Пептидергическая регуляция экспрессии сигнальных молекул в пинеальной железе и тимусе при старении

Линькова, Наталья Сергеевна

Диссертации по медицине → Геронтология и гериатрия

Автореферат и диссертация по медицине (14.01.30) на тему:Пептидергическая регуляция экспрессии сигнальных молекул в пинеальной железе и тимусе при старении

ДИССЕРТАЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

Линькова, Наталья Сергеевна Санкт-Петербург 2014 г.

Ученая степень: доктора биологических наук

ВАК РФ: 14.01.30

Автореферат диссертации по медицине на тему Пептидергическая регуляция экспрессии сигнальных молекул в пинеальной железе и тимусе при старении

На правах рукописи

ЛИНЬКОВА

Наталья Сергеевна

ПЕПТИДЕРГИЧЕСКАЯ РЕГУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ СИГНАЛЬНЫХ МОЛЕКУЛ В ПИНЕАЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЕ И ТИМУСЕ ПРИ СТАРЕНИИ

14.01.30 - геронтология и гериатрия 03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

005547940

Санкт-Петербург - 2014

005547940

Работа выполнена в лаборатории биогеронтологии Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН

Научные консультанты:

заслуженный деятель науки РФ, член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор Хавинсон Владимир Хацкелевич

доктор биологических наук, профессор Полякова Виктория Олеговна

Официальные оппоненты:

Марков Александр Георгиевич, доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный университет» (ФГБОУ ВПО СПбГУ), заведующий кафедрой общей физиологии. Назаров Петр Григорьевич, доктор медицинских наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины" СЗО РАМН, заведующий лабораторией общей иммунологии отдела иммунологии.

Белушкина Наталья Николаевна, доктор биологических наук, профессор, НБИКС-центр Национального исследовательского центра «Курчатовский институт», главный научный сотрудник. Ведущая научная организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии им. И.П. Павлова Российской академии наук.

на заседании диссертационного совета Д 601.001.01 при Санкт-Петербургском институте биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН по адресу: 197110, Россия, Санкт-Петербург, пр. Динамо, д. 3.

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН (197110, Россия, Санкт-Петербург, пр. Динамо, д. 3).

Автореферат разослан « ( Ь » 2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

профессор, доктор биологических наук, Козина Л.С.

Защита диссертации состоится

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Для сохранения здоровья и продления активного долголетия постоянно увеличивающейся доли лиц старших возрастных групп важным является изучение молекулярных механизмов, лежащих в основе старения организма.

Участие сигнальных молекул в функционировании регуляторных систем организма привело к созданию новых областей науки - молекулярной медицины и нейроиммуноэндокринологии, которые изучают взаимосвязи между указанными системами в норме и при патологии [Ноздрачев А.Д. и соавт., 2001; Пальцев М.А., Кветной И.М., 2008; Liberman P.M., 1997]. С точки зрения геронтологии важнейшими органами диффузной нейроиммуноэндокринной системы являются пинеальная железа (ПЖ) и тимус [Кветной И.М., Полякова В.О., 2009]. Возрастное снижение функциональной активности ПЖ, сопровождающееся снижением секреции мелатонина (МТ), лежит в основе таких заболеваний, как болезнь Альцгеймера, сахарный диабет, гипертензия, возрастные иммунодефицита, ишемическая болезнь сердца [Anisimov V.N., Khavinson V.Kh., 2010]. Тимус подвергается инволюции, начиная с 30 лет, а к 60 годам его функциональная активность снижается, что приводит к увеличению заболеваемости раком, вирусными, бактериальными инфекциями и аутоиммунным заболеваниям [Ярилин A.A., Беляков И.М., 1996; Griffin D.O., Rothstein T.L., 2012].

Ключевым звеном молекулярно-клеточной регуляции гомеостаза в ПЖ и тимусе является секреция ряда общих медиаторов, осуществляющих передачу информации между различными клетками. К ним относятся вещества природного происхождения (МТ, серотонин, транскрипционный фактор pCREB) и синтетические короткие пептиды.

Нейромедиаторы ПЖ МТ и серотонин были верифицированы в ткани тимуса, а регуляторный белок тимуса pCREB был обнаружен в пинеалоцитах. Установлено, что 10% площади ПЖ занимает лимфоидная ткань, секретирующая цитокины, идентичные тем, которые экспрессируются в тимусе [Mosenson J., McNulty J., 2006]. Кроме того, снижение синтеза пинеального МТ при старении приводит к нарушению пролиферации и дифференцировки Т-лимфоцитов тимуса, что свидетельствует о тесном молекулярном взаимодействии между указанными органами [Reiter R.J. et al., 2010].

Результаты многолетних исследований показывают, что снижение функциональной активности центральных органов

нейроиммуноэндокринной системы связано с нарушением молекулярно-клеточных механизмов пептидной регуляции [Ашмарин И.П., Королева C.B., 2003; Арутюнян A.B. и соавт., 2009], что открывает возможности поиска новых фармакологических средств, например пептидной природы. В России изучение биологической активности коротких пептидов активно развивается с 70-х годов XX века [Тутельян В.А. и соавт., 2003; Anisimov V.N., Khavinson

У.КЪ., 2010; БегесИпт 8.В. й а1., 1997; 1узпоу У.Т. е1 а1., 2005; Бе1вт V.!. & а1., 2007; МуаБоес1оу КБ. а1., 2011].

Ключевую роль в сохранении функций ПЖ и тимуса при старении может играть синтетический пептид АЕБв, стимулирующий иммунную и эндокринную функцию тимуса [Кветной И.М., Полякова В.О., 2009; Амэтюу У.Ы., Ытутвоп У.КЬ., 2010]. Пептид АЕБО активирует выработку МТ пинеальной железой, который связывается с мелатониновыми рецепторами клеток тимуса. Например, таким путем может регулироваться циркадианное повышение выработки тимического сывороточного фактора, способствующего поздней активации тимоцитов [Райхлин Н.Т. и др., 2004]. Пептид КЕ стимулирует иммуногенез в тимусе, активируя пролиферацию тимоцитов, и обладает антиканцерогенным действием [Ашбшоу У.К, КЬаутзоп У.КЬ., 2010]. Пептид ЕОЛ является индуктором пролиферации иммунных клеток в органотипических культурах тканей [СЬаНзоуа N.1. е1 а1., 2008].

Таким образом, исследование пептидергической регуляции молекулярно-клеточных аспектов старения ПЖ и тимуса является актуальной задачей фундаментальной геронтологии и молекулярной медицины. Кроме того, для практической геронтологии представляется важной разработка новых подходов к восстановлению экспрессии сигнальных молекул в ПЖ и тимусе при старении с применением синтетических пептидов.

Цель и задачи исследования

Целью диссертационного исследования явилось изучение влияния коротких пептидов на экспрессию сигнальных молекул в пинеальной железе и тимусе при их старении.

Для достижения указанной цели были поставлены и последовательно решены следующие задачи:

1. Выявить экспрессию общих сигнальных молекул, участвующих в процессах иммуногенеза, пролиферации, дифференцировки, межклеточных взаимодействий в пинеальной железе и тимусе человека при старении.

2. Оценить влияние пептидов КЕ, АЕОО, КЕБ и ЕБЯ на пролиферацию и дифференцировку лимфоцитов в культурах клеток пинеальной железы и тимуса, полученных от молодых и старых животных.

3. Изучить действие пептидов КЕ, АЕОО, КЕБ и ЕО!1 на апоптоз в культурах клеток пинеальной железы и тимуса, полученных от молодых и старых животных.

4. Выявить роль пептидов КЕ, AEDG, KED и EDR в регуляции процессов клеточного обновления и межклеточных взаимодействий в культурах клеток пинеальной железы и тимуса, полученных от молодых и старых животных.

5. Оценить влияние пептидов КЕ и AEDG на экспрессию фермента AANAT и транскрипционного фактора pCREB, участвующих в синтезе мелатонина, в диссоциированной культуре пинеалоцитов.

6. Создать трехмерную модель взаимодействия пептидов КЕ и AEDG с промоторными участками генов изученных сигнальных молекул.

7. Оценить роль коротких пептидов в регуляции экспрессии сигнальных молекул в пинеальной железе и тимусе при старении.

Научная новизна

Впервые выявлены общие сигнальных молекулы (Ki67, Р53, AIF, CGRP, ММР2, ММР9, CD4, CD5, CD8, CD20), участвующие в процессах клеточного обновления, межклеточных взаимодействиях, иммунологических реакциях в пинеальной железе и тимусе людей старше 60 лет, что позволяет расширить представления об экспрессии сигнальных молекул в указанных органах и их вкладе в механизмы старения.

На клеточном уровне установлено, что лимфоидный компонент пинеальной железы человека представлен 3 субпопуляциями иммунных клеток: Т-хелперами, цитотоксическими Т-лимфоцитами и В-клетками. Впервые проведен сравнительный анализ возрастной динамики количества различных субпопуляций лимфоцитов в пинеальной железе и тимусе при старении. Установлено, что при старении в пинеальной железе количество Т-хелперов, цитотоксических Т-клеток, B-лимфоцитов и CD5+ клеток снижается незначительно, тогда как в тимусе у лиц старше 60 лет численность Т-клеток и CD5+ лимфоцитов резко снижается. Кроме того, впервые установлено, что в пинеальной железе маркер CD5 преимущественно представлен на B-клетках, что указывает на их активацию и реализацию иммуносупрессорных свойств. При этом для тимуса характерно наличие CD5+ Т-клеток. Полученные данные позволили выдвинуть и обосновать гипотезу о том, что пинеальная железа, являясь органом нейроиммуноэндокринной системы, при старении организма может играть важную роль в поддержании пула иммунных клеток.

В настоящей работе впервые исследована возрастная динамика молекулярных механизмов клеточного обновления в ткани пинеальной железы и тимуса человека. Установлено, что в пинеальной железе пролиферативная активность клеток, оцениваемая по экспрессии маркера Ki67, сохраняется на стабильном уровне у пожилых людей и лиц старческого возраста и несколько снижается у долгожителей. В тимусе экспрессия Ki67 у лиц старческого возраста снижается в 8 раз по сравнению с пожилыми людьми. Апоптоз в пинеальной железе и тимусе реализуется по двум механизмам: каспаза-зависимому, с участием белка Р53, и

митохондриально-опосредованному, ассоциированному с протеином AIF. С возрастом митохондриально-опосредованный апоптоз в тимусе возрастает, тогда как в пинеальной железе этот процесс при старении не изменяется.

Впервые установлено, что в пинеальной и вилочковой железах ремоделирование межклеточного матрикса, необходимое для реализации межклеточных взаимодействий, осуществляется с участием металлопротеиназ ММР2 и ММР9. С возрастом экспрессия обоих изученных металлопротеиназ в пинеальной железе и в тимусе уменьшается. Кроме того, экспрессия нейропептида CGRP в пинеальной железе не зависит от возраста и существенно снижается при старении тимуса. Таким образом, впервые выявлены 10 ключевых сигнальных молекул (CD4, CD5, CD8, CD20, AIF, Р53, Ki67, CGRP, ММР2, ММР9), отражающих общность молекулярных механизмов возрастной инволюции пинеальной железы и тимуса. Установлено, что в пинеальной железе возрастное снижение данных молекулярных маркеров выражено менее сильно по сравнению с тимусом.

Впервые в органотипической культуре клеток пинеальной железы крыс разного возраста выявлена способность синтетических пептидов AEDG, ICE, EDR восстанавливать экспрессию сигнальных молекул AIF, Р53, Ki67, CGRP, ММР9. Установлено, что наибольшим стимулирующих эффектом из всех изученных пептидов обладает AEDG. Впервые показано, что пептид AEDG снижает уровень каспаза-зависимого апоптоза в культурах клеток пинеальной железе и тимуса, полученных от старых животных, что может указывать на общие регуляторные механизмы клеточной гибели в исследуемых органах при старении. Установлено, что наибольшим стимулирующим эффектом на лимфоидную ткань пинеальной железы и тимуса обладает пептид ICE, однако в зависимости от органа и возраста животных имеются некоторые особенности его эффектов. Так, в культурах клеток пинеальной железы, полученных от молодых крыс, пептид КЕ усиливает процессы дифференцировки иммунных клеток, тогда как в культурах клеток, полученных от старых животных, этот пептид стимулирует активацию и пролиферацию различных субпопуляций иммунных клеток. Впервые установлено, что пептиды AEDG и КЕ обладают выраженной активностью в отношении экспрессии молекул AANAT и pCREB, участвующих в синтезе мелатонина пинеалоцитами.

Впервые выявлено, что пептиды КЕ, EDR и AEDG обладают активностью в отношении пролиферации и дифференцировки лимфоцитов тимуса старых животных. Установлено, что пептид КЕ стимулирует пролиферацию активированных Т-лимфоцитов. Пептиды EDR и AEDG, обладая тем же эффектом, что и КЕ, стимулируют пролиферацию В-лимфоцитов. Методом молекулярного моделирования доказано, что в основе пептидергической регуляции нейроиммуноэндокрнных функций пинеальной железы и тимуса может лежать сайт-специфическое взаимодействие пептидов AEDG и КЕ с промоторными зонами генов, кодирующих изученные белки.

Практическая значимость

Полученные результаты позволили выявить 3 субпопуляции иммунных клеток в ПЖ, что подтверждает о тесную взаимосвязь эпифиза с тимусом в рамках единой нейроиммуноэндокринной системы.

В работе установлены общие возрастные аспекты снижения экспрессии ряда сигнальных молекул - маркеров клеточного обновления, ремоделирования межклеточного матрикса и нейроиммуноэндокринных взаимодействий в ПЖ и тимусе. Это является важным вкладом в понимание фундаментальных аспектов старения нейроиммуноэндокринной системы и свидетельствует о физиологической взаимосвязи между вилочковой и пинеальной железой, нарушение которой может быть одной из причин ускоренного старения.

Применение в работе сочетания методов органотипического и диссоциированного культивирования клеток и иммуноцитохимии оказалось эффективным для оценки биологической активности коротких пептидов (AEDG, КЕ, EDR, KED) и поиска молекулярных мишеней их действия в ПЖ и тимусе.

На основании анализа влияния коротких пептидов на синтез белков -маркеров функциональной активности клеток ПЖ и тимуса были найдены соответствующие им промоторные зоны генов. Методом молекулярного моделирования были установлены вероятные специфические сайты связывания для пептидов AEDG и КЕ в промоторных зонах генов изученных белков ПЖ и тимуса. Полученные данные позволяют выявить предполагаемые генные мишени действия пептидов AEDG и КЕ, что является новым перспективным подходом к созданию геропротекторных и других биологически активных веществ, направленных на регуляцию экспрессии генов.

Положения, выносимые на защиту

1. В основе нейроиммуноэндокринного механизма старения пинеальной железы и тимуса лежит снижение экспрессии сигнальных молекул, участвующих в клеточном обновлении (Ki67, Р53, AIF), иммунном ответе (CD4, CD5, CD8, CD20), пептидной нейрорегуляции (CGRP) и изменение количества матриксных металлопротеиназ (ММР2, ММР9).

2. В пинеальной железе человека верифицированы иммунные клетки (Т-хелперы, цитотоксические Т-лимфоциты, B-клетки), характерные для ткани тимуса, а в тимусе - нейропептид CGRP, экспрессируемый пинеалоцитами, что является доказательством общности этих органов в рамках диффузной нейроиммуноэндокринной системы.

3. Пептид КЕ стимулирует пролиферацию и активацию лимфоцитов в культурах клеток пинеальной железы, полученных от молодых и старых животных. В тимусе пептиды КЕ, EDR, AEDG также оказывают

стимулирующий эффект на лимфоидный компонент, однако он менее выражен по сравнению с пинеальной железой.

4. Пептид ЛЕОв снижет уровень апоптоза в культурах клеток пинеальной железы и тимуса, полученных от старых животных.

5. Пептид АЕЭС активирует процессы клеточного обновления, межклеточные взаимодействия и снижает экспрессию проапоптотического белка Р53 в пинеальной железе при старении. Сходным эффектом на пролиферацию и ремоделирование межклеточного матрикса в ткани пинеальной железы обладает пептид ЕОИ.

