Автореферат и диссертация по медицине (14.01.25) на тему:Апоптоз клеток воспаления и морфологические изменения бронхов при бронхиальной астме

На правах рукописи

КАШИНЦЕВА ТАТЬЯНА ВАЛЕРЬЕВНА

АПОПТОЗ КЛЕТОК ВОСПАЛЕНИЯ И МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ БРОНХОВ ПРИ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМЕ

14.01.25 — Пульмонология 14.03.02 — Патологическая анатомия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 9 МДР ¿012

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 2012

005020618

005020618

Работа выполнена на кафедре госпитальной терапии имени академика М.В. Черноруцкого государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научные руководители:

доктор медицинских наук, доцент Ирина Ивановна Нестерович доктор медицинских наук, профессор Вадим Валентинович Байков

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Валерий Андреевич Яковлев

доктор медицинских наук, ведущий научный сотрудник Иветга Владиславовна

Двораковская

Ведущая организация:

ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная педиатрическая медицинская академия» Минздравсоцразвития России

Защита диссертации состоится «/г » <$/7/6^/7% 2012 г. в /с] часов на заседании диссертационного совета/по защите докторских и кандидатских диссертаций Д.208.090.02 при ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова» Минздравсоцразвития РФ в Научно-исследовательском институте пульмонологии (197022, Санкт-Петербург, ул. Рентгена, д. 12).

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке Санкт-Петербургского государственного медицинского университета имени академика И.П. Павлова (197022, Санкт-Петербург, ул. Л. Толстого, д. 6/8).

Автореферат разослан « ¿2 » 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук,

профессор Альберт Леонидович Александров

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы

Бронхиальная астма (БА) является одной из важнейших проблем пульмонологии и внутренней медицины в связи с распространённостью и значительным влиянием на качество жизни. Специальными эпидемиологическими исследованиями установлено, что распространённость БА в разных странах составляет не менее 8-18% среди взрослого населения, 10-20% - среди детей (Федосеев Г.Б., Трофимов В.И., Петрова М.А., 2011). Кроме этого, обращает на себя внимание увеличение распространённости БА в России, увеличение тяжести течения заболевания и связанный с этим рост летальности (Илькович М.М., Чучалин А.Г., 2009; Федосеев Г.Б., Трофимов В.И., Петрова М.А., 2011). Вызывает обоснованную тревогу большой процент инвалидности, а также размеры экономического ущерба, связанного с заболеваемостью БА (Кокосов А.Н., 2005).

Повышение эффективности лечения и профилактики БА связывается с необходимостью глубокого знания патогенетических особенностей заболевания. В настоящее время патогенез БА достаточно хорошо изучен, однако полное понимание всех его деталей не достигнуто.

По данным ряда исследований ведущую роль в патогенезе астмы играет хронический воспалительный процесс (Федосеев Г.Б., Трофимов В.И., 2006; МинеевВ.Н., Нестерович И.И., 2006; Григоренко A.A., 2006). Одним из важных механизмов поддержания воспаления является персистенция в органе-мишени клеток-эффекторов воспаления и иммунных реакций, в частности, лимфоцитов и эозинофилов, в том числе в связи с нарушением их элиминации путем угнетения апоптоза. Эти нарушения имеют место как в бронхах, так и в других тканях, в том числе периферической крови (Parfrey H., Farahi N., Porter L., 2010; Wegmann M. et al., 2011). Нельзя не отметить и тот факт, что глюкокортикоиды, важный компонент базисной терапии БА, реализуют своё действие в значительной мере за счёт изменений апоптоза клеток-мишеней (Saglani S., Malmstrom К., Pelkonen A.S., 2004; Black J.L., Oliver B.G.G., Roth M., 2009; Benedictis F., Bush A., 2011).

При БА описывают существенные нарушения структуры и функции эпителия бронхов, которые могут играть патогенетическую роль (Нестерович И.И., 2005; Jeffery Р.К., 2004; Holgate S.T., 2007; Davies D.E., 2009). Апопгоз эпителия дыхательных путей рассматривается как потенциальный механизм повреждения эпителиальной выстилки бронхов (Нестерович И.И., 2005; Gang Cheng, Zhifei Shao, Bharti Chaudhari, 2007; Cohen L., Xueping E., Tarsi J., 2007; Chi Liu, Yang Xiang, Huijun Liu, 2010). Более того, при БА происходит перестройка всех структурных компонентов стенки бронхов, называемая ремоделированием: нарушаются пролиферация, миграция, и дифференцировка клеточных компонентов, что ведет к изменениям в соединительной ткани и нарушению структуры дыхательных путей.

Ремоделирование бронхов включает в себя не только фибропластическую реакцию, но также изменение всех структурных элементов дыхательных путей: покровного эпителия, микрососудов, гладких мышц и слизеобразующих клеток (Jeffry Р.К., 2004; Holgate S.T., 2007; Bergeron С., Al-Ramli W., Hamid Q„ 2009).

Структурная перестройка слизистой оболочки бронхов и ее влияние на течение БА, особенности ремоделирования бронхов у больных с разными вариантами БА до настоящего времени изучены недостаточно. Не вполне освещён также вопрос о взаимосвязи нарушений апоптоза с особенностями воспалительного процесса и ремоделирования бронхов у больных БА.

Цель работы

Выявить особенности апоптоза лимфоцитов периферической крови и эпителиальных клеток бронхов при бронхиальной астме и установить связь нарушений апоптоза с особенностями и выраженностью воспалительного процесса и ремоделирования в бронхах у больных бронхиальной астмой.

Задачи исследования

1. Оценить нарушения апоптоза лимфоцитов периферической крови и эпителиальных клеток в бронхах.

2. Оценить морфологические изменения слизистой бронхов при БА, включая количественные морфометрические показатели ремоделирования.

3. Сопоставить показатели апоптоза лимфоцитов крови и эпителиальных клеток бронхов и морфологические изменения бронхов при аллергической и неаллергической БА.

4. Оценить изменения морфометрических показателей ремоделирования при аллергической и неаллергической БА.

5. Охарактеризовать взаимосвязи между выраженностью апоптоза лимфоцитов периферической крови и эпителиальных клеток бронхов, особенностями ремоделирования бронхов и проводимой терапией.

Научная новизна работы

1. Впервые установлена связь между активностью апоптоза лимфоцитов в периферической крови, активностью апоптоза эпителиальных клеток в бронхах и особенностями структуры бронхов в процессе ремоделирования при БА.

2. Впервые показаны различия профилей ремоделирования бронхов при аллергической и неаллергической БА.

3. Впервые продемонстрировано, что лекарственная терапия оказывает влияние на активность апоптоза клеток эпителия бронхов, а также определяет интенсивность ремоделирования его стенки.

Практическая ценность работы

Определение уровня активности каспазы-3 лимфоцитов периферической крови является наиболее простым и информативным методом оценки апоптоза клеток-мишеней. Это позволяет рекомендовать его в качестве дополнительного исследования для дифференциальной диагностики вариантов бронхиальной астмы.

Положения, выносимые на защиту

1. Для бронхиальной астмы характерны изменения спонтанного апоптоза клеток-мишеней, зависящие от варианта заболевания. Характерной особенностью аллергической бронхиальной астмы являлось торможение апоптоза лимфоцитов периферической крови и повышение экспрессии ингибитора апоптоза Вс1-2 в эпителиальных клетках. Неаллергическая бронхиальная астма характеризовались повышением апоптоза лимфоцитов периферической крови и снижением экспрессии индуктора апоптоза Вах в эпителиальных клетках бронхов.

2. Процессы ремоделирования бронхов при различных вариантах БА неодинаковы. Характерной особенностью аллергической БА является шеддинг эпителия, а неаллергической БА - метаплазия эпителия. Особенностью ремоделирования при АБА по сравнению с НАБА является более выраженные утолщение и гиалинизация базальной мембраны, гипертрофия мышечных клеток, васкуляризация, эозинофильная и лимфоцигарная инфильтрация. Выраженность процессов ремоделирования под влиянием глюкокортикостероидной терапии уменьшается.

3. Интенсивность апоптоза лимфоцитов периферической крови у больных БА тесно связана с показателями апоптоза эпителия бронхов и признаками ремоделирования бронхов, что указывает на универсальность механизмов регуляции процесса апоптоза и на единство регуляции процесса апоптоза как на клеточном, так и на органном и организменном уровнях.

Реализация и апробация работы

Результаты исследования внедрены в практическую работу клиники госпитальной терапии, межклинического аллергологического отделения СПбГМУ им. И.П. Павлова.

Материалы диссертации докладывались на 14 и 15 научно-практических конференциях «Актуальные вопросы пульмонологии и клинической аллергологии -врачам общей практики» (Санкт-Петербург, 2010 и 2011); на научной конференции, посвященной 110-летию кафедры госпитальной терапии им. акад. М.В. Черноруцкого СПбГМУ им. И.П. Павлова (Санкт-Петербург, 2011); на 19-м Конгрессе Европейского Респираторного Общества (Vienna, Austria, 2009); на 20-м Конгрессе Европейского Респираторного Общества (Barcelona, Spain, 2010).

По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ (4 в отечественных изданиях и 3 в зарубежных), из которых 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК.

Объём и структура диссертации

Диссертация изложена на 166 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, трёх глав результатов исследования, обсуждения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа иллюстрирована 33 таблицами и 4 рисунками. Библиография включает 192 источника: 43 отечественных и 149 зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Клиническая характеристика больных

Отбор и клинико-лабораторное обследование больных осуществлялись на базе клиники госпитальной терапии имени академика М.В. Черноруцкого ГБОУ ВПО СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова Минздравсоцразвития РФ. Больные находились на стационарном лечении от 14 до 20 дней. Диагноз БА устанавливали в соответствии с классификацией и критериями международного консенсуса по вопросам диагностики и лечения БА (GINA, 2010).

В контрольную группу практически здоровых лиц вошло 40 человек: 9 мужчин (21.7%) и 31 женщина (78.3%). Средний возраст мужчин составил 24,14 ± 4,48 года, а средний возраст женщин - 30,42 ± 10,02 лет. Для отбора практически здоровых лиц использовались следующие критерии: 1) отсутствие хронической бронхо-лёгочной патологии; 2) отсутствие признаков острых заболеваний в течение последнего месяца; 3) неотягощенная по БА и другим аллергическим заболеваниям наследственность; 4) спокойный аллергологический анамнез; 5) неотягощённая наследственность в отношении аллергических заболеваний.

Было обследовано 143 человека: 103 пациента с бронхиальной астмой (52 больного АБА и 51 больной НАБА) и 40 практически здоровых лиц.

Среди больных БА было 38 мужчин и 65 женщин. Возраст обследованных в группе больных Б А находился в пределах от 18 до 80 лет у женщин и от 18 до 75 лет у мужчин и в среднем составил 47,92 ± 19,27 года. Длительность заболевания у больных БА колебалась от 0,1 до 60 лет.

Больные АБА с легким течением составили 50% наблюдений, с течением средней тяжести - 38,5% наблюдений и тяжелое течение заболевания - у 11,5% наблюдений. Большинство больных НАБА были с течением средней тяжести - 82,4% больных. Пациенты с тяжелым течением болезни были статистически значимо старше (средний возраст составил 55,56 ± 12,46 года) и имели достоверно наибольшую продолжительность болезни (в среднем 18,7 ± 11,29 года), чем больные с легким и среднетяжелым течением БА.

Пациенты с различной степенью тяжести болезни достоверно отличались друг от друга по характеру получаемой терапии.

Больные с легким течением БА достоверно чаще использовали в терапии интал или тайлед по сравнению с больными со среднетяжелым и тяжёлым течением заболевания. Бронхолитики достоверно чаще были использованы в терапии больных со среднетяжелым и тяжелым течением заболевания по сравнению с легким течением. р2-адреномиметики использовали 90% больных с лёгким течением, 93,5% больных со среднетяжелым и 100% больных с тяжелым течением заболевания. Частота использования антибактериальных препаратов увеличивалась с нарастанием тяжести течения БА (10% при лёгком течении, 19,4% при среднетяжёлом течении и 40% при тяжёлом течении).

Ингаляционные кортикостероиды в терапии больных с легким течением болезни использовались существенно реже по сравнению с больными со среднетяжелым и тяжелым течением (30%, 85,5% и 90% соответственно). Среднесуточная доза ингаляционных глюкокортикостероидов также нарастала с увеличением тяжести течения БА. Парентеральные глюкокортикостероиды с высокой достоверностью чаще назначали больным со среднетяжелым течением (72,6%) и с тяжелым течением БА (100%). Среднесуточная и курсовая дозы парентеральных глюкокортикостероидов были достоверно выше у больных с тяжёлым течением БА. При этом длительность терапии парентеральными глюкокортикостероидами у больных с тяжёлым течением БА была также достоверно выше по сравнению с больными БА с легким и среднетяжелым течением заболевания. Системные глюкокортикостероидные препараты назначались в основном больным с тяжелым течением заболевания (40%). Среднесуточная доза системных глюкокортикостероидных препаратов в среднем составила 7,5 ± 3,54 мг в пересчете на преднизолон у больных со среднетяжелым течением и 9,26 ± 4,39 мг в пересчете на преднизолон у больных с тяжёлым течением БА.

Методы исследования

Больным проводили стандартное клиническое, лабораторное и рентгенологическое обследование, аллергологическое тестирование с постановкой кожных проб с различными неинфекционными аллергенами, а также цитологическое исследование мокроты. При наличии медицинских показаний выполнялась фибробронхоскопия с прицельной биопсией слизистой бронха и взятием смывов из бронхов (39 больных).

У всех больных и практически здоровых лиц получали информированное согласие на проведение обследования.

Для оценки состояния функции внешнего дыхания производили запись спирограммы с определением жизненной ёмкости лёгких (ЖЕЛ), объёма форсированного выдоха за первую секунду (ОФВ1), регистрировали максимальную

скорость выдоха на различных уровнях ФЖЕЛ: ПОС, МОС50, МОС75, определяли бронхиальное сопротивление (Raw) и структуру общей емкости легких с последующим расчетом удельной проводимости бронхов (SGaw). Все показатели оценивали исходно и через 15 минут после ингаляции бронхолитика для определения степени выраженности бронхоспазма.

С целью исследования готовности лимфоцитов периферической крови к апоптозу оценивали активность спонтанной экспрессии рецептора CD95/Fas/APO-l на лимфоцитах с использованием моноклональных антител фирмы Immunotech (Coulter Corp., USA).

Для исследования ранней стадии апоптоза лимфоцитов периферической крови использован набор фирмы Becton Dikinson (Германия), включающий Аннексии, конъюгированный с флюорохромом-флюоресцеинизотиоционатом (Aimexin V-FITC), пропидиум иодид (PI) и буфер для окрашивания Аннексии V.

Для определения апоптоза лимфоцитов крови на основе оценки активности каспазы-3 использован набор фирмы Becton Dikinson (Германия), включающий моноклональные антитела к активной каспазе-3, коныогированные с фикоэритрином, раствор для пермеабилизации мембраны Cytofix/Cytoperm и буфер для отмывания -Perm/Wash.

Цитометрический анализ лимфоцитов проводили на проточном цигофлуориметре РARTEC PAS (Германия). Данные анализировали с помощью компьютерной программы FIoMax.

Указанные исследования выполнены в лаборатории иммунологии Центра Лабораторной диагностики СПбГМУ им. И.П. Павлова совместно с к.м.н. A.B. Луговой при методическом содействии зав. кафедрой клинической лабораторной диагностики СПбГМУ им. И.П. Павлова, д.м.н., профессора В.Л. Эмануэля.

Механизмы регуляции апоптоза эпителиальных клеток бронхиального дерева исследовались с использованием иммуногистохимических методик (определение активности каспазы-3, экспрессии Вс1-2 и Вах) с использованием наборов фирмы DAKO. Работа выполнена совместно с к.м.н. Р.В. Грозовым в лаборатории иммуногистохимии кафедры патологической анатомии СПбГМУ им. ИЛ. Павлова (зав. кафедрой д.м.н., профессор М.Г. Рыбакова).

Ремоделирование бронхов оценивалось с помощью использования стандартных гистологических методик и морфометрического исследования, выполненного с помощью применения прикладной компьютерной лицензионной программы анализа микроскопических изображений Videotest 3,0 согласно основным принципам стереологии и морфометрии.

Морфометрическое ^исследование выполнено совместно с jc.m.h. ИМ. "Нутфуллиной на кафедре патологической анатомии СПбГМУ им.ТИЛ. Павлова (зав. кафедрой д.м.н., профессор М.Г. Рыбакова).

Статистическая обработка материала выполнялась с использованием стандартного пакета прикладного статистического анализа SPSS for Windows (Statistical Package for the Social Science, версия 16.0).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Морфологическое исследование включало оценку структурных изменений бронхов при различных вариантах БА в препаратах с обзорными окрасками, так и анализ количественных морфометрических показателей ремоделирования (рис.1).

80 70 60

Sклеток 5Q

40 30 20 10 0

Рис. 1. Зависимость морфологических показателей от варианта БА

Наиболее частым признаком ремоделирования бронхов являлось повреждение эпителия, а именно, его десквамация, что в большей степени было характерно для больных АБА (десквамация эпителия наблюдалась у 50% больных АБА и 20% НАБА), Что касается метаплазии эпителия, то этот признак был в основном характерен для больных НАБА (метаплазия эпителия наблюдалась у 66,7% больных НАБА и 33,3% АБА), имеющих стаж курения и сопутствующий хронический бронхит. По данным литературы известно, что наиболее вероятной причиной слущивания эпителия является высокая токсичность протеинов, содержащихся в эозинофильных гранулах эозинофилов: основного протеина, эозинофильного катионного протеина, эозинофильной пероксидазы (Волкова Л.И., Будкова A.A.,

Кустов В.И., 2000; Kawa Amin, Dora Ludviksdottir, Christer Janson, 2000; Saglani S., Malmström К., 2004).

Было выявлено, что при АБА утолщение и гиалинизация базальной мембраны, гипертрофия мышечных клеток более выражены, по сравнению с НАБА. Утолщение и гиалинизация базальной мембраны наблюдались у 50% больных АБА и у 20% больных НАБА. Гипертрофия гладкомышечных клеток была выявлена у 41,7% больных АБА и 20% НАБА. Механизмы утолщения базальной мембраны до сих пор до конца не выяснены, однако в ретикулярном слое базальной мембраны у больных астмой рядом авторов обнаружены депозиты коллагена и пролиферация миофибробластов. Иммуногистохимические исследования показали, что в составе депозитов содержится коллаген 3, 4 и 5 типов и фибронекгин, которые мотуг вырабатываться фибробластами под влиянием трансформирующего фактора роста из эозинофилов (Волкова Л.И., Будкова A.A., Кустов В.И., 2000; Григоренко A.A., 2006). Что касается гипертрофии мышечных клеток, известно, что толщина субэпителиального коллагена тесно взаимосвязана с пролиферативной активностью миофибробластов (Roche W.R., 1991). Эозинофильная и лимфоцитарная инфильтрация слизистой оболочки бронхов также в большей степени наблюдалась у больных АБА.

Морфометрический анализ позволил в целом подтвердить данные, полученные при обзорном гистологическом исследовании, и дать более точную количественную оценку процессам ремоделирования бронхов.

Так, показатели толщины эпителия, базальной мембраны и миоцигов были значительно выше показателей у здоровых (для сопоставления использованы показатели здоровых лиц, по данным литературы - Benayoun L, Druilhe A., Dombret М.С., 2003; Hamilton L.M., Puddicombe S.M., Dearman R.J., 2003). Это подтверждает развитие процесса ремоделирования бронхов при БА. При АБА толщина эпителия, по нашим данным, составляла в среднем 32,49цш, толщина базальной мембраны -6,46цт, толщина миоцита - 4,86цт, а при НАБА - 30,94цт, 5,37цт и 4,08цт соответственно (рис.2). Таким образом, описанные показатели у больных АБА были выше, чем при НАБА, что позволяет считать, что при АБА структура бронхов изменяется более существенно, чем при НАБА.

Что касается инфильтрации стенки бронхов клетками воспаления, то следует отметить, что при морфометрическом исследовании биоптатов бронхов у больных АБА, по сравнению с больными НАБА, были выявлены как повышение клеточности в целом (52,12 ± 13,77 при АБА и 39,42 ± 15,15 при НАБА), так и повышенные абсолютные и относительные (в %) показатели эозинофилов и плазмоцитов, что говорит в пользу более активного процесса ремоделирования у больных АБА. При АБА количество эозинофилов в среднем составляло 2,55 на единицу площади (4,83%

*Р < 0,05

■ АБА ОНАБА

Толщина эпителия

Толщина БМ

Рис. 2. Зависимость морфометрических данных от варианта БА

Толщина миоцита

от общего клеточного состава), это почти в 3 раза больше по сравнению с НАБА.Количество плазмоцитов при АБА в среднем составило 1,91 на единицу площади (4,43% от общего клеточного состава), это в 2 раза больше по сравнению с НАБА. По мнению ряда исследователей, увеличение числа эозинофилов, лимфоцитов и плазматических клеток в подслизистом слое по сравнению со здоровыми субъектами является диагностически значимым признаком при БА (Dolen W.K.,1996; Poulter L.W., Burke C.M., 1996; Amin К., Ludviksdottir D.s Janson С., 2000).

Нами было выявлено, что количество сосудов на единицу площади при АБА было больше по сравнению с НАБА. Так, количество сосудов на единицу площади при АБА в среднем составило 1,34 ± 1,23, а при НАБА - 0,0 ± 0,74. Повышенную васкуляризацию слизистой оболочки при БА связывают с большим количеством фактора роста эндотелия сосудов и фактора роста фибробластов, которые стимулируют пролиферацию эндотелиальных клеток (Amin К., Ludviksdottir D., Janson С., 2000). Эти ростовые факторы выделяются главным образом CD34-лимфоцитами, эозинофилами, макрофагами, присутствующими в слизистой бронхов в больших количествах у больных АБА (рис.3).

При сопоставлении показателей толщины базальной мембраны эпителия у больных с различной тяжестью течения БА показано, что с нарастанием тяжести течения базальная мембрана достоверно утолщается в 1,5 раза. Таким образом, тяжелому течению БА соответствует более глубокая перестройка слизистой оболочки бронхов, что согласуется с данными литературы (Г.Б. Федосеев, В.И. Трофимов, 2006).

В ходе исследования продемонстрировано, что процессы ремоделирования в бронхах при БА отражаются на показателях ФВД. По показателям ФВД также можно судить о выраженности процессов ремоделирования. Увеличение массы гладких

мышц, застой в сосудистом русле и гипертрофия слизистых желез приводят к утолщению стенки и уменьшению диаметра просвета бронхов (Woodruff P.G., Dolganov G.M., Ferrando R.E., 2004). Это препятствует поступлению воздушного потока в легкие и приводит к повышению поверхностного натяжения.

Количество/цт

2,5 2 1,5 1 0,5

® АБА 0НАБА

Эозинофилы Плазмациты Васкуляризация

*р < 0,05 ±*р = 0,0001

Рис. 3. Зависимость морфометрических данных от варианта БА

Нами было исследовано влияние терапии ГКС на процессы ремоделирования, а также в отдельности влияние как ингаляционных так и парентеральных ГКС. У больных, получающих глюкокортикостероиды, шеддинг эпителия и гиалинизация базальной мембраны, утолщение базальной мембраны и миоцитов, эозинофильная и лимфоцитарная инфильтрации встречались гораздо реже по сравнению с больными БА, не получающими ГКС. При корреляционном анализе были выявлены отрицательные связи между указанными показателями ремоделирования и терапией ГКС. Известно, что терапия глюкокортикостероидными гормонами способна уменьшать субэпителиальное отложение коллагена путем подавления экспрессии металлопротеиназы-9 и индукции активности тканевого ингибитора металлопротеиназы-1 (Hoshino М. et al., 1999).

Апоптоз эпителия дыхательных путей рассматривается как потенциальный механизм повреждения эпителиальной выстилки бронхов (White S.R., Dorscheid D.R., 2002). Нами было исследовано влияние апоптоза эпителиальных клеток и лимфоцитов на процессы ремоделирования бронхов при БА.

В ходе настоящего исследования выявлены сильные статистически значимые связи между активностью регуляторов апоптоза эпителия и процессами ремоделирования слизистой оболочки бронхов. При этом между экспрессией ингибитора апоптоза Вс1-2 и десквамацией эпителия выявлена положительная корреляционная связь (0,819, р=0,0001), а между экспрессией индуктора апоптоза Вах

и десквамацией эпителия - отрицательная (-0,868, р=0,0001). В противоположность этому между метаплазией эпителия и экспрессией ингибитора апоптоза Вс1-2 выявлена отрицательная корреляционная связь (-0,379, р=0,09), а между экспрессией индуктора апоптоза Вах и метаплазией эпителия - положительная (0,485, р=0,03) (рис.4).

Рис. 4. Корреляционный анализ показателей апоптоза эпителиальных клеток и ремоделирования стенки бронхов

В литературе имеются указания на активацию апоптоза в клетках эпителия бронхов при при БА (Bucchieri F., Puddicombe S.M., Lordan J.L. et al., 2002). Интересные данные получены Sarah M. Puddicombe и соавт. (2003) о высокой экспрессии ингибитора циклин-зависимой киназы - p21waf в эпителии бронхов больных БА. Отметим, что ингибиторы клеточного цикла осуществляют контроль над пролиферативной активностью клеток. Авторы полагают, что существует дисбаланс во взаимодействии между жизнеспособностью клеток, пролиферацией и апоптозом, что приводит к нарушению регуляции обновления эпителиального слоя, что может способствовать персистенции воспаления и ремоделированию дыхательных путей при БА.

В результате исследования были выявлены статистически значимые положительные корреляции между экспрессией ингибитора апоптоза Вс1-2 и утолщением и гиалинизацией базальной мембраны, гипертрофией гладкомышечных клеток и эозинофильно-лимфоцитарной инфильтрацией, и отрицательные корреляции между- экспрессией индуктора апоптоза. Вах и этими же морфологическими показателями. Полученные данные свидетельствуют о том, что при пониженной активности апоптоза эпителиальных клеток (что наблюдается в основном у больных

Процессы ремоделирования:

Утолщение и гиалинизация БМ, гипертрофия

интпл^п

АБА), процессы ремоделирования усиливаются. По данным литературы, в осуществлении контроля за развитием гипертрофии и гиперплазии гладких миоцитов существенная роль может принадлежать апоптозу (Hamann K.J., Vieira J.E., Halayko AJ. et al., 2000).

В ходе исследования выявлен более высокий уровень экспрессии ингибитора апоптоза Вс1-2 у больных АБА, по сравнению с больными НАБА (32,06±7,83% и 12,25±4,39%, р=0.0001). В противоположность этому, экспрессия индуктора апоптоза

- Вах у больных АБА была меньше, чем при НАБА. Индекс Bcl-2/Bax, интегрально характеризующий баланс активности генов-регуляторов апоптоза клетки, также указывает на преобладание антиапоптотического регулирующего влияния на клетку над проапоптотическим у больных АБА.

Показано, что важное влияние на апоптоз эпителиальных клеток оказывает терапия больных БА. Отметим, что при проведении корреляционного анализа между уровнем экспрессии регулятора апоптоза Вс1-2 в эпителиальных клетках бронхов больных БА и проводимой глюкокортикостероидной терапией выявлены отрицательные достоверные корреляционные связи, а между активностью индуктора апоптоза Вах и каспазы-3 в эпителиальных клетках и использованием глюкокортикостероидных препаратов (ингаляционных, парентеральных и системных)

- положительные, что говорит о том, что глюкокортикостероидная терапия может индуцировать апоптоз эпителиальных клеток. Следует отметить, что всем больным НАБА в период госпитализации были назначены парентеральные глюкокортикостероиды и именно в этой группе преобладала экспрессия индуктора апоптоза Вах.

При проведении корреляционного анализа между уровнем экспрессии Вс1-2 и Вах в эпителиальных клетках бронхов и уровнем экспрессии CD95/Fas/APO-l рецепторов, фосфатидилсерина на поверхности лимфоцитов, а также активности ключевой эффекторной каспазы-3 в лимфоцитах периферической крови нами показана тесная взаимосвязь между исследуемыми показателями апоптоза.

Так, были выявлены высокие положительные корреляционные связи между уровнем экспрессии индуктора апоптоза Вах эпителиальными клетками бронхов и процентом апоптотических лимфоцитов периферической крови, оцениваемых по уровню экспрессии CD95 (г=0,956, р<0.05) антигена, фосфатидилсерина на поверхности лимфоцитов (г=0,943, р=0,0001), а также по активности каспазы-3 (г=0,822, р=0,045) в лимфоцитах периферической крови. Данные связи свидетельствуют о том, что повышение активности индуктора апоптоза в органе-мишени больных БА сопряжено с повышением апоптоза лимфоцитов периферической крови. В противоположность этому, нами выявлены отрицательные корреляционные связи между уровнем экспрессии антиапоптотического белка Вс1-2 в бронхиальных эпителиальных клетках и долей апоптотических лимфоцитов

периферической крови (экспрессия СБ95 г=-0,997, р=0,046, экспрессия фосфатидилсерина г=-0,924, р=0,0001, активность каспазы-3 1=-0,884, р=0,008).

Таким образом, полученные данные свидетельствуют в пользу единства регуляции программированной клеточной гибели в целостном организме.

Показано наличие достоверных корреляционных связей между количеством апоптотических лимфоцитов и показателями ремоделирования слизистой оболочки бронхов у больных БА. Так, между уровнем АппехтУ+/Р1-и СП-95/Та5/АРО-1 рецепторов, активностью каспазы-3 лимфоцитов периферической крови и десквамацией эпителия, утолщением и гиалинизацией базальной мембраны, гипертрофией гладкомышечных клеток и эозинофильно-лимфоцитарной инфильтрацией выявлены отрицательные корреляции, а между уровнем АппехтУ+/Р1-, СВ-95/Таэ/АРО-1 рецепторов, активностью каспазы-3 лимфоцитов периферической крови и метаплазией эпителия - положительные.

Для аллергической БА характерно торможение апоптоза лимфоцитов периферической крови, выявленное нами на разных этапах реализации программы клеточной гибели.

Феномен повышенной резистентности лимфоцитов к спонтанному апоптозу при аллергической БА (АБА), выявлен нами при исследовании уровня экспрессии С095/Та5/АР0-1 рецепторов (маркер готовности клетки к апоптозу) и уровня экспрессии фосфатидилсерина на поверхности лимфоцитов (маркер ранней (еще обратимой) стадии апоптоза), при оценке активности ключевой эффекторной каспазы-3 (маркер клетки, подвергшейся апоптозу).

Обращают на себя внимание результаты корреляционного анализа, полученного нами при исследовании апоптоза лимфоцитов у больных АБА.

В группе больных АБА четко прослеживается взаимосвязь между процессом апоптоза лимфоцитов периферической крови и лабораторными признаками, свидетельствующими о наличие аллергического процесса. Нами выявлена отрицательная корреляционная связь между уровнем экспрессии фосфатидилсерина на лимфоцитах периферической крови, что характеризует активность ранней стадии апоптоза, и наличием стойкой эозинофилии во всех клинических анализах крови (г=-0,503, р=0,002).

Представляют значительный интерес выявленные в ходе исследования отрицательные корреляционные связи между долей апоптотически измененных лимфоцитов, оцениваемых по активности эффекторной каспазы-3, и наличием эозинофилии крови (г—0,459, р=0,011) и эозинофилии, выявленной при цитологическом исследовании смывов (г=-0,709, р=0,015), полученных при проведении фибробронхоскопии. Это отражает, с одной стороны, наличие эозинофильного воспаления в органе-мишени (бронхах), а с другой стороны, снижение апоптоза иммунокомпетентных клеток в условиях аллергического воспаления при АБА. Таким образом, данные корреляционные связи, на наш взгляд,

подтверждают, что торможение процесса апоптоза сопряжено с персистенцией аллергического воспаления, что может рассматриваться с точки зрения участия апоптоза в патогенезе АБА.

При исследовании апоптоза лимфоцитов периферической крови нами показано, что больные НАБА отличались по характеру изменений апоптоза от больных АБА.

При исследовании уровня экспрессии CD95/Fas/APO-l рецепторов и уровня экспрессии фосфатидилсерина на поверхности лимфоцитов, а также при оценке активности ключевой эффекгорной каспазы-3 в лимфоцитах периферической крови нами выявлен феномен сниженной резистентности лимфоцитов к спонтанному апоптозу при НАБА.

У больных НАБА наблюдается повышение уровня спонтанной экспрессии на лимфоцитах CD95 антигена, указывающего на готовность клетки вступить в апоптоз. Заслуживают внимание данные корреляционного анализа, отражающие наличие воспалительного процесса у больных указанной группы, а именно: нами выявлены положительные корреляционные связи между уровнем экспрессии CD95/Fas/APO-l рецепторов на поверхности лимфоцитов и наличием воспаления в мокроте (г=0,998, р=0,043), выявленном при цитологическом исследовании мокроты больных НАБА - т.е. непосредственно в органе-мишени.

При исследовании уровня экспрессии фосфатидилсерина на поверхности лимфоцитов нами выявлены положительные корреляционные связи между процентом апоптотических лимфоцитов периферической крови и лейкоцитозом (г=0,523, р=0,009), СОЭ (г=0,528, р=0,008).

Обратим внимание на данные корреляционного анализа, демонстрирующие наличие положительной связи между процентом лимфоцитов, экспрессирующих CD95/Fas/APO-l антиген, а также фосфатидилсерин и наличием антибактериальной терапии в группе больных НАБА (г=0,612, р>0,05 и г=0,483, р=0,017 соответственно). Как известно, многие антибиотики являются факторами, участвующими в индукции Fas-опосредованного апоптоза клетки (Райхлин Н.Т., Райхлин А.Н., 2002).

Учитывая важную на сегодняшний день роль глюкокортикостероидных препаратов в терапии БА, нами проведен корреляционный анализ между выраженностью апоптоза лимфоцитов периферической крови и наличием в терапии глюкокортикостероидных препаратов с учетом их способа введения. Показана прямая зависимость между оцениваемыми нами показателями, характеризующими апоптоз лимфоцитов по уровню экспрессии CD95/Fas/APO-l рецепторов, уровню экспрессии фосфатидилсерина на поверхности лимфоцитов, а также при оценке активности эффекторной каспазы-3 в лимфоцитах и наличием пероральных ГКС, ингаляционных и парентеральных ГКС. Способность глюкокортикостероидов индуцировать апоптоз клеток, инфильтрирующих бронхиальное дерево, может являться одним из факторов, обусловливающим их клиническую эффективность.

Таким образом, полученные в результате настоящей работы данные позволили уточнить особенности апоптоза лимфоцитов и эпителиальных клеток у больных БА, установить связь нарушений апоптоза с характеристикой воспалительного процесса и ремоделирования бронхов.

ВЫВОДