Автореферат и диссертация по медицине (14.01.04) на тему:Взаимосвязь клинико-функциональных параметров, экспрессии Р-гликопротеина и апоптоза лимфоцитов периферической крови при бронхиальной астме

На правах рукописи

ЧУБАРОВА Светлана Владимировна

ВЗАИМОСВЯЗЬ КЛИНИКО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ПАРАМЕТРОВ, ЭКСПРЕССИИ Р-ГЛИКОПРОТЕИИА И АПОПТОЗА ЛИМФОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ПРИ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМЕ

14.01.04 - внутренние болезни 14.01.25 - пульмонология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 4 ОКТ 2013

Красноярск 2013

005535653

Работа выполнена на кафедрах внутренних болезней № 2 с курсом ПО и биологической химии с курсом медицинской, фармацевтической и токсикологической химии в ГБОУ ВПО «Красноярский государственный медицинский университет имени профессора В.Ф. Войпо-Ясснецкого» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научные руководители: доктор медицинских наук, доцент

ДЕМКО Ирина Владимировна доктор медицинских наук, профессор САЛМИНА Алла Борисовна

Официальные оппоненты:

Шестовицкий Владимир Андреевич - доктор медицинских наук, доцент, ГБОУ ВПО «Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Савченко Андрей Анатольевич - доктор медицинских наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт медицинских проблем Севера» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук, лаборатория молекулярно-клеточной физиологии и патологии, заведующий.

Ведущая организация:

ГБОУ ВПО «Саратовский государственный медицинский университет имени В. И. Разумовского» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита диссертации состоится «14» ноября 2013 года в 13°° часов на заседании диссертационного совета Д. 208.037.01 на базе ГБОУ ВПО «Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого» Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу 660022, Россия, Красноярский край, г. Красноярск, улица Партизана Железняка, дом 1

С диссертацией можно ознакомиться в научной медицинской библиотеке ГБОУ ВПО «Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого» Минздрава России

Автореферат разослан «*//» октября 2013 года

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 208.037.01

доктор медицинских наук, доцент Штарик Светлана Юрьевна

тс

{¿шак.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность работы

Бронхиальная астма (БА) представляет серьезную проблему здравоохранения во всем мире (Г.Б. Федосеев и др., 2011; A.C. Белевский, 2012; D.Ukena, L. Fishman, W.B. Niebling,2008). Распространенность БА варьирует в различных популяциях от 1 до 18% (Г.Б. Федосеев и др.,2011). В настоящее время по данным Всемирной организации здравоохранения от астмы страдает около 300 миллионов человек. Ежегодно БА становится причиной смерти около 250 тысяч человек, что свидетельствует о недостаточном контроле этого заболевания (A.C. Белевский, Н.П. Княжеская, Ю.К. Новиков, 2007; Ю.Б. Сучкова, А.Г. Чучалин, Н.П. Княжеская и др., 2008). Основной целью лечения БА является достижение контроля над симптомами заболевания и поддержание его на оптимальном уровне (A.C. Белевский, 2012; D.Ukena, L. Fishman, W.B. Niebling, 2008). Однако у подавляющего большинства больных симптомы заболевания контролируются недостаточно, несмотря на наличие высокоэффективной лекарственной терапии (Н.П. Княжеская, 2008; J.L. Desfougeres, В. Sohier, D. Freedmanetal., 2007).

Клиническая практика показывает, что больные, нуждающиеся в глюкокортикостероидах (ГКС), различаются как по чувствительности к ней (N. Mercado, A. Hakim, Y. Kobayashietal., 2012), так и по частоте и тяжести развития мног очисленных побочных эффектов этой терапии (P.J. Barnes, 2011). В настоящее время остается неясным, почему у некоторых пациентов ингаляционные ГКС (ИГКС), а иногда и системные ГКС (СГКС) оказываются менее эффективными. Таким образом, важно исследовать как клинические, так и молекулярные особенности чувствительности к данной препаратам при бронхиальной астме.

Противовоспалительное действие ГКС реализуется за счет увеличения экспрессии противовоспалительных белков, а также индукции апоптоза в клетках воспаления (Т. Rhen, J.A. Cidlowski., 2005). На данный момент найдено и описано достаточно много клеточно-молекулярных механизмов, играющих роль в снижении чувствительности к терапии ГКС (P.J. Bray, R.G. Cotton, 2003; P.J. Barnes, 2004). В то же время, не изучена роль Р-гликопротеина (Pgp), который является продуктом гена множественной лекарственной устойчивости (MDR1), осуществляющий АТФ-зависимый эффлюкс различных веществ из клеток, в том числе и ГКС. В связи с этим особый интерес представляет изучение взаимосвязи экспрессии Р-гликопротеина и эффективности проводимой противовоспалительной терапии.

Вне зависимости от степени тяжести БА воспаление в дыхательных путях является персистирующим. Благодаря исследованиям последних лет предполагается, что персистенция воспаления в дыхательных путях при астме обеспечивается усилением выживаемости Т-лимфоцитов и потери их способности к программируемой клеточной гибели, результатом чего является накопление мононуклеарных клеток, в том числе лимфоцитов, в зоне воспаления (Ю.В. Скибо, Н.Ш. Курмаева, 2012; A.M.Vignola, 2000). В связи с этим, является актуальным изучение программированной клеточной гибели при

астме для полного понимания патогенетических механизмов формирования этого заболевания.

Цель исследования

Изучить наиболее значимые факторы неконтролируемого течения во взаимосвязи с клинико-функциональными параметрами, экспрессией Р-гликопротеина и апоптозом лимфоцитов периферической крови у больных бронхиальной астмой.

Задачи исследования

1. Выявить наиболее значимые факторы, влияющие на уровень контроля у больных бронхиальной астмой среднетяжелого и тяжелого течения, по данным краевого легочно-аллергологического центра г. Красноярска.

2. Оценить особенности экспрессии Р-гликопротеина на лимфоцитах периферической крови в динамике у пациентов с бронхиальной астмой в зависимости от степени тяжести, фенотипа заболевания, объема и длительности базисной терапии.

3. Изучить особенности спонтанного и глюкокортикостероид-индуцированного апоптоза лимфоцитов периферической крови у больных бронхиальной астмой различной степени тяжести в динамике заболевания.

4. Изучить характер взаимосвязей между экспрессией Р-гликопротеина и апоптозом у больных бронхиальной астмой различной степени тяжести.

Новизна исследования

В результате выполнения данной диссертационной работы получены новые теоретические знания, касающиеся патогенетических механизмов бронхиальной астмы.

Впервые изучены особенности экспрессии Р-гликопротеина на лимфоцитах периферической крови у больных бронхиальной астмой различной степени тяжести в период обострения заболевания и вне его, а также показаны особенности экспрессии в зависимости от объема и продолжительности глюкокортикостероидной терапии.

Впервые изучены особенности спонтанного и индуцированного апоптоза у больных бронхиальной астмой среднетяжелого и тяжелого течения в зависимости от фазы заболевания.

Впервые изучены взаимосвязи между экспрессией Р-гликопротеина, спонтанным апоптозом лимфоцитов периферической крови и клинико-функциональными параметрами в зависимости от степени тяжести бронхиальной астмы и фазы заболевания.

Практическая значимость

Показана необходимость оценки детекции Р-гликопротеина на лимфоцитах периферической крови у больных бронхиальной астмой среднетяжелого и тяжелого течения для определения чувствительности к терапии глюкокортикостероидами. А также Р-гликопротеин может рассматриваться как потенциальная фармакологическая мишень с целью преодоления низкой чувствительности к данной терапии.

Определение показателей спонтанного и глюкокортикостероид-индуцированного апоптоза лимфоцитов периферической крови при бронхиальной астме среднетяжелого и тяжелого течения, а также при неконтролируемом течении заболевания, может быть использовано для характеристики тяжести заболевания и оценки эффективности лечения.