6. Пептидергическая регуляция синтеза мелатонина в пинеалоцитах осуществляется через стимуляцию экспрессии лимитирующих факторов данного процесса - фермента ААЫАТ и транскрипционного фактора рСИЕВ под действием пептидов АЕБО и КЕ.

7. Методом молекулярного моделирования установлено, что пептиды АЕОО и КЕ способны связываться с ДНК. Пептидергическая регуляция экспрессии сигнальных молекул в пинеальной железе и тимусе может осуществляться за счет связывания пептидов АЕОО и КЕ с азотистыми основаниями регуляторных участков генов, кодирующих изученные сигнальные молекулы.

8. В поддержании функциональной активности пинеальной железы и тимуса участвует совокупность сигнальных мессенджеров, экспрессия которых с возрастом снижается. Пептиды АЕОО и КЕ геноспецифически восстанавливают синтез указанных сигнальных молекул в пинеальной железе и тимусе. При этом пептид АЕОО оказывает наибольший эффект на процессы клеточного обновления и межклеточные взаимодействия, а пептид КЕ стимулирует пролиферацию и дифференцировку лимфоидного компонента обоих органов.

Связь с научно-исследовательской работой Института

Диссертационная работа является научной темой, выполняемой по основному плану НИР Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 7 глав собственных исследований, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы. Текст диссертации изложен на 282 страницах, содержит 11 таблиц, иллюстрирован 101 рисунком. Список литературы содержит 323 источника, из них на русском языке -84, на английском - 239.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 49 научных работ, в том числе 30 статей в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ для опубликования материалов диссертационных исследований, 2 статьи в других журналах, 11 глав в монографиях и руководствах, б основных тезисов докладов.

Апробация и реализация диссертации

Основные материалы диссертации доложены на VII Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2010); VI научно-практической конференции с международным участием «Пушковские чтения» (Санкт-Петербург, 2010); Всероссийской научно-практической конференции «Терапевтические проблемы пожилого человека» (Санкт-Петербург, 2010); на конференции «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия». (Москва, 2010); III Международном симпозиуме «Взаимодействие нервной и иммунной систем в норме и при патологии» (Санкт-Петербург, 2011); Международном форуме «Старшее поколение» (Санкт-Петербург, 2011); Всероссийской научной конференции с международным участием «Дни биохимии в СПбГМУ» (Санкт-Петербург, 2011); Всероссийской научной конференции-школы «Нейробиология интегративных функций мозга» (Санкт-Петербург, 2011); Санкт-Петербургском научном форуме «Наука и общество» (Санкт-Петербург, 2011); 12th International Congress on Amino Acids, Peptides and Proteins (Beijing, China, 2011); Российском конгрессе с международным участием «Молекулярные основы клинической медицины - возможное и реальное» (Москва, 2012); XIX Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2012); 5-ой юбилейной международной конференции «Геронтологические чтения - 2012» (Белгород, 2012); Международной конференции «Генетика старения и долголетия» (Москва, 2012); 8th European Congress of Biogerontology joint with the 2nd international Resolve Meeting "Healthy Ageing and Regenerative Medicine" (Israel, 2013); 20th IAGG Word Congress of Gerontology and Geriatrics (Seoul, Korea, 2013).

Работа H.C. Линьковой на тему «Молекулярно-клеточные механизмы пептидной регуляции функций эпифиза при старении» заняла II место на конкурсе научных работ, проводимом в рамках III Съезда геронтологов и гериатров России (Новосибирск, 2012).

Под руководством Н.С. Линьковой по теме диссертации в 2010-2012 г. была выполнена и защищена магистерская работа студентки факультета медицинской физики и биоинженерии СПбГПУ А.С. Катанугиной «Возрастная динамика экспрессии сигнальных молекул в тимусе и эпифизе человека».

Материалы диссертационного исследования внедрены в качестве главы в учебнике для студентов медицинских вузов, рекомендованного Департаментом образовательных медицинских учреждений и кадровой

политики Министерства здравоохранения РФ «Руководство по нейроиммуноэндокринологии [Пальцев М.А., Кветной И.М., 2014].

Личный вклад автора

Личный вклад автора в диссертационное исследование состоял в планировании, проведении экспериментов, статистической обработке и анализе данных молекулярного механизма пептидергической регуляции тимико-эпифизарных взаимоотношений. В ходе выполнения исследования отработана и стандартизирована методика органотипического культивирования ПЖ и тимуса крыс с последующим применением метода иммуноцитохимии. Автор принимала участие во всех экспериментах, включавших в себя культивирование клеток, иммуноцито- и иммуногистохимическое окрашивание, микроскопию, морфометрию, молекулярное моделирование взаимодействия пептидов с ДНК и статистический анализ данных.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Характеристика исследуемого материала Для изучения общности сигнальных молекул ПЖ и тимуса при старении был использован аутопсийный материал людей в возрасте от 60 до 98 лет. Образцы аутопсийного материала ПЖ и тимуса людей разного возраста были получены в ФГБУ «Клиническая больница № 122 им. Л. Г. Соколова» ФМБА и СПб ГБУЗ «Городская больница Святого Великомученика Георгия» (Санкт-Петербург, Россия). Весь материал был разделен на 3 группы в соответствии с классификацией, принятой ВОЗ: 1 - пожилой возраст (60-74 года), 2 - старческий возраст (75-89 лет), 3 - долгожители (90 лет и более) (табл. 1). Сравнительное изучение структурно-функциональной организации ткани ПЖ и тимуса человека проводили методом световой микроскопии на препаратах, окрашенных гематоксилином и эозином.

Исследование пептидной регуляции экспрессии сигнальных молекул ПЖ и тимуса при старении изучали иммуноцитохимическим методом на органотипических и первичных диссоциированных культурах клеток ПЖ и тимуса в лабораториях пептидной регуляции старения Института физиологии им. И.П. Павлова РАН и иммунологии старения Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии.

Исследование пептидной регуляции в диссоциированных культурах клеток ПЖ проводили в рамках совместного проекта с Институтом анатомии Университета И.В. Гетте (Франкфурт-на-Майне). Считаю необходимым выразить глубокую признательность руководителю Института проф. Х.В. Корфу и проф. Т.В. Кветной за помощь в организации и проведении исследования.

Органотипические культуры были получены от молодых (1,5-3 мес.) и старых (18-24 мес.) крыс линии «Wistar». Диссоциированные культуры тимуса и ПЖ (3 пассаж) были выделены из органов крыс линии «Wistar» (3 мес.). В работе также использовали тимус эмбриона человека (16-24 нед. гестации), который был получен в НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта РАМН.

В работе использовали короткие пептиды, сконструированные и синтезированные в Санкт-Петербургском институте биорегуляции и геронтологии: КЕ (Lys-Glu, вилон, АВ-0, стимулятор регенерации тканей) [Khavinson V.Kh., et al., 2003], AEDG (Ala-Glu-Asp-Gly, эпиталон, специфичный к ткани ПЖ) [Khavinson V.Kh., 2006], EDR (Lys-Glu-Asp, везуген, T-38, регулятор функций сосудов) [Khavinson V.Kh., et al., 2008] и KED (Glu-Asp-Arg, пинеалон, T-33, регулятор функций головного мозга) [Khavinson V.Kh., et al., 2009].

Органотипические культуры клеток ПЖ и тимуса разделяли на 5 равных групп (n=100): 1 - контроль (введение физиологического раствора), 2 - введение пептида KED, 3 - введение пептида AEDG, 4 - введение пептида КЕ, 5 - введение пептида EDR. Пептиды вводили в концентрации 0,05 нг/мл.

Таблица I

Распределение аутопсийного материала по группам_

Группа Средний возраст, лет Исследуемый материал Число образцов

1 (пожилой возраст) 65±2 пинеальная железа, тимус 15

2 (старческий возраст) 82±2 пинеальная железа, тимус 15

3 (долгожители) 93±2 пинеальная железа, тимус 12

всего 42

Диссоциированные культуры пинеалоцитов разделяли на 4 равные группы (п=80): 1 - контроль (введение физиологического раствора), 2 -введение норадреналина (НА) в концентрации 1 мкг/мл (положительный контроль), 3 - введение пептида AEDG в концентрации 100 нг/мл, 4 — введение пептида КЕ в концентрации 100 нг/мл. Обработку культур пептидами проводили в течение 3 ч. Диссоциированные культуры клеток тимуса человека и крысы разделили на 2 равные группы (n=20): 1 - контроль (введение физиологического раствора), 2 — введение пептида КЕ в концентрации 20 нг/мл.

Гистологический метод

Кусочки ПЖ и тимуса человека объемом 1 см3, полученные при аутопсии, фиксировали в 10% нейтральном забуференном растворе формалина (pH 7,2), обезвоживали с помощью автоматической станции проводки материала «Leica» TP1020 и заливали в парафин. Из парафиновых блоков на микротоме «Leica» 540М делали срезы толщиной 3 мкм.

Парафиновые срезы помещали на предметные стекла, покрытые поли-L-лизином («Sigma») и окрашивали гематоксилином и эозином по стандартной методике.

Методы клеточных культур

Органотипическое культивирование ПЖ и тимуса крыс проводи по описанной ранее методике [Чалисова Н.И. и др., 2005]. Сочетание методик по выделению и культивированию ПЖ крыс, разработанных проф. A.B. Арутюняном и проф. Н.И. Чалисовой [Чалисова Н.И. и др., 2005; Арутюнян A.B. и др., 2009], позволило создать адекватную модель для изучения влияния пептидов на ПЖ. В органотипической культуре объектом для исследования служил монослой клеток, находящихся в зоне роста культуры. В качестве питательной среды для органотипических культур клеток использовали среду с pH 7,2 следующего состава из расчёта на 100 мл: раствор Хенкса - 41 мл, среда Игла - 30 мл, сыворотка крови плодов коровы - 25 мл, глюкоза 40% - 1 мл, инсулин 2,5 мл и гентамицин 0,5 мл. Эксплантаты помещали по 10 штук в чашку Петри с коллагеновым покрытием (размер 3,5x2,5 мм, Jet Biofïl) и культивировали (5% С02, 36,7°С, 3 сут) в 3 мл питательной среды указанного состава.

Выделение первичной диссоциированной культуры клеток ПЖ и тимуса проводили на чашках, обработанных раствором желатина («Биолот»), Последующее культивирование (5% С02, 36,7°С) осуществляли во флаконах с обработанной поверхностью объемом 50 мл (JetBiofïl, 25 см2, «Биолот») в среде, содержащей 15% фетальной бычьей сыворотки, 82,5% RPMI, 1,5% HEPES, L-глутамин. Для пересева клеток использовали раствор трипсина-версена (3:1). Посевная концентрация составляла 5х103 клеток на флакон. Пассирование производили через 3 сут, когда культура достигала монослоя. Культивирование проводили до 3 пассажа, на котором клетки рассеивали на планшет и проводили иммуноцитохимическое окрашивание.

Иммуногисто- и иммуноцитохимический методы

Для иммуногисто- и иммуноцитохимического исследования использовали первичные моноклональные мышиные анти-человеческие антитела к CD4 (1:30, «Novocastra»), CD5 (1:30, «Novocastra»), CD8 (1:30, «Novocastra»), CD20 (1:30, «Novocastra»), MMP2 (1:60, «Novocastra»), MMP9 (1:60, «Novocastra»), AIF (1:30, «Novocastra»), P53 (1:50, «Dako»), Ki67 (1:50, «Dako»), CGRP (1:30, «Novocastra»), CXCL12 (1:50, «Dako»), pCREB (1:50, «Dako») и AANAT (1:50, «Dako»).

В качестве вторичных антител использовали универсальный набор, содержащий биотинилированные анти-мышиные и анти-кроличьи иммуноглобулины. Визуализацию окрасок проводили с применением комплекса авидина с биотинилированной пероксидазой (ABC-kit) с последующим проявлением пероксидазы хрена диаминобензидином (все реагенты от Novocastra).

Морфометрическое исследование и компьютерный анализ микроскопических изображений

Морфометрическое исследование аутопсийного материала и образцов культур клеток ПЖ и тимуса проводили с использованием системы компьютерного анализа микроскопических изображений, состоящей из микроскопа «Nikon Eclipse» Е400, цифровой камеры «Nikon» DXM1200, персонального компьютера на базе Intel Pentium 4 и программного обеспечения «Видеотест-Морфология 5.2». Морфометрию всех образцов проводили в одинаковых условиях (при одинаковой яркости и увеличении изображений). В каждом случае анализировали по 10 полей зрения при увеличении 200 для аутопсийного материала и по 4 поля зрения при увеличении 200 для культур клеток. Площадь экспрессии рассчитывали как отнощение площади, занимаемой иммунопозитивными клетками, к общей площади клеток в поле зрения и выражали в процентах. Оптическую плотность экспрессии измеряли в условных единицах (у.е.).

Метод молекулярного моделирования

Для исследования конформации пептидов использовали программу Hyperchem 8.2. Молекулярное моделирование комплекса ДНК с пептидами выполняли с использованием программного обеспечения Molecular Operating Environment 2012. Для проведения расчетов параметров взаимодействия пептидов КЕ и AEDG с промоторными участками генов CD4, CD8, CD20, ММР2, Р53, Ki67, CREB и CGRP использовали метод молекулярной механики. Результаты молекулярной динамики были получены в силовом поле ММ+ в 2 режимах: 1 - длительностью 1 пикосекунда (пс) с шагом 0,001 пс и температурой системы 310 К; 2 - методом отжига (simulated annealing), где начальная температура системы составила 1000 К, охлаждалась до 100 К и через 200 шагов доводилась до 0 К. Затем для предварительно отобранных конформаций проводили оптимизацию геометрии (градиент минимизации составлял 0,05 ккал/А-моль"1) и рассчитывали уточненную энергию полученных конформаций. Под энергией минимизации понимается наиболее энергетически выгодное состояние молекулы. В каждом режиме анализировали около 100 предварительных конформаций пептидов, а в дальнейшем из них выбирались наиболее энергетически выгодные ротамеры. Участки генов АТТТС, CATGG и GCAG моделировали с использованием структур ДНК из базы данных PDB: 2EZD, 1BUT, 1QMS. Влияние растворителя при расчете энергии минимизации комплекса ДНК-пептид учитывали в генерализованном борновском приближении с введением внутренней диэлектрической константы равной 1, а внешней - 80. Расчеты комплексов проводили в силовом поле AMBER99. Энергию связывания пептида с ДНК (ккал/моль) рассчитывали как разность энергий отдельных молекул ДНК и пептида и комплекса ДНК-пептид.

Статистическая обработка результатов исследования

Статистическая обработка экспериментальных данных включала в себя подсчет среднего арифметического, стандартного отклонения, доверительного интервала для площади экспрессии и оптической плотности каждого иммуногистохимического маркера в тканях ПЖ и тимуса человека и крыс и оптимальных конформационных характеристик пептидов и проводилась в программе «81айзиса 7.0».

Для оценки возрастной динамики иммуногистохимических показателей применялся критерий Пирсона. В тех случаях, когда корреляция между исследуемыми величинами не могла быть выявлена методом Пирсона, использовался критерий Спирмана. Для оценки того, насколько достоверно условия постановки эксперимента и выбранный вариант корреляционного анализа отражают механизмы молекулярных взаимоотношений в тканях ПЖ и тимуса при старении, был использован коэффициент детерминации который показывает, насколько хорошо аппроксимирующее уравнение описывает связь между зависимой величиной X (возрастом человека) и независимой функцией У (экспрессией иммуногистохимического маркера в ПЖ/тимусе). Коэффициент детерминации использовали только для оценки линейных зависимостей и рассчитывали как квадрат коэффициента линейной корреляции Пирсона.

После расчета значения коэффициента детерминации его переводили в проценты, и полученное значение показывало степень различия в значениях зависимой переменной X (возраст человека) от различий в независимой переменной У (экспрессия иммуногистохимического маркера в ПЖ/тимусе).

