Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Участие различных типов опиоидных рецепторов в регуляции антителогенеза и ранних этапов активации лимфоцитов

Г Го

1 1\ ИЮЛ

российская академия наук

ИНСТИТУТ БИО ОРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. М.М. ШЕМЯКИНА и Ю.А. ОВЧИННИКОВА

На правах рукописи

МАЛЮКОВА Ирина Владимировна

УЧАСТИЕ РАЗЛИЧНЫХ ТИПОВ ОПИОИДНЫХ РЕЦЕПТОРОВ В РЕГУЛЯЦИИ АНТИТЕЛОГЕНЕЗА И РАННИХ ЭТАПОВ АКТИВАЦИИ ЛИМФОЦИТОВ

14.00.36 - Аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук.

Москва - 1997

Работа выполнена в лаборатории медиаторов нммунной системы Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю .А. О вчшшикова Р АН.

Научный руководитель: доктор биологических наук JI.A. Захарова Научный консультант: доктор химических наук C.B. Зайцев

Официальные оппоненты:

академик РАЕН, доктор биологических наук, профессор В.Я. Арнон доктор медицинских наук М.С. Бляхср

Ведущая организация:

Институт иммунологии Минздрава РФ

Защита диссертации состоится "_"_ 1997 г. в_часов

на заседании Специализированного Ученого Совета Д.084.66.02 при НИИ физико-химической медицины МЗ и МП РФ. Адрес: 119828, Москва, ул. М. Пироговская, д. 1а

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ физико-химической медицины МЗ и МП РФ.

Автореферат разослан " чклйиэ^ 1997 г.

Учёный секретарь Специализированного Ученого Совета кандидат биологических наук

JI. JI. Васильева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Факты, свидетельствующие о тесной взаимосвязи между нейроэндокринной и иммунной системами, давно и широко известны. Однако лишь в последнее десятилетие были выявлены конкретные медиаторы, участвующие в реализации этой взаимосвязи (Morley, 1987; Захарова и Петров, 1990; Madden, 1995). Это поставило проблему на молекулярный уровень исследований и открыло возможности изучать тончайшие механизмы нейроиммунных взаимодействий, а именно, роль рецепторного аппарата клеток, принимающих участие в данном процессе. В зависимости от биологической значимости, силы и длительности раздражителя, а также врожденных и приобретенных индивидуальных различий, ответ организма реализуется путем вовлечения комплекса нейроэндокринных механизмов, которые оказывают мощное влияние на иммунную систему.

Открытие иммуномодулирующих свойств нейромедиаторов позволило существенно дополнить представления о механизмах передачи сигналов от нервной системы к иммунной. На иммунокомпетентных клетках обнаружены рецепторы к целому ряду нейрогормонов и нейротрансмиттеров (Carr et al., 1988; Blalock, 1989; Elands, 1990; Aune et al., 1993; Singh & Leu, 1993). Среди нейропептидов выделяют класс опиоидных пептидов, спектр действия которых выходит далеко за пределы нервной системы. Иммуномодулнрующий характер действия опиоидных пептидов основан на их взаимодействии со специфическими рецепторами по крайней мере трех основных типов - ц-, 8-, и к-, обнаруженных на лимфоцитах (Carr et al., 1988; Fiorica & Spector, 1988; Carr et al., 1989; Bidlack et al., 1993;). Многочисленные данные о влиянии опиоидных пептидов на иммунный ответ побуждают к исследованиям участия разных типов опиоидных рецепторов (ОР) в реализации этого влияния. В настоящее время известны лишь единичные работы, посвященные выяснению молекулярных механизмов действия опиоидных пептидов и, в частности, тому, с каким типом рецептора может быть связано их иммуномодулирующее действие, какова их роль в проведении сигнала через плазматическую мембрану и дальнейших рецептор-опосредованных событиях, происходящих в клетке.

Цель и задачи исследования

Целью настоящего исследования является изучение роли различных типов опиоидных рецепторов в регуляции антителогенеза и их участия в проведении активациоиного сигнала через плазматическую мембрану лимфоцитов. Для достижения этой цели были поставлены следующие конкретные задачи:

1. Исследовать изменения общего уровня налоксон-чувствительных рецепторов и распределения опиоидных рецепторов по ц-, 6- и к-типам на клетках лимфатических узлов в динамике развития первичного и вторичного иммунного ответа на у-глобулин быка у мышей.

2. Изучить влияние селективных опиоидных лигандов на антителогенез у мышей.

3. Изучить распределение опиоидных рецепторов по ц-, 8- и к-типам на лимфоцитах мышей после слабого стрессогенного термораздражения.

4. Исследовать влияние селективных агонистов опиоидных рецепторов ц-, 5-, и к-типа на уровень внутриклеточного свободного Са2+ в лимфоцитах на ранних этапах активации конканавалином А у мышей.

Научная новизна

В результате проведенных исследований получены неизвестные ранее данные об изменении общего уровня экспрессии налоксон-чувствительных рецепторов и распределения опиоидных рецепторов по ц-, 5-, и к-типам на лимфоцитах в динамике развития первичного и вторичного иммунного ответа на бычий у-глобулин, а также после стрессогенного воздействия у мышей. Опиоидные рецепторы к-типа отвечают за стимуляцию, а ц- и 8-типа - за подавление иммунного ответа.

Вскрыты новые молекулярные механизмы, обеспечивающие контроль со стороны опиоидергической системы иммунологических функций организма. Показан модулирующий эффект селективных опиоидных лигандов на уровень внутриклеточного свободного Са2+ в лимфоцитах на ранних этапах активации у мышей. Агонисты ц- и б-рецепторов подавляют, а к-агонист модулирует уровень внутриклеточного свободного Са2+ в лимфоцитах, стимулированных конканавалином А (Кон А).

