидантной защиты.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Полученные данные дают основание полагать, что нормализация гормонального статуса у людей с преждевременным старением может привести к нормализации системы антиоксидантной защиты организма. Этот подход может лежать в основе разработки схем, направленных на нормализацию процессов транспорта кислорода в условиях острого стресса.

2. Эпиталон можно использовать для коррекции возрастных нарушений антиоксидантной ферментной защиты.

3. Полученные результаты могут быть использованы при чтении курса лекций по геронтологии, эндокринологии, нормальной и патологической физиологии.