Таблица 2

_Шкала Чеддока__

количественная мера тесноты связи качественная характеристика силы связи

0,1-0,3 слабая

0,3-0,5 умеренная

0,5-0,7 заметная

0,7-0,9 высокая

0,9-0,99 очень высокая

Коэффициент детерминации может принимать значения в диапазоне от 0 до 1 по шкале Чеддока (табл. 2), причем, чем ближе к 1, тем лучше аппроксимирующее уравнение в сочетании с условиями постановки эксперимента описывает наблюдаемый результат.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Клеточное обновление в пинеальной железе и тимусе при старении

У лиц пожилого возраста площадь экспрессии Р53 в ПЖ была в 3,29 раза больше, чем в старческом возрасте (2 группа), и в 23 раза больше, чем у долгожителей (3 группа) (табл. 3). Коэффициент корреляции Спирмана между выборками из показателей площади экспрессии Р53 в ПЖ и возрастом составил -0,95, что свидетельствует о сильной связи между величинами. Зависимость между площадью экспрессии белка Р53 в ПЖ и возрастом описывается уравнением у = 2\5-е~0Мх, где х - возраст; у - площадь экспрессии белка Р53. Коэффициент детерминации был равен 0,62, что подтверждает предположение о том, что возраст является ведущим фактором в снижении экспрессии белка Р53 в ПЖ.

Площадь экспрессии Р53 в тимусе была достоверно выше в группе людей старческого возраста по сравнению с пожилыми людьми и долгожителями (табл. 3). Площадь экспрессии маркера митохондриально-опосредованного апоптоза AIF в клетках ПЖ у лиц старческого возраста была, соответственно, в 2,01 и 1,76 раза выше по сравнению с пожилыми людьми и долгожителями (табл. 3). Зависимость площади экспрессии AIF в ПЖ от возраста можно описать уравнением у = 0,1х-1, где х - возраст; у -площадь экспрессии белка AIF. При этом коэффициент корреляции Пирсона между выборками из показателей площади экспрессии AIF в ПЖ и возрастом составил 0,1, что свидетельствует о слабой связи между исследуемыми величинами. Коэффициент детерминации для указанной зависимости был равен 0,01.

Площадь экспрессии AIF в клетках тимуса была в 19,29 раза выше в группе людей старческого возраста по сравнению с пожилыми людьми, тогда как во 2 группе площадь экспрессии AIF в 1,93 раза ниже по сравнению с долгожителями (табл. 3). Зависимость между площадью экспрессии белка AIF в тимусе и возрастом описывается уравнением у = 0,13х-8,5, где х -возраст; у - площадь экспрессии белка AIF. Коэффициент детерминации был равен 0,54.

Таблица 3

Возрастная динамика экспрессии маркеров пролиферации (Кл67) и _апоптоза (Р53, АШ) в пинеальной железе и тимусе_

маркеры Площадь экспрессии, %

пинеальная железа тимус

пожилой возраст старческий возраст долгожители пожилой возраст старческий возраст долгожители

Ki67 0,38±0,09 0,54±0,12 0,19±0,03*# 0,58±0,07 0,19±0,03* 0,07±0,02*#

Р53 1,15±0,27 0,35+0,08* 0,05±0,01*# 4,51+0,11 9,32±0,43* 4,41±0,20#

AIF 4,54±1,15 9,12±1,04* 8,00±1,08* 0,07+0,02 1,35±0,02* 2,61±0,31*#

* - р<0,05 по сравнению с соответствующим показателем в пожилом возрасте,

# - р<0,05 по сравнению с соответствующим показателем в старческом возрасте.

Площадь экспрессии Кл67 в ПЖ в пожилом и старческом возрасте достоверно не различалась (табл. 3). У долгожителей площадь экспрессии маркера пролиферации Кл67 в ПЖ была в 2,84 раза меньше, чем в пожилом возрасте (табл. 3). Зависимость между площадью экспрессии Кл67 в ПЖ и возрастом людей носит линейный характер у = -0,02х+2, где х - возраст, у -площадь экспрессии Кл67 (рис. 1А). Коэффициент корреляции Пирсона между указанными величинами составил -0,22, а коэффициент детерминации -0,12.

В тимусе у пожилых людей площадь экспрессии Кл67 была в 3,05 раза выше по сравнению с группой лиц старческого возраста. У долгожителей площадь экспрессии Ю67 была в 8,29 раза меньше по сравнению с пожилыми людьми и в 2,71 раза ниже по сравнению с лицами старческого возраста (табл. 3).

А Б

■о

¡3

г £

I в

Рис. 1. Зависимость между площадью экспрессии пролиферотропного протеина К167 и возрастом: точки - экспериментальные данные, сплошная линия - аппроксимирующая прямая: А - в пинеальной железе, Б - в тимусе.

Зависимость площади экспрессии Ю67 в тимусе от возраста описана уравнением у = -0,04х+4, где х — возраст, у - площадь экспрессии ¥лв1 (рис. 1Б). Коэффициент корреляции Спирмана для этой зависимости составил -0,56. Отрицательное значение коэффициента Спирмана свидетельствует о снижении площади экспрессии Кл67 в тимусе с возрастом.

Роль нейропептида СвИР и матриксинов в поддержании гомеостаза пинеальной железы и тимуса при старении

Площадь экспрессии пептида СвЯР в ПЖ у пожилых людей и в старческом возрасте достоверно не различалась. У долгожителей данный показатель был в 1,63 раза ниже, чем у лиц старческого возраста (табл. 4). Зависимость между площадью экспрессии СОЯР в ПЖ и возрастом носит линейный характер у = 0,02х+3, где х - возраст, у - площадь экспрессии СО!1Р. Коэффициент корреляции Спирмана между указанными величинами составил 0,2, а коэффициент детерминации 0,04.

Площадь экспрессии пептида CGRP в тимусе в старческом возрасте была в 3,84 раза ниже по сравнению с пожилыми людьми, однако у долгожителей и пожилых людей этот показатель достоверно не изменялся (табл. 4). Зависимость между площадью экспрессии CGRP в тимусе и возрастом носит квадратичный характер у = -0,06х+6, где х - возраст, у -площадь экспрессии CGRP. Коэффициент корреляции Спирмана между указанными величинами составил -0,75, а коэффициент детерминации 0,61.

Площадь экспрессии маркера ремоделирования межклеточного матрикса ММР2 в ПЖ в старческом возрасте была в 2 раза ниже по сравнению с пожилыми людьми, а у долгожителей - в 1,95 раза ниже по сравнению со старческим возрастом (табл. 4). Зависимость между площадью экспрессии ММР2 в ПЖ и возрастом носит линейный характер у = -0,01х+1, где х - возраст, у - площадь экспрессии ММР2. Коэффициент корреляции Пирсона между указанными величинами составил -0,96, а коэффициент детерминации 0,92.

Площадь экспрессии ММР2 в тимусе в старческом возрасте была в 3,52 раза ниже по сравнению с пожилым возрастом, при этом данный показатель у лиц старческого возраста и долгожителей не различался (табл. 4). Коэффициент корреляции между площадью экспрессии ММР2 в тимусе и возрастом составил - 0,8, что свидетельствует о достоверном снижении экспрессии указанной металлопротеиназы при инволюции тимуса и может

_ Oí -0.06*

быть описано экспоненциальным уравнением у — ¿J-e , где х - возраст, у - площадь экспрессии ММР2. Коэффициент детерминации для приведенного уравнения составил 0,67.

Площадь экспрессии ММР9 в ПЖ снижалась соответственно в 1,91 и 2 раза в старческом возрасте и у долгожителей по сравнению с пожилыми людьми (табл. 4).

Таблица 4

Возрастная динамика экспрессии нейропептида CGRP и

металлопротеиназ (ММР2, ММР9) в пинеальной железе и тимусе

маркеры Площадь экспрессии, %

пинеальная железа тимус

пожилои возраст старческий возраст долгожители пожилой возраст старческий возраст долгожители

CGRP 4,49±0,59 5,98±0,74* 3,67±0,25*# 2,38+0,18 0,62±0,17* 0,97+0,15*

ММР2 0,43+0,08 0,22±0,04* 0,11±0,03*# 0,74+0,13 0,21±0,05* 0,16+0,03*

ММР9 0,35±0,09 0,18±0,04* 0,10±0,02*# 0,48+0,11 0,26±0,03* 0,24+0,03*

* - р<0,05 по сравнению с соответствующим показателем в пожилом возрасте,

# - р<0,05 по сравнению с соответствующим показателем в старческом возрасте.

) 100 Возраст, лет

о- 0.5

0.5

0.4

5 0.4

О ф 0.3

с па

о 0.2

& 0.2

э О 0.1

с 0.1

0.0

100

Возраст, лет

Рис. 2. Зависимость между площадью экспрессии металлопротеиназы ММР9 и возрастом: точки - экспериментальные данные, сплошная линия -аппроксимирующая прямая: А - в пинеальной железе, Б - в тимусе.

Коэффициент корреляции Пирсона между площадью экспрессии ММР9 в ПЖ и возрастом составил -0,88, что указывает на наличие отрицательной линейной зависимости, причем данная зависимость описывается тем же уравнением, что и для ММР2 (рис. 2А). Коэффициент детерминации для этого уравнения составил 0,77.

Площадь экспрессии ММР9 в тимусе у лиц старческого возраста была в 1,84 раза ниже, чем у пожилых людей, при этом данный показатель у лиц старческого возраста и долгожителей не различался (табл. 4). Коэффициент корреляции Пирсона между площадью экспрессии ММР9 в тимусе и возрастом составил -0,7, что свидетельствует о сильной отрицательной связи между исследуемыми величинами. Возрастное снижение экспрессии ММР9 в тимусе описывается уравнением у = -0,01х+0,7, где х - возраст, у - площадь экспрессии ММР9 (рис. 2Б). Коэффициент детерминации для полученной зависимости составил 0,46.

Общность лимфоидного компонента пинеальной железы и тимуса

при старении

Площадь экспрессии С020+ В-лимфоцитов в ПЖ в старческом возрасте снижалась в 2,08 раза относительно пожилых людей (табл. 5). Коэффициент корреляции Спирмана между площадью экспрессии С020 в ПЖ и возрастом составил -0,59, что свидетельствует об умеренной отрицательной связи между исследуемыми величинами. Возрастное снижение экспрессии маркера СБ20 в ПЖ описывается линейным уравнением у = -0,03х+3,6, где х -возраст, у - площадь экспрессии СЭ20. В тимусе площадь экспрессии СБ20 достоверно не различалась во всех 3 исследуемых группах (табл. 5).

В ПЖ площадь экспрессии СБ4+ клеток (Т-хелперов) у пожилых людей и в старческом возрасте достоверно не различалась. У долгожителей указанный параметр возрастал в 2,29 раза по сравнению с пожилыми людьми

(табл. 5). Усиление экспрессии маркера CD4 в ПЖ у долгожителей по сравнению с пожилыми людьми и лицами старческого возраста описывается уравнением у = 0,01х-0,2, где х — возраст, у - площадь экспрессии CD4. Площадь экспрессии цитотоксических Т-лимфоцитов (CD8+ клеток) в ПЖ с возрастом достоверно не изменялась (табл. 5). Повышение экспрессии маркера CD8 в ПЖ с возрастом описывается уравнением у = 0,06х-2,2, где х — возраст, у — площадь экспрессии CD8.

Площадь экспрессии CD4+ клеток в тимусе в старческом возрасте была в 1,71 раза ниже, чем в пожилом. У долгожителей площадь экспрессии CD4 была в 4,93 раза меньше по сравнению с группой лиц пожилого возраста, что свидетельствует о выраженном возрастном снижении способности тимуса поддерживать дифференцировку тимоцитов в Т-хелперы (табл. 5). Коэффициент корреляции Пирсона между возрастом и площадью экспрессии CD4+ клеток в тимусе составил -0,70, коэффициент детерминации для аппроксимирующего зависимость уравнения у = -0,1х+8, где, х - возраст, у -площадь экспрессии маркера CD4, составил 0,42. Площадь экспрессии CD8+ клеток в тимусе не различалась в пожилом и старческом возрасте, но была в 2,28 раза ниже у долгожителей (табл. 5).

Таблица 5

Возрастная динамика экспрессии маркеров лимфоцитов _в пинеальной железе и тимусе_

Площадь экспрессии, %

пинеальная железа тимус

маркеры пожилой старческий пожилой старческий

возраст возраст долгожители возраст возраст долгожители

CD4 0,31 ±0,07 0,34±0,08 0,71+0,14*# 2,70+0,54 1,58±0,18* 0,32+0,07*#

CD5 2,36±0,44 1,68±0,23 1,11±0,12*# 2,48±0,31 1,66±0,31 1,05±0,12*#

CD8 1,49+0,25 1,70±0,22 2,12±0,32*# 3,88+0,52 3,91±0,49 1,84+0,32*#

CD20 1,52±0,19 0,73±0,21* 1,01±0,19* 0,69±0,12 0,56±0,11 0,65±0,13

* - р<0,05 по сравнению с соответствующим показателем в пожилом возрасте,

# - р<0,05 по сравнению с соответствующим показателем в старческом возрасте.

Коэффициент корреляции Пирсона между возрастом и площадью экспрессии CD8+ клеток в тимусе составил -0,99, коэффициент детерминации для аппроксимирующего зависимость уравнения у=-0,09х+9,6, где, х — возраст, у - площадь экспрессии маркера CD8, составил 0,73. Площадь экспрессии маркера активированных лимфоцитов CD5 в ПЖ у пожилых людей и лиц старческого возраста достоверно не различалась. У долгожителей площадь экспрессии CD5 была в 2,12 раза меньше по сравнению с 1 группой (табл. 5). Коэффициент корреляции Пирсона между возрастом и площадью экспрессии CD5+ клеток в ПЖ составил -0,77, коэффициент детерминации для аппроксимирующего зависимость уравнения у = -0,07х+8, где, х — возраст, у - площадь экспрессии маркера CD5, составил 0,60 (рис. ЗА).

В ПЖ взаимосвязь между площадью экспрессии маркера зрелых В-лимфоцитов CD20 и площадью экспрессии CD5 была сильно выражена, о чем свидетельствует высокое значение коэффициентов корреляции Спирмана и детерминации (табл. 6). Вероятно, большинство В-клеток в ПЖ коэкспрессируют CD5+ и являются активированными. Изучение зависимостей числа CD4+ и CD8+ клеток в ПЖ от количества CD5+ лимфоцитов показало, что эти параметры имеют слабую корреляционную тенденцию, а стремящееся к нулю значение коэффициента детерминации свидетельствует, что CD4+ Т-хелперы и CD8+ цитотоксические Т-лимфоциты в незначительной степени экспрессируют маркер активации лимфоцитов CD5 (табл. 6).

Площадь экспрессии маркера активированных лимфоцитов CD5 в тимусе в старческом возрасте была в 1,49 раза ниже по сравнению с пожилыми людьми.

А Б

Рис. 3. Зависимость между площадью экспрессии активированных лимфоцитов CD5 и возрастом: точки - экспериментальные данные, сплошная линия - аппроксимирующая прямая: А - в пинеальной железе, Б - в тимусе.

При этом у долгожителей площадь экспрессии CD5 в тимусе была в 1,58 раза меньше по сравнению с лицами старческого возраста (табл. 5). Коэффициент корреляции Пирсона между возрастом и площадью экспрессии CD5 в тимусе составил -0,93, коэффициент детерминации для описывающего эту зависимость уравнения у = -0,3х+30, где, х - возраст, у - площадь экспрессии маркера CD5, составил 0,87 (рис. ЗБ).

В тимусе взаимосвязь между площадью экспрессии CD20 и площадью экспрессии CD5 была умеренно выражена, о чем свидетельствует низкое значение коэффициента корреляции Пирсона, равное 0,59 (табл. 7).

