Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Взаимосвязь липидного фенотипа и состояния клеточного звена иммунного гомеостаза у мужчин с начальными проявлениями нарушений кровоснабжения мозга

Актуальность проблемы изучения клеточных иммунных механизмов и их взаимосвязи с липидным профилем сыворотки крови при начальных проявлениях нарушений кровоснабжения мозга определяется важным значением атерогенных нарушений липидного спектра, как важного модифицируемого фактора риска развития хронических цереброваскулярных заболеваний (ХЦВЗ) и связана с широким распространением в мире данной патологии (Виленский Б.С., 2000; Верещагин Н.В., Варакин Ю.Я. 2001; Смирнов В.Е., Манвелов, 2001; Альтман Д.Ш., 2004). Согласно данным Госкомстата России цереброваскулярная патология занимает второе место в ряду главных причин смертности и имеет неуклонную тенденцию роста в современном обществе, являясь ведущей причиной инвалидизации населения в экономически развитых странах, что определяет ее как одну из важнейших медицинских и социальных проблем (Липовецкий Б.М., 1997; 2000; 2001; Манвелов Л.С. и соавт., 1995, 1999; Еленков Ю.Н., Мартынов А.И., Оганов Р.Г, 2003; Харченко В.И., 2005).

Начальные проявления нарушений кровоснабжения моза (НПНКМ) относятся к клиническим проявлениям хронической цереброваскулярной недостаточности, выделены в качестве самостоятельной нозологической единицы (Шмидт Е.В.,1985) и регистрируется в 60 - 75% случаев выявленных ХЦВЗ у мужчин трудоспособного возраста (Манвелов Л.С., Ю.Я. Варакин с соавт., 1999). В связи с этим, особое значение придается своевременной диагностике и адекватному лечению больных именно с начальными формами недостаточности кровоснабжения мозга, создающих реальную возможность снижения заболеваемости инсультом (Манвелов Л.С., 1999; Верещагин Н.В. и соавт., 2001; Липовецкий Б.М., 1997, 2000, 2001; Альтман Д.Ш., 2004).

Главными общепризнанными факторами риска возникновения хронической цереброваскулярной недостаточности и, в частности НПНКМ, являются системные нарушения кровообращения, которые связаны с развитием атеросклероза и гипертонической болезни (Манухина Е.Б, и соавт., 2002; Альтман Д.Ш., 2004; Puddu P., et al, 2000; G. Hansson., 2001).

Если в настоящее время нарушения липидного обмена (В.Н. Титов 2000; JI.M. Доборджгинидзе. и соавт., 2000; В.А. Нагорнев., О.А. Яковлева., 2001; Рагино Ю.И. 2004; Nicoletti А., 2000), и артериальная гипертензия (Е.Б. Манухина и соавт., 2002; Kistler J.P. et al., 1994; Puddu P. et al, 2000; Shao J., 2003) признаны ведущими факторами риска развития системной сосудистой патологии, то роль иммуноопосредованных механизмов в патогенезе поражения сосудистой сети, в развитии воспаления на ее уровне, остается наименее исследованной. (Ross, 1999; Waldmann, 1999; Dumoutier et al., 2000; Hansson G.K., 2001; Maseri A., 2002).

Вместе с тем постулировано, что в патогенезе развития атеросклероза иммуноопосредованные механизмы повреждения на локальном и системном уровнях принимают активное участие. Наличие сдвигов в популяционном составе иммуноцитов, нарушение цитокинового баланса, формирование неоантигенов, могут являться триггером развития эндотелиальной дисфункции. Особое значение специалистами придается иммунным клеткам моноцитам-макрофагам, которые являются эффекторами атеросклеротического поражения (Nicoletti А., 2000; Zhou, et al., 2001).

Именно поэтому оценка функциональных свойств иммуноцитов (лимфоцитов и моноцитов/макрофагов) на начальных стадиях формирования хронической цереброваскулярной недостаточности представляется крайне важной, поскольку ранние проявления иммунного аллостаза могут играть роль предикторов в развитии системной и локальной сосудистой патологии.

Настоящяя работа является фрагментом комплексного многолетнего исследования в области нейроиммунологии проводимого на базе Челябинского областного клинического терапевтического госпиталя для ветеранов войн и лаборатории нейроиммунологии ИИиФ УрО РАН под руководством проф. С.Н. Тепловой и посвящена анализу клеточного звена иммунитета при начальных проявлениях нарушений кровоснабжения мозга (НПНКМ) при разных типах гиперлипопротеидемий.

Цель исследования: лабораторный анализ липидного спектра, количества и функциональной активности иммунных клеток крови для определения патогенетически значимой взаимосвязи липидного фенотипа с изменениями состояния клеточного компартмента иммунного гомеостаза при начальных проявлениях нарушений кровоснабжения мозга (НПНКМ) у мужчин 30-40 лет.

Задачи:

1. Изучить показатели липидного спектра сыворотки крови у мужчин 3040 лет с начальными проявлениями недостаточности кровоснабжения мозга (НПНКМ).

2. Изучить популяционный и субпопуляционный спектр лимфоцитов крови у больных с НПНКМ.

3. Провести оценку процессов позитивной и негативной активации и апоптоза иммуноцитов у больных с начальными проявлениями недостаточности кровоснабжения мозга при разных типах липидного спектра сыворотки крови.

4. Определить количество моноцитов (МО) в циркуляции и их функциональную активность в условиях культивирования in vitro у пациентов с начальными проявлениями недостаточности кровоснабжения мозга при разных вариантах липидного профиля сыворотки крови.

5. Определить базовый уровень сывороточных цитокинов (IL-lp, IL-8, TNF-a, IL-2, VEGF-(5) и оксида азота у пациентов с начальными проявлениями недостаточности кровоснабжения мозга при разных типах липидного спектра сыворотки крови.

6. Изучить в условиях in vitro спонтанную и индуцированную продукцию моноцитами хемокина (IL-8) и оксида азота у больных с начальными проявлениями недостаточности кровоснабжения мозга, имеющих различный фенотип липидного спектра сыворотки крови. 7. Провести корреляционный анализ для выявления взаимосвязей между показателями липидного спектра сыворотки крови пациентов и состоянием клеточного компартмента иммунитета. Научная новизна исследования

Впервые выявлены количественные и функциональные особенности мононуклеарных клеток у мужчин 30-40 лет с НПНКМ при разных типах липидного спектра сыворотки крови. Новыми являются данные о максимальных изменениях иммунного гомеостаза у пациентов с НПНКМ при наиболее атерогенным типе ГЛП ПБ. Возмущающее воздействие на иммунный гомеостаз данного типа ГЛП подтверждается ростом численности популяций Т-лимфоцитов, снижением числа клеток с признаками апоптоза, ростом количества моноцитов с усилением их адгезивной, НСТ- и нитроксидергической активности, ростом уровня провоспалительных (TNF-а, IL-8, IL-ip) и регуляторных (IL-2) цитокинов в сыворотке, изменением характера межсистемных корреляционных связей между липидными и иммунными показателями крови. Новыми являются данные о наличии достоверных сильных, положительных корреляционных взаимосвязей между уровнем продукции метаболитов N0 в сыворотке и их содержанием в супернатанте культивируемых моноцитов при всех изучаемых типах ГЛП, что отражает участие моноцитов в изменении нироксидергических процессов на уровне системного кровотока.

Теоретическое и практическое значение работы состоит в углублении существующих представлений о роли иммуноопосредованных механизмов в патогенезе ранних стадий формирования хронической цереброваскулярной недостаточности, ассоциированной с разными типами липидного спектра сыворотки крови. Выявление активации лимфо- и моноцитопоэза, усиления цитокин- и нитроксидергических процессов, проявляющих корреляционную зависимость с липидными показателями крови, особенно при наиболее атерогенных вариантах дислипидемии, отражают взаимосвязь дислипидемии у мужчин среднего возраста при НПНКМ с состоянием клеточного компартмента иммунного гомеостаза и их вероятную совокупную роль в качестве факторов риска в развитии ранних форм хронической цереброваскулярной патологии.

Положения, выносимые на защиту:

1. Изменение популяционного и субпопуляционного спектра лимфоцитов, количества и функциональной активности моноцитов, цитокин- и нитроксидергических процессов у пациентов с НПНКМ зависит от липидного фенотипа сыворотки крови и максимально при ГЛП НБ.

2. Нормолипидемия, как у здоровых лиц, так и у пациентов с НПНКМ характеризуется оптимумом взаимодействия иммунных и липидных показателей, о чем свидетельствует максимальное число межсистемных корреляций и превалирование связей отрицательного характера.

3. Атерогенные нарушения липидного спектра сыворотки крови у пациентов с НПНКМ влияют на формирование иммунного гомеостаза и определяют меньшую согласованность изучаемых систем, о чем свидетельствует снижение числа корреляционных связей, изменение их характера и знака.

4. В изменении цитокин- и нитроксидергических процессов при нарушении липидного спектра сыворотки крови у пациентов 30-40 лет с НПНКМ принимают участие моноциты периферической крови.

Внедрение

По теме диссертации опубликовано 9 научных работ. Материалы диссертации внедрены в диагностическую работу Челябинского областного клинического терапевтического госпиталя для ветеранов войн. Основные положения диссертации внедрены в учебный процесс на кафедре иммунологии и аллергологии Челябинской государственной медицинской академии в разделе нейроиммунологии.

Апробация диссертации: материалы исследования докладывались на научно-практической конференции, посвященной имени академика Гракова Б.С. (Красноярск, 2003), научно-практической конференции, посвященной 80-летию заслуженного деятеля науки РФ, проф. Глубокова Д.А. (Челябинск, 2003), на Объединенном иммунологическом форуме (Екатеринбург, 2004) и III, IV конференциях Иммунологов Урала (Челябинск, 2003; Уфа, 2005).

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 163 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы материалов и методов исследования, четырех глав собственных исследований, заключения, выводов и списка цитированной литературы. Иллюстрирована 4 рисунками и 29 таблицами. Библиографический список литературы содержит 233 источника (40 отечественных и 193 зарубежных).

ВЫВОДЫ

1. У мужчин 30-40 лет с впервые установленным диагнозом начальных проявлений нарушений кровоснабжения мозга (НПНКМ), нормолипидемия выявлена у 11,7% пациентов, в 88,5% случаев зарегистрированы атерогенные" нарушения липидного спектра сыворотки крови с частотой: гиперлипопротеидемия (ГЛП) IIA типа - в 29,8 %; ГЛП ПБ типа - в 28,7%; ГЛП IV типа - в 29,8% случаев.

2. У пациентов с НПНКМ имеющих нормолипидемию изменения в популяционном и субпопуляционном спектре лимфоцитов проявлялись достоверным увеличением количества CD3+ и CD4+ лимфоцитов в сравнении с контрольной группой; более низким числом клеток с рецепторами адгезии (CD18) и сывороточным уровнем TNF-a в сравнении с группами с ГЛП НА и ГЛП ПБ типов.

3. У пациентов с НПНКМ имеющих ГЛП IIА типа установлен достоверный рост CD3+, CD4+, CD95+, CD45RA+, С018+лимфоцитов в сопоставлении с контрольной группой, максимальный по своему значению индекс реализации апоптоза, достоверное повышение абсолютного и относительного числа моноцитов в циркуляции, усиление их адгезивных свойств, спонтанной и индуцированной НСТ-активности, продукции конечных метаболитов N0 и повышение сывороточного уровня TNF-a.

4. Мужчины с диагнозом НПНКМ с ГЛП ПБ типа, имели самые выраженные изменения иммунного гомеостаза. В сопоставлении с контрольной группой у них установлен достоверный подъем абсолютного числа лимфоцитов CD3+, CD4+, CD45RA+, CD 18+ и относительного числа CD95+ клеток, достоверное снижение числа лимфоцитов с морфологическими признаками апоптоза, падение индекса реализации апоптоза, рост количества моноцитов, их адгезивной, спонтанной и индуцированной НСТ-активности, продукции NO, увеличение количества сывороточных провоспалительных цитокинов: TNF-a, IL-8, IL-ip, а также уровня IL-2.

5. Среди пациентов с НПНКМ, имеющих нарушения липидного спектра сыворотки крови, при ГЛП IV типа выявлены наименьшие изменения параметров иммунной системы, характеризующиеся достоверным ростом абсолютного числа CD3+, CD4+ популяций Т-лимфоцитов, ростом N0 в сыворотке, увеличением абсолютного и относительного количества моноцитов в циркуляции, усилением процессов их адгезии, повышением спонтанной и индуцированной НСТ-активности.