Научная и практическая значимость работы

Совокупность результатов работы позволяет высказать новую научную гипотезу о регуляторной роли опиоидных рецепторов и их лнгандов в процессах, связанных с подавлением и стимуляцией иммунного ответа на начальных и конечных этапах его развития.

Результаты проведенных исследований могут служить основанием для разработки новых подходов, способствующих пониманию взаимосвязи нейроэндокринной и иммунной систем, необходимых для объяснения многих противоречивых научных данных о направленности иммуномодулирующего действия опиоидных пептидов.

Полученные данные могут быть использованы для дифференциальной терапии лекарственными препаратами, действующими на различные типы опиоидных рецепторов, с целью профилактики и лечения иммунодефицитных состояний.

Основные положения, выносимые на защиту

1. В динамике развития первичного иммунного ответа к у-глобулину быка на иммунокомпетснтных клетках мышей на пике ответа преобладает доля опиоидных рецепторов к-типа, тогда как на его спаде - доля рецепторов ц- и 6-типа.

2. В динамике развития вторичного иммунного ответа к у-глобулину быка относительное количество к-рецепторов на иммунокомпетентных клетках мышей существенно превышает долю ц- и 8-рецепторов в течение всего времени развития ответа. Доля опиоидных рецепторов к-типа резко возрастает, достигая максимального значения ко 2-му дшо, и сохраняется на достаточно высоком уровне до 9-го дня иммунного ответа.

3. Селективный агоннст к-типа Ш9.593 стимулирует, а селективные агонисты ц- и 8-тнпа ОАЛЮО и ОБЬЕТ подавляют продукцию антител на пике первичного и вторичного иммунного ответа к у-глобулину быка у мышей.

4. Подавление антителообразования к эритроцитам барана, вызванное тестом горячей пластины, сопровождается увеличением доли опиоидаь:;'. рецепторов ц- и 8-типа и снижением рецепторов к-типа на лимфоцитах мышей.

5. Селективные агонисты опиоидных рецепторов ц-типа, ОАМСО, н 8-типа, ОБЬЕТ, дозозависимо снижают, а к-селективный агонист динорфин А (1-13) модулирует уровень внутриклеточного свободного Са2+ в лимфоцитах, активированных, конканавалином А, у мышей.

Работа выполнена в рамках научно-технической программы лаборатории медиаторов иммунной системы Института биоорганической

___________ ¥ / Ъ 1 I * Т___________ 1А Л Г\_______________ ГЪДТТ II Г»___________ _________

лимш1 им. ш.т. Шемякина и ^ьчитшлива г/\п оыдслснис, ич»н_1ка

и изучение свойств пептидов костного мозга", программой гранта РАН "Изучение генетически обусловленных иейроиммунных механизмов, лежащих в основе биологической защиты организма при действии факторов внешней среды" и научным направлением гранта РАМН "Патологическая боль" по теме "Влияние пороговой ноцицептивной стимуляции на иммунный ответ и экспрессию опиоидных рецепторов на лимфоцитах".

Публикация результатов исследования и апробация работы

По теме диссертации опубликовано 3 работы и одна сдана в печать. Результаты исследований доложены на 3-ем Международном конгрессе Международного общества по нейроиммуномодуляции в Бетезде, США в 1996 г., 1-ом Российском конгрессе по патофизиологии в Москве в 1996 г. и на совместном семинаре лаборатории гормональных регуляций Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН и лаборатории клеточных взаимодействий отдела иммунологии Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН в 1997 г.

Структура и объем работы

Диссертационная работа изложена на Э? страницах машинописного текста, содержит 9 рисунков и 4 таблицы. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов и результатов собственных исследований, изложенных в 4 главах. В списке использованной литературы 2О~Ь источников отечественных и зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Эксперименты выполнены на мышах линии СВА, и гибридах (CBAxC57BL/6)Fi, самцах и самках, массой 18-20 г (питомники РАМН "Столбовая" и "Светлые горы").

Иммунизация.

Мышей Fi(CBAxC57BL/6) иммунизировали раствором бычьего у-глобулина (БГГ) ("Serva", Германия) в полном адьюванте Фрейнда ("Boehringer", Германия) подкожно в передние и задние конечности по 0.1 мл из расчета 100 мкг антигена на 1 мышь. Через 30 дней проводили повторную иммунизацию БГГ в 0,9% растворе NaCl в той же дозе и тем же способом.

Приготовление суспензии клеток селезенки и лимфатических узлов.

У неиммунизированных мышей линии СВА извлекали селезенку, а у мышей Fi(CBAxC57BL/6), иммунизированных БГГ, с 1 по 14-й день первичного и с 1 по 9-й день вторичного иммунного ответа извлекали подмышечные, подколенные и паховые лимфатические узлы, гомогенизировали в среде RPMI-1640 ("Sigma", США), осаждали центрифугированием при 300 х g, 10 мин и дважды отмывали в той же среде. Выход клеток составлял 200-250x10® на 1 мышь для селезенки и 30-40x10® на 1 мышь для лимфатических узлов. Для получения фракции клеток селезенки, обогащенной лимфоцитами, 5 мл суспензии в концентрации 20x10® клеток в 1 мл наслаивали на 5 мл лимфолита М ("Cederlane", Канада) и центрифугировали при 1000 х g, 20 мин. Интерфазу собирали, дважды отмывали центрифугированием (300 х g, 10 мин) в среде RPMI-1640. Выход обогащенной лимфоцитами суспензии составлял 70-80 хЮ® клеток на 1 мышь.

Используемые реагенты.

рН]налоксон (60 Ки/ммоль) ("Amersham", Великобритания); немеченый налоксон ("Sigma", США); ц-агонист DAMGO [D-AlaW-Me-Phe^-Gly5-ол]энкефалин ("Amersham", Великобритания), б-агонист DSLET [D-Ser2-

Ьеи5-ТЬг6]энкефалин ("Serva", ФРГ), к-агонисты: U69.593 D-(5a,7a,8p)-(+)-^-метил-jV- {7-(1 -пирролидпнил)-1 -оксапиро[4,5]дек-8-ил}бешоацетамид ("Amersham", Великобритания) и динорфин А (1-13) ("Sigma", США).

Радиолигандный анализ.

Для проведения радиолигандного анализа специфического связывания [3Н]налоксона в лунки 96-луночных микропланшетов для культу]) клеток

/мл - —»1 mil А \ -----------г а _____ тп------------ -- -----------м

^ v^uíiai , umnj вносили но jo mkji i^njiiajiuKcoiia до кинсчпин

концентрации 7 нМ, 100 мкл соответствующего немеченого лиганда (налоксон, DAMGO, DSLET или U69.593) до конечной концентрации 1 мкМ, после чего добавляли по 100 мкл суспензии клеток (2,5 хЮ6/ мл). Для определения общего связывания вместо немеченых опиоидных лигандов в лунки вносили 100 мкл среды 199М ("Sigma", США). Все растворы готовили на среде 199М. Концентрация [3Н]налоксона 7 нМ была выбрана оптимальной для получения достаточно высоких значений радиоактивного счета и сохранения необходимого уровня специфического связывания лиганда по отношению к неспецифическому. Планшеты инкубировали при встряхивании в течение 30 мин при 37°С. Разделение свободной и связанной метки проводили при помощи полуавтоматического харвестра ("Skatron", Норвегия) с использованием стекловолокнистых фильтров GF/B ("Whatman" Великобритания). Радиоактивность измеряли методом жидкостной сцинтилляционной спектроскопии на счетчике Rack Beta ("LKB", Швеция). За величину специфического связывания принимали разницу между величинами связывания [3Н]цалоксона в отсутствии и в присутствии немеченого налоксона. Распределение ц-, 5-, и к-гипов ОР оценивали по вытеснению [3Н]налоксона соответствующими селективными немечеными лигандами. Сумма величин вытеснения [3Н]налоксона селективными опиоидными лигандами была сравнима со значением специфического связывания [3Н]налоксона.

Оценка эффекта селективных лигандов на продукцию антител к БГГ.

На 7-ой день первичного и 5-й день вторичного иммунного ответа выделяли клетки лимфатических узлов, ресуспендировали в среде RPMI-1640 ("Sigma", США), содержащей 2 мМ L-глутамина, 10 мМ HEPES буфера (рН 7.4), 100 Е/мл гентамицина и вносили по 100 мкл (10х106/мл) в 96-

луночные микропланшеты ("Costar", США). В лунки добавляли по 100 мкл соответствующих селективных опиоидных лигандов до конечной концентрации I01-1, 10-'° и 106 М или 100 мкл среды. Планшеты инкубировали 24 часа при 37°С в атмосфере 5%-СОг, после чего центрифугировали при 400 х g, 10 мин, клетки отбрасывали, супернатант собирали и использовали для определения антител к БГГ методом иммупоферментного анализа (ИФА).

Плшунофер.иентный анализ.

Раствор БГГ (10 мкг/мл) в фосфатно-солевом буфере (ФСБ), 0,15 М NaCl, рН 7,4 вносили по 250 мкл в лунки 96-луночных микропланшетов для ИФА ("Linbro", Великобритания), инкубировали 24 часа при 4°С, отмывали ФСБ. В лунки вносили по 250 мкл 0,1% раствора БСА в ФСБ, инкубировали 2 часа при 37°С и отмывали ФСБ. Затем наносили супернатант клеток лимфатических узлов мышей после культивирования с опиоидными лигаидамн, содержащий антитела к БГГ, и инкубировали 1 час при 37°С, трехкратно отмывали ФСБ, содержащем 0.05% Тритона Х-100 (ФСБТ). Раствор копыогата пероксидазы хрена и иммуноглобулинов кролика против иммуноглобулинов мыши в ФСБТ в необходимом разведении вносили по 200 мкл и инкубировали 1 час при 37°С. Планшеты отмывали трижды ФСБТ и вносили по 200 мкл субстрата - ортофенилендиамииа, ("Sigma", США) в концентрации 0,4 мг/мл в 0,05 М цитратном буфере, рН 4,5 и до 3 мМ перекиси водорода. Реакцию останавливали через 20 минут добавлением 50 мкл 2 М серной кислоты. Измерение оптической плотности производили при длине волны 410 нм на микропланшетном спектрофотометре Multiscan ("Flow Laboratories", Великобритания).

Тест горячей пластины.

Тест горячей пластины (Ankier, 1974) использовали в качестве стрессогенного воздействия, вызывающего развитие ноцицептивной реакции. Мышей линии СВА помещали на металлическую пластину с температурой 50°С. Животных снимали с пластины после наступления болевой реакции, выражающейся в яростном облизывании одной из задних ian. Максимальное пребывание животного на пластине не превышало 60 :екунд.

Определение уровня свободного цитонлазмшнического Ca* в лимфоцитах.