Таблица 6

Характеристики зависимостей между экспрессией различных маркеров _иммунных клеток в пинеальной железе человека _

объединенные возрастные группы сравниваемые показатели площади экспрессии коэффициент корреляции характер зависимости между величинами коэффициент детерминации

пожилой, старческий возраст, долгожители CD20 CD5 0,99 сильная 0,99

пожилой, старческий возраст, долгожители CD4 CD5 0,30 слабая 0,09

пожилой, старческий возраст, долгожители CD 8 CD5 0,07 слабая 0,005

Таблица 7

Характеристики зависимостей между экспрессией различных маркеров _иммунных клеток в тимусе человека__

пожилой, старческий возраст, долгожители CD20 CD5 0,59 умеренная 0,34

пожилой, старческий возраст, долгожители CD4 CD5 0,78 сильная 0,60

пожилой возраст CD8 CD5 0,92 сильная 0,85

старческий возраст, долгожители CD8 CD5 0,80 сильная 0,64

у = 0.1 2Х

R! = 0.21 ♦

♦

♦ ♦

♦

^-♦---

О 2 4 6 8 (О

Площадь экспрессии CD5, %

Рис. 4. Зависимость между площадью экспрессии активированных лимфоцитов CD5 и площадью экспрессии В-лимфоцитов CD20 в тимусе: точки - экспериментальные данные, сплошная линия - аппроксимирующая прямая.

Полученные данные показали, что у людей старше 60 лет в тимусе снижается количество активированных CD5+ клеток, причем с возрастом этот процесс ускоряется (рис. 4, табл. 7). Вероятно, 12% от общего числа CD5' клеток составляют CD20+ В-лимфоциты. Еще 12% от общего числа CD5 клеток приходится на Т-хелперы. Процесс активации цитотоксических Т-лимфоцитов в тимусе различался у пожилых людей и у лиц старше 74 лет. В пожилом возрасте 70% CD5+ клеток экспрессировали маркер цитотоксических Т-клеток, тогда как у людей старше 74 лет только 54% активированных клеток коэкспрессировали маркер CD8.

Пептидергическая регуляция активации, пролиферации и апоптоза клеток пинеальной железы и тимуса при старении

Влияние пептидов на активацию лимфоцитов пинеальной железы и тимуса Среди пептидов КЕ, ЕБЯ и АЕБО наибольший эффект на численность СБ5+ клеток в культуре ПЖ молодых и старых крыс оказывал пептид ВСЕ, причем его эффект определялся возрастными особенностями ткани ПЖ (рис. 5А).

А Б

Площадь экспрессии CD5 в пинеальной железе, %

" L,

контроль КЕ | молодые

EDR

AEDG

старые

Площадь экспрессии CD5 в тимусе, % 0.9 #

о,aj-1-

:Г «Щ

0.5--, В!-

°<ч—

0,2-г-I Я

^ ш

0,1-_-1■'■■■; '-,.■

0-Е5шИ1--i----ш

1Л

шЩл I

............. —I

контроль молодые

КЕ

AEDG старые

Рис. 5. Влияние пептидов на площадь экспрессии маркера активированных лимфоцитов CD5 в органотипических культурах клеток молодых и старых крыс: А - пинеальная железа, Б - тимус.

* - р<0,05 по сравнению с аналогичным показателем у молодых животных, #- р<0,05 по сравнению с аналогичным показателем в контроле.

Так, в культурах клеток ПЖ, полученных от молодых животных, пептид КЕ подавлял экспрессию маркера CD5 в 4,74 раза, что свидетельствует о снижении активации лимфоцитов, тогда как в «старых» культурах пептид КЕ, напротив, усиливал экспрессию CD5 в 9,37 раза (рис. 5А), что указывает на стимуляцию активации лимфоцитов. Пептид EDR способствовал повышению площади экспрессии CD5 в культурах клеток ПЖ,

полученных от старых крыс, но не влиял на этот показатель в культурах клеток, полученных от молодых животных (рис. 5А).

Пептиды КЕ, AEDG - в большей степени и пептид EDR - в меньшей степени, усиливали активацию лимфоцитов в культурах клеток тимуса, полученных от молодых и старых крыс (рис. 5Б). Влияние пептида КЕ, тропного к клеткам тимуса, на активацию лимфоцитов в ПЖ, и усиление экспрессии CD5 под влиянием пептида AEDG, тропного к ткани ПЖ, могут свидетельствовать о том, что процессы иммуногенеза в ПЖ и тимусе при старении организма тесно связаны между собой.

Влияние пептидов на Т-хелперы пинеальной железы и тимуса

Среди исследуемых пептидов только КЕ способствовал увеличению числа CD4+ клеток в культурах клеток ПЖ, полученных от молодых и старых животных, соответственно, в 5,23 и 2,31 раза (рис. 6А).

А Б

%Г

Площадь экспрессии CD4 в пинеальной железе,

_*_

* # —г™!

# *—

контроль КЕ

молодые

EDR

AEDG

старые

Плоицадь экспрессии CD4 в тимусе, %

; -

контроль

молодые

EDR

AEDG

старые

Рис. б. Влияние пептидов на площадь экспрессии маркера Т-хелперов С04 в органотипических культурах клеток молодых и старых крыс: А - пинеальная железа, Б - тимус.

На аутопсийном материале тимуса человека было показано, что число Т-хелперов в нем у людей старше 60 лет снижалось, однако в органотипических культурах тимуса старых крыс ни один из изученных пептидов (КЕ, ЕОЯ, АЕОС) не способствовал увеличению количества СГ)4 клеток в тимусе (рис. 6Б). Следовательно, возрастное снижение числа Т-хелперов, наблюдаемое в ПЖ и тимусе, может быть восстановлено под действием пептида КЕ в ПЖ, но, вероятно, является необратимым в тимусе.

Влияние пептидов на цитотоксические Т-лимфоциты пинеальной железы и тимуса В ПЖ молодых и старых крыс увеличение количества цитотоксических Т-лимфоцитов происходит под действием пептида КЕ соответственно в 11,03

Площадь экспрессии CD8 в тимусе, %

EDR

AEDG

старые

контроль □ молодые

и 7,89 раза, тогда как пептиды ЕОЯ и АЕОО не обладают таким эффектом (рис. 7А).

А Б

Рис. 7. Влияние пептидов на площадь экспрессии маркера цитотоксических Т-лимфоцитов CD 8 в органотипических культурах клеток молодых и старых крыс: А - пинеальная железа, Б - тимус.

В тимусе, для которого характерно возрастное снижение числа цитотоксических Т-клеток, стимулирующим эффектом в отношении численности данной субпопуляции лимфоцитов обладали все изученные пептиды: КЕ, EDR и AEDG (рис. 7Б).

Влияние пептидов на В-лимфоциты пинеальной железы и тимуса

Из всех исследуемых пептидов на экспрессию маркера CD20 в органотипических культурах ПЖ молодых и старых крыс наибольшее влияние оказывал пептид КЕ. Так, в культурах клеток ПЖ молодых животных площадь экспрессии CD20 возрастала в 24,32 раза, (рис. 8А). В культурах клеток ПЖ старых крыс пептид КЕ увеличивал площадь экспрессии CD20 в 26,57 раза (рис. 8А). Пептиды EDR и AEDG повышали площадь экспрессии маркера CD20 в культурах клеток ПЖ, полученных от молодых крыс, но практически не влияли на этот показатель в культурах, полученных от старых животных (рис. 8А).

В культурах клеток тимуса молодых и старых крыс стимулирующий эффект на экспрессию В-лимфоцитов оказывали пептиды EDR и AEDG. Площадь экспрессии маркера CD20 в культурах клеток тимуса молодых животных увеличивалась, соответственно, в 1,65 и 2,42 раза (рис. 8Б). В культурах клеток тимуса старых животных под влиянием пептидов EDR и AEDG этот показатель возрастал, соответственно, в 4,50 и в 2,51 раза (рис. 8Б).

Пдощадь экспрессии СП20 в пинеал ьной железу %

-- #

контроль КЕ молодые

Площадь экспрессии СР20 в тимусе.

контроль КЕ П молодые

ЕОИ

ДЕОв

I старые

Рис. 8. Влияние пептидов на площадь экспрессии маркера В-лимфоцитов С020 в органотипических культурах клеток молодых и старых крыс: А -пинеальная железа, Б - тимус.

Изучение пептидергической регуляции экспрессии маркера С020 в ПЖ и тимусе при старении показало, что в ПЖ увеличение продукции В-клеток происходит под действием пептида КЕ и более выражено в сравнении с тимусом, в котором наибольшим эффектом обладал пептид АЕОО.

Влияние пептидов на каспаза-зависимый апоптоз в пинеальной железе и тимусе

В культурах клеток ПЖ, полученных от молодых и старых крыс, пептид КЕ снижал площадь экспрессии Р53, соответственно, в 6,55 и 14,92 раза по сравнению с контролем (рис. 9А). Пептид ЕОЛ снижал площадь экспрессии Р53 культурах клеток ПЖ молодых и старых крыс, соответственно, в 8,43 и в 6,10 раза (рис. 9А). Пептид АЕОО оказывал разнонаправленное действие на апоптоз в культурах клеток ПЖ, полученных от молодых и старых животных. В культурах клеток ПЖ молодых крыс пептид АЕОО повышал площадь экспрессии Р53 в 3,89 раза и способствовал снижению данного показателя в культурах клеток старых крыс в 5,94 раза (рис. 9А).

Установлено, что в тимусе у людей в старческом возрасте уровень экспрессии протеина Р53 возрастал, при этом пептиды КЕ, Е1Ж и АЕОО способствали его снижению в культуре клеток тимуса молодых и старых крыс. Пептиды КЕ, ЕОЫ и АЕОО снижали площадь экспрессии Р53 в органотипических культурах клеток тимуса молодых и старых крыс в 2-8 раза по сравнению с контролем (рис. 9Б).

Площадь экспрессии Р53 в тимусе, %

Рис. 9. Влияние пептидов на площадь экспрессии маркера каспаз-зависимого апоптоза Р53 в органотипических культурах клеток молодых и старых крыс: А - пинеальная железа, Б - тимус.

Наиболее выраженным антиапоптотическим эффектом в отношении органотипической культуры клеток тимуса молодых и старых крыс обладал пептид АЕБО (рис. 9Б).

Влияние пептидов на дифференцировку, пролиферацию и апоптоз в диссоциированной культуре клеток тимуса

Введение в культуру клеток тимуса пептида ICE в 1,42 раза увеличивло экспрессию маркера пролиферации Ki67 и в 1,64 раза - маркера дифференцировки CXCL12 по сравнению с контролем (введение физиологического раствора) (рис. 10). Площадь экспрессии апоптозного белка Р53 под действием пептида КЕ уменьшалась в 1,97 раза по сравнению с контролем (рис. 10).

Площадь экспрессии маркера CD4 в культуре клеток тимуса крысы имела тенденцию к повышению, но достоверно не изменялась под действием пептида КЕ (табл. 8). В культуре клеток тимуса эмбриона человека под влиянием пептида КЕ площадь экспрессии трансмембранного гликопротеина CD4 возрастала на 56% по сравнению с контролем (табл. 8). Площадь экспрессии маркера CD8 в культурах клеток тимуса крысы и эмбриона человека под действием пептида КЕ также имела тенденцию к увеличению (табл. 8). Из исследуемых маркеров пептид КЕ оказывал наибольшее воздействие на экспрессию молекулы CD5, что свидетельствует о его влиянии на процессы дифференцировки клеток тимуса и подтверждается индукцией экспрессии маркера CXCL12. Под действием дипептида КЕ площадь экспрессии маркера CD5 в культурах клеток тимуса крысы и

эмбриона человека возрастала, соответственно, в 1,78 и 1,45 раза по сравнению с контролем (табл. 8).

К ¡67 CXCL12 Р53

□ контроль □ КЕ

Рис. 10. Влияние дипептида КЕ на экспрессию маркеров пролиферации (Ю67), дифференцировки (СХСЫ2) и апоптоза (Р53) в диссоциированной культуре клеток тимуса крысы.

* - р<0,05 по сравнению с соотвествующим показателем в контроле.

Таблица 8.

Влияние пептида КЕ на экспрессию маркеров иммунных клеток в диссоциированных культурах клеток тимуса человека и животных

Группа Маркеры, площадь экспрессии

Тимус крысы Тимус плода человека

CD4 CD8 CD5 CD4 CD8 CD5

Контроль 2,62±0,38 1,96±0,31 2,05±0,31 2,36±0,24 2,24±0,35 1,94±0,24

Пептид КЕ 3,17±0,51 2,26±0,24 3,64±0,51* 3,10±0,31* 2,86±0,28 2,82±0,37*

* - р<0,05 по сравнению с соответствующим контролем

Таким образом, пептид КЕ в первичных диссоциированных культурах клеток тимуса крысы и эмбриона человека стимулировал экспрессию маркера пролиферации Ki67, маркеров активации и дифференцировки иммунных клеток CXCL12, CD5, CD4 и снижал экспрессию апоптозного белка Р53, что коррелирует с данными, полученными в органотипических культурах молодых и старых животных.

Пептидергическая регуляция экспрессии сигнальных молекул пинеальной железы при старении

Влияние пептидов на митохондриально-опосредоаванный апоптоз

в пинеальной железе Пептид АН ОС не влиял на экспрессию АН7 в культурах ПЖ молодых животных, однако достоверно увеличивал площадь экспрессии А№ в 38,21 раза в культурах клеток ПЖ, полученных от старых крыс (рис. 11). Пептиды КЕ и 1ХЖ не влияли на экспрессию АН ' в культурах клеток ПЖ (рис. 11).

Площадь экспрессии А1Р в пинеальнои железе, %

[1- X

* * * * ЙИ

контроль КЕ ЕОР? АЕОО КЕО

□ молодые и ^рые

Рис. 11. Влияние пептидов на площадь экспрессии маркера митохондриально-опосредованного апоптоза АШ в органотипической культуре клеток пинеальной железы молодых и старых крыс. * - р<0,05 по сравнению с аналогичным показателем у молодых животных, #- р<0,05 по сравнению с аналогичным показателем в контроле.

Пептид КЕБ не влиял на экспрессию А1К в культурах клеток ПЖ молодых крыс, однако способствовал увеличению этого показателя в 7,83 раза в культурах клеток ПЖ, полученных от старых животных (рис. 11). При старении в ПЖ человека и крыс интенсивность митохондриально-опосредованного апоптоза снижалась, что может являться причиной накопления поврежденных, мутантных и функционально неактивных клеток. Пептид АЕБС, тропный к клеткам ПЖ, способен частично восстанавливать экспрессию маркера митохондриально-опосредованного апоптоза АН7, в меньшей степени сходным эффектом обладает пептид КЕО.

Влияние пептидов на экспрессию нейропептида ССЯР в пинеальной железе Пептид КЕ увеличивал площадь экспрессии СОШ3 в 4,73 раза в культурах клеток ПЖ, полученных от старых животных, но не влиял на этот показатель в культурах клеток молодых крыс (рис. 12). Пептид АЕОй обладал наиболее выраженным стимулирующим действием на экспрессию нейропептида ССЛР в культурах клеток ПЖ молодых и старых крыс.

Площадь экспрессии ССИР в пинеальной железе, %

# *

контроль КЕ ЕОК АЕРО КЕО

□ молодые 1 старые

Рис. 12. Влияние пептидов на площадь экспрессии нейропептида СОЯР в органотипических культурах клеток пинеальной железы молодых и старых крыс.

В культурах клеток ПЖ, полученных от молодых и старых крыс, под действием пептида АЕОв площадь экспрессии СО!1Р увеличивалась, соответственно, в 6,74 раза и 19,33 раза (рис. 12). Пептид КЕЭ полностью (до нулевого уровня) подавлял экспрессию транскрипционного фактора СвЯР в культурах клеток ПЖ старых животных и не влиял на данный показатель в культурах клеток ПЖ, полученных от молодых крыс (рис. 12).