6. Наиболее тесное взаимодействие и взаимосвязь между изучаемыми параметрами иммунной системы и липидного спектра сыворотки крови установлено при нормолипидемии, как в контрольной группе, так и у пациентов с НПНКМ, при этом выявлено максимальное число достоверных межсистемных корреляционных связей с преобладанием (до 80%) доли отрицательных корреляций.

7. При изучаемых типах гиперлипопротеидемий у пациентов с НПНКМ установлено значительное уменьшение числа межсистеимных (иммуно-липидных) достоверных корреляционных связей, с превалированием позитивных корреляций, а также с выявлением связи уровня атерогенных липидов с количеством цитотоксических клеток, провоспалительных факторов (цитокинов и продукции активных форм кислорода) при наиболее атерогенном варианте ГЛП ПБ.

8. В системе in vitro, моноциты пациентов с ГЛП, в сравнении с моноцитами лиц с нормолипидемией, характеризуются более интенсивной продукцией хемокина IL-8 при стимуляции ЛПС и провоспалительными цитокинами и чувствительны к ингибиторному влиянию TGF-p (при ГЛП ПБ и ГЛП IV) на продукцию IL-8.

9. Позитивный характер корреляционных связей между уровнем конечных стабильных метаболитов оксида азота в сыворотке и культуральной жидкости при спонтанной и индуцированной продукции моноцитами пациентов в условиях in vitro отличает группу пациентов с НПНКМ при ГЛП всех типов от группы контроля и пациентов с нормолипидемией и отражает участие моноцитов в росте уровня сывороточного оксида азота при дислипидных фенотипах.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Цереброваскулярная патология, согласно данным Госкомстата России, занимает второе место в ряду главных причин смертности (В.И. Харченко, 2005), и имеет неуклонную тенденцию роста в современном обществе. На фоне ХЦВЗ, по данным проспективных наблюдений, достоверно чаще развиваются острые нарушения мозгового кровтока, которые являются не только ведущей причиной смертности, но и приводят к стойкой инвалидизации, утрате трудоспособности. В условиях современной демографической ситуации, с увеличением доли пожилых и старых людей в структуре населения индустриально развитых стран, проблема ХЦВЗ приобретает важнейшее медико-социальное значение (Верещагин Н.В., Варакин Ю.Я., 2001; Липовецкий Б.М. 2001; Виленский Б.С. с соавт., 2000; Манвелов Л.С. и соавт., 1998; Еленков Ю.Н., Мартынов А.И. Оганов Р.Г., 2003).

Особо актуальной является эта патология для мужчин, которые по данным эпидемиологических исследований переносят инсульты в молодом возрасте чаще, чем женщины, в среднем на 30% (Еленков Ю.Н., Мартынов А.И. Оганов Р.Г., 2003). Отмечен повсеместный рост этой патологии среди лиц молодого и среднего возраста. Поэтому, изучение мало исследованных на сегодня патогенетически значимых механизмов, состояния гомеостатических систем организма в т.ч. иммунной, представляется значимым для уточнения существующих представлений о роли иммуноопосредованных реакций в патогенезе заболевания, для оптимизации своевременной диагностики и раннего назначения рационального и обоснованного лечения данной категории больных. Анализ иммунологических аспектов патогенеза ранних форм ХЦВЗ при наличии у пациентов нарушений липидного спектра сыворотки крови является перспективным в определении мишеней для фармакологического контроля заболевания, предупреждения его прогрессии в более тяжелые формы (Манвелов Л.С., 1999; Верещагин Н.В., Варакин Ю.Я. 2001; Альтман Д.Ш., 2004).

Общепризнанными факторами риска развития хронических цереброваскулярных заболеваний и, в частности НПНКМ, являются системные нарушения сосудистой сети атеросклеротнческого характера. Нарушения липидного обмена обнаруживаются уже на самых ранних стадиях ХЦВЗ, степень выраженности которых возрастает по мере увеличения гемодинамических расстройств в головном мозге (Манвелов JI.C. с соавт., 1999; Манухина Е.Б.с соавт, 2002; Альтман Д.Ш., 2004; Puddu P. et al., 2000; G.K. Hansson., 2001). В настоящее время существенное значение в патогенезе развития атеросклеротнческого поражения сосудов придается иммуноопосредованным механизмам воспаления (Ross R., 1999; Dumoutier L. et al., 2000; Hansson G.K., 2001; Maseri A., 2002). С этих позиций атеросклероз рассматривают как заболевание, связанное с дисфункцией мононуклеаров крови и сопровождающееся формированием хронического Thl-зависимого воспаления в стенке сосуда. Особая роль принадлежит моноцитам/макрофагам, которые признаны эффекторами атеросклеротнческого поражения. Отдельными исследованиями показано взаимное регуляторное влияние компонентов липидного обмена и иммунных клеток. (Nicoletti A., Paulsson et al., 2001; Zhou et al., 2001). Именно поэтому, оценка количества и функциональных свойств мононуклеарных иммунных клеток и их взаимосвязь с показателями липидного спектра сыворотки крови на ранних стадиях формирования хронической цереброваскулярной патологии представляется крайне важной, поскольку ранние признаки изменения характера иммунного гомеостаза могут играть роль предикторов в развитии данной патологии.

Настоящая работа является фрагментом комплексного нейроиммунологического исследования проводимого в рамках государственной научной программы «Иммунологические аспекты патогенеза возрастных особенностей течения заболеваний и преждевременного старения организма» (№ гос. регистрации: 01.200.202.388.) на базе лаборатории нейроиммунологии Института иммунологии и физиологии УрО РАН и Челябинского областного клинического терапевтического госпиталя для ветеранов войн. Работа посвящена изучению мало исследованных сторон патогенеза НПНКМ, касающихся соотношения процессов позитивной и негативной активации иммуноцитов и дисбаланса секреторных провоспалительных продуктов при сопутствующих нарушениях липидного спектра сыворотки крови. Нами проведено лабораторне иммунологическое обследование пациентов с НПНКМ, у которых был верифицирован тип липидного спектра сыворотки крови. Всего в исследование включено 118 мужчин в возрасте от 30 до 40 лет.