Внедрение в практику

Результат исследования введен в практику аллергологического, пульмонологического отделений КГБУЗ «Краевая клиническая больница» г. Красноярска. Теоретические и практические положения, изложенные в диссертации, используются в учебном процессе НИИ молекулярной медицины и патобиохимии в программах обучения студентов ГБОУ ВПО «Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого» Минздрава России.

Положения, выносимые на защиту

1. У больных тяжелой нестероидозависимой и стероидозависимой бронхиальной астмой отмечается неконтролируемое течение заболевания, несмотря на адекватную базисную терапию. Установлены основные факторы неконтролируемого течения бронхиальной астмы: степень тяжести заболевания, астматическое состояние в анамнезе, прием системных глюкокортикостероидов курсами в течение 5 лет и более, снижение объема форсированного выдоха за первую секунду до 60% и менее, применение высоких доз ингаляционных глюкокортикостероидов, женский пол, возраст, давность заболевания, индекс массы тела, стероидозависимость.

2. У больных бронхиальной астмой независимо от степени тяжести и фазы заболевания увеличена экспрессия Р-гликопротеина на лимфоцитах периферической крови в сравнении с контрольной группой, нарастающая в зависимости от объема и длительности терапии глюкокортикостероидами.

3. Лимфоциты периферической крови больных тяжелой бронхиальной астмой резистентны к развитию спонтанного апоптоза и имеют повышенную чувствительность к апоптоз-индуцирующему эффекту глюкокортикостероидов, тогда как при среднетяжелом течении астмы лимфоциты подвержены интенсивному спонтанному и глюкокортикостероид-индуцированному апоптозу в период обострения заболевания. Купирование обострения бронхиальной астмы среднетяжелого и тяжелого течения нормализует уровень спонтанного, но не глюкокортикостероид-индуцированного апоптоза лимфоцитов периферической крови.

4. Повышение уровня экспрессии Р-гликопротеина и нарушение механизмов реализации спонтанного апоптоза лимфоцитов периферической крови больных бронхиальной астмой среднетяжелого и тяжелого течения тесно связанно с выраженностью клинических проявлений заболевания и степенью нарушения функции внешнего дыхания.

Личный вклад

Диссертация является самостоятельным трудом, выполненным на кафедрах внутренних болезней № 2 с курсом ПО, биологической химии с курсом медицинской, фармацевтической и токсикологической химии ГБОУ

ВПО «Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого» Министерства здравоохранения РФ по основному плану НИР, номер государственной регистрации - 01200907000. Автором проведено клиническое обследование и динамическое наблюдение пациентов, создание электронной базы данных. Автором лично выполнен весь объем лабораторных исследований: выделение лимфоцитов, проведение иммуноцитохимического исследования. Выполнен поиск и критический анализ отечественной и зарубежной литературы по изучаемой проблеме, проведен анализ полученных данных, статистическая обработка, написание публикаций, монографии и диссертации.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены и обсуждены на научно-практической конференции «Встреча академика А.Г. Чучалина с молодыми учеными» г. Красноярск 2009, 2012гг., общегородской выставке инновационных проектов и научно-технических разработок в МВДЦ «Сибирь» г. Красноярск 2010г.; конференции «Восстановительная медицина в пульмонологии» г. Красноярск 2010г.; конференции «Актуальные вопросы коморбидной патологии в пульмонологии, посвященной 60-летию КБ №51 г. Железногорска ФМБА России» г. Железногорск 2011г.; научных семинарах НИИ молекулярной медицины и патобиохимии ГБОУ ВПО «КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого» (2009-2012 гг.). Работа поддержана грантами Российского фонда фундаментальных исследований (2009г), КГАУ «Красноярского краевого фонда поддержки научной и научно-технической деятельности» (2010г).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 20 печатных работ, в том числе 5 статей в журналах, рекомендованных ВАК РФ и 1 монография.

Структура и объем диссертации

Исследование изложено на 178 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, содержащего 53 отечественных и 209 зарубежных источников, содержит 32 таблицы, диссертация иллюстрирована 40 рисунками.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Исследования были выполнены с разрешения Локального этического комитета ГОУ ВПО КрасГМУ (протокол № 29 от/2011 от 19.01.2011).

Общая характеристика обследованных больных

Было обследовано 136 больных Б А среднетяжелого и тяжелого течения, которые находились на стационарном лечении в отделении аллергологии КГБУЗ Краевой клинической больницы №1.

Критерии включения:

• бронхиальная астма среднетяжелого и тяжелого течения;

• возраст от 18 до 70 лет;

• подписанное и датированное информированное согласие пациента на участие в исследовании;

Критерии исключения:

• другие заболевания органов дыхания: ХОБЛ, пневмония, активный туберкулез, диссеминированные заболевания легких и др.;

• злокачественные новообразования;

• беременность, период лактации;

• тяжелая сердечная недостаточность, соответствующая IV классу по NYHA;

• тяжелая почечная и печеночная недостаточность;

• психические заболевания, которые могут ограничивать действительность информированного согласия (на усмотрение исследователя);

• цереброваскулярные заболевания;

• бронхиальная астма легкой степени тяжести;

• прием лекарственных препаратов: верапамил, макролиды, респираторные фторхинолоны, статины, противогрибковые препараты, спиронолактон, дигоксин, амиодарон.

У всех пациентов диагноз БА был установлен в соответствии с критериями «Глобальной стратегии лечения и профилактики бронхиальной астмы» 2007 и 2011 (А.Г. Чучалин, 2008; A.C. Белевский, 2012).

Для решения поставленных задач обследовано 67 больных БА среднетяжелого течения, медиана возраста которых составила 40 [30,0;53,0] лет, давность заболевания 3 [1,0;9,0] года, возраст дебюта заболевания 33 [22,0;49,0] года. По полу распределение в этой группе было следующим: 48 (71,6±5,5%) женщин и 19 (28,4±5,5%) мужчин.

В зависимости от проводимой терапии и постоянного приема СГКС, среди пациентов с БА тяжелого течения были выделены группа больных стероидозависимой БА (СЗБА) и группа больных нестероидозависимой БА (НСЗБА). СЗБА отмечалась у 31 пациента, которые постоянно принимали СГКС в дозе 10 [5,0;15,0] мг в перерасчете на преднизолон, длительность приема составила 6 [3,0; 10,0] лет. Возраст, которых составил 51 [47,0;55,0] год, давность заболевания 14 [9,0;25,0] лет, возраст дебюта заболевания 33 [24,0;43,0] года. Среди них 24 (77,4±7,5%) женщины и 7 (22,6±7,5%) мужчин.

В группу больных НСЗБА было включено 38 пациентов, медиана возраста - 50 [45,0;55,3] лет, давность заболевания 12,5 [4,0;17,0] лет, возраст дебюта заболевания 39 [30,0;44,0] лет. Из них женщин - 29 (76,3±6,9%), мужчин - 9 (23,7±6,9%). В таблице 1 представлена общая характеристика больных исследуемых групп.

Возраст больных БА среднетяжелого течения статистически значимо был меньше в сравнении с аналогичным показателем пациентов с тяжелой СЗБА (р=0,003) и не отличался от значения больных тяжелой НСЗБА (р=0,059). Тогда как, в группах с тяжелой НСЗБА и тяжелой СЗБА возраст больных не имел существенной разницы. Более того, среди всех исследуемых больных БА, согласно классификации ВОЗ, преобладали пациенты зрелого возраста (36-60 лет по ВОЗ). Кроме того, давность заболевания больных тяжелой НСЗБА и тяжелой СЗБА существенно превышает значения пациентов с БА среднетяжелого течения.