Влияние пептидов на пролиферацию в клетках пинеальной железы

В контрольных культурах клеток ПЖ старых животных площадь экспрессии Кл67 снижалась в 6,92 раза по сравнению с культурами клеток, полученными от молодых животных (рис. 13). Снижение с возрастом пролиферативной активности клеток ПЖ у крыс носит тот же выраженный характер, который мы наблюдали на аутопсийном материале ПЖ человека. Пептид КЕ увеличивал площадь экспрессии ¥Л61 в культурах клеток ПЖ старых животных в 14,87 раза, но не влиял на культуры клеток молодых животных (рис. 13). Пептид ЕОЯ увеличивал площадь экспрессии ¥Л61 в культурах клеток ПЖ, полученных от молодых и старых животных, соответственно, в 1,73 и 18,32 раза (рис. 13). Из всех изученных пептидов АЕБО обладал наиболее сильным стимулирующим эффектом на площадь экспрессии маркера пролиферации К167 в культурах клеток ПЖ, полученных от молодых и старых крыс (рис. 13). В культурах клеток ПЖ молодых животных под влиянием пептида АЕОС площадь экспрессии Ю67 возрастала

в 2,89 раза, а в культурах клеток ПЖ старых животных - в 39,84 раза (рис. 13).

б Площадь экспрессии К167 в пинеальной железе, %

—ц-

—т-

контроль КЕ О молодые

■

#1*

АЕО<3 КЕО | старые

Рис. 13. Влияние пептидов на площадь экспрессии маркера пролиферации Кд67 в органотипической культуре клеток пинеальной железы молодых и старых крыс.

Пептид КЕБ не влиял на площадь экспрессии Кл67 в органотипических культурах ПЖ молодых крыс, но увеличивал площадь экспрессии К167 в 2,81 раза в культурах клеток ПЖ старых животных. Следовательно, из всех изучаемых пептидов стимуляторами пролиферации клеток ПЖ являются ДЕОв и ЕВЫ, причем эффект первого пептида выражен более сильно.

Влияние пептидов на синтез металлопротеиназ в пинеальной железе

Пептид ЛЕИв повышал площадь экспрессии ММР9 в культурах клеток ПЖ, полученных от молодых и старых крыс, соответственно, в 1,34 и в 1,97 раза (рис. 14).

Пептид ЕОЯ снижал площадь экспрессии ММР9 в культурах клеток ПЖ молодых крыс в 1,86 раза и не влиял на этот показатель у старых крыс (рис. 14). Пептиды КЕ и КЕБ не влияли на экспрессию ММР9 в культурах клеток ПЖ, полученных от молодых и старых животных (рис. 14).

Возрастное снижение экспрессии ММР9, осуществляющей ремоделирование межклеточного матрикса в ПЖ человека и крыс, свидетельствует о нарушении межклеточных взаимодействий, процессов дифференцировки и пролиферации клеток в процессе старения.

Рис. 14. Влияние пептидов на площадь экспрессии металлопотеиназы ММР9 в органотипической культуре клеток пинеальной железы молодых и старых крыс.

Из всех исследуемых пептидов повышение экспрессии ММР9 в культуре клеток ПЖ молодых и старых животных наблюдалось только под влиянием пептида AEDG.

Влияние пептидов на синтез мелатонина в пинеальной железе

Норадреналин (НА, положительный контроль) способствовал повышению экспрессии pCREB (cyclic AMP-responsive element-binding protein) в культуре пинеалоцитов при инкубации в течение 1 и 2 ч., соответственно, в 16,13 и 15,82 раз, а при инкубации в течение 3 ч - в 4,53 раза (табл. 9). Пептид AEDG способствовал стабильной стимуляции экспрессии pCREB в 4 раза в течение всего времени инкубации (табл. 9). При действии пептида КЕ в течение 1 ч экспрессия pCREB увеличивалась в 6,84 раза, тогда как при инкубации в течение 2 и 3 ч экспрессия данного транскрипционного фактора снижалась до уровня контроля (табл. 9). Полученные данные свидетельствуют о том, что введение в культуру пинеалоцитов НА и пептида КЕ вызывает кратковременное усиление экспрессии pCREB, тогда как под действием пептида AEDG этот эффект сохраняется в течение более длительного периода.

Пептид КЕ способствовал повышению экспрессии фермента AANAT (арилалкиламин-1М-ацетилтрансферазы) при инкубации в течение 1 ч (табл. 10). Однако увеличение времени инкубации показало кратковременность эффекта пептида КЕ на экспрессию AANAT. Пептид AEDG увеличивал экспрессию AANAT во все сроки инкубации и по своей силе был выше в сравнении с действием НА (табл. 10).

Таблица 9

Влияние пептидов на экспрессию рСБШВ в диссоциированной культуре клеток пинеальной железы

время инкубации, ч оптическая плотность экспрессии, у.е.

контроль НА АЕБО КЕ

1 5,1±0,4 82,3±12,2* 20,8±3,1* 34,9±6,2*

2 5±0,3 79,1±12,0* 17,1±3,3* 6,9±1,1

3 4,3±0,3 19,5±3,4 20,6±1,8* 6,7±0,9

* - р< 0,05 — по сравнению с соответствующим показателем в контроле.

Таблица 10

Влияние пептидов на экспрессию ААКАТ

оптическая плотность экспрессии, у.е.

время инкубации, ч контроль НА АЕБО КЕ

1 7,0±1,1 11±0,8* 9,0±2,1 5,6±0,7

2 9,1±0,9 10,1±1,0 12,8±0,9* 8,4±1,4

3 8,7±1,3 11,7±0,7* 12,0±0,8* 8,5±1,2

* - р< 0,05 - по сравнению с соответствующим показателем в контроле.

Таким образом, значительным влиянием на экспрессию транскрипционного фактора рСИЕВ и фермента ААИАТ в культуре пинеалоцитов обладает АЕОС - пептид, тропный к клеткам ПЖ. Следовательно, в основе пептидной регуляции активности клеток ПЖ может лежать влияние пептида АЕБО (в большей степени) и пептида КЕ (в меньшей степени) на фермент ААИАТ и транскрипционный фактор рСЯЕВ.

Модель взаимодействия пептидов с промоторными участками генов сигнальных молекул пинеальной железы и тимуса

При расчетах взаимодействия пептидов КЕ и АЕБО с молекулой ДНК исходили из того, что, она имеет правоспиральную ориентацию основной цепи и находится в В-форме. На молекулярной поверхности двойной спирали различали большую и малую бороздки, шириной 2,1 нм и 1,2 нм, соответственно.

Рис. 15. Локализация пептидов в предполагаемых центрах связывания промоторной части генов: А - локализация АЕЭС в участке ДНК 5'-В(СССАААТТССТС)-3' (РОВ: 2К2П)); Б - локализация КЕ в участке ДНК 5'-Б( ОСА ССТТССТОС)- 3' (РЕ) В: К^УЕ). Пунктиром изображены молекулярные оболочки пептидов. Буквами обозначены азотистые основания ДНК: А - аденин, Т - тимин, в - гуанин, С - цитозин.

А Б

Рис. 16. Взаимодействие пептидов с азотистыми основаниями ДНК: А -взаимодействие АЕВв с последовательностью АТТТС, Б - взаимодействие КЕ с последовательностью ОСАО. Пунктиром обозначены водородные связи между атомами пептидов и ДНК, жирными линиями выделены азотистые основания ДНК, образующие с пептидом водородные сети. Буквами обозначены азотистые основания (А - аденин, Т - тимин, й - гуанин, С -цитозин) и атомы пептидов (Ы - азот, О - кислород).

Установлено, что пептиды АЕВв и КЕ взаимодействуют с ДНК, связываясь с ее большой канавкой (рис. 15). Положение связываемых

пептидов оказалось дискретно фиксированным. Возможность свободно-непрерывного перемещения вдоль канавки отсутствала. Шаг пептидной цепи в р-конформации, приходящийся на одну аминокислоту, был равен 0,35 нм, а расстояние между парами оснований в цепи ДНК составило 0,34 нм.

На рисунке 16 показаны найденные модели взаимодействия пептидов АЕОву и КЕ с их селективными сайтами связывания. Видно, что взаимодействие пептида АЕОО с последовательностью АТТТС и комплементарной ей ТЛААв осуществлялось за счет вандерваальсовых, электростатических взаимодействий и образования водородных связей между функциональными группами обеих молекул. Энергия образования комплекса составила 10,3 ккал/моль.

Найдена сеть четырех водородных связей, образованная атомами кислорода основной цепи аланина и азотосодержащего фрагмента аденина, карбоксильной группой боковой цепи глутаминовой кислоты и азотосодержащего фрагмента тимина, карбоксильной группой боковой цепи аспарагиновой кислоты и азотосодержащего фрагмента аденина, карбонильной группой основной цепи глицина и атомом кислорода цитозина (рис. 16 А). При взаимодействии КЕ с последовательностью вСЛв и комплементарной ей ССГС найдено три водородные связи: аминогруппа основной цепи лизина образует водородные связи с атомом кислорода гуанина и азотом цитозина, а карбоксильная группа основной цепи глутаминовой кислоты образует водородную связь с атомом азота аденина (рис. 16 Б). Энергия связывания этого пептида составила 11 ккал/моль. Таким образом, энергии взаимодействия пептидов КЕ и АЕБО имели близкие значения, соответственно, 11,0 и 10,3 ккал/моль. Сходные значения энергии связывания пептидов могут свидетельствовать о близкой фармакодинамической активности рассматриваемых веществ. Полученные абсолютные значения энергии взаимодействия лигандов с ДНК были близки к значениям энергий, типичным для веществ, обладающих выраженным биологическим действием в отношении своих мишеней.

Сконструированные модели взаимодействия пептидов КЕ и АЕБО с двойной спиралью ДНК являются важным аспектом для понимания их взаимодействия с некоторыми генами и синтеза соответствующих белков. Так, последовательность вСАв, с которой по данным моделирования связывается пептид КЕ, и последовательности АТТТС, ОТТТС и СТТТС, комплементарные пептиду АЕОО, обнаружены в промоторной зоне м!ША генов, кодирующих белки С020, СБ4, ММР2, р53, К167, СвЯР, СЯЕВ (табл. 11).

В различных генах обнаружено один или несколько сайтов связывания для исследуемых пептидов. Так, например, в гене CD4 для пептида КЕ обнаружено 4 сайта связывания, а для пептида АЕОО только один, что может служить объяснением более выраженного иммуномодулирующего действия пептида КЕ в отношении Т-клеточного звена. Кроме того, пептид АЕОО имеет 3 сайта связывания с геном белка К67 и только один — с

проапоптотическим геном р53, что указывает на его ключевую роль в регуляции процессов пролиферации и менее выраженное действие на механизмы каспаз-зависимого апоптоза.

Таблица 11

Сайты связывания пептидов АЕБО и КЕ в промоторных участках генов

Название mRNA гена Локализация возможных сайтов связывания гена с пептидом

CD20 (human) 1 cctcaatgac actcatggag gaaatgctga gagaagcatt cagatgcatg acacaaggta 61 agacigccaa aaatcttgtt cttgctctcc tcattttgtt atttgtttta tttttaggag 121 ttttgagagc aaa

CD4 (human) 1 caagcccaga gcccteccat ttctgtgggc tcaggtccct acfectcagc cccttcctcc 61 ctcggcaagg ccacaatgaa ccggggagtc ccttttaggc acttgcttct ggtgcigcaa 121 ctggcgctcc tcccagcagc cactcaggga

ММР2 (rat) 1 ctmcg/ctiz cccgccctte tttccgctgc atccagactt ccccgggtgg ctggaggctc 61 tgtgtgcatc cagaacttta gatatacaaa gggattacta ggacctecaa gcacccjecaj? 121 ccgtggtgcg tactggtacg tgggatcccg ttatgagacc ctgagcccgg agaagctgag 181 gcaattgagta aaggggtctc agaacgccgt ggagagcag gcgccagccg ggtggacccc 241 agggcacagcc agcgacctca gggtgacacg cggagcccg ggagcgcaag g

CD8 beta (human) 1 gcgactgtct ccgccgagcc cccggggcca ggtgtcccgg gcgcgccacg atgcggccgc 61 ggctgtggct cctcctggcc gcgcagctga cagttctcca tggcaactca gtc

P53 (human) 1 ggcacgagcc accgfccagg gagcaggtag ctgctgggct ccggggacac tttgcgttcg 61 ggctgggagc gtgctttcca cje«o?gtgac acgcttccct ggattge«ue ccagactecc 121 ttccgggtca cigcc

Ki67 (human) 1 ctaccgggcg gaggtgagcg cggcgccggc tcctcc/gcg gcggactttg ggtgcgactt 61 gacgagcggt ggttcgacaa gtggccttgc gggccggatc^icccagtgg aagagttgta 121 aatttgcttc tggccttccc ctacggatta tacctggcct tcccctacgg attatactca 181 acttactstt tagaaa

CREB (human) 1 ggaattccgc ggagtgttgg tgagXgacgc ggcggaggtg tagtttgacg cggtgtgtta 61 cgtgggggag agaataaaac tccagcgaga tccgggccgt gaacgaaagc agtgacggag 121 gagcttgtac caccggtaac taa

CGRP (human) 1 gactecejegt gtggtgttca tcccgggtcg accggccgct cgcgcteccc tgaaactcta 61 gtcgccagag aggcggc

Жирным курсивом и нижним подчеркиванием отмечены предполагаемые участки связывания пептидов с генами. Промоторные части генов взяты из базы данных ОепВапк (1ЧСВ1), цифрами обозначены порядковые номера нуклеотидов в гене. Курсивом отмечены возможные сайты связывания пептида КЕ, а подчёркиванием - с АЕБО.

При этом пептид КЕ, имеющий по 3 сайта связывания на генах, кодирующих белки Ki67 и р53, обладает, вероятно, одинаковым регуляторным действием в отношении процессов пролиферации и апоптоза.

Пептиды AEDG и КЕ имеют по 4 сайта связывания для гена ММР2, что свидетельствует о равнозначности регуляторной способности данных пептидов в отношении процессов ремоделирования межклеточного матрикса. В отношении регуляторной способности синтеза нейропептидов CREB и CGRP пептид КЕ, вероятно, обладает более высокой активностью в сравнении с AEDG, однако следует учитывать, что данные эффекты зависят от типа ткани, на которую действует пептид.

Интересно отметить, что для гена CD8 не было найдено ни одного сайта связывания с исследуемыми пептидами, вероятно, для этого белка характерен другой тип пептидной регуляции, не ассоциированный с взаимодействием пептид-ДНК.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Пептидергические механизмы регуляции функций ПЖ и тимуса играют важную роль в процессе старения организма [Anisimov V.N., Khavinson V.Kh., 2010; Reiter R.J. et al.,2010]. Морфологические признаки старения в ПЖ менее выражены по сравнению с тимусом, что совпадает с результатами проведенного нами гистологического изучения ПЖ и тимуса человека. Признаки возрастной инволюции ПЖ становятся заметными при переходе от пожилого к старческому возрасту, тогда как жировая атрофия тимуса ярко выражена у лиц старше 30 лет. Первая часть нашего исследования была посвящена верификации общих сигнальных молекул, отражающих взаимосвязь между ПЖ и тимусом при старении.

Пролиферативная способность клеток ПЖ и тимуса, оцениваемая по экспрессии ядерного протеина Ki67, сохраняется в обоих органах у людей старше 60 лет. При этом в ПЖ у лиц пожилого и старческого возраста способность пинеалоцитов к пролиферации не изменяется, а у долгожителей способность клеток ПЖ к делению снижается. В тимусе пролиферативная активность клеток снижается в 8 раз при переходе от пожилого к старческому возрасту, та же тенденция сохраняется и у долгожителей. Сравнивая пролиферативную способность клеток ПЖ и тимуса, можно сделать вывод о том, что пинеалоциты сохраняют способность к делению в пожилом и старческом возрасте, тогда как клетки тимуса быстро теряют свой пролиферативный потенциал к 30 годам.

Другим процессом, свидетельствующим о возрастной инволюции органа, является усиление апоптоза. Нами были изучены 2 маркера, характеризующих программированную клеточную гибель - Р53 и AIF. Установлено, что в ПЖ и тимусе апоптоз может развиваться в соответствии с 2 независимыми механизмами: по каспаза-зависимому и митохондриально-опосредованному пути. В ПЖ и тимусе интенсивность каспаза-зависимого апоптоза, оцениваемого по экспрессии белка Р53, с возрастом не изменялась. В то же время митохондриально-опосредованный апоптоз, реализуемый при

участии белка АП7, в тимусе в старческом возрасте и у долгожителей усиливался.

Установлено, что нейропептид СвЯР, связанный с геном кальцитонина, синтезировался в ПЖ и тимусе, что свидетельствует об интегральной роли пептидной регуляции в процессах формирования взаимосвязей в нейроиммуноэндокринной системе. Вероятно, в ПЖ пептид СОЛР участвует в регуляции нейроэндокринных взаимодействий, тогда как в тимусе ему отводится роль регулятора активности иммунных клеток. Нами выявлена различная возрастная динамика синтеза пептида ССЖР в тканях ПЖ и тимуса. В ПЖ при переходе от пожилого к старческому возрасту экспрессия СвЯР имеет тенденцию к повышению, тогда как у долгожителей этот показатель в 2,5 раза ниже по сравнению с пожилым возрастом. При этом синтез пептида СОКР в ПЖ не коррелирует с возрастом. В тимусе у лиц старческого возраста экспрессия пептида ССЯР в 3 раза ниже, чем у пожилых людей. Синтез пептида СОИР в тимусе сильно коррелирует с возрастом, то есть с возрастом тимус теряет способность к пептидной регуляции процессов иммуногенеза. Таким образом, пептидная регуляция нейроиммуноэндокринных взаимодействий посредством С011Р в ПЖ не зависит от возраста и резко снижается при старении тимуса.

В ПЖ и тимусе ремоделирование межклеточного матрикса, необходимое для реализации межклеточных взаимодействий, осуществляется металлопротеиназами ММР2 и ММР9. Вероятно, ММР2 в ПЖ и тимусе синтезируется иммунными клетками, тогда как экспрессия ММР9, предположительно, происходит в пинеалоцитах и эпителиальных клетках тимуса. С возрастом экспрессия обоих металлопротеиназ в пинеальной и вилочковой железах уменьшается. В ПЖ в старческом возрасте экспрессия ММР2 снижается в 2 раза, тогда как в тимусе - в 3,5 раза, что свидетельствует о более выраженном нарушении ремоделирования межклеточного матрикса в тимусе в сравнении с ПЖ.

Известно, что 10% ткани ПЖ составляет лимфоидный компонент, что является еще одним свидетельством молекулярного взаимодействия ПЖ и тимуса [Кветной И.М., Полякова В.О., 2009]. Нами впервые были верифицированы различные субпопуляции иммунных клеток в составе лимфоидной ткани пинеальной железы (Т-хелперы, цитотоксические Т-клетки, В-клетки, активированные лимфоциты) а также выявлена их возрастная динамика в сравнении с тимусом.

Число цитотоксических Т-лимфоцитов и Т-хелперов в ПЖ в пожилом и старческом возрасте сохраняется на стабильном уровне, тогда как у долгожителей наблюдается увеличение количества обеих указанных субпопуляций иммунных клеток. Для тимуса характерна противоположная тенденция. Начиная с 60 лет, число Т-хелперов в вилочковой железе сокращается, а у долгожителей данный процесс усиливается, кроме того, наблюдается резкое снижение числа цитотоксических Т-клеток.

Способность лимфоцитов к активации в пинеальной и вилочковой железе была различна. Несмотря на то, что в пожилом возрасте число CD5+ полипотентных клеток в тимусе почти в 4 раза превышало таковое в эпифизе, у долгожителей данное различие уменьшалось - у лиц старше 90 лет число CD5+ лимфоцитов в тимусе лишь в 2,5 раза превышло данный показатель в ПЖ.

В ПЖ количество CD5+ активированных клеток в возрастном диапазоне 60-89 лет не изменялось, а его снижение наблюдалось только у долгожителей. При этом в тимусе, как в старческом возрасте, так и у долгожителей, выявлено снижение числа активированных лимфоцитов, предположительно Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов. Интересными представляются результаты корреляционного анализа, показавшие, что CD5+ клетки в ПЖ, вероятно, имели фенотип В-лимфоцитов, что являлось важным отличием от тимуса, где активированными преимущественно являлись Т-клетки.

Следовательно, ключевыми молекулами, экспрессия которых была верифицирована в ПЖ и тимусе, являются: Ki67, Р53, AIF, CGRP, ММР2, ММР9, CD4, CD5, CD8 и CD20. При этом в тимусе возрастное снижение экспрессии сигнальных молекул-маркеров пролиферации, апоптоза, межклеточных и нейроиммуноэндокринных взаимодействий, а также иммунных клеток более выражено в сравнении с ПЖ.

Пептиды, сконструированные и синтезированные в Санкт-Петербургском институте биорегуляции и геронтологии, показали свою эффективность в восстановлении мелатонинобразующей функции ПЖ и иммунной функции тимуса [Хавинсон В.Х., 2009]. Однако в большинстве эти результаты основывались на морфологических и функциональных характеристиках органов нейроиммунноэндокринной системы. В связи с этим следующим этапом исследования явилось изучение влияния синтетических пептидов AEDG, КЕ, EDR и KED на экспрессию тех сигнальных молекул ПЖ и тимуса, возрастное снижение которых было описано в первой части работы.

Изучение влияния синтетических пептидов КЕ, EDR и AEDG на активацию и пролиферацию иммунных клеток ПЖ и тимуса в органотипических культурах молодых и старых животных позволило установить, что, наибольшим стимулирующим эффектом на лимфоидную ткань обоих органов обладал пептид КЕ. Однако в зависимости от органа и возраста культуры имелись некоторые особенности его эффектов.

Так, в культурах клеток ПЖ, полученных от молодых животных, пептид КЕ способствовал одновременному снижению числа активированных CD5+ клеток при увеличении всех остальных субпопуляций лимфоцитов — Т-хелперов, цитотоксических Т-лимфоцитов и B-клеток. В культурах клеток ПЖ, полученных от старых животных, пептид КЕ стимулировал увеличение числа как активированных CD5+ клеток, так и остальных изученных субпопуляций: CD4+, CD8+ и CD20+. Таким образом, в культурах клеток ПЖ

старых животных пептид КЕ одновременно стимулировал активацию и пролиферацию иммунных клеток ПЖ.

В органотипических культурах клеток тимуса молодых и старых крыс активностью в отношении иммунных клеток обладали все изученные пептиды. Пептид КЕ стимулировал экспрессию маркеров CD5 и CD8, что свидетельствует об усилении пролиферации и активации лимфоцитов. Пептиды EDR и AEDG обладали тем же эффектом, что и КЕ; кроме того, они стимулировали пролиферацию В-лимфоцитов.

Таким образом, в отношении лимфоидного компонента ПЖ эффективным стимулятором активации и пролиферации клеток оказался пептид КЕ, тогда как иммунные клетки тимуса при его старении менее чувствительны к пептидной регуляции, однако стимулируются более широким спектром пептидов — КЕ, EDR и AEDG.

Изучение пептидной регуляции апоптоза в клетках ПЖ и тимуса при старении по экспрессии белка Р53 позволило установить, что среди пептидов КЕ, EDR и AEDG наибольшее снижение экспрессии транскрипционного фактора Р53 наблюдалось под влиянием пептида AEDG. Так, пептид AEDG снижал уровень каспаза-зависимого апоптоза в культурах клеток ПЖ и тимуса старых животных, соответственно в 6 и 7 раз. Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что пептид AEDG обладал способностью подавлять каспаза-зависимый апоптоз не только в родственной ему ткани ПЖ, но также и в тимусе, что может указывать на общие регуляторные механизмы клеточной гибели в исследуемых органах при старении.

Исследование возрастной динамики экспрессии сигнальных молекул AIF, CGRP, Ki67 и ММР9 в органотипических культурах клеток ПЖ крыс позволило установить, что синтез всех маркеров, кроме CGRP, снижался с возрастом, что совпадает с данными, полученными на аутопсийном материале ПЖ человека.

Таким образом, старение ПЖ на молекулярном уровне определяется снижением способности пинеалоцитов к поддержанию баланса между митохондриально-опосредованным апоптозом (маркер AIF) и пролиферацией (Ki67), а также способностью клеток к взаимодействию и дифференцировке, осуществляемой с участием металлопротеиназы ММР9.

Изучение способности пептидов КЕ, EDR, AEDG и KED индуцировать экспрессию указанных сигнальных молекул показало, что в культурах клеток ПЖ старых животных влияние пептидов проявляется гораздо сильнее по сравнению с культурами клеток ПЖ, полученными от молодых животных. В культурах клеток ПЖ молодых и старых крыс из всех изученных пептидов наибольшей активностью обладал AEDG. В культурах клеток ПЖ молодых животных пептид AEDG стимулировал экспрессию 3 из 4 изученных молекул (Ki67, CGRP, ММР9), тогда как в культурах клеток ПЖ, полученных от старых животных, пептид AEDG влиял на все 4 молекулы (Ki67, CGRP, ММР9, AIF). Хотя эффект пептида EDR был менее выражен, чем для пептида AEDG, однако он также стимулировал экспрессию сигнальных молекул: в

культурах клеток ПЖ молодых животных - Ki67 и ММР9, в культурах клеток ПЖ старых крыс - CGRP и Ki67.

Установлено, что пептид AEDG обладал выраженной активностью в отношении экспрессии ключевых молекул, участвующих в синтезе МТ пинеалоцитами, что подтверждает ранее полученные данные о его влиянии на клетки ПЖ [Anisimov V.N., Khavinson V.Kh., 2010]. Пептид AEDG стимулировал синтез фермента AANAT, содержащегося в цитоплазме клетки, и экспрессию транскрипционного фактора pCREB, локализованного в ядре. Фермент AANAT участвует в синтезе МТ из серотонина. В свою очередь, активность AANAT регулируется транскрипционным фактором pCREB. Таким образом, в основе усиления синтеза МТ под действием пептида AEDG лежит его способность влиять на цитоплазматические (AANAT) и ядерные (pCREB) белки, участвующие в синтезе МТ. Потенцирование эффекта НА на экспрессию AANAT и транскрипционного фактора pCREB, триггерно связанного с цАМФ, а также образование кластеров клеток под действием пептида AEDG свидетельствует о том, что данный пептид усиливает синтез МТ пинеалоцитами. Пептид КЕ также стимулирует экспрессию фермента AANAT и транскрипционного фактора pCREB, однако его эффект менее выражен по силе и длительности в сравнении с пептидом AEDG. Таким образом, среди изученных пептидов (КЕ, AEDG, KED, EDR), эффективную пептидергическую регуляцию экспрессии сигнальных молекул-маркеров функционального состояния ПЖ и тимуса осуществляли пептиды КЕ и AEDG.

Проведенный нами анализ конформаций пептидов AEDG и КЕ позволил создать модели сайт-специфического взаимодействия пептидов с азотистыми основаниями регуляторных участков генов, кодирующих белки CD20, CD4, ММР2, Р53, Ki67, CGRP и CREB, которые участвуют в межклеточных взаимодействиях и активации клеток

нейроиммуноэндокринной системы. Установлено, что пептиды КЕ и AEDG могут комплементарно связываться с последовательностями, образующими большую канавку двуспиральной ДНК, о чем свидетельствует их комплементарная совместимость по принципу «ключ-замок» [Khavinson V.Kh., Malinin V.V., 2005]. Полученные структурные модели и выявленные особенности взаимодействия пептидов AEDG и КЕ с азотистыми основаниями последовательностей АТТТС и GCAG подтверждают ранее выдвинутые предположения о возможности и характере образования комплексов пептидов с нуклеиновыми кислотами [Huang H. et al., 2010]. Кроме того, сопоставляя результаты молекулярного моделирования с экспериментальными данными, характеризующими способность пептидов AEDG и ВСЕ осуществлять пептидергическую регуляцию экспрессии сигнальных молекул в ПЖ и тимусе, можно предположить, что регуляция процессов пролиферации, апоптоза, дифференцировки и ремоделирования межклеточного матрикса имеет различные механизмы в зависимости от количества возможных сайтов связывания ДНК.

Таким образом, возрастные особенности функциональной активности ПЖ и тимуса характеризуются изменением экспрессии маркеров Ki67, Р53, AIF, CGRP, ММР2, ММР9, CD4, CD5, CD8 и CD20, верифицированных в обоих органах. Пептидергическая регуляция функций ПЖ и тимуса при старении осуществляется пептидами AEDG и КЕ имеющими сайты связывания АТТТС и GCAG в промоторных зонах генов, кодирующих указанные сигнальные белки.

Кроме того, установлено, что пептид КЕ, тропный к ткани тимуса, активирует лимфоидный компонент ПЖ и экспрессию фермента AANAT, участвующего в синтезе МТ, а специфичный к ткани ПЖ пептид AEDG активирует процессы клеточного обновления в тимусе при его старении. Таким образом, влияние пептидов КЕ и AEDG, соответственно на ПЖ и тимус, указывает на их функциональную взаимосвязь в рамках нейроиммуноэндокринной системы.

ВЫВОДЫ

1. В пинеальной железе и тимусе человека верифицирован ряд общих сигнальных молекул - маркеров пролиферации (Ki67), апоптоза (Р53, AIF), различных субпопуляций лимфоцитов (CD4, CD5, CD8, CD20), нейроиммуноэндокринных взаимодействий (CGRP) и ферментов, участвующих в ремоделировании межклеточного матрикса (ММР2, ММР9). В тимусе возрастное снижение экспрессии указанных сигнальных молекул и металлопротеиназ более выражено, чем в пинеальной железе.

2. Пептиды стимулируют пролиферацию и активацию лимфоцитов в культурах клеток пинеальной железы и тимуса, полученных от молодых и старых животных. В пинеальной железе пептид ВСЕ повышает экспрессию маркеров иммунных клеток в 5-25 раз, а в тимусе такой эффект оказывают пептиды КЕ, EDR и AEDG.

3. Пептид AEDG в 6-8 раз снижает уровень апоптоза в культурах клеток пинеальной железы и тимуса, полученных от старых животных.

4. Пептид AEDG повышает экспрессию пролиферотропного протеина Ki67, нейропептида CGRP и матриксной металлопротеиназы ММР9 в пинеальной железе, причем в культурах клеток, полученных от старых животных, этот эффект более выражен, чем в культурах клеток молодых животных.

5. Пептид EDR усиливает экспрессию белков Ki67 и ММР9 в культурах клеток пинеальной железы молодых животных в 2 раза и CGRP, Ki67 — в культурах клеток пинеальной железы старых животных, соответственно, в 2 и 19 раз.

6. Пептиды AEDG и КЕ стимулируют экспрессию фермента AANAT и транскрипционного фактора pCREB, участвующих в синтезе мелатонина, в культуре пинеалоцитов в 4-7 раза. При этом пептид КЕ обладает кратковременным эффектом, тогда как пептид AEDG оказывает на эти маркеры пролонгированное действие.

7. Методом молекулярного моделирования в двуспиральной В-форме ДНК для пептидов АЕБО и КЕ найдены специфичные сайты связывания АТТТС и ССАО. В основе пептидергической регуляции экспрессии сигнальных молекул в пинеальной железе и тимусе может лежать сайт-специфическое взаимодействие пептидов АЕОО и КЕ с азотистыми основаниями регуляторных участков генов, кодирующих синтез молекул СБ20, СБ4, ММР2, Р53, Ю67, СОЯР и рСЫЕВ.

8. С возрастом функциональная активность пинеальной железы и тимуса снижается, что выражается в нарушении экспрессии ряда сигнальных молекул - маркеров активности клеток. Пептиды АЕОО и КЕ геноспецифически восстанавливают экспрессию указанных сигнальных молекул в пинеальной железе и тимусе, причем пептид КЕ активирует лимфоидный компонент обоих органов, а пептид АЕОО индуцирует процессы клеточного обновления в них.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Сравнительное изучение биологической активности пептидов АЕОО, КЕ и ЕБЯ в культурах клеток органов нейроиммуноэндокринной системы при старении может явиться новым перспективным подходом для разработки пептидных препаратов.

2. Установлено, что под действием пептида ЛЕОв в пинеалоцитах повышается экспрессия фермента ААЫАТ и транскрипционного фактора рСИЕВ, участвующих в синтезе мелатонина. Это может быть связано с образованием комплекса ДНК-пептид АЕОО по сайту связывания АТТТС, что открывает новые перспективы изучения этого и других коротких пептидов в качестве потенциальных лекарственных средств, фармакологической мишенью которых являются специфические гены.

3. Применение иммуноцитохимического исследования экспрессии различных сигнальных молекул в культурах клеток при их старении может быть использовано для изучения фундаментальных механизмов клеточного старения и может служить адекватной моделью для первичной оценки биологической активности потенциальных лекарственных препаратов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в журналах, рекомендованных ВАК

1. Белки AIF, CREB и CGRP - сигнальные молекулы возрастной патологии / Катанугина

A.C., Линькова Н.С., Полякова В.О., Кветной И.М. // Успехи современной биологии. -2011.-Т. 131, №6,- С. 543-547.

2. Влияние трипептида Lys-Glu-Asp на физиологическую активность клеток нейроиммуноэндокринной системы / Чалисова Н.И., Лопатина Н.Г., Камышев Н.Г., Линькова Н.С., Концевая Е.А., Дудков A.B., Козина Л.С., Хавинсон В.Х., Тиков Ю.С. // Клеточные технологии в биологии и медицине. - 2012. - № 2. - С. 98-101.

3. Возрастная динамика дифференцировки иммунных клеток тимуса человека / В.Х. Хавинсон, Н.С. Линькова, В.О. Полякова, A.B. Дудков, И.М. Кветной // Бюлл. эксп. биол. мед. - 2011. - Т. 151, № 5. - С. 569-572.

4. Кветной И.М. Структурно-функциональное сходство пинеалоцитов и клеток тимуса / Кветной И.М., Полякова В.О., Линькова Н.С. // Иммунология. - 2011. - № 3. - С. 131134.

5. Короткие пептиды, проникающие в клетку: модель взаимодействия с промоторными участками генов / Хавинсон В.Х., Тарновская С.И., Линькова Н.С., Проняева В.Е., Шатаева Л.К., Якуцени П.П. // Бюлл. эксп. биол. мед. - 2012. - №10. - С. 391-396.

6. Линькова Н.С. Нейропептид CGRP: возрастные особенности экспрессии в эпифизе и тимусе человека / Линькова Н.С. // Профилактическая и клиническая медицина. — 2011. - № 3. - С. 107-109.

7. Линькова Н.С.Возможности взаимной компенсации функций эпифиза и тимуса при их возрастной инволюции / Линькова Н.С. // Профилактическая и клиническая медицина.-2011.-№4.-С. 113-116.

8. Линькова Н.С. Иммунные клетки эпифиза при его старении / Линькова Н.С. // Вестник

СПбГУ. - Сер. 11. - 2012. - Вып. 3. - С.18-22.

9. Линькова Н.С. Экспрессия маркеров AIF и CGRP в эпифизе и тимусе при старении / Линькова Н.С., Катанугина A.C., Хавинсон В.Х. // Успехи геронтологи. - 2011. - Т. 24,№4.-С. 601-605.

10. Линькова Н.С. Ремоделирование межклеточного матрикса в ткани эпифиза при возрастной инволюции / Н.С. Линькова, В.О. Полякова, И.М. Кветной // Успехи геронтологии. - 2011. - Т. 24., № 3. - С. 423-425.

11. Линькова Н.С. Единый механизм ремоделирования межклеточного матрикса в ткани тимуса и эпифиза при старении / Н.С. Линькова, В.О. Полякова, И.М. Кветной // Успехи геронтологии. - 2011. - Т. 24., № 3. - С. 420-422.

12. Линькова Н.С. Роль дендритных клеток в формировании субпопуляции цитотоксических Т-лимфоцитов тимуса при его старении / Линькова Н.С., Полякова

B.О., Кветной И.М. // Бюлл. эксп. биол. мед. - 2011. - Т. 151, № 4. - С. 439-441.

13. Линькова Н.С. Роль матриксинов в старении тимуса человека / Линькова Н.С., Полякова В.О., Кветной И.М. // Успехи геронтол. - 2011. - Т. 24, N 2. С. 216-219.

14. Линькова Н.С. Соотношение апоптоза и пролиферации клеток тимуса при его инволюции / Линькова Н.С., Полякова В.О., Кветной И.М. // Бюлл. эксп. биол. мед. -2011.-Т. 151, №4.-С. 442-444..

15. Влияние коротких пептидов на экспрессию сигнальных молекул в органотипической культуре клеток эпифиза / Хавинсон В.Х., Линькова Н.С., Чалисова Н.И., Дудков A.B., Концевая Е.А. // Клеточные технологии в биологии и медицине. - 2011. - № 3. -

C. 151-154.

16. Влияние пептидов эпифиза на функции тимуса при его старении /Линькова Н.С., Полякова В.О., Трофимов A.B., Севостьянова H.H., Кветной И.М. // Успехи геронтол.-2010.- Т. 23, N 4. - С. 543-546.

17. Влияние трипептидов на лимфоидные и стволовые клетки / Хавинсон В.Х., Никольский И.С., Никольская В.В., Зубов Д.А., Галицкая С.Н., Тарануха Л.И., Семенова Я.-М.А., Лисица H.A., Линькова Н.С., Бутенко Г.М. // Бюлл. эксп. биол. мед. - 2011. - Т. 151, № 6. - С. 668-671.

18. Методика создания монослоя клеток на базе органотипической культуры для тестирования физиологически активных веществ / Хавинсон В.Х., Линькова Н.С., Проняева В.Е., Чалисова Н.И., Концевая Е.А., Полякова В.О., Кветная Т.В., Кветной И.М., Яковлев Г.М. // Бюлл. эксп. биол. мед. - 2012. - № 2. - С. 759-763.

19. Молекулярно-клеточные механизмы пептидной регуляции синтеза мелатонина в культуре пинеалоцитов / Хавинсон В.Х., Линькова Н.С., Кветной И.М., Кветная Т.В., Полякова В.О., Корф X. // Бюлл. эксп. биол. мед. - 2012. - Т. 153, №2. - С. 223-226.

20. Пептидергическая стимуляция дифференцировки иммунных клеток эпифиза / Линькова Н.С., Хавинсон В.Х., Чалисова Н.И., Катанугина A.C., Концевая Е.А. // Клеточные технологии в биологии и медицине. - 2011. - № 3. - С. 136-139.

21. Полякова В.О. Динамика процессов апоптоза и пролиферации клеток пинеальной железы человека при старении / Полякова В.О., Линькова Н.С., Пичугин С.А. // Бюлл. эксп. биол. мед.-2010.-Т. 150. -№ 10.-С. 443-445.

22. Роль сигнальных молекул в старении эпифиза и тимуса человека / Линькова Н.С., Полякова В.О., Кветная Т.В., Катанугина A.C., Костылев A.B., Абдулрагимов Р.И., Севостьянова H.H. // Молекулярная медицина. - 2012. - № 5. - С. 41-44.

23. Изменения дифференцировки, пролиферации и апоптоза тимоцитов под влиянием синтетических пептидов / Ярилин A.A., Хавинсон В.Х., Полякова В.О., Линькова Н.С., Кветной И.М. // Морфология. - 2011. - Т. 140. - № 4. - С. 23-26.

24. Морфофункциональные основы пептидной регуляции старения / Хавинсон В.Х., Линькова Н.С., Трофимов A.B., Полякова В.О., Севостьянова H.H., Кветной И.М. // Успехи современной биологии. -2011. - Т. 131, №2.-С. 115-121.

25. Особенности эпифизарно-тимических взаимоотношений при старении / Линькова Н.С., Трофимов A.B., Полякова В.О., Севостьянова H.H., Кветной И.М. // Успехи геронтологии. - 2011. - Т. 24, № 1. - С.38-42.

26. Пептидергическая регуляция дифференцировки, пролиферации и апоптоза тимоцитов при старении вилочковой железы / Н.С. Линькова, В.О. Полякова, A.B. Трофимов, И.М. Кветной, В.Х. Хавинсон // Бюлл. эксп. биол. мед. - 2011. - Т. 151, № 2. - С. 203206.

27. Пептидная регуляция репаративных процессов в органах иммунной системы при ускоренном старении / В.Х. Хавинсон, Н.С. Линькова, И.М. Кветной, В.О. Полякова, A.B. Трофимов, H.H. Севостьянова, Р.И. Абдулрагимов // Научные ведомости БелГУ. Серия Медицина. Фармация. - 2010. - Вып. 12/1. - № 22 (93). - С. 57-61.

28. Функциональное единство тимуса и пинеальной железы в исследовании механизмов старения/ В.О. Полякова Н.С. Линькова, И.М. Кветной, В.Х. Хавинсон // Бюлл. эксп. биол. мед. - 2011. - Т. 151, № 5. - С. 565-568..

29. Хавинсон В.Х. Морфофункциональные и молекулярные основы старения эпифиза/ Хавинсон В.Х., Линькова Н.С. // Физиология человека. - 2012. - Т. 38, № 1. - С. 119127.

30. Эпигенетическое действие пептидов Lus-Glu и Ala-Glu-Asp-Gly на состояние системы гемостаза / Хавинсон В.Х., Кузник Б.И., Тарновская С.И., Линькова Н.С. // Тромбоз, гемостаз, реология. - 2013. - №3 (55). - С. 26-33.

Главы в руководстве

31. Сигнальные молекулы, осуществляющие нейроиммноэндокринные взаимодействия/ Голубев А.Г., Кветная Т.В., Полякова В.О., Дурнова А.О., Петросян М.А., Линькова Н.С. // В кн. Пальцев М.А., Кветной И.М. «Руководство по нейроиммуноэндокринологии», 3-е изд. М.: Шико. - 2014. - С. 81-140.

32. Молекулярная физиология нейроиммуноэндокринных взаимодействий/ Полякова

B.О., Князькин И.В., Линькова Н.С., Ингель И.Э., Южаков В.В., Костылев A.B. // В кн. Пальцев М.А., Кветной И.М. «Руководство по нейроиммуноэндокринологии», 3-е изд. М.: Шико. - 2014. - С. 140-166.

33. Роль факторов транскрипции и дифференцировки в нейроиммуноэндокринных взаимодействиях / Полякова В.О., Линькова Н.С. // В кн. Пальцев М.А., Кветной И.М. «Руководство по нейроиммуноэндокринологии», 3-е изд. М.: Шико. - 2014. - С. 166178.

34. Влияние пептидов на дифференцировку полипотентной эмбриональной ткани и иммунных клеток человека / Хавинсон В.Х., Полякова В.О., Кветной И.М., Линькова Н.С., Дудков A.B. // В кн.: «Молекулярные основы пептидергической регуляции старения» - СПб.: Наука. - 2011. - С. 111-140.

35. Влияние пептидов на морфофункциональные особенности различных органов в модели ускоренного старения / Хавинсон В.Х., Рыжак Г.А., Кветной И.М., Кветная Т.В., Полякова В.О., Линькова Н.С. // В кн.: «Молекулярные основы пептидергической регуляции старения» - СПб.: Наука. - 2011. - С. 74-98.

36. Возрастная инволюция органов и тканей на системном и клеточном уровнях / Хавинсон В.Х., Кветной И.М., Полякова В.О., Линькова Н.С. // В кн.: «Молекулярные основы пептидергической регуляции старения» - СПб.: Наука. - 2011. - С. 11-35.

37. Линькова Н.С. «Сигнальные взаимодействия пинеальной железы (эпифиза) и тимуса при старении» // В кн.: «Нейроиммуноэндокринные механизмы старения и возрастной патологии». - 2012. - Изд-во «Наука», Санкт-Петербург. - С. 94-122.

38. Линькова Н.С. «Лимфоидная ткань эпифиза и тимуса: взаимоотношения при старении» // В кн.: «Нейроиммуноэндокринные механизмы старения и возрастной патологии». - 2012. - Изд-во «Наука», Санкт-Петербург. - С. 123-139.

39. Южаков В.В., Кветная Т.В., Чалисова Н.И., Дурнова А.О., Линькова Н.С. «Глава 2. Роль современной морфологии в методологии изучения нейроиммуноэндокринных механизмов старения» в книге Пальцев М.А., Кветной И.М., Полякова В.О., Гурко Г.И., Мурсалов С.У. «Нейроиммуноэндокринные механизмы старения и возрастной патологии». - 2012. - Изд-во «Наука», Санкт-Петербург. - С.32-46.

40. Молекулярные основы пептидной регуляции старения / Хавинсон В.Х., Линькова Н.С., Трофимов A.B., Рыжак А.П. // В кн.: «Молекулярные основы пептидергической регуляции старения» - СПб.: Наука. - 2011. - С. 36-63.

41. Полякова В.О. Иммуногистохимические маркеры в диагностике патологии тимуса / Полякова В.О., Линькова Н.С., Абдулрагимов Р.И. // В кн.: «Введение в молекулярную диагностику. Т. 1. Белки-маркеры в современной клинической диагностике» - М.: Медицина. - 2010. - С. 216-225.

Статьи в других журналах

42. Инволютивные изменения резидентных клеток тимуса человека при его старении / Полякова В.О., Кветной И.М., Линькова Н.С., Коновалов С.С., Севостьянова H.H., Абдулрагимов Р.И. // Геронтологический журнал им. В.Ф. Купревича. - 2010. - № 1. -

C. 48-51.

43. V. Kh. Khavinson, V. О. Polyakova, N. S. Linkova, A. V. Dudkov, and I. M. Kvetnoy Peptides Regulate Cortical Thymocytes Differentiation, Proliferation, and Apoptosis // Journal of Amino Acids, vol. 2011, Article ID 517137, 5 pages, 2011. doi: 10.4061/2011/517137

Основные тезисы

44. Khavinson V.Kh., Linkova N.S., Tarnovskaya S.I., Pronyaeva V.E., Trofimova S.V. Induction of differentiation as geroprotective mechanism of peptides in neuro-immuno-endocrine organs // The Journal of Nutrition, Health and Aging (The materials of 20th IAGG Word Congress of Gerontology and Geriatrics. - Seoul, Korea). - 2013. - Vol. 17, Suppl. l.-P. S348.

45. Khavinson V.Kh., Linkova N.S., Benberin V.V., Umnov R.S., Cherviakova N.A., Trofimova S.V. Peptides slow down aging of the brain and thymus cells // The Journal of Nutrition, Health and Aging (The materials of 20th IAGG Word Congress of Gerontology and Geriatrics. - Seoul, Korea). - 2013. - Vol. 17, Suppl. 1. - P. S538.

46. Molecular mechanism of tetrapeptide geroprotection and its genomic regulation / Khavinson V.Kh., Tarnovskaya S.I., Pronyaeva V.E., Linkova N.S., Dudkov A.V. // Тез. докл. 2 Международной конференции «Генетика старения и долголетия», Москва. - 2012. -С. 34.

47. Peptides regulate proliferative activity of stem cells / V. Kh. Khavinson, N.S. Linkova, A.V. Dudkov, A.V. Trofimov and S.V. Trofimova // Abstracts presented at the 12th International Congress on Amino Acids, Peptides and Proteins (Beijing, China). - J. Amino Acids. -2011. - Vol. 41. - Suppl. l.-P. S63.

48. Khavinson V.Kh., Umnov R.S., Linkova N.S., Tarnovskaya S.I., Pronyaeva V.E., Trofimova S.V. Molecular aspects of tripeptide neuroprotective impact on the Ageing brain // 8th European Congress of Biogerontology joint with the 2nd international Resolve Meeting "Healthy Ageing and Regenerative Medicine", Israel. - 2013. - P. 78.

49. Khavinson V.Kh., Linkova N.S., Tarnovskaya S.I., Pronyaeva V.E., Umnov R.S., Nichik Т.Е., Chervjakova N.A. The role of peptide signal molecules in maintance of the neuro-immuno-endocrine system in ageing // 8th European Congress of Biogerontology joint with the 2nd international Resolve Meeting "Healthy Ageing and Regenerative Medicine", Israel. -2013.-P. 17.

Список сокращений

ВОЗ Всемирная организация здравоохранения

ДНК Дезоксирибонуклеиновая кислота

мт Мелатонин

НА Норадреналин

ПЖ Пинеальная железа

AANAT Арилалкил-амин-М-ацетилтрансфераза

AEDG Пептид Ala-Glu-Asp-Gly (эпиталон)

AIF Фактор, индуцирующий апоптоз

CD Кластер дифференцировки

CGRP Родственный кальцитонину пептид

EDR Пептид Glu-Asp-Arg (везуген)

КБ Пептид Lys-Glu (вилон)

KED Пептид Lys-Glu-Asp (пинеалон)

ММР Матриксные металлопротеиназы

mRNA Матричная рибонуклеиновая кислота

pCREB Транскрипционный фактор, связывающийся с цАМФ

Линъкова Наталья Сергеевна ПЕПТИДЕРГИЧЕСКАЯ РЕГУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ СИГНАЛЬНЫХ МОЛЕКУЛ В ПИНЕАЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЕ И ТИМУСЕ ПРИ СТАРЕНИИ//Автореф. дис. докт. биол. наук: 14.01.30; 03.03.04 - СПб., 2014. - 47с.

Подписано в печать 14.04.14. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать офсетная. Печ. л. 3,0. Тираж 100 экз. Заказ 25.

Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии Издательства СПбГЭГУ «ЛЭТИ» 197376, С.-Петербург, ул. Проф. Попова, 5

Текст научной работы по медицине, диссертация 2014 года, Линькова, Наталья Сергеевна

Санкт-Петербургский институт биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН

На правах рукописи

ЛИНЬКОВА

0520145 2.1Ь8 Наталья Сергеевна

ПЕПТИДЕРГИЧЕСКАЯ РЕГУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ СИГНАЛЬНЫХ МОЛЕКУЛ В ПИНЕАЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЕ И ТИМУСЕ

ПРИ СТАРЕНИИ

14.01.30 — геронтология и гериатрия 03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук

Научные консультанты -

член-корреспондент РАМН, заслуженный деятель науки РФ, профессор, доктор медицинских наук Хавинсон Владимир Хацкелевич

профессор, доктор биологических наук Полякова Виктория Олеговна

Санкт-Петербург - 2014

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ........................................................................................................7

ВВЕДЕНИЕ............................................................................. 1 о

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ПЕПТИДЕРГИЧЕСКАЯ РЕГУЛЯЦИЯ ФУНКЦИЙ ПИНЕАЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ И ТИМУСА ПРИ СТАРЕНИИ....................................... 21

1.1. Структурно-функциональная организация пинеальной железы...... 21

1.1.1. Функции пинеальной железы.......................................... 24

1.1.1.1. Регуляторные эффекты мелатонина............................ 24

1.1.1.2. Регуляторные эффекты пептидов........................................................................33

1.2. Возрастная инволюция пинальной железы................................ 40

1.2.1. Морфологические изменения пинеальной железы

при старении.......................................................................

1.2.2. Функциональные изменения пинеальной железы при

старении............................................................................. 44

1.3. Структурно-функциональная организация тимуса....................... 47

1.3.1. Гистология тимуса и его иммунная функция........................ 47

1.3.2. Нейроиммуноэндокринная функция тимуса........................ 56

1.4. Возрастная инволюция тимуса.............................................. 58

1.5. Пептидергическая регуляция функций пинеальной железы и

тимуса и ее роль в механизмах старения..........................................................................66

1.5.1. Пинеальный мелатонин: посредник в функциональном взаимодействии пинеальной железы и тимуса в норме и при

старении...........................................................................

1.5.2. Восстановление функций тимуса под действием пептидов

пинеальной железы........................................................................................................................73

1.5.3. Пептидная регуляция экспрессии генов и молекулярное моделирование.................................................................... £1

Заключение к главе 1 ............................................................... 85

Глава 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАН ИЯ..........................................87

2.1. Характеристика исследуемого материала....................................................................87

2.2. Гистологический метод......................................................................................................................................90

2.3. Методы клеточных культур........................................................................................................90

2.3.1. Метод органотипических культур..............................................................91

2.3.2. Метод диссоциированных первичных культур..............................94

2.4. Иммуногисто- и иммуноцитохимический методы........................................96

2.5. Морфометрический метод и компьютерный анализ

микроскопических изображений......................................................................................................................102

2.6. Метод молекулярного моделирования......................................................................102

2.7. Статистическая обработка результатов исследования................................104

2.7.1. Коэффициент корреляции Пирсона............................................................105

2.7.2. Коэффициент корреляции Спирмана........................................................106

2.7.3. Коэффициент детерминации............................................................................107

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

ГЛАВА 3. МЕХАНИЗМЫ КЛЕТОЧНОГО ОБНОВЛЕНИЯ

ПРИ СТАРЕНИИ ПИНЕАЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ И ТИМУСА..............................110

3.1. Сравнительный анализ гистологического строения пиненальной железы и тимуса при старении......................................................................................................110

3.2. Апоптоз как универсальный механизм возрастной инволюции пинеальной железы и тимуса..........................................................................................................113

3.2.1. Апоптоз в ткани пинеальной железы при ее старении............115

3.2.2. Апоптоз в ткани тимуса при его старении..........................................121

3.3. Пролиферативная активность клеток пинеальной железы и тимуса

при старении..............................................................................................................................................................126

3.3.1. Пролиферативная активность клеток пинеальной железы

при старении....................................................................................................................................127

3.3.2. Пролиферативная активность клеток тимуса при

старении....................................................................... 129

Заключение к главе 3............................................................... 132

ГЛАВА 4. РОЛЬ НЕЙРОПЕПТИДА ССИР И МЕТАЛЛОПРОТЕИНАЗ В ПОДДЕРЖАНИИ ГОМЕОСТАЗА ПИНЕАЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ И ТИМУСА ПРИ

СТАРЕНИИ............................................................................ 134

4.1. Возрастная динамика синтеза пептида СвЯР в пинеальной железе и тимусе............................................................................... 134

4.1.1. Возрастная динамика синтеза пептида СвЯР в пинеальной железе..............................................................................................................................................135

4.1.2. Возрастная динамика синтеза пептида ССИР в тимусе ... 137

4.2. Ремоделирование межклеточного матрикса в пинеальной железе и тимусе при старении...................................................................... 140

4.2.1. Возрастная динамика ремоделирования межклеточного матрикса в пинеальной железе.......................................... 143

4.2.2. Возрастная динамика ремоделирования межклеточного матрикса в тимусе.......................................................... 149

Заключение к главе 4................................................................ 154

ГЛАВА 5. ОБЩНОСТЬ ЛИМФОИДНОГО КОМПОНЕНТА ПИНЕАЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ И ТИМУСА ПРИ СТАРЕНИИ.............. 156

5.1. Возрастная динамика количества В-лимфоцитов пинеальной

железы и тимуса..................................................................... 157

5.1.1. Возрастная динамика количества В-лимфоцитов

пинеальной железы......................................................... 157

5.1.2. Возрастная динамика количества В-лимфоцитов

тимуса........................................................................ 159

5.2. Возрастная динамика количества Т-лимфоцитов пинеальной

железы и тимуса...................................................................... 160

5.2.1. Возрастная динамика количества Т-лимфоцитов пинеальной железы..................................

5.2.2. Возрастная динамика количества Т-лимфоцитов

тимуса........................................................................... 163

5.3. Возрастная динамика количества активированных CD5+

лимфоцитов пинеальной железы и тимуса....................................... 168

5.3.1. Возрастная динамика количества активированных CD5+ лимфоцитов пинеальной железы.......................................... 168

5.3.2. Возрастная динамика количества активированных CD5+ лимфоцитов тимуса........................................................... 172

Заключение к главе 5.................................................................. 178

ГЛАВА 6. ПЕПТИДЕРГИЧЕСКАЯ РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВАЦИИ, ПРОЛИФЕРАЦИИ И АПОПТОЗА КЛЕТОК ПИНЕАЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ И ТИМУСА ПРИ СТАРЕНИИ....................................... 181

6.1. Влияние пептидов на активацию лимфоцитов пинеальной железы и тимуса............................................................................................................ 182

6.2. Влияние пептидов на Т-хелперы пинеальной железы и

тимуса.................................................................................. 186

6.3. Влияние пептидов на цитотоксические Т-лимфоциты пинеальной железы и тимуса...................................................................... 190

6.4. Влияние пептидов на В-лимфоциты пинеальной железы и

тимуса.................................................................................. 193

6.5. Влияние пептидов на каспаза-зависимый апоптоз в пинеальной

железе и тимусе............................................................................................................................................196

6.6. Влияние пептидов на активацию, пролиферацию и апоптоз в

диссоциированных культурах клеток тимуса..................................................................200

Заключение к главе 6..............................................................................................................................207

ГЛАВА 7. ПЕПТИДЕРГИЧЕСКАЯ РЕГУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ СИГНАЛЬНЫХ МОЛЕКУЛ ПИНЕАЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ПРИ СТАРЕНИИ............................................................................. 210

7.1. Влияние пептидов на митохондриально-опосредованный апоптоз в пинеальной железе..............................................................................................................................210

7.2. Влияние пептидов на экспрессию нейропептида СвИР в пинеальной железе....................................................................................... 212

7.3. Влияние пептидов на пролиферацию в пинеальной железе............. 215

7.4. Влияние пептидов на ремоделирование межклеточного матрикса в пинеальной железе...................................................................... 217

7.5. Влияние пептидов на синтез мелатонина в пинеальной

железе..................................................................................... 219

Заключение к главе 7.................................................................. 223

ГЛАВА 8. МОДЕЛЬ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ПЕПТИДОВ С ПРОМОТОРНЫМИ УЧАСТКАМИ ГЕНОВ СИГНАЛЬНЫХ

МОЛЕКУЛ, ПИНЕАЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ И ТИМУСА........................... 226

Заключение к главе 8.................................................................. 236

ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ............................................................ 238

ВЫВОДЫ.................................................................................. 246

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.......................................... 248

УКАЗАТЕЛЬ ЛИТЕРАТУРЫ....................................................... 249

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АД артериальное давление

АКТГ аденокортикотропный гормон

АХ ацетилхолиностераза

АТФаза аденозинтрифосфатаза

АФК активные формы кислорода

ВОЗ Всемирная организация здравоохранения

ГП глутатионпероксидаза

ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота

ДНИЭС диффузная нейроиммуноэндокринная система

лг лютеинизирующий гормон

МНС антигены главного комплекса гистосовместимости

мт мелатонин

МСК мезенхимальные стволовые клетки

НА норадреналин

ПЖ пинеальная железа

ПОЛ перикисное окисление липидов

РНК рибонуклеиновая кислота

РТМЛ реакция торможения миграции лейкоцитов

СОД супероксиддисмутаза

СТГ соматотропный гормон

схя супрахиазматические ядра

ТСФ тимический сывороточный фактор

ТЭК эпителиальные клетки тимуса

ФГА фитогемагглютинин

ФСГ фолликулостимулирующий гормон

цАМФ циклический аденозинмонофосфат

цГМФ циклический гуанозинмонофосфат

ЭПР эндоплазматический ритикулум

AANAT арилалкил-амин-Ы-ацетилтрансфераза

AEDG пептид эпиталон (Ala-Glu-Asp-Gly)

AIF фактор, индуцирующий апоптоз (apoptotic inducing

factor)

CD кластер дифференцировки

CGRP родственный кальцитонину пептид (calcitonin gene-

related peptide)

CPP пептид, проникающий в клетку (cell penetrating peptide)

6-COMT 6-сульфатоксимелатонин

EDR пептид везуген (Glu-Asp-Arg)

G-CSF гранулоцитарный колониестимулирующий фактор

GM-CSF гранулоцитарно-макрофагальный

колониестимулирующий фактор

HLA антигены главного комплекса гистосовместимости

HLA-DR поверхностный маркер зрелых, активированных Т-

лимфоцитов человека

Ig иммуноглобулин

IGF инсулиноподобный фактор роста

IL Интерлейкин

КЕ пептид вилои (Lys-Glu)

KED пептид пинеалон (Lys-Glu-Asp)

M-CSF колонийстимулирующий фактор макрофагов

ММР матриксные металлопротеиназы

NK натуральные киллеры

pCREB транскрипционный фактор, связывающийся с цАМФ

R коэффициент корреляции Пирсона

R2 коэффициент детерминации

RSI, коэффициента корреляции Спирмана

TCR Т-клеточный рецептор

TGF трансформирующий фактор роста

фактор роста эндотелия сосудов вазоактивный интерстинальный пептид

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы

[Ноздрачев А.Д. и соавт., 2001; Пальцев М.А., Кветной И.М., 2008; Liberman P.M., 1997]. С точки зрения геронтологии важнейшими органами диффузной нейроиммуноэндокринной системы являются пинеальная железа (ПЖ) и тимус [Кветной И.М., Полякова В.О., 2009]. Возрастное снижение функциональной активности ПЖ, сопровождающееся снижением секреции мелатонина (МТ), лежит в основе таких заболеваний, как болезнь Альцгеймера, сахарный диабет, гипертензия, возрастные иммунодефицита, ишемическая болезнь сердца [Anisimov V.N., Khavinson V.Kh., 2010]. Тимус1 подвергается инволюции, начиная с 30 лет, а к 60 годам его функциональная активность снижается, что приводит к увеличению заболеваемости раком, вирусными, бактериальными инфекциями и аутоиммунным заболеваниям [Ярилин A.A., Беляков И.М., 1996; Назаров П.Г. и др., 1999; Griffin D.O., Rothstein T.L., 2012].

Ключевым звеном молекулярно-клеточной регуляции гомеостаза в ПЖ и тимусе являются молекулы, осуществляющие передачу информации ( между различными клетками. К ним относятся вещества природного происхождения (МТ, серотонин, транскрипционный фактор pCREB) и синтетические короткие пептиды.

Установлено, что применение коротких пептидов, которые обладают высокой биологической активностью, ткане- и геноспецифичностью и не имеют видоспецифичности и иммуногенности, способствует коррекции возрастного снижения функций пинеальной и вилочковой желез [Khavinson V.Kh., Malinin V.V., 2005; Khavinson V.Kh. et al., 2011]. Ключевую роль в сохранении функций ПЖ и тимуса при старении может играть синтетический пептид AEDG, стимулирующий иммунную и эндокринную функцию тимуса. Пептид AEDG активирует выработку МТ пинеальной железой, который связывается с мелатониновыми рецепторами клеток тимуса [Кветной И.М., Полякова В.О., 2009; Anisimov V.N., Khavinson V.Kh., 2010]. Например, таким путем может регулироваться циркадианное

повышение выработки тимического сывороточного фактора, способствующего поздней активации тимоцитов [Райхлин Н.Т. и др., 2004]. Пептид КЕ стимулирует иммуногенез в тимусе, активируя пролиферацию тимоцитов, и обладает антиканцерогенным действием [Ап1з1шоу У.Ы., Юшушбоп У.КИ., 2010]. Пептид ЕОИ. является индуктором пролиферации иммунных клеток в органотипических культурах тканей [СЬаПзоуа N.1. е1 а1., 2008].

Цель и задачи исследования

Для достижения указанной цели были поставлены и последовательно решены следующие задачи:

2. Оценить влияние пептидов КЕ, ДЕОв, КЕБ и ЕБЯ на пролиферацию и дифференцировку лимфоцитов в культурах клеток пинеальной железы и тимуса, полученных от молодых и старых животных.

3. Изучить действие пептидов КЕ, AEDG, KED и EDR на апоптоз в культурах клеток пинеальной железы и тимуса, полученных от молодых и старых животных.

Научная новизна

иммунологических реакциях в пинеальной железе и тимусе людей старше 60 лет, что позволяет расширить представления об эк

Автореферат и диссертация по медицине (14.01.30) на тему:Пептидергическая регуляция экспрессии сигнальных молекул в пинеальной железе и тимусе при старении

Автореферат диссертации по медицине на тему Пептидергическая регуляция экспрессии сигнальных молекул в пинеальной железе и тимусе при старении

Текст научной работы по медицине, диссертация 2014 года, Линькова, Наталья Сергеевна

Похожие научные работы

Каталог диссертаций