Основную группу исследования (87 человек) составили лица с диагнозом НПНКМ, средний возраст которых 40,3 ± 0,47 года. Контрольную группу составил 31 мужчина, в возрасте от 30 до 40 лет, средний возраст 38,97 ± 1,14 года, без признаков ХЦВЗ, не имеющих нарушений липидного спектра сыворотки крови и не имеющих симптомов артериальной гипертензии. Критериями исключения для обеих групп являлись острые заболевания и обострение хронических процессов, наличие АГ. В обеих группах, приблизительно у 1/3 включенных в исследование пациентов встречалась сопутствующая хроническая соматическая патология вне обострения преимущественно в виде хронических заболеваний желудочно-кишечного тракта (гастриты, колиты), реже заболеваний бронхолегочной системы.

Диагноз начальных проявлений нарушения кровоснабжения мозга (НПНКМ) установлен при обследовании пациентов клиническими специалистами госпиталя в соответствии с существующими стандартами диагностики НПНКМ и в соответствии с классификацией сосудистых поражений головного и спинного мозга и диагностическими клиниконеврологическими критериями, разработанными в НИИ неврологии РАМН (Шмидта Е.В., 1985).

У пациентов, включенных в основную группу, в течение последних 3 месяцев, не реже 1 раза в неделю появлялись 2-3 жалобы: головная боль, головокружение, шум в ушах, снижение памяти и работоспособности. Жалобы возникали при обстоятельствах, сопровождающихся повышенной потребностью в кровоснабжении мозга (в условиях усиленной умственной нагрузки, информационного стресса, переутомлении), имели свойство нарастать при продолжении работы и уменьшались после отдыха. Неврологический статус характеризовался отсутствием симптомов очагового поражения нервной системы. Диагноз НПНКМ во всех случаях был верифицирован на основании неврологического, офтальмологического, инструментального исследования (биомикроскопии бульбарной коньюнктивы, ультразвуковой экстра- и транскраниалыюй допплерографии).

Всем без исключения пациентам проводилось исследование липидного спектра сыворотки крови. Взятие крови из вены производилось после 12-часового интервала в приеме пищи. Определение концентрации основных показателей липидного обмена (ОХС, ТГ, ХС-ЛПВП) проводилось стандартными энзиматическими колориметрическими методами на полуавтоматическом анализаторе ФП901М (Финляндия) с помощью наборов реагентов фирмы «Labsystems» (Финляндия). Показатели ХС ЛПНП и ХС ЛПОНП вычислялись по формуле Friedwald W.T. (1975). Всем пациентам с нарушениями липидного спектра сыворотки крови проводились дополнительные клинико-лабораторные исследования для исключения вторичных гиперлипидемий, которые развиваются на фоне диабета, гипотиреоза, обструктивных заболеваний печени, нефротическом синдроме и пр. По данным анамнеза, исключались семейные формы комбинированной ГЛП и случаи приема лекарственных препаратов, влияющих на липидный обмен.

Числовые критерии нормолипидемии и ГЛП при формировании изучаемых групп были взяты из материалов третьего доклада экспертов Национальной образовательной программы по холестерину в США, National Cholesterol Education Program, NCEP (2001). Деление больных на группы по типу ГЛП проводилось согласно классификации типов ГЛП, разработанной D. Fredrikson и соавторами, и одобренной экспертами ВОЗ (Beamont J. et al., 1970), которые выделяют пять типов ГЛП. В нашем исследовании было 3 типа ГЛП: IIA, ПБ, IV.

Нормолипидемии; 11,7%

НБ тип; 28,70%

Рисунок 4. Частота выявления различных типов ГЛП у пациентов с НПНКМ

Частота встречаемости различных типов ГЛП среди пациентов с НПНКМ, в т.ч. и количество пациентов, имеющих нормолипидемию, представлена на рис. 4.

Пациенты с НПНКМ, имеющие нормолипидемию, составляют 10 человек (11,7%). Среди 87 пациентов с НПНКМ, 77 мужчин (88,5 %) имели различные нарушения липидного обмена.

Пациентов с НПНКМ, имеющих IIA тип гиперлипопротеидемии, было 26 пациентов, что составило 29,8%. IIА тип характеризуется высоким содержанием общего ХС сыворотки более 6,5 ммоль/л, уровнем ХС-ЛНПН более 5,0 ммоль/л и нормальным уровнем ТГ.

Пациентов с НПНКМ, имеющих ГЛП ПБ тип липидограммы, было 25 (28,7%). Для этого типа характерны высокая концентрация общего холестерина (более 6,5 ммоль/л), триглицеридов (более 2,3-2,5 ммоль/л), а также высокое содержание ХС-ЛПНП и ХС-ЛПОНП. По мнению Климова А.Н., Никульчевой (1999), гиперлипопротеидемия ПБ типа является наиболее атерогенным вариантом ГЛП, поскольку сочетает в себе повышенные уровни ОХС, ТГ и ХС-ЛПНП, и в нашем исследовании была определена у 1/3 пациентов с НПНКМ. Brewer Н.В., (1999) показал, что триглицериды являются независимым фактором риска развития системного атеросклероза. Lemieux I., (1999) отмечено, что насыщенные триглицеридами липопротеины (ЛПОНП, ЛППП) ассоциируются с прогрессированием раннего атеросклероза.

Пациентов с НПНКМ, у которых выявлен IV тип ГЛП, было 26 человек (29,8%). Этот тип характеризуется высоким содержанием ХС-ЛПОНП, повышенной концентрацией ТГ (более 2,3-2,5 ммль/л) в сочетании с нормальным или несколько повышенным уровнем общего ХС (не более 6,36,5 ммоль/л).

В целом частота встречаемости отдельных ГЛП типов (ПА, ПБ, IV), как видно из рис.4, у мужчин 30-40 лет с НПНКМ была практически одинаковой и составляла около 30% каждый.

Исходя из поставленных задач, и, принимая во внимание значение дислипидемических расстройств в формировании хронической цереброваскулярной недостаточности, нами были изучены популяционный и субпопуляционный состав лимфоцитов, процессы позитивной и негативной активации иммунокомпетентных клеток, апоптоз лимфоцитов, проанализированы количественные и функциональные характеристики моноцитов- эффекторов атеросклеротического поражения сосудов у пациентов с НПНКМ в целом (без учета типа ГЛП) и при различных типах нарушений липидного спектра сыворотки крови.

В результате установлены некоторые особенности функционирования иммунной системы пациентов с НПНКМ в целом в группе и с разными вариантами нарушений липидного спектра сыворотки крови.

В целом в группе пациентов с НПНКМ в сравнении с контрольной группой наблюдался рост абсолютного числа Т- лимфоцитов, Т-хелперов, лимфоцитов «наивного фенотипа» CD45RA. Рост количества этих клеток, а особенно популяции CD45RA может свидетельствовать об усилении процессов лимфопоэза в центральных органах иммунной системы, т.к. эта популяция состоит из клеток «наивного фенотипа» и характеризует антиген-независимую стадию развития иммуноцитов. Увеличение этой популяции может также отражать усиление миграции лимфоцитов из центральных в периферические органы иммунной системы в результате изменения уровня хематтрактантов, гомеостатических параметров крови в результате различных, в т.ч. дисметаболических процессов. Кроме того, отмечено повышение относительного количества клеток с маркерами негативной активации лимфоцитов (CD95) и рецепторами адгезии (CD 18). Принципиально количественные вариации относительных показателей гемограммы и иммунограммы отражают изменения количества клеток в кровотоке, перераспределительного характера, связанного с миграцией клеток.

Frostegard J. et al. (1999); Kaski J.C., Zouridakis E.G. (2001); Goran K. Hansson, (2001) указали на ключевую роль цитокинемии при атерогенном поражении сосудистой стенки и прогрессии Thl-зависимого иммунного воспаления сосудистой стенки. В связи с этим, нами были изучены не только количество лимфоцитов, экспрессирующих разные рецепторы, но и уровни флогогенных цитокинов, секретируемых макрофагами и ТЫ-лимфоцитами и уровень ростового фактора - васкулоэндотелиального фактора роста (TNF- а,

IL-8, IL-lp, IL-2, VEGF) в сыворотке крови пациентов с НПНКМ в целом в группе, а затем и в зависимости от типа ГЛП.

В общей группе больных с НПНКМ (без учета липидного профиля сыворотки крови) нами установлено достоверное повышение уровней сывороточных цитокинов провоспалительного действия: TNF- а и IL-8.

TNF-a - полифункциональный цитокин, вызывает генерацию в клеточной мембране активных форм кислорода, супероксид-анион радикалов, а также оксида азота, оказывая цитотоксическое действие на эндотелий, усиливая экспрессию на нем молекул адгезии, активирует макрофаги, нейтрофилы, усиливает секрецию простагландинов, оказывает хемотаксическое действие на различные клетки, способствует синтезу белков острой фазы воспаления, а также индуцирует Fas-зависимый апоптоз (Saren P. et al., 1996; Sack М., 2002).

Интерлейкин-8 относится к особой группе СХС- или а-иммунорегуляторных пептидов-хемокинов, синтезируется в основном, моноцитами/макрофагами и эндотелиоцитами (Cruikshank W.W. et al., 2000.). Основными индукторами его синтеза выступают бактериальные липополисахариды, провоспалительные цитокины, факторы свертывания крови, а также модифицированные (окисленные) липопротеиды в процессе формирования атеросклеротнческого повреждения (Bonecchi R. et al., 2000; Opal S.M. et al., 2000; Simonini A. 2004). Согласно данным литературы, хемокины производятся эндотелиальными клетками, эпителиоцитами, макрофагами интимы в процессе формирования атеросклеротнческого повреждения (Torzewski J. et al., 1996; Cruikshank W.W. et al., 2000). IL-8 способен усиливать адгезивность эндотелия, лимфоцитов и моноцитов, j вызывать направленную миграцию нейтрофилов (Simonini A. et al., 2000)

Существенного подъема уровня провоспалительного цитокина IL-ф в сыворотке у пациентов с НПНКМ нами не было обнаружено. Напротив, его уровень был несколько ниже, чем в контрольной группе, хотя различия не достигали степени статистической достоверности. Gottsater A. et al., (2002) показал у людей в области атеросклеротически измененных тканей усиление местной продукции IL-1, локальная секреция IL-1 служит для поддержания активного провоспалительного ответа (Garcia G.E. et al., 2000; Stanford S.J.et al., 2000).

Изменений уровня IL-2, основными продуцентами которого являются активированные Thl(CD4+)- лимфоциты нами установлено не было. Количество васкулоэндотелиального фактора роста-Р (VEGF-P) в сыворотке пациентов с НПНКМ достоверно не отличалось от нормы. Вероятно, этот цитокин растет и приобретает важное патогенетическое значение на более поздних стадиях формирования ХЦВЗ, когда срочные механизмы компенсации гипоперфузии сосудов головного мозга и связанной с ней гипоксии исчерпывают свои возможности для обеспечения адекватного кровотока. В этом случае реализуются долгосрочные механизмы компенсации в виде усиления неоангиогенеза и других проявлений ремоделлинга церебральных сосудов, в которых участвует данный фактор роста (Neufeld G. et al., 1999).

Исходя из того, что часть анализируемых нами цитокинов продуцируется не только лимфоцитами, но и другими клетками мононуклеарного ряда (моноцитами и макрофагами), а также, учитывая важное значение последних в иммунноопосредованных процессах воспаления, далее нами был проведен анализ количества и функции моноцитов у больных с НПНКМ в общей группе.

Нами установлено достоверное увеличение абсолютного и относительного количества моноцитов у пациентов в общей группе пациентов с НПНКМ, которое сопровождалось усилением адгезивных свойств клеток, выявляемых при спектрофотометрической оценке адгезии мононуклеаров. Согласно литературным данным (Springer Т.А., 1994.) в процессе инициальных атеросклеротических событий происходит усиление экспрессии молекул адгезии LFA-1 (CD1 la/CD 18) и Мас-1 (CD1 lb/CD 18) на мононуклеарах.

Об активации моноцитов свидетельствуют не только показатели адгезии клеток, но и рост спонтанного и индуцированного НСТ- теста моноцитов больных с НПНКМ, оцененных нами также спектрофотометрически, в сопоставлении с показателями контрольной группы. Рост НСТ-активности отражает повышение внутриклеточной продукции активных форм кислорода.

В соответствии с общим планом работы далее был проведен анализ популяционного и субпопуляционного состава лимфоцитов, характера цитокинемии, а также определены количественные и функциональные характеристики моноцитов у пациентов с НПНКМ, имеющих разные профили липидного спектра сыворотки крови: нормолипидемический и ГЛППА, ПБ, IV типов.

В группе пациентов с НПНКМ с нормолипидемическим профилем, изменения спектра лимфоцитов по сравнению с контрольной группой мужчин того же возраста, но без симптомов НПНКМ, без общих заболеваний сосудистой системы, были минимальными и характеризовались увеличением абсолютного числа двух популяций лимфоцитов CD3+ и CD4+. У больных с нормолипидемией выявлен более низкий уровень в циркуляции абсолютного и относительного количества лимфоцитов, экспрессирующих рецепторы адгезии (CD 18), в сопоставлении с больными, имеющими ГЛП IIA и ПБ тип, что отражает менее выраженную активацию лимфоидных клеток в условиях нормолипидемии. Количество TNF- а в этой группе также оказалось минимальным и было достоверно ниже, чем у пациентов с НПНКМ со НА и ПБ типами ГЛП. Количество IL-lp, IL -8 и IL-2 у больных этой группы достоверно не отличалось от других групп, включенных в исследование.

У пациентов с НПНКМ со НА типом ГЛП установлен рост общего количества Т- лимфоцитов, Т- хелперов и достоверное увеличение числа CD45RA+ лимфоцитов «наивного фенотипа» по сравнению с группой контроля, что может отражать возмущенность Т-лимфопоэза в центральных органах иммуногенеза и/или активацию миграционных процессов иммуноцитов на периферию. У этих больных установлено параллельное увеличение абсолютного количества лимфоцитов с готовностью к апоптозу (CD95). Из литературы известно, что Fas/APO-l/CD95, относящийся к суперсемейству рецепторов для ФИО, взаимодействует с Fas-L и содержит в цитоплазматическом участке «death domain», активирующий каскад каспаз (Сепиашвили Р.И. с соавт. 2000). При активации Т-лимфоцитов увеличивается экспрессия Fas/CD95 на мембране, что отражает высокую чувствительность этих клеток к Fas-зависимому апоптозу. В соответствии с ростом числа лимфоцитов, экспрессирующих маркеры готовности к апоптозу (CD95+) у больных данной группы выявлен также и высокий индекс реализации апоптоза, определяемый как отношение содержания апоптотирующих клеток к общему числу CD95+ экспрессирующих клеток. (Теплова С.Н., 2003). Вместе с тем, у больных с НПНКМ и ГЛП ПА при высокой готовности лимфоцитов к данной форме рецептор-опосредованного апоптоза и высоком ИРА, относительное и абсолютное число клеток с морфологическими признаками программированной клеточной гибели достоверно не отличается от контрольной группы. У пациентов этой группы установлен рост уровня TNF-a. Эффект цитокина на процессы активации клеток является двойственным. С одной стороны, TNF-a может инициировать апоптоз через рецептор TNFR1 (Барышников А.Ю., Шишкин Ю.В., 2002, Krammer Р., 2000). С другой стороны, он может выступать в качестве ко-стимулирующего сигнала, способствующего увеличению жизнеспособности клеток и их пролиферации путем включения фактоа транскрипции NF-kB (Lenardo М., 1999; Fadeel В., 2000).

Само повышение уровня TNF-a в системном кровотоке вполею объяснимо, поскольку IIA тип ГЛП характеризуется повышением уровня ОХС и ХС-ЛПНП, а последние, как известно, относятся к наиболее атерогенному классу липопротеидов, чаще подвергающихся химической (оксидативной) модификации, что инициирует адгезию и секреторную активность моноцитов, продуцирующих данный цитокин (Frostegard J. et al., 1999; Cruikshank W.W. et al., 2000). При этом количество IL-ip, IL-8, IL-2 в крови достоверно не отличалось от аналогичных показателей в контрольной группе. Количество VEGF-p во всех группах пациентов с НПНКМ с разными типами ГЛП, достоверно не отличалось от контроля, что, вероятно, характерно именно для самых ранних проявлений ХЦВЗ, когда рост цитокина не происходит, а ожидаемый подъем может регистрироваться на более поздних стадиях ХЦВЗ, как маркер развития ремоделлинга (Neufeld, G.,etal., 1999).

Наибольшее количество измененных показателей иммунной системы отмечено у пациентов с НПНКМ имеющих НБ тип ГЛП. В этой группе, увеличено количество CD3+, CD4+, CD45RA лимфоцитов и клеток, несущих мембранные рецепторы адгезии (CD18), процентное содержание популяции, экспрессирующей Fas-рецептор. У больных снижено абсолютное и относительное количество лимфоцитов с морфологическими признаками апоптоза, индекс реализации апоптоза (ИРА), т.е. несмотря на высокий процент готовности к апоптозу, реализовать программу гибели удается ограниченному числу лимфоцитов, что может быть связано с изменением характера липидного микроокружения клетки в условиях ГЛП НБ, препятствующего нормальной сборке DISC (смерть-индуцирующего комплекса) (Sharma К. et al., 2000) и проведению проапоптогенного сигнала внутрь клетки (Сибиряк С.В. и соавт., 2003). У этих больных установлены также наибольшие изменения в уровне цитокинемии. У них зарегистрирован достоверный рост уровня провоспалительных цитокинов TNF-a, IL-8, IL-lp, уровня IL-2. В совокупности, изменение количества цитокинов отражает высокую степень активации Th -лимфоцитов и моноцитов/ макрофагов и иной уровень цитокинергической регуляции в условиях роста атерогенных фракций липидов в крови. В мировой литературе показано (Huang Y,H. et al., 1999), что модифицированные липопротеиды могут непосредственно активировать макрофаги, воздействуя на специфические рецепторы на их мембране, усиливая секреторную функцию клеток. Продуцируемые ими провоспалительные цитокины (TNF-a, IL-ip, IL-8) усиливают экспрессию интегринов на мононуклеарах, осуществляют шеддинг L-селектина на мембране, стимулируют хемотаксис нейтрофилов в зону воспаления, усиливая продукцию супероксид аниона и других медиаторов воспаления. Среди вышеперечисленных цитокинов IL-ф является важным фактором для активации Т-клеток, как и TNF-a, он является проапоптогенным цитокином, повышает адгезивность эндотелия сосудов, увеличивает прокоагулянтную активность крови, стимулирует фагоцитоз, генерацию супероксид-радикалов, дегрануляцию тучных клеток, способствуя развитию экссудативной и пролиферативной составляющих воспалительной реакции (Garcia G.E. et al., 2000; SasuS. et al., 2001).

Отмеченный при данном типе ГЛП достоверный рост уровня IL-2 происходит параллельно с увеличением численности Т хелперной популяции лимфоцитов, которые, как известно являются основными продуцентами данного цитокинового лимфопоэтина (Huber S.A. et al., 2001; Laurat E. et al., 2001). Роль IL-2 при атерогенных процессах заключается в формировании определенного типа и длительности иммунного ответа за счет контроля пролиферации, дифференцировки и выживаемости клеток-мишеней, стимуляции их клональной экспансии. IL-2 контролирует антигензависимую и антигеннезависимую пролиферацию Т-лимфоцитов «наивного фенотипа», повышает цитотоксичность CD8+ лимфоцитов, NK-клеток оказывает влияние на Thl/Th2 баланс. Робинсон М.В., Труфакин В.А., (1999); Lenardo М. (1999) показали, что IL-2 предохраняет активированные Т-лимфоциты от апоптоза, активируя киназу PBK/Akt, которая подавляет каскад каспаз, путем блокирования их взаимодействия с APAF-1 и/или активацией ингибиторов апоптоза (IAPs, XIAP) (Kennedy S.G. et al., 1997). Действие киназы PBK/Akt, связано с вовлечением антиапоптотических механизмов, реализуемых через Вс1-2 и активацию NF-kB (Lenardo М., 1999). Возможно, рост IL-2, является одним из механизмов, объясняющих снижение числа лимфоцитов с признаками апоптоза и минимальный уровень ИРА при атерогенных вариантах ГЛП, что мы и наблюдали при ГЛП ПБ типа.

Итак, в условиях ГЛП ПБ наблюдается активация Т-лимфопоэза и миграции клеток на периферию, снижается число клеток с признаками апоптотической фрагментации ядра, снижение индекса ИРА, что может приводить в ряде случаев к сохранению аутореактивных клонов иммунных клеток, способных вызывать повреждение тканей и участвовать в прогрессировании атеросклероза.

Наименьшие изменения со стороны изучаемых популяций лимфоцитов были отмечены у пациентов с НПНКМ, имеющих IV тип ГЛП. При IV типе ГЛП установлен достоверный рост абсолютного числа CD3, CD4, CD 18 - Т лимфоцитов в циркуляции. Не было отмечено роста цитокинов в циркуляции по сравнению с контрольной группой, напротив, при ГЛП IV типа отмечен достоверный минимум IL-1[3, уровень которого существенно отличался от больных с ГЛП ИБ типа.

У пациентов с НПНКМ, в общей группе и при всех типах нарушения липидного обмена (ГЛП IIA, ПБ и IV типа), менялись не только количественные характеристики популяций лимфоцитов и характер цитокинов, но и достоверно увеличивалось относительное и абсолютное число моноцитов в циркуляции, менялись функциональные свойства клеток, что отражает истинное усиление моноцитопоэза и активацию моноцитов при данных вариантах ГЛП. У пациентов при всех вариантах ГЛП, по данным спектрофотометрической оценки, были увеличены показатель адгезии мононуклеаров на пластик, спонтанная и индуцированная ЛПС микробов НСТ-активность. Показатель адгезии (%) мононуклеаров на пластик у пациентов с ИБ типом ГЛП был достоверно повышен в сравнении с контрольной группой.

Экспериментальное изучение продукции одного из провоспалительных цитокинов (IL-8) моноцитами больных с разными типами ГЛП проведено нами в условиях in vitro, исходя из данных литературы о главенствующем значении клеток макрофагальной линии в секреции данного хемокина (Simonini A. et al., 2000), и исходя из предположения, что на эту продукцию могут оказывать существенное воздействие стимуляторы функции моноцитов, а также другие цитокины, накапливающиеся в циркуляции при системных воспалительных процессах.

Особое внимание мы уделили IL-8, так как его уровень, как показали (Lauder L., 2000; Zhou R.H. et al., 2001), повышается в периферической крови при стабильной гиперхолестеринемии. Нами также установлен достоверный рост уровня этого хемокина в сыворотке пациентов с НПНКМ в условиях гиперлипопротеидемии при НБ типе ГЛП.

В качестве активаторов в этом эксперименте нами выбраны стандартные индукторы клеток: ЛПС, TNF-a, IL-ip (Симбирцев А.С., 1999), а также IFN-y и TGF-P, которые по мнению некоторых авторов (Преображенская Е.В., Стойка Р.С., 2002; Friesel R., 1987; Tellides G. et al., 2000; Mallat Z. et al., 2001c) относятся к эндогенным отрицательным регуляторам синтеза IL-8. В результате исследования нами выявлено, что уровень спонтанной секреции хемокина IL-8 моноцитами больных с НПНКМ при их культивировании мало зависит от типа ГЛП. Лишь при ГЛП ПБ он оказался достоверно выше, чем в контрольной группе, и может отражать многократное усиление секреторной функции клеток моноцитарной линии в этих условиях.

При обработке культур клеток здоровых лиц с нормолипидемией и пациентов с НПНКМ при ГЛП IV типа стандартным индуктором ЛПС S.typhi зарегистрирован достоверный рост IL-8. В обоих случаях уровень ЛПС-стимулированной продукции IL-8 был приблизительно вдвое выше, чем уровень спонтанной продукции.

Провоспалительные цитокины TNF-a и IL-ip, добавленные к культуре клеток, оказали однотипный повышающий эффект на продукцию IL-8, как в малой, так и максимальной дозе во всех исследуемых группах, достоверно отличающийся от такового в контрольной группе. Установлено достоверное увеличение продукции IL-8 в сравнении со спонтанной под воздействием минимальной (25 пг/мл) и максимальной (250 пг/мл) доз TNF-a и IL-lp во всех исследуемых группах.

При добавлении к культуре моноцитов мужчин контрольной группы с нормолипидемией IFN-y, вырабатываемого Thl-лимфоцитами, в дозах (50 пг/мл и 2000 пг/мл), установлена, не достигающая степени статистической достоверности, тенденция к снижению уровня продукции IL-8 под влиянием используемой максимальной дозы интерферона, что соответствует литературным данным о роли IFN-y, как понижающего синтез IL-8 модулятора, который в условиях атерогенного поражения сосудов может проявлять себя в качестве противовоспалительного цитокина (Peilot Н., 2000; Tellides G. et al., 2000). Каких-либо изменений продукции хемокина в культуральной жидкости моноцитов во всех группах больных с НПНКМ, имеющих ГЛП, под влиянием IFN-y, в сравнении со спонтанной продукцией, а также между аналогичными показателями контрольной группы нами не обнаружено.

Установлено негативное влияние на продукцию IL-8 трансформирующего ростового фактора -(3 (TGF-p), вырабатываемого Th3- популяцией лимфоцитов, который как в низкой (20 нг/мл), так и в высокой (600 нг/мл) дозе, оказывал понижающее влияние на продукцию IL-8 макрофагами больных с IV типом ГЛП, и только в высокой дозе у лиц с ПБ типом ГЛП, что подтверждается и другими исследователями (Преображенская Е.В., 2002; Mallat Z. et al.,2001с). Также установлены достоверные различия индуцированной продукции IL-8 под влиянием разных доз цитокина в группах пациентов со ПБ типом ГЛП.

Таким образом, в прямом эксперименте in vitro показано достоверное повышающее воздействие на продукцию моноцитами IL-8 стандартных индукторов клеток (ЛПС, TNF-a, IL-ip), а также понижающее действие TGF-Р у больных с НПНКМ при ГЛП IV и ПБ. Понижающая тенденция под влиянием IFN-y в максимальной дозе на продукцию хемокина установлена только у здоровых лиц.

Важной функцией моноцитов и макрофагов является их способность продуцировать не только цитокины, но и другие регуляторные и эффекторные молекулы, в частности N0, который важен не только для осуществления внутриклеточного киллинга фагоцитов, но при гиперпродукции может иметь значение в цепи событий перекисного окисления, за счет образования в тканях пероксинитрита, обладающего выраженными деструктивными свойствами. Оксид азота, являясь универсальным мессенджером, в малых дозах может оказывать существенное влияние на состояние сосудистого тонуса.

Нами была проведена оценка нитроксидергических процессов на основании определения уровня конечных стабильных метаболитов оксида азота в сыворотке крови и уровня спонтанной и индуцированной продукции N0 моноцитами больных in vitro у пациентов с НПНКМ в целом в группе и в зависимости от типа ГЛП. Группой сравнения служили практически здоровые мужчины с нормолипидемией и без признаков артериальной гипертензии.

В общей группе пациентов с НПНКМ сывороточные уровни суммарной продукции метаболитов N0 и нитратов, оказались достоверно высокими, что вероятно свидетельствует об усилении нитроксидергических процессов у пациентов с проявлениями хронической цереброваскулярной недостаточности. Рост этих показателей сыворотки может быть связан с активацией индуцибельных NO-синтаз эндотелиоцитов, нельзя исключить при этом и участия моноцитов/макрофагов. Мы предполагаем, что моноциты, активированные в условиях сложившейся атерогенной ситуации в организме могут вносить свой существенный вклад в гиперпродукцию оксида азота.

Исходя из этого, нами проведен анализ уровня спонтанной и индуцированной продукции конечных метаболитов оксида азота в супернатанте суточной культуры моноцитов.

В общей группе пациентов с НПНКМ отмечен достоверный рост спонтанной суммарной продукции оксида азота и содержания нитратов. Установлены достоверные положительные корреляции между терминальными метаболитами N0 моноцитарного происхождения и уровнями этих метаболитов в сыворотке крови, что позволяют связывать рост продукции N0 в сыворотке с активацией моноцитов.

Далее мы определяли базовый уровень конечных стабильных метаболитов оксида азота в сыворотке пациентов с НПНКМ в зависимости от типа ГЛП. При анализе групп пациентов с НПНКМ с разными типами ГЛП максимально низкий уровень нитритов (самых нестабильных соединений) установлен в группе с нормальными показателями липидограммы и у пациентов со IIA типом ГЛП. Напротив, самым высоким уровень нитритов оказался в группе пациентов с ИБ и IV типом ГЛП.

Показатели суммарной продукции метаболитов NO (NOx) и нитратов (NO3) в группе пациентов с НПНКМ со ПБ типом ГЛП были самыми высокими, что свидетельствует о гиперактивации нитроксидергической системы при данном типе нарушений липидного обмена. Jovinge S. et al., (1996); Huang Y.H. et al., (1999); Gimbrone M.A., (2000) утверждают, что химически модифицированные ЛПНП, вызывают активацию макрофагов, способных продуцировать TNF-a, являющегося мощным индуктором индуцибельной формы NO-синтазы (iNOS) в макрофагах, эндотелиальных и других клетках-продуцентах, что подтверждено иммуногистохимическими исследованиями (Puddu P. et al., 2000). Исходя из этого, мы определили уровень спонтанной и индуцированной продукции нитроксид-ионов в суточной культуре моноцитов у пациентов с НПНКМ в зависимости от типа ГЛП. Нами установлено, что при наиболее атерогенных типах ГЛП (ИБ и IIA) увеличена спонтанная суммарная продукция NO, уровни нитритов и нитратов. Индуцированная продукция терминальных метаболитов NO была максимальной лишь у больных с НПНКМ при ГЛП ПБ.

Индекс стимуляции продукции NO в группах пациентов с ГЛП ПБ, IIA и IV типов в сравнении с контрольной группой и пациентами с НПНКМ с нормолипидемией был достоверно меньше. Снижение индекса стимуляции в сопоставлении со спонтанной продукцией оксида азота указывает на низкий функциональный резерв моноцитов в плане возможности дальнейшего усиления образования оксида азота de novo. Проведенный нами корреляционный анализ взаимосвязей подтверждает наличие отрицательной средней силы связи, между показателями спонтанной и индуцированной продукции. У лиц с НПНКМ с нормолипидемией эта связь была положительной, что свидетельствует о сохранности функционального резерва моноцитов в этих условиях.

Таким образом, у мужчин 30-40 лет с НПНКМ с разными вариантами нарушений липидного спектра сыворотки крови установлены существенные количественные и функциональные изменения состояния клеточного компартмента иммунной системы в сравнении с мужчинами контрольной группы и пациентами с НПНКМ, имеющими нормолипидемический статус, что доказывает роль дислипидемии в формировании аллостаза при наиболее ранних проявлениях ХЦВЗ.