Таблица 1 - Характеристика больных бронхиальной астмой

Единицы измерения БА среднетяжелого течения (п=67) БА тяжелого течения (п=69)

Показатель НСЗБА (п=38) СЗБА (п=31)

1 2 3

Возраст, годы Me TQ1;Q3] 40 Г30,0;53,0] 50 [45,0;55,3] 51 [47Д55.01

Давность заболевания, годы Me [Q1;Q3] 3 [1,0;9,0] 12,5 [4,0; 17,0] 14 [9,0;25,0]

Пол мужчин абс/% 19/28.4 9/23,7 7/22,6

женщин абс/% 48/71,6 29/76,3 24/77,4

Возраст дебюта заболевания, годы Me[Qi;Q3] 33 [22,0;49,0] 39 [30,0;44,0] 33 [24,0;43,0]

Распределение больных по полу во всех исследуемых группах не имеет статистически значимой разницы. Более того, было отмечено значительное преобладание женщин над мужчинами, что не противоречит данным эпидемиологических исследований (Г.Б. Федосеев, В.И. Трофимов, М.А. Петрова, 2011).

В группе больных БА среднетяжелого течения превалировала аллергическая БА (АБА) и регистрировалась у 44 (65,7±5,8%) пациентов, неаллергическая БА (НАБА) отмечалась у 23 (34,3±5,8%) больных. В группе с тяжелой НСЗБА у 23 (60,5±7,9%) пациентов преимущественно отмечалась АБА, НАБА диагностирована у 15 (39,5±7,9%) человек. Группа больных, страдающих тяжелой СЗБА, была сформирована из числа больных, относящихся к различным патогенетическим фенотипам (аллергическая и неаллергическая).

В контрольную группу были включены 40 респондентов, возраст которых составил 38 [32,0;48,0] лет, из которых было 20 (50±7,9%) мужчин и 20 (50±7,9%) женщин. Критериями включения для контрольной группы были следующие: отсутствие признаков острых заболеваний в течение последнего месяца; отсутствие признаков хронических заболеваний в стадии обострения, отрицательный аллергологический анамнез; отсутствие аллергических заболеваний у кровных родственников; отсутствие приема некоторых лекарственных препаратов: блокаторы кальциевых каналов, макролиды, респираторные фторхинолоны, статины, противогрибковые препараты, спиронолактон, дигоксин, амиодарон.

Общеклинические методы обследования

Для динамического наблюдения и оценки контроля над симптомами БА было спланировано сравнительное, проспективное исследование, общая длительность участия пациентов, в котором составила 12 месяцев. У всех пациентов выяснялось наличие основных симптомов заболевания. Уровень контроля над Б А определялся в соответствии с рекомендациями GINA 2011, а также использовался тест по контролю над астмой (ACT™) (A.C. Белевский, 2012; JI.M. Огородова, E.JI. Тимошина, 2006). ACT™ представляет собой

вопросник, отражающий основные жалобы при БА. Содержит 5 вопросов, на которые предлагается 5 вариантов ответов, каждый из которых соответствует определенному количеству баллов. Пациент оценивается по 5-ти бальной шкале (от 1 до 5). Результат теста записывается в виде суммарного значения балла (A.C. Белевский, Н.П. Княжеская, Ю.К. Новиков, 2007): сумма 25 баллов соответствует полному контролю, сумма 20-24 балла означает, что астма контролируется хорошо, но не полностью, сумма 19 баллов и меньше указывает на неконтролируемое течение астмы, сумма 14 баллов и меньше свидетельствует о том, что астма у пациента серьезно вышла из-под контроля.

Методы исследования функции внешнего дыхания Исследование функции внешнего дыхания проводили на аппарате общей плетизмографии «ErichEger» (Германия) с компьютерной спирометрией. Анализировали следующие показатели: объем форсированного выдоха за первую секунду (ОФВ,), форсированная жизненная емкость легких (ФЖЕЛ), отношение ОФВ^ФЖЕЛ. Пациентам проводилась бронходилатационная проба с 400 мкг сальбутамола для оценки обратимости бронхиальной обструкции. Тест считался положительным при увеличении ОФВ] на 12% (200 мл) по сравнению с исходными значениями.

Анализ показателей проводился путём расчёта фактических величин, сопоставляя их с расчётными должными значениями в процентном отношении в соответствии с рекомендациями Европейского респираторного общества.

Пульсоксиметрия Сатурацию кислорода крови (Sa02) измеряли на аппарате Spirolab III (Spirolab III Sp02) Mir (Италия).

Иммуноцитохимические методы исследования Выделение лимфоцитов из периферической венозной крови проводилось по стандартному протоколу. Для детекции Р-гликопротеина на предварительно обезжиренное предметное стекло наносилось 50 мкл суспензии клеток и высушивалось. Предметные стекла с мазками клеток хранились в морозильной камере при температуре -20°С; максимальный срок хранения - до 6 месяцев. Детекция Pgp-экспрессирующих клеток осуществлялась по стандартному протоколу иммуноцитохимического метода исследования. В качестве первичных антител использовали мышиные античеловеческие Pgp антитела, «Abcam», (Великобритания), а вторичных антител - овечьи антимышинные FITC-меченые антитела, «Сорбент» (Москва). Визуализация осуществлялась с помощью прямого микроскопа «OLYMPUSCX41 с поляризационной насадкой и флуоресцентным осветителем CXRFA 2d в комплекте с видеокамерой DP71» при увеличении х 900. Учитывали относительное количество Pgp-иммунопозитивных клеток на 100 лимфоцитов крови.

Для детекции апоптоза клеточную взвесь распределяли на три пробы по 300 мкл (1 миллион клеток в 1 миллилитре), клетки инкубировали в термостате в присутствии дексаметазона (Россия) в концентрации 1 х 10"5, либо дексаметазона в той же концентрации и верапамила (Македония) в концентрации 5><10"5 в течение 30 минут. Негативным контролем служили пробы, в которых клетки инкубировали в тех же условиях, но без добавления

модуляторов. После этого на предварительно обезжиренное предметное стекло взвесь наносилась по типу «толстой капли» и высушивалась.

Детекция апоптоза проводилась набором TUNEL Apo-BrdU (88-6671, Millipore, США) по стандартному протоколу фирмы-производителя. Для детекции TUNEL+ лимфоцитов первоначально проводилась фиксация препарата в парах 10% формалина. Следующим этапом была постфиксация (пермеабилизация) препарата и инкубация в морозильной камере в течение 5 минут с последующей промывкой препарата. После этого проводилась окраска ДНК. Раствор готовился на 3 препарата следующим образом: 10 мкл TdT Reaction Buffer, 0,75 мкл TdT Enzyme, 8 мкл Br-dUTP, 32,25 мкл дистиллированная вода. Препараты с нанесенным раствором для окраски ДНК инкубировались во влажной камере в термостате при температуре 37°С в течение 1 часа. Следующий этап заключался в добавлении по 15 мкл раствора FITC меченных анти-BrdU моноклональных антител, который готовился в объеме также на 3 препарата. Он содержал 1 мкл Fluorescein-PRBl, 44 мкг Rinse Buffer. После инкубации во влажной камере в течение 30 минут в темноте при комнатной температуре для детекции ядерного материала препараты подкрашивались раствором пропидия йодида/РНКазы A (Propidium Iodide/RNase A Solution). Регистрация результатов осуществлялась с помощью люминесцентного микроскопа «01ympusCX41 с поляризационной насадкой и флуоресцентным осветителем CXRFA 2d в комплекте с видеокамерой DP71», увеличение х 900. Подсчитывалось общее количество TUNEL+ клеток с последующим расчетом апоптотического индекса (АИ) на 300 клеток (АИ -доля TUNEL+ клеток, выраженная в процентах от общего количества клеток).

Статистическая обработка данных

Статистическая обработка полученных данных выполнялась при помощи программы SPSS, версии 18.0. Проверка нормальности распределения признаков в группах наблюдения проводилась с использованием критерия Колмогорова-Смирнова. Описательная статистика результатов исследования представлена для качественных признаков в виде процентных долей и их стандартных ошибок. В случаях отсутствия нормального распределения переменных, в описательной статистике использовались медиана (Me) и квартили (QbCb). Значения средних величин отображались, в этом случае, как Me [Qi;Qj].

При отсутствии нормального распределения переменных проводили сравнение групп с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни. Значимость различий качественных показателей в группах наблюдения оценивали при помощи непараметрического критерия Пирсона yj с поправкой на непрерывность. При частоте встречаемости признака 5 и менее использовался точный критерий Фишера. Оценку статистической значимости различий изменения количественных признаков в динамике проводили по непараметрическому критерию Вилкоксона при отсутствии нормального распределения переменных. Различия во всех случаях оценивали, как статистически значимые при р<0,05.

Для анализа корреляционной связи между исследуемыми признаками применялся коэффициент корреляции Спирмена (для оценки силы и направленности связи порядковых признаков и количественных переменных, распределение которых отличалось от нормального). Сила корреляции оценивалась, как статистически значимая, при р<0,05.

Для оценки степени риска неконтролируемого течения БА в группах наблюдения производили оценку отношения шансов (ОШ) с расчетом доверительных интервалов. Расчет данного показателя производился по классической методике в таблицах сопряженности 2x2. Отношение шансов (ОШ) = (а/Ь) / (с/с1). Статистически значимыми считали шансы, если в доверительный интервал не попадала единица. К числу наиболее важных факторов были отнесены информативные признаки со значением ОШ более 1,0.

Результаты собственных исследований

Настоящая работа посвящена изучению возможного достижения уровня контроля над симптомами астмы, особенностей экспрессии Р-гликопротеина и реализации программируемой клеточной гибели у больных бронхиальной астмой среднетяжелого и тяжелого течения.

Для динамического наблюдения и оценки возможного достижения контроля над симптомами БА было спланировано сравнительное, проспективное исследование. Общая длительность участия пациентов, в котором составила 12 месяцев. В рамках данного исследования были запланированы следующие визиты: визит 0, характеризуется обострением астмы, требующего госпитализации; 1-й визит через 4 недели после выписки из стационара; 2-й визит через 6 месяцев±14 дней; 3-й визит через 12 месяцев ±14 дней. Уровень контроля над симптомами БА определялся в соответствии с рекомендациями США 2011. С этой целью анализировались частота дневных и ночных симптомов астмы, потребность в препаратах неотложной помощи, ОФВ|. Также для оценки уровня контроля над симптомами БА в качестве стандартизованного метода использовался АСТ™.

Анализ базисной противовоспалительной терапии показал, что при первичном осмотре 34 (50,7±6,1%) пациента с БА среднетяжелого течения и 4 (10,5±4,9%) пациента с НСЗБА не получали противоастматическую терапию. В целом 27,9% больных БА по разным причинам не использовали базисную терапию.

Известно, что необходимым условием эффективного лечения БА является адекватность и регулярность приема базисной терапии. Поэтому всем пациентам осуществлялось назначение базисной терапии при отсутствии таковой, а также проводилась ее коррекция. В процессе динамического наблюдения среди различных вариантов противовоспалительной терапии преимущественно использовалась комбинация ИГКС и длительно действущие агонисты ДДА, а именно: у 40 (69±6,1%) больных БА среднетяжелого течения, 23 (60,5±7,9%) пациента с НСЗБА и у 20 (64,5±8,6%) больных СЗБА в сочетании с СГКС. Однако, несмотря на рекомендации, сохранялось низкое число пациентов, которые применяли в качестве базисной терапии комбинацию ИГКС, ДДА и АЛТ.

На момент включения в исслсловаиис неконтролируемое течение астмы отмечалось у 61 (91.(>±3.5%) больною БА среднетяжелого течения Частично контролируемое течение БА, соответствующее показателю ACT"* 20-24 баллов, отмечалось всего у 6 (9,0=3.5%) пациентов. Полного контроля над симптомами заболевания не имел ни опии пациент исследуемой группы При первом визите все больные НСЗБА и СЗБА имели неконтролируемое течение заболевания После оптимизации противовоспалительной базисной терапии с приоритетным назначением фиксированной комбинации, в результате динамического наблюдения и обучения пациентов отмечалось существенное увеличение числа лиц. достигающих части итого или полного контроля над симптомами астмы

Так. среди больных БА среднетяжелого течения контроля над заболеванием удалось достигнуть у 55.9% больных, среди которых полный контроль отмечался у 16.9% пациентов (рис I).

среди« БА НСЗЬА СЧБА

Рисунок I. Уровень »оитрол* у больных бронхиальной астмой с|5слнст»*сж>г0 и тяжелого течения

Несмотря на адекватную базисную терапию, контролируемое течение заболевания среди паниештов с НСЗБА, по нашим данным, достигли всего 15% человек, из которых полный контроль отмечался у 6.1%. У всех пациентов со СЗБА наблюдалось неконтролируемое течение заболевания Более того, превалирующая часть больных данной группы имела крайне низкий суммарный показатель ACT"1, соответствующий интервалу 5-9 байтов. Анализ результатов проведенною геста ACT™ показал, что уровень контроля над симптомами заболевани» достигает незначительная доля пациентов, которая резко уменьшается с утяжелением заболевания Более того, за время исследования на фоне регулярной, адекватной базисной терапии отмечается значительное уменьшение клинических проявлений у больных БА. Однако у пациентов с тяжелым течением заболевания (стероидозависимая и нестероидозависимая) не получено существенного улучшения функциональных показателей

Расчет отношения шансов с определением риска развития неконтролируемого течения астмы позволил отметить основные факторы. Оценку ОШ в группах больных с достигнутым контролем сравнивали с группой больных, не нмеощих контроль заболевания (табл.2).

В ходе исследования были выделены наиболее важные факторы риска развития неконтролируемого течения астмы. Так, тяжелое течение астмы приводит к увеличению риска отсутствия контроля в 13,71 раз, наличие астматических состояний в анамнезе - в 9,98 раз, прием СГКС курсами в течение 5 лет и более - в 7,02 раза. Выраженность нарушений функции внешнего дыхания (ФВД) также является одним из факторов отсутствия контроля над симптомами астмы. Установлено, что снижение ОФВ! до 70 % и менее повышает риск неконтролируемого течения БА в 3,48 раза. Более того, уменьшение данного показателя до 60% и менее увеличивает риск уже в 7,14 раз. Обращает внимание, что высокие дозы базисной терапии также являются фактором риска неконтролируемого течения заболевания и приводит к повышению риска в 4,82 раза соответственно. Другие наиболее значимые факторы, негативно влияющие на достижение контролируемого течения БА, представлены в таблице 2.

Таблица 2 -Факторы риска развития неконтролируемого течения бронхиальной астмы

Фактор риска Показатель отношения шансов Доверительный интервал

Степень тяжести БА 13,71 4,79-39.19

Пол женский 2,62 1,15-6,13

Возраст старше 45 лет 2,23 1,00-4,96

Давность заболевания более 5 лет 2,69 1,22-5,97

ИМТ более 25 кг/м2 2,91 1,25-6,78

ОФВ1 менее 60% 7,14 2,02-25,27

ОФВ1 менее 70% 3,48 1,46-8.29

Патология ЖКТ 5,61 1.23-25,48

Стероидозависимость 1,70 1,44-2,02

Наличие астматических состояний в анамнезе 9,98 1,28-78,12

Прием СГКС курсами в течение 5 лет и более 7,02 2,62-18,82

Высокие дозы ИГКС 4,82 2,08-11,17

Примечание. Выделены наиболее значимые факторы риска развития неконтролируемого течения бронхиальной астмы (доверительный интервал более 1,0).

Таким образом, отмечается достаточно большое число разнообразных факторов, которые оказывают негативное воздействие на течение БА и приводят к отсутствию контроля над симптомами заболевания.

Сопутствующая патология также оказывает значительное влияние на состояние пациентов страдающих БА и существенно изменяет ее течение.

В целом, в процессе исследования была зарегистрирована высокая частота сопутствующей патологии: у 60 (89,6±3,74%) больных БА среднетяжелого течения, у 36 (94,7±3,62%) пациентов с НСЗБА и у всех (100±0,0%) больных СЗБА. Наиболее часто регистрировалась гипертоническая болезнь, которая отмечалась при СЗБА у 74,2% больных, при НСЗБА у 57,9% пациентов, а при БА среднетяжелого течения у 28,4%. Одинаково часто

регистрировался аллергический ринит: при среднетяжелом течении БА у 65,7% больных, при НСЗБА у 60,5%, а при СЗБА у 51,6% пациентов. Кроме того, у больных астмой отмечались и другие сопутствующие заболевания: полипы придаточных пазух, патология желудочно-кишечного тракта и т.д. Более того у больных БА, тяжелого течения, нарастает число комбинаций сопутствующих заболеваний, что приводит к взаимному отягощению состояния.

Большинство больных БА, имеющих оптимальную противоастматическую терапию, продолжают испытывать симптомы заболевания (Н.П. Княжеская, 2008; J.L. Desfougeres, В. Sohier, D. Freedmanetal., 2007).Что, вероятнее всего, связано со снижением чувствительности к данным препарат (S.B.Moody, 2002). Известно, что транспорт ГКС в клетку является пассивным процессом. Однако существует активный процесс выведения последних из клетки, опосредуемый АТФ-зависимым транспортным белком Р-гликопротеином.

Отмечено, что независимо от периода обследования: обострение, выписка, через 12 месяцев, у больных БА среднетяжелого и тяжелого течения экспрессия Pgp была выше в сравнении с контролем (табл. 3).

Таблица 3 - Уровень Pgp-экcnpeccиpyющиx клеток у больных БА различной степени тяжести в динамике заболевания_

Группы наблюдения Период наблюдения Значимость различий

Обострение Выписка Через 12 месяцев

1 2 3

БА среднетяжелое течение 1 [1,0;2,0]* 2 [1,0;4,0]* 2 [1,0;6,0]* pi .2=0,008 Pi_3<0,001 Р2-З=0,054

НСЗБА 2,5 [1,0;4,0]*'** 3 [1,0;5,0]* 2 [1,0;3,0]* PI-2=0,210 р,.з=0,432 Р2-З=0,138

СЗБА 2 [1,0;3,0]*'** 2 [1 Д4,0]* 2 [1,0;4,0]* PI_2=0,344 р,.з=0,728 Р2-з=0,391

Группа контроля 1 [ОД 1,0] -

Примечание: Различия по исследуемым показателям рассчитаны с использованием критериев Вилкоксона и Манна-Уитни. * - значимость различий с контрольной группой, при р<0,05, ** - значимость различий по отношению к значениям больных БА среднетяжелого течения, при р<0,05.

Более того, на фоне противовоспалительной терапии, было выявлено значимое увеличение количества Pgp+ клеток при БА среднетяжелого течения, что, возможно, связанно с определенным спектром чувствительности к глюкокортикостероидной терапии у данной группы больных.

Проанализирована экспрессия Р-гликопротеина на лимфоцитах периферической крови при БА в зависимости от давности заболевания. Все больные были разделены на 3 группы. В 1-ю вошли 51 (41,8±4,5%) пациент давность заболевания, которых не превышала 5 лет, во 2-ю были включены 20

(13.9±3.1%) человек, длительность астмы которых составила от 6 до 10 лет, а в 3-ю - 54 (44,3*4,5%) пациента с давностью заболевания 11 лет и более (габл 4). Выло выявлено, что больные с периодом заболевания до 5 лет характеризуются статистически значимо низким числом І^р-жспрессирующих клеток.

Таблица 4 Экспрессия Р-тлнкомротсина на лимфоцитах периферической кроки у больных бронхиальной астмой я зависимости от лаитччн заболевания_

1Іоказатсль д авность заболевания Значимость различий

<5 лет 6-Ю лез 11 лет и более

1 2 3

Me (О,.0.1 МсІОкОіІ МеЮ.;0»1

Экспрессия Р-| л икон рої сипа 1 [1.00.01 2 [t.0,4.0) 2 11.0,3.0) pi.j-0.041 р, л 0.046 Рм-0.168

Примечание Различия по исследуемым показателям рассчитаны с использованием критерия Мання-Уктни

Таким образом, нами установлено, что .алительный анамнез ЬА приводит к увеличению экспрессии Р-гликопротеина. что, скорее всею, связано с более частым и продолжительным использованием в качестве базисной терапии ГКС.

С целью анализа экспрессии Р-гликопротеина на лимфоцитах периферической крови больных ЬА. получающих и не получающих базисную терапию, все пациенты были разделены па 2 группы: в 1-ю было включено 38 (27,9±3.9%) пациентов, которые не получали базисной терапии, во 2-ю группу вошли 98 (72,1*3,9%) пациентов, которые использовали для лечения ИГКС и сочетание ИГКС и СГ'КС (рис. 2). Следует отметить, что в 1-ю группу в основном вошли больные БА Среднетяжслого течения, только 4 человека имели тяжелое течение заболевания.

Примечание: Различия по исследуемым показателям рассчитаны с использованием крюерия Мяина-Уитни * - значимость различий между показателями исследуемых групп (при р- 0.05)

Рисунок 2. Экспрессия Р-гликопротеина на лимфоцитах периферической кропи у больных БЛ в записи мости от наличия и отсутствия терапии 1"КС

Согласно полученным данным, уровень экспрессии Р-гликопротениа в группе пациентов, имеющих постоянную базисную терапию, статистически значимо превышал значения пациентов, которые не имели постоянной противоастмагической терапии (р-0.023).

Учитывая, что больные СЗБА нуждаются в постоянном приеме не только ИГКС. но и СГКС представлялось интересным определить экспрессию Pgp в зависимости от дозы перорапьных глюкокортикостсроидов Предварительно все пациенты были разделены на группы в зависимости от дозы СГКС.

Количество пациентов получающих ие более 5 мг/сут составило 10 (32,3±8.4%) человек, 12 (38,7±8,7%) больных получали дозу от 6 до 10 мг/сут и 9 (29±8.2%) пациентов 11 мг/сут и более. Согласно полученным данным, количество Рзр-экспрсссируюших лимфоцитов статистически значимо больше у больных, доза СГКС в перерасчете по преднизолону которых составляла II мг/суг и более, в сравнении с показателями пациентов получающих 10 мг/суг и менее (рис. 3).

1 I ■ ■ I ■

.типа. >»гк дои ■ кси •Чясу| ИЛ« вЛкксм ()■

Примечание Различия по исслелусммм показателям рассчитаны с использованием критерия Манма-Унгни * ■ значимость различий между показателями при р- 0.05

Рисунок 3. 'Экспрессия Р-гликопротеина на лимфоцитах периферической крови у больных ОБА в зависимости от дозы СГКС

Вместе с тем. в превалирующем ряде случаев нами зарегистрирована экспрессия Рур на лимфоцитах периферической крови не превышающая 2-3%, что. в свою очередь, свидетельствует о незначительной роли этой молекулы в ответе лимфоцитов на терапию ГКС.

В зависимости от патогенетических фенотипов астмы были выделены группы с аллергической, нсаллергической и стсрондозависимой БА. В результате было установлено, что экспрессия Р-гликопротеина на лимфоцитах периферической крови в зависимости от натотенегических фенотипов БА существенно не отличалась.

Нами установлены корреляционные взаимосвязи между экспрессией Р-гликопротеина на лимфоцитах периферической крови, основными клиническими проявлениями заболевания и параметрами функции внешнею дыхания. Так, в группе больных БА срсднетяжслого течения в период обострения заболевания выявлены отрицательные корреляционные взаимосвязи между экспрессией Р-гликопротеина на лимфоцитах периферической крови и насыщением крови кислородом (г=-0,56; р=0,010), а также между экспрессией Р-гликопротеина и показателем ОФВ|/ФЖЕЛ (г=-0,36; р=0,043). Характер данных взаимосвязей свидегельегвуег о том. что

увеличение уровня экспрессии Рвр ассоциируется с усилением бронхиальной обструкции.

В группе больных НСЗБА в период обострения регистрируются положительные взаимосвязи между экспрессией Р-гликопротеина на лимфоцитах периферической крови и числом дневных приступов удушья (г=0,54. р=0,038). между количеством Р8Р+ лимфоцитов и давностью ухудшения состояния (г=0,3б, р=0,029), а также определена отрицательная взаимосвязь экспрессии Р-гликопротеина с возрастом дебюта астмы (г=-0,56; р=0,032).

В труппе больных СЗБА в период обострения заболевания была выявлена положительная взаимосвязь экспрессии Р-гликонротсина на лимфоцитах периферической крови и частотой дневных приступов удушья, а также потребностью в р3 агоннстах короткого дейст вия (г=0.49 и г=0.37. при р- 0.05).

В динамике через 12 месяцев (вне обострения заболевания) также выявлены взаимосвязи между экспрессией Р-гликопротеина на лимфоцитах периферической крови и клинико-фупктшопальными параметрами Так. в труппе больных БА среанетяжелот о течения выявлены умеренные отрицательные взаимосвязи экспрессии Р-гликопротеина на лимфоцитах периферической крови с показателем ОФВ, (г=-0.41; р=0.028) и ФЖЕЛ (г=-0.49; р=0,007). Увеличение числа Рвр+ клеток ассоциировано с нарастанием потребности в |Ь агонистах короткого действия (г=0.37. р=0.007) и количеством ночных присту пов удушья (г=0,36. р-Ю.013) А в группе больных НСЗБА через 12 месяцев наблюдения заре истрировапа отрицательная взаимосвязь между экспрессией Р-гликопротеина и ЖЕЛ (т=-0.73, р=0.016).

Характер данных взаимосвязей свидетельствует о наличии перснстирующего воспалени« дыхательных путей, что ассоциируется со снижением показателей футкции внешнего дыхания (ФВД) и степенью бронхиальной обструкции.

В последние годы аюлштьным становится изучение программируемой клеточной гибели при различных воспалительных заболеваниях, в том числе и БА 11редполап1стся, что псрсистенцня воспаления в дыхательных путях обеспечивается посредством повышенного рскрутннга иммунокомпетентных клеток в слизистую бронхиального дерева и за счет повышения выживаемости и задержки элиминации этих клеток в воздухоносных путях, что вероятнее всего, осуществляется за счет торможения процесса программируемой клеточной гибели

Согласно полученным данным у больных БА срсднстяжелого течения уровень спонтанного апонгоза не отличался от значения контрольной группы в период обострении и вне его (р=0.762 ир=0,144 соответственно). Тогда как в группе больных БА тяжело о течения в период обострения заболевания отмечалось существенное его снижение (р=0.048). Кроме того, при сравнении показателей двух исследуемых групп, у больных БА среднетяжелого течения ЛИ существенно превышал начение больных БА тяжелого течения (р=0.002). Нарушение реализации споншшого анонима у больных БА тяжелого течения, вероятно, может объяснить более тяжелое течение заболевания и

необходимость в более длительном назначении СІ КС с целью купирования обострения (рис. 4). Повышенная резистентность к спонтанному аноптозу при тяжелом течении БА свидетельствует о возможном участии программированной клеточной гибели в формировании персисгируюшего воспаления.

После купирования обострения у больных БЛ тяжелого течения задержки спонтанного апоптоза выявлено не было, что подтверждается отсутствием значимых отличий от показателей группы больных БЛ срсднетяжслого течения (р=0.215) и контроля ([>=0.804). Кроме того, в ходе исследования было выявлено, что у болымх БА срсднетяжслого течения зарегистрировано статистически значимое снижение спонтанною апоитоза после купирования обострения (р=0.015) в сравнении с исходными данными.

Сдоим ЬЛ Т«А*М* ЬА (яірмі

Примечание: Различия по исслелусммм показателям рассчитаны с использованием кржерия Манна-Уигни * • значимость различий в сравнении с показателями труппы контроля, пр" р<0.05 •• - значимость различий между исследуемыми группами, при р<0.05. ••• - значимость различий между показателями в период обострения и вне сто. прм р- 0.05.

Рисунок 4 Спонтанный апотоз лимфоцитов периферической крови больных бронхиальной астмой различной степени тяжести в сравнении с показателем контрольной группы в динамике заболевания

С учетом того, что для купирования обострения бронхиальной астмы используются СГКС, представлял интерес изучить ГКС-индуцированный апоптоз В качестве модуляторов программируемой клеточной гибели использовались дсксаметазон и комбинация дексаметазоиа и веранамила С этой целью мы провели анализ уровня спонтанного и ГКС-индуиированного апоптоза в зависимости от фазы и тяжести заболевания

Получено, что АИ больных БА среднетяжелого течения после инкубации с дексаметазоном и комбинацией дексаметазоиа и веранамила существенно превышает уровень спонтанного апоптоза как в фазу обострения заболевания (р=0,004 и р=0,045 соответственно), так и после его купировании (р=0,002 и р=0.016 соответственно) Аналогичная ситуация прослеживалась в пробах больных БА тяжелого течения Так АИ в пробе с дексаметазоном и комбинацией дексаметазоиа и веранамила статистически значимо превышает уровень спонтанного апоптоза как в период обострения (р- 0.001 и р=0.026 соответственно), так м после его купирования (р=0.035 и р=0,046

соответственно). Вместе с тем, у больных БЛ сред нетяжелого и тяжелою течения статистически значимых отличий между пробами с дексаметазоном и комбинацией дексаметазона и веранамила в период обострения и после ею купирования зарешетрировано не было. Что свидетельствует о том. что не зависимо от фазы заболевания, всрапамнл. как модулятор активности кальциевых каналов и не проявил своего действия в реализации

механизмов апоптоза лимфоцитов периферической кроки больных БЛ.

При сопоставлении значений индуцированною шюнтоза в пробах в зависимости от фазы заболевания у больных 1>Л средне-тяжелого течения выявлено существенное снижение апоптотической активности как в пробе с дексаметазоном (р=0,008). так и в пробе с комбинацией дексаметазона и веранамила (р=0,(Х)4) после купирования обострения астмы в сравнении с аналогичными показателями в фазу обострения Имеете с тем, у больных БЛ тяжелого течения вне обострения заболевания отмечается существенное увеличение дсксамсгазон-индуцнрованного апоптоза (в присутствии (р=0,041) или в отсутствии веранамила (р=0,039) в сравнении с аналогичным показателем в период обострения

Был проанализирован индуцированный апоптоз (с веранамилом и без) лимфоцитов больных БЛ в сравнении с аналої ичным показателем контрольной группы в период обострения заболевания (рис. 5).

Примечание Различия по исследуемым показателям рассчитаны с и:полыопанисм критерия Манка-Уитни. • - значимость различий и сравнении с группой контроля •• • значимость различий межлу исследуемыми группами

Рисунок 5 Индуцированный апопто) лимфоцитов периферической >рови больных бронхиальной астмой различной Степени тяжесги в период обострения заболевания в сравнении с контрольной группой

Выявлено, что в группе больных БЛ среднстяжслого течения в период обострения уровень дексамстаюи-индуциро ванного апоптоза существенно выше как в присутствии веранамила (р-0,001) так и без него (р- 0.001) в сравнении с группой кон (роля. Также и в фунпе больных БЛ тяжелого течения ЛИ существенно превышал значение контроля как в пробе с дексаметазоном (р=0.031) так и в пробе с сочетанием дексаметазона и веранамила (р=0.028).

Однако апоптоз больных БЛ тяжелою течения существенно ниже в сравнении с показателем при среднстяжслом течении заболевания как в

присутствии верамамила (р<0.001). гак и без него (р=0.018). Таким образом, в период обострения заболевания индуцированный аполтоз лимфоцитов периферической крови у больных ЬЛ СРСДНСТЯЖСЛОГО И Т1ЖСЛОГО течения существенно превышает значения контрольной группы Вместе с тем. ответ на индукцию ГКС у больных БА тяжелого течения значительно снижен в сравнении со значением больных БА среднетяжслого течения

После курирования обострения (рис 6) в группе больных БА среднетяжслого течения уровень ЛИ существенно выше чей в контрольной группе как в присутствии всрапамила (р=0.035), так и в січ) отсутствии (р=0,022). Аналогичная картина была выявлена и в группе больных БА тяжелого течения, у которых ЛИ статистически значимо выше, чем в контроле как в пробе с дексаметазоном (р-0,001) іак и с сочетанием дексамстазона и всрапамила (р=0,009). В тоже время в группе больных БЛ тяжелого течения регистрируется статистически значимое увеличение апоптотической активности после купирования обострения, что по нашему мнению, может свидетельствовать о восстановлении чувствительности к ГКС. После купирования обострения уровень индуцированного апоптоза (с всрапамилом и без) больных БА среднетяжслого и тяжелого течения статистически значимо не изменялся. _

IMLT) ШфОЫЯШЫЛ

■ кимбнмшви МО«!"«" >

Примечание Различи» по исследуемым показателям рассчитаны с использованием критерии Манна-У итни • • значимость различий в сравнении с контрольной группой

Риеунок 6. Индуцированныйапоптоз лимфоцит«« периферической крови больных бронхиальной астмой различной степени тяжести после купирования обострения в сравнении с контрольной группой

В объединенной группе больных БА определяется отрицательная корреляционная связь между значением апоптотаческого индекса и уровнем Р-гликопротсина (г=-0.60, р-0,008), что, возможно, отражает роль Pgp в реализации про1раммированной клеточной гибели. Также было выявлено, что повышение уровня апоптоза ассоциировано с увеличением значения суммарного показателя ЛСТ™ (г"0,48, р=0,043).

В период обострения выявлено, что снижение апоптоза лимфоцитов периферической крови требует увеличения количества курсов СГКС у больных БЛ среднетяжслого течения (г=-0.51, р=0,043) и у болыых БЛ тяжелого

течения (г=-0,75, р=0,008), что свидетельствует о неконтролируемом течении заболевания.

Согласно результатам корреляционного анализа в группе больных БА тяжелого течения выявлена положительная взаимосвязь между уровнем апоптоза и функциональными параметрами: ОФВ, (г=0,61, р=0,044) и ФЖЕЛ (г=0,53, р=0,038), а также отрицательная взаимосвязь с уровнем прироста ОФВ] (г=-0,56, р=0,031). У больных Б А тяжелого течения в период обострения заболевания прослеживается отрицательная взаимосвязь между апоптозом и уровнем экспрессии Р-гликопротеина (г=-0,63, р=0,037), что по нашему мнению подтверждает роль Pgp в реализации программируемой клеточной гибели.

Таким образом, нарушение экспрессии Р-гликопротеина и апоптоза лимфоцитов периферической крови у больных бронхиальной астмой среднетяжелого и тяжелого течения тесно связанно с выраженностью клинических проявлений заболевания и степенью нарушения функции внешнего дыхания. По нашему мнению, БА среднетяжелого и тяжелого течения характеризуется гиперэкспрессией Р-гликопротеина на лимфоцитах периферической крови, что обусловливает развитие лекарственной устойчивости, в частности к глюкокортикостероидам. Данный аспект является одним из составляющих сложного механизма развития нечувствительности к базисной терапии (рис. 7).

Примечание. * — точки приложения действия возможных корригирующих препаратов.

Рисунок 7 — Схема механизма развития нечувствительности к ПСС при бронхиальной астме

Нарушение механизмов реализации программируемой клеточной гибели отражает степень вовлеченности иммунокомпетентных клеток в формирование персистирующего воспаления, что приводит к нарушению функции внешнего дыхания и обусловливает развитие определенной клинической картины. Повышение экспрессии Р-гликопротеина и дизрегуляция апоптоза лимфоцитов периферической крови у больных БА отражает спектр чувствительности к ГКС

и способствует неконтролируемому течению заболевания. Учитывая данные аспекты, возможно использование в качестве дополнения к базисной терапии модуляторов экспрессии, активности Р-гликопротеина и модуляторов апоптоза.

ВЫВОДЫ

1. Контроль над заболеванием регистрируется у 55,9% больных бронхиальной астмой среднетяжелого течения, в том числе полный контроль — у 16,9% пациентов, в группе больных НСЗБА — у 15% пациентов, все пациенты со СЗБА характеризовались неконтролируемым течением заболевания. Выделены факторы неконтролируемого течения астмы: степень тяжести заболевания (ОШ=13,71), астматическое состояние в анамнезе (ОШ=9,98), прием системных глюкокортикостероидов курсами в течение 5 лет и более (0111=7,02), снижение объема форсированного выдоха за первую секунду до 60% и менее (ОШ=7,14), применение высоких доз ингаляционных глюкокортикостероидов (0111=4,82), женский пол (ОШ=2,62), возраст (ОШ=2,23), давность заболевания (ОШ=2,69), ИМТ (ОШ=2,91), стероидозависимость (01Д=1,70).

2. У больных бронхиальной астмой увеличивается экспрессия Р-гликопротеина на лимфоцитах периферической крови независимо от периода наблюдения и степени тяжести заболевания в сравнении с контролем. С увеличением давности заболевания до 6 лет и более отмечается нарастание уровня экспрессии Р-гликопротеина в 2 раза. У больных СЗБА, получающих СГКС в дозе 11 мг/сут и более, регистрируется увеличение экспрессии Р-гликопротеина в 5 раз.

3. В период обострения заболевания при тяжелом течении бронхиальной астмы отмечается торможение спонтанного апоптоза лимфоцитов периферической крови в 2 раза в сравнении с контролем и в 3 раза в сравнении с показателем при среднетяжелом течении. У больных бронхиальной астмой независимо от степени тяжести заболевания регистрируется существенное повышение уровня ГКС-индуцированного апоптоза in vitro в сравнении с показателем контрольной группы.

4. Корреляционные взаимосвязи между уровнем экспрессии Р-гликопротеина, развитием апоптоза, функциональными и клиническими проявлениями предполагают возможность значимого вклада нарушений экспрессии Pgp в характер прогрессирующего хронического воспаления и в повышение потребности в р2-агонистах (г=0,37), снижение чувствительности лимфоцитов периферической крови к апоптозу определяет повышение количества курсов СГКС у больных Б А среднетяжелого (г=-0,51) и тяжелого (г=-0,75) течения.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. При ведении больных бронхиальной астмой, для достижения оптимальных результатов в лечении, а также с целью профилактики обострений рекомендуется учитывать факторы неконтролируемого течения астмы: степень тяжести заболевания, астматическое состояние в анамнезе, прием системных глюкокортикостероидов курсами в течение 5 лет и более, снижение объема форсированного выдоха за первую секунду, применение

высоких доз иигаляциоииых глюкокортикостероидов, женский пол, возраст, давность заболевания, ИМТ, стероидозависимость.

2. В комплекс исследования больных бронхиальной астмой, особенно среднетяжелого и тяжелого течения, необходимо включать определение количества Pgp-экспрессирующих лимфоцитов периферической крови, что может применяться в качестве маркера эффективности противовоспалительной терапии. Для улучшения чувствительности к терапии глюкокортикостероидами рекомендуется исследовать фармакологическую эффективность препаратов, модулирующих активность Р-гликопротеина.

3. Выявленные особенности апоптоза иммунокомпетентных клеток у больных бронхиальной астмой следует использовать для оценки степени тяжести заболевания и оптимизации динамического наблюдения, что позволит своевременно проводить коррекцию противоастматической терапии. Нарушение реализации механизмов апоптоза обусловливает необходимость подключения к терапии глюкокортикостероидами апоптоз-регулирующих агентов для усиления противовоспалительных эффектов.

СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Способ определения чувствительности к терапии глюкокортикостероидами при тяжелых формах бронхиальной астмы методом экспрессии Р-гликопротеина на лимфоцитах периферической крови / И. В. Демко, С. В. Чубарова, А. Б. Салмина, Н. А. Малиновская, A.B. Моргун// Вузовская наука. Инновационные методы, используемые в научной и клинической работе КрасГМА. - Красноярск, 2007. -С.43-45.

2. Demko, I. V. Role of Pgp in corticosteroid sensitivity in patients with severe forms of bronchial asthma /1. V. Demko, A. B. Salmina, S. V. Chubarova // Abstracrt of the ERS congress. - Berlin, 2008. - P. 633.

3. Клинико-функциональные особенности течения бронхиальной астмы в пожилом возрасте / Е. А. Собко, И. В. Демко, Н. Г. Рязанова, С. В. Чубарова, Н. Г. Рязанова, О. П. Ищенко, А. Ю. Крапошина, JI. И. Каптюк // Профилактическая и клиническая медицина. -2010. -С.295-301.

4. Аллергенспецифическая иммунотерапия - эффективный метод в лечении больных бронхиальной астмой / Е. А. Собко, И. В. Демко, О. П. Ищенко, А. Ю. Крапошина, С. В. Чубарова // Аллергология и иммунология-2011. -№1. -С.23.

5. Оценка клинико-функционалыюго статуса и артериальной ригидности у больных бронхиальной астмой / Е. А. Собко, И. Г. Рязанова, И. В. Демко, А. Ю. Крапошина, С. В. Чубарова, О.П. Ищенко // Сиб. мед. обозрение. -2011. -№1. - С.44-48.

6. Содержание фактора некроза опухоли, С-реактивного белка и показатели жесткости сосудистого русла у больных бронхиальной астмой / А. Ю. Крапошина, Е. А. Собко, И. В. Демко, А. Б. Салмина, Н. Г. Рязанова, О. П. Ищенко, С. В. Чубарова // Аллергология и иммунология. - 2011. - №1- С.20.

7. Expression of P-glycoprotein in patients with bronchial asthma / S. V. Chubarova, E. A. Sobko, A. Yu. Kraposhina, I. V. Demko, A. B. Salmina [Электронный ресурс] // EuropeanAcademyofAllergyandClinicallmmunology Congress 2012,- Geneva, 2012. -Режим доступа: htp://congrex.insideguidance.com/eaaci/2012/catalog/#!event.

8. Tumo rnecrosis factor - б, interlukin-6 and arterial rigidity indexes in patients with bronchial asthma / A.Yu. Kraposhina, E.A. Sobko, O.P. Ishenko, S.V. Chubarova, I.V. Demko, A.B. Salmina [Электронный ресурс] // EuropeanAcademyofAllergyandClinicallmmunologyCongress 2012. - Geneva, 2012. -Режим доступа :http://congrex.insideguidance.com/eaaci/2012/catalog/#! event

9. Молекулярные механизмы стероидорезистентности при бронхиальной астме: р-гликонротеин и CD38 как новые мишени для фармакологической коррекции / Л. И. Каптюк, А. Ю. Крапошина, Е. А. Собко, А. Б. Салмина, И. В. Демко, Н. А. Малиновская, М. М. Петрова, А. Г. Чучалин, С. В. Чубарова // Молекулярная медицина. - 2012. - №2.- С.11-16.

10. Показатели жесткости артериального русла и содержание фактора некроза опухоли-A, интерлейкина-6 у больных бронхиальной астмой / А. Ю. Крапошина, Е. А. Собко, С. В. Чубарова, О.П. Ищенко, И.В. Демко, А.Б. Салмина, Н.Г. Рязанова, P.C. Эйдемиллер // Сборник трудов конгресса XXII Национального конгресса по болезням органов дыхания, 23-26 октября 2012г.-М., 2012. - С.36-37.

11. Р-гликопротеин у больных бронхиальной астмой в процессе проспективного наблюдения / С. В. Чубарова, Е. А. Собко, А. Ю. Крапошина, И. В. Демко, А. Б. Салмина // Сборник трудов конгресса XXII Национального конгресса по болезням органов дыхания 23-26 октября 2012г. - М.,2012. - С.37-38.

12. Системное воспаление и показатели жесткости сосудистого русла у больных бронхиальной астмой / Е. А. Собко, А. Ю. Крапошина, О. П. Ищенко, И. В. Демко, Н. Г. Рязанова, Л. И. Каптюк, С. В. Чубарова, Н.С. Эйдемиллер, Ю.Г.Толмачева, О.Н. Новокрещенных // Первая краевая. - 2012. - №1. - С.23-27.

13. Системное воспаление и эндотелиальная дисфункция при бронхиальной астме / Е. А. Собко, А. Ю. Крапошина, И. В. Демко, О. П. Ищенко, С. В. Чубарова, Л. В. Аристархова // Материалы юбилейной научно-практической конференции, посвященной 70-летию Краевой клинической больницы 11-12 октября 2012г. - Красноярск, 2012. - С.149-152.

14. Физиологические и клинические аспекты Р-гликопротеина / С. В. Чубарова, А. Ю. Крапошина, Е. А. Собко,И. В. Демко, А. Б. Салмина // Бюл. физиологии и патологии дыхания. - 2012. - № 45. - С.91-97.

15. Апоптоз лимфоцитов периферической крови при бронхиальной астме / С. В. Чубарова, И. А. Чернова, А. Ю. Крапошина, И. В. Демко, А. Б. Салмина, Е. А. Собко // Материалы V Съезда врачей-пульмонологов Сибири и Дальнего Востока, 22-23 мая. - Благовещенск, 2013. - С. 15-17.

16. Нарушение вазорегулирующей функции эндотелия у больных бронхиальной астмой / Е. А. Собко, С. В. Чубарова, А. Ю. Крапошина, Н. Г. Рязанова, О. П. Ищенко, И. А. Соловьева, И. В. Демко // Труды XII Конгресса Современные проблемы иммунологии, аллергологии и иммунофармакологии (11-13 марта 2013 г., Москва). - М., 2013. - С.267-269.

17. Апоптоз лимфоцитов периферической крови при бронхиальной астме различной степенп тяжести / С. В. Чубарова, И. А. Чернова, А. Ю. Крапошина, И, А. Соловьева, И. В. Демко, А. Б. Салмипа, Н. А. Малиновская // Бюл. физиологии и патологии дыхания. - 2013. - №48. -С.28-33.

18. Роль АТФ-зависимого трансмембранного белка в оптимизации базисной терапии при бронхиальной астме / С. В. Чубарова, А. Ю. Крапошина, И. А. Соловьева, И. В. Демко, Е. А. Собко // Первая краевая. - 2013. - №2. -С.38-40.

19. Роль р38 МАРК в развитии иммунного воспаления / И.А. Соловьева, И.В. Демко, Е.А. Собко, А.Ю. Крапошина, C.B. Чубарова, А.Б. Салмина// Бюллетень физиологии и патологии дыхания. - 2013. - №49. - С. 105114.

20. Чубарова, C.B. Патогенетические аспекты стероидочувствителыюсти при бронхиальной астме // C.B. Чубарова, И.В. Демко, А.Б. Салмина. - Красноярск: тип. Печатный двор, 2013. - 129с.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АБА аллергическая бронхиальная астма

АИ апоптотический индекс

АСТ™ тест по контролю над астмой

АТФ аденозинтрифосфат

БА бронхиальная астма

ГКС глюкокортикостероид

ДДА длительно действующие агонисты р2 -адренорецепторов

игкс ингаляционный глюкокортикостероид

имт индекс массы тела

НАБА неаллергическая бронхиальная астма

НСЗБА нестероидозависимая бронхиальная астма

ОФВ! объем форсированного выдоха за 1-ую секунду

ОШ отношение шансов

СГКС системный глюкокортикостероид

СЗБА стероидозависимая бронхиальная астма

ФВД функция внешнего дыхания

ФЖЕЛ форсированная жизненная емкость легких

MDR ген множественной лекарственной устойчивости

PgP Р-гликопротеин

Отпечатано в полиграфическом центре «Печатный двор» 660041, г. Красноярск, ул. Марковского, д. 19. Тел.: (391)294-91-04 Подписано в печать 10.10.2013. Формат 60x90/16. Печать офсетная 1,25 усл. п. л. Заказ № 1952. Тираж 100 экз.