Уровень внутриклеточного свободного Са2+ определяли с помощью флуоресцентного зонда фура-2 (Cobbold, 1987). Для встраивания зонда к 0,5 мл суспензии клеток лимфатических узлов (50х106/мл) в среде RPMI-I640, содержащей 5% фетальной сыворотки, 2 мМ L-глутамина, 10 мМ HEPES ("Sigma", США) добавляли ацетоксиметиловый эфир фуры-2 (фура-2 AM) (Calbiochern) до конечной концентрации 1 мкМ и инкубировали 20 мин при 20°С в темноте. Суспензию клеток разводили в 10 раз и продолжали инкубацию в тех же условиях 45 мин. Клетки 3-х кратно отмывали (300 х g, 10 мин) в растворе Хенкса, pH 7,2, содержащем 1% фетальной сыворотки, концентрацию клеггок доводили до 2х10б/мл. Интенсивность флуоресценции (Г) регистрировали на приборе Hitachi F-4000 при 37°С в термостатируемых кварцевых кюветах с перемешиванием при длине волны 515 нм (возбуждение 335 нм, щели 1,5 и 20 нм для возбуждения и испускания соответственно). Для уменьшения влияния рассеяния применяли светофильтры: на возбуждении -Corning 9863 (пропускание 250-390 нм), на испускании - Hitachi VY-43 (пропускание >430 нм). Внутриклеточную концентрацию кальция рассчитывали по формуле: [Ca2+]i = К (I - /mm)/(/max - Г), где /гаах интенсивность флуоресценции фуры-2, находящегося в форме комплекса с Са2\ зарегистрированная после добавления в кювету 50 мкМ днгитошша; I - интенсивность флуоресценции фуры-2 в виде свободной кислоты. Величину К принимали равной 224 нм (Tsien, 1985 ). Значение /min раССЧИТЫВаЛИ ПО формуле: /rein = /тп + 0,32(/тах - /пт), ГДе /тп собственная флуоресценция клеток после добавления 1,5 мМ МпСЬ (Сурин, 1991).

Опиоидные лиганды инкубировали с клетками в течение 20 мин и 2-х часов. При 20-ти минутной инкубации опиоиды добавляли к клеткам с уже встроенным зондом непосредственно во флуорнметре в термостатируемых кюветах с перемешиванием при 37°С. При анализе эффектов опиоидов на уровень Са2+ в лимфоцитах, активированных Кон А, митоген добавляли в кювету во флуориметре до конечной концентрации 5 мкг/мл по окончании времени инкубации с лигандами. При проведении 2-х часовой инкубации суспензию клеток переносили в 24-луночные планшеты ("Nunclon", Дания) в среде RPMI-1640 ("Sigma", США), содержащей 5% фетальной сыворотки, 2

мМ L-глутамппа, 10 мМ HEPES, до конечной концентрации 2,5х106 клеток в 1 мл. Предварительно в лунки планшетов были добавлены селективные опиоидные лнганды DAMGO, DSLET и дннорфнн А (1-13) в соответствующих концентрациях или необходимый объем среды. Планшеты инкубировали при 37°С в атмосфчю 5% СО2. По окончании инкубации клетки дважды отмывали средой RPM1-1640 того же состава и проводили встраивание флуоресцентного зонда.

Статистическая обработка результатов.

Математическую обработку данных проводили с использованием критерия Стыодента (программа Statgraphics, USA). Для построения 1°рафнков использовали npoi-рамму Sigmaplot for Windows версия 2.0 (Jandei Corp., USA).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Способность веществ опиоидной природы оказывать иммуномодулнрующее действие на организм человека и животных подтверждена многочисленными экспериментальными данными. В определенных условиях огшоиды могут стимулировать либо подавлять различные функции иммунной системы как in vivo, так и in vitro (Johnson et а!., 19X2; FrakerÄ Gang, 1987; Morgan et al., 1990; Taub et al., 1991; Bussiereet al., 1993). Иммуномодулирующнн характер действия опиоидных пептидов основан на их взаимодействии со специфическими рецепторами на поверхности иммунокомпетснтных клеток (Carr et al., 1988; Fiorica & Spector, 1988; Carr et al., 1989; Bidlack et al., 1993). Однако дальнейшие молекулярные события, развивающиеся в лимфоцитах после образования лнганд-рецепгорного комплекса с опиоидами, практически не изучены.

Роль оинондпых рецепторов р-, 5- н к-тмпа на иммунокомпетснтных клетках и их лигандов в развитии гуморального иммунного ответа у мышей

Ранее было показано, что специфическое связывание неселективного опнон;июго антагониста [3Н]налоксона с нммунокомпстентнымп клетками мышей обратимо и насыщаемо (Зайцев и соавт., 1992), что доказывает существование ОР на поверхности этих клеток. Наибольшая плотность мест опиоидного связывания наблюдается на клетках лимфатических узлов

(Хегай и соавт., 1992), в связи с чем они были использованы в экспериментах в качестве основного источника клеток.

Изменение уровня налоксон-чувствительных рецепторов на клетках лимфатических узлов мышей Р¡(СВАхС57ВЬ/6) в динамике развития первичного иммунного ответа на БГГ.

Динамику изменения активности ОР в развитии антителогенеза оценивали по уровню специфическою связывания "11]налоксо1:а на клетках лимфатических узлов со дня введения БГГ (0 день) по 14-й день первичного иммунного ответа (рис. 1). Уровень специфического связывания [3Н]налоксона на иммунокомпетентных клетках увеличивается с первого дня иммунизации и возрастает почти в 6 раз к 7-му дню, соответствующему пику ответа. На 8-ой день значение специфического связывания [3Н]налоксона выходит на плато и сохраняется на том же уровне вплоть до 14-го дня после иммунизации, когда синтез антител прекращается (рис. 1).

Изменение распределения опиоидных рецепторов по ц-, 3- и к-типам на клетках лимфатических узлов мышей Р] (СВАхС57В1У6) в динамике развития первичного иммунного ответа на БГГ.

Участие ц-, 5- и к-типов ОР в развитии первичного иммунного ответа оценивали по вытеснешпо [3Н]налоксона соответствующими селективными немечеными лигандами ОАМвО (ц-агонист), ОБЬЕТ (5-агонист) и Ш9,593 (к-агонист). Концентрация лигандов составляла 1 мкМ, что на два порядка больше использованной концентрации радиоактивно меченного лнганда. Сумма величин ингибирования селективных лчгандов в каждый день ответа была сопоставима со значением специфического связывания [3Н]налоксона.

В процессе развития иммунного ответа наблюдается значительное усиление вытеснения [3Н]налоксона селективным агонистом Ш9,593 (рис. 2). На 7-8 дни, то есть на пике иммунного ответа, количество к-рецепторов возрастает в 5 раз по сравнению с исходным (0-й день ответа), и составляет 63% от суммарного связывания на иммунокомпетентных клетках. В последующие дни доля к-рецепторов резко падает, достигая 2% к 14-му дню иммунного ответа. Число ОР ц- и 8-тнпа существенно не меняется до 8-го дня, а затем возрастает, достигая к 14-му дшо 35% и 63% от общего числа ОР соответственно.

Таким образом, в динамике развития первичного иммунного ответа на БГГ доля- к-рецепторов на иммунокомпетентных клетках преобладает в период роста ответа, тогда как, рост доли ц- и 5-рецепторов коррелирует со спадом иммунного ответа на введенный антиген.

Изменение уровня налоксон-чувствительных рецепторов на клетках лимфатических узлов мышей F,(CBAxC57BL/6) в динамике развития вторичного иммунного ответа на БГГ.

При развитии вторичного иммунного ответа на БГГ первоначальная величина связывания [3Н]налоксона (0-й день) почти в 6 раз превышает таковую при первичном ответе (рис. 3). Максимальный уровень связывания [3Н]налоксона наблюдается на 5-й день, при этом его значение в 1,5 раза превосходит исходный уровень вторичного иммунного ответа. На 8-9-й дни происходит снижение опиоидного связывания почти до начального уровня (О день).

Изменение распределения опчоидных рецепторов по /л-, и к-типам на клетках лимфатических узлов мышей Ft (CBAxC57BL/6) в динамике развития вторичного иммунного ответа на БГГ.

В процессе развития вторичного иммунного ответа доля к-рецепторов резко возрастает (рис. 4), достигая максимального значения уже на второй день, что составляет 77% от общего связывания и превышает исходную величину в 2,5 раза. В последующие дни наблюдается незначительное снижение числа к-рецепторов, которое сохраняется на том же уровне до 9-го дня вторичного иммунного ответа. Существенного изменения доли ц- и 8-рецепторов при вторичном иммунном ответе не происходит, наряду с этим их уровень значительно ниже уровня к-ОР. Необходимо отметить, что в процессе развития как первичного так и вторичного иммунного ответа наблюдается корреляция распределения ц- и 5-ОР. Наличие этой корреляции, по-видимому, связано с тем, что при использованной концентрации 1 мкМ DAMGO и DSLET могут вытеснять [3Н]налоксон как с ц- гак н с 5-пишв рецепторов, однако они не взаимодействуют с рецепторами к-гнпа (Goldstein & James, 1984). Поэтому нельзя строго дискриминировать величины ннгибирования [3Н]налоксона указанными лигандами, но при этом можно сравнивать суммарный уровень ц- и 8-типов рецепторов с уровнем к-рецепторов.

Из полученных данных следует, что в динамике развития вторичного иммунного ответа на БГГ ключевая роль принадлежит к-рецепторам, относительное количество которых существенно превышает долю ц- и 5-рецепторов в течение всего времени развития ответа.

Влияние селективных лигандов опиоидных рецепторов на антителопродукцию лимфоцитов лимфатических узлов мышей F1(CBAxC57BL/6) в динамике развития первичного и вторичного иммунного ответа на БГГ.

Участие селективных опиоидных лигандов в регуляции антитело!енеза изучали по их влиянию на продукцию антител к БГГ лимфоцитами лимфатических узлов in vitro (рис. 5). DAMGO (1010 и 10 6 М) и DSLET (Ю-6 М) подавляют антителопродукцию на 17-28%, проявляя сходный эффект при первичном и вторичном иммунном ответе (рис. 5). U69.593 в концентрации 1010 М стимулирует антителогенез на 48% при псрничиом (рис. 5а) и на 12% при вторичном иммунном ответе (рис. 56).

Таким образом, огаюидные лиганды, селективные к разным типам рецепторов, могут обладать разнонаправленным эффектом на иммунный ответ. Лиганд к-рецепторов, U69.593, стимулирует, а лиганды ц- и 5-рецепторов, DAMGO и DSLET, подавляют антителогенез.

Изменение распределения различных типов опиоидных рецепторов на лимфоцитах мышей линии СБА после слабого стрессогенного воздействия. Известно, что в стресс-вызванный ответ организма вовлекаются различные механизмы, среди которых значимая роль принадлежит опноидергпческим (Fischer, 1988; Kulling et al., 1988). Следующим этапом наших исследований было изучение распределения ОР различных типов на лимфоцитах селезенки в модели стресс-вызванного подавления иммунного ответа к эритроцитам барана у мышей. В качестве стрессорного воздействия был использован тест горячей пластины (ТГП), который, как было показано ранее (Василенко и соавт., 1995), вызывает развитие опиоидзависимой. Непосредственно после ТГП, либо через 20 мин, 1 или 3 ч у животных определяли методом радиолигандного анализа общее количество ОР, а также их распределение по ц-, 5-, и к-типам на обогащенной лимфоцитами суспензии клеток селезенки (рис. 6). Общее количество ОР на лимфоцитах, оцениваемое по специфическому связыванию [3Н]налоксона, не меняется в течение 3 ч после

ТГП и составляет 150-200 расп./мин на 106 клеток, что было принято памп за 100%. При этом ТГП вызывает изменение соотношения типов ОР, оцениваемое по вытеснению [3Н]налоксона немечеными DAMGO, DSLET и U69,593. Максимальные изменения наблюдаются через 3 ч после ТГП. Доля к-рецепторов снижается с 50% до 18%, а доля ц- и 8-рецепторов увеличивается с 31" о до 45% и с 16% до 34% от общего опиоидного связывания соответственно (рис. 6).

Таким образом, подавление иммунного ответа, вызванное слабым стрессорным термораздражнтслем, коррелирует с уменьшением доли ОР к-тпна па лимфоцитах мышей и ростом доли ОР ц- и 8-тнпа.

Полученные результаты по влияшпо селективных опиоидных лнгандов на развитие гуморального иммунного ответа и определению уровня различных типов ОР на лимфоцитах методом радиолигандного анализа свидетельствуют о том, что функция ОР к-типа на лимфоцитах и их лнгандов связана со стимуляцией иммунного ответа, а ц- и 8-типа - с его ингнбпровапнем. Это согласуется с рядом данных, имеющихся в литературе (Johnson et al., 1982; Barreca et al., 1987; Fraker & Gang, 1987; Jankovic & Marie, 1987). Направленность эффектов опиоидов может зависеть от целого ряда факторов: дозы опиоидного лиганда, дозы митогена, времени их введения, исходного состояния животных (Roda et al., 1996). В настоящем исследовании показано, что тип ОР, через который реализуется эффект опиоидного лиганда, также играет существенную роль.

Молекулярные механизмы действия селективных опноидиых лнгандов па ранних л апах мнтогеиион активации лимфоцитов у мышей

Известно, что увеличение концентрации Са2+ в цитоплазме является одним из центральных событий в развитии цепи внутриклеточных реакций, связанных с активацией лимфоцитов (Gardner, 1989; Lewis & Cahalan, 1995). В связи с этим было изучено влияние селективных опиоидных лнгандов на изменение уровня внутриклеточного свободного Са2+ ([Ca2+]i) в лимфоцитах мышей в норме и при активации Т-клеточиым митогеном Кон А. Время инкубации опиоидов с клетками составляло 20 мини 2 ч.

Влияние селективных агонистов ¡л-, 5- и к-типов ОР на уровень внутриклеточного свободного Са2* в неактивированных лимфоцитах лимфатических узлов мышей.

К клеткам лимфатических узлов мышей линии СБА после встраивания флуоресцентного зонда фура-2 и регистрации начальной концентрации Са2+ в цитоплазме ([Са2+]|,о) добавляли опиоидные лиганды в диапазоне концентраций Ю-12-Ю-7 М. Через 20 мин повторно регистрировали концентрацию внутриклеточного Са2+ - [Са2+],,20'. Почти все исследованные концентрации опиоидных пептидов вызывают достоверное увеличение [Са2+]1 в лимфоцитах (табл. 2). Наиболее эффективными концентрациями для ОАМвО и ОБЬЕТ являются 1010 и 10-8 М, для динорфина А (1-13) (к-агонист) - 1012 и 1010 М. В пробах без добавления опиоидов уровень внутриклеточного Са2+ в течение 20 мин инкубации практически не меняется.

Таким образом, ц-, 5-, к-селективные опиоидные лиганды повышают уровень Са2+ в неактивированных лимфоцитах практически одинаково.

Таблица I.

Влияние оинондных пептидов на уровень внутриклеточного свободного Са2+ в лимфоцитах мышей линии СВА.

[Са2+]1,о (начальная), нМ |Са2+]1,20' (после 20 мин инкубации с оиноидом), нМ Онноидный лпганд

10"12 10-ч 10-к 10» 10-8 ю-7 концентрация, нМ

117±9 163 143 225 181 204 147 БАК-ЮО

116±13 169 185 221 145 236 161 ОБЬЕТ

120±13 214 187 204 201 154 116 Динорфин А (1-13)

Примечашя. Значения [Са2+],,о даны в виде среднего ± стандартное отклонение (п=10). Для э<|к})скт он опиоидо» представлены значения показательных экспериментов. Характер изменения уровня свободного Са2+ под действием опиоидов от эксперимента к эксперименту сохранялся.

Влияние ¡.I- и б-селективных опиоидных лигандов на уровень цитоплазматического свободного Са2+ в лимфоцитах, активированных Кон А.

Селективный ц-агонист БАМСО достоверно подавляет подъем [Са24} в лимфоцитах в ответ на Кон А в диапазоне концентраций 1013-10-8 М как при 20 мин (рис. 7), так и при 2 ч инкубации с лигандом (рис. 8а). Однако характер концентрационной зависимости различается. При 20 мин инкубации наблюдается резкое снижение ответа уже при низких дозах лиганда - 1012 и 10" М. Максимальное ингибирование на 75-80% достигается при 10 ", Ю 8 и 10 7 М. После 2 ч инкубации зависимость имеет более плавный характер с максимальным снижением ответа на 75% при концентрации лиганда 10-8 М. Ингибирующий эффект ОАМвО отменяется антагонистом ОР налоксоном (рис. 7).

ОБЬЕТ (6-агонист) также подавляет подъем [Са2+]1 в лимфоцитах, активированных Кон А (рис. 7, 86), но в меньшей степени по сравнению с ОАМОО. При 20 мин инкубации достоверное ингибирование наблюдается во всем исследованном диапазоне концентраций 10 |3-10-8 М с максимальным подавлением ответа на 55% при Ю-7 М (рис. 7). Добавление налоксона в концентрации Ю-5 М отменяет ингибирующий эффект лиганда (рис. 7). При 2 ч инкубации ОБЬЕТ в низких дозах не влияет на [Са2+]| в лимфоцитах, активированных Кои А. Достоверное снижение уровня внутриклеточного Са:+ отмечается при копией фациях лиганда Ю-9- 10 8 М (рис. 86).

Таким образом, исследованные ц- и 5-агонисты ОР вызывают увеличение [Са2+], в неактивнрованных лимфоцитах и ингибируют подъем Са2+ в ответ на Кон А.

Влияние к-селективного агониста динорфина А (1-13) на уровень цитоплазматического свободного Са2+ в лимфоцитах, активированных Кон А.

Характер действия динорфина А (1-13) на подъем [Са2+],, индуцированный Кон А, существенно различается в зависимости от времени инкубации с лимфоцитами. При 20 мин инкубации опноида в низких дозах наблюдается незначительная стимуляция, а в высоких - существенное ингибирование ответа лимфоцитов (рис. 9 А). Оба эффекта отменяются налоксоном. При 2 ч инкубации опноида в дозе 10"9 М происходит мощная стимуляция индуцированного митогеном кальциевого втока (рис. 9 Б).

Влияние селективных опиоидных агоннстов на изменение [Са2+], в лимфоцитах на ранних стадиях активации Кон А и отмена полученных эффектов антагонистом OP noijBqjayiaeT наличие функционально активных ОР на этих клетках.

Совокупность полученных данных свидетельствует, что активация ц- и 5-типов ОР селективными агонистами и увеличение их уровня на лимфоцитах коррелирует со снижением уровня Са2+ при активации Кон А и подавлением антителогенеза. Напротив, активация к-ОР на лимфоцитах селективными агонистами приводит, главным образом, к повышению уровня Са2+ при активации Кон А и стимуляции иммунного ответа клеток.

ВЫВОДЫ

1. В динамике развития первичного иммунного ответа на у-глобулин быка уровень налоксон-чувствительных рецепторов на иммунокомпетентных клетках мышей увеличивается в 6 раз, при этом, увеличение доли опиоидных рецепторов к-типа коррелирует с увеличением продукции антител, а увеличение доли ц- и 5-рецепторов - с ее снижением.

2. В динамике развития вторичного иммунного ответа на у-глобулин быка исходный уровень налоксон-чувствительных рецепторов на иммунокомпетентных клетках мышей в 6 раз превышает таковой при первичном ответе, доля опиоидных рецепторов к-типа существенно превышает долю ц- и 5-рецепторов, достигая максимального значения ко 2-му дню, и сохраняется на достаточно высоком уровне до 9-го дня иммунного ответа.

3. Селективные опиоидные лига иды ц-типа, DAMGO, и 8-типа, DSLET, подавляют, а к-лиганд U69.593 стимулирует продукцию антител к у-глобулину быка in vitro на пике первичного и вторичного иммунного ответа у мышей.

4. Подавление антителопродукции к эритроцитам барана, вызванное слабым стрессогенным термораздражением, сопровождается снижением доли опиошшых рецепторов к-типа и увеличением доли рецепторов ц- и о-типа на лимфоцитах у мышей.

5. Селективные агоннсты опиондных рецепторов ц-тнпа, DAMGO, и 8-типа, DSLET, дозозавпеимо снижают, а к-селективный агонист динорфин А (i-I3) модулирует уровень внутриклеточного свободного Са2+ в лимфоцитах, активированных конканавалнном А, у мышеи.

РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Гппоалгезия, индуцированная слабым стрессогенным воздействием, сопровождается снижением антнгелообразования и изменением соотношения типов опиондных рецепторов на иммунокомпетентных клеткахДДоклады академии наук-1995.- Т.340.-№5.-С.691-693. (Соавт. Л.А. Захарова, Метакса Е.Е., Василенко A.M.).

2. Опосредованное участие опиоидной системы в регуляции болевой чувствительности пептидными фрагментами МП1 и МП2.// Биохимия.-1996.-Т.61.- №.3.-С.440-444. (Соавт., Л.А. Захарова, Метакса Е.Е.)

3. Interrelationship of pain sensitivity and immune response in mice: changes in pain threshold, antibody production and ratio of ц.-, 8- and к-types of opioid receptors on spleen cells caused by hot plate test.//Analgesia-I996.-Vol.2.-N.2.-P.21-24 (Vasilenko A.V., Zakharova L.A, Metaxa E.E.).

4. Участие огшопдпы.х рецепторов лимфоцитов в сочетании* изменениях порога боли и иммунного ответа.//Материалы 1-го Российского конгресса по патофизиологии. М.-1996.-С.42. (Соавт. A.M. Василешсо, Л.А. Захарова, Е.Е. Метакса).

5. ц-, 8- and к-Opioid agonist modulation of Con A stimulated cytoplasmic free

Ca2+ increase in mouse lymphocytes. General Program of The 3-rd International congress of International sosiety for neuroimmunomodulation, Bethesda, USA, 1996, P. 80. (Molotkovskaya, I.M., Zakharova, L.A)

6. к- and ц-Opioid ligands inhibit [3H]naloxone binding on murine lymphocytes in opposite manner during the humoral immune response development. Immunopharmacol. Immunotoxicol., 1997 (in press). (Zakharova L.A, Dubinin K.V., Gavrilova E.M., Alekseev T.A., Zaitsev S.V.)

5 500

Г

6 8 10 Дни з

Рис. 1. Изменение специфического связывания [ Н]налоксона с клетками лимфатических узлов мышей в динамике развития первичного иммунного ответа на БГГ (-♦-). Контролем служили неиммунизированные животные (-О- )■

Данные представлены в виде среднего + стандартное отклонение (п=5). *р<0,05 по критерию Стьюдента.

о

ш

(О X

с о га о.

а>

X

а> х о 0) н: л

ш

300 250 200 150 100 50 0

I I р- (ЭАМСО) [22 5- (031_ЕТ) к- (1)69,593)

1

71 / /

Дни

8

13

I

И /

/ / / /

У / / / / / / / /

14

Рис. 2. Ингибирование связывания [ Н]налоксона на клеткахах лимфатических узлов селективными опиоидными лигандами в динамике развития первичного иммунного ответа на БГГ у мышей. Данные представлены в виде среднего ± стандартное отклонение (п=5). *р<0,05 по критерию Стьюдента

с о

(О

о.

(Ц ^

X

я ю л п

к со о

3"

(и с О

600 -

500

400

300

0

4 Дни

8

10

ис. 3. Изменение специфического связывания [ Н]налоксона с клетками имфатических узлов мышей в динамике развития вторичного иммунного гвета на БГГ (-#-). Контролем служили животные без повторной ммунизации (-О-)-

энные представлены в виде среднего + стандартное отклонение (п=5). »<0,05 по критерию Стьюдента.

го

X

1

2

с

0 го

о.

ф"

^

1

ш

I

о си

со

500 -л

400

300 -

200

С

ц- (ЭАМСО)

8- (051_ЕТ) . И К- (1)69,593) I

XI!

100

%

/ц

I

1 I

I

'4

I

I й

и

/I у

И-,

/Ш

о

1

т

5

I

I

к-1 Ущ /Ш

<1

Дни

8

Р

И

/г

9

Рис. 4. Ингибирование связывания [ Н]налоксона на клеткахах лимфатических узлов селективными опиоидными лигандами в динамике развития вторичного иммунного ответа на БГГ у мышей. Чанные представлены в виде среднего + стандартное отклонение (п=5). 'р<0,05 по критерию Стьюдента

160 -140 -120 -100 -80 -60 40 -20 -0

I

10

•12

[771 ОАМСО(и) Е83 031_ЕТ(6) иб9,593 (к)

Концентрация лигандов, М

а> &

Ф о

40 -

А

10"12 10"|и 10" Концентрация лигандов, М Рис. 5. Влияние селективных опиоидных лигандов на антителопродукцию на 7-ой день первичного (А) и 5-й день вторичного (Б) иммунного ответа на БГГ.

Величина оптической плотнности в контроле составила А492=1,44 (А) иА492=1,57(Б).

Значения представлены в виде среднего+стандартное отклонение (п=4) *р<0,05 по критерию Стьюдента.

о с; га х

о;

X ГО со л п а;

8 аз

X X

2

8.

ю

£ X

О 1/3 1

Время после ТГП, ч

Рис. 6. Интбирование связывания [3Н]налокеона с лимфоцитами селезенки селективными опиоидными лигандами после ТГП у мышей. Данные представлены в виде среднего + стандартное отклонение (п=6). *р<0,05 по критерию Стьюдента

лиганд, [М]

Рис. 7. Влияние селективных опиоидных лигандов ц- (ОА1\/ЮО —) и 8-типа (ОБЬЕТ—) на уровень внутриклеточного свободного Са2* в лимфоцитах, активированных Кон А, при 20-ти минутах инкубации с лигандами. ( О )РАМСО + налоксон; ( Д ) РБЬЕТ + налоксон Налоксон использовали в концентрации 10"6 М, эффект антагониста составил 145%.

Значения контроля (-о- ) представлены в виде среднего ± стандартное отклонение п=5.

оамво, [м]

б

озьет, [м]

Рис. 8. Влияние селективных опиоидных лигандов ц- (А) и 5-типа (Б) на уровень внутриклеточного свободного Са2* в лимфоцитах, активированных Кон А, при 2-х часовой инкубации с лигандами. Значения контроля (• - О - • ) представлены в виде среднего ± стандартное отклонение (п=5).

Динорфин А (1-13), [М]

Динорфин А (1 -13), [М]

-✓.с. 9. Влияние к-агониста динорфина А (1-13) на уровень внутриклеточного свободного Са2* в лимфоцитах, активированных Кон А, при 20-ти минутной (А) и 2-х часовой инкубации (Б) с лигандом. ( О) динорфин А (1-13) + налоксон 10"5 М. Эффект 10"5 М налоксона составил 145 %.

Значения контроля (--□--) представлены в виде среднего ± стандартное отклонение (п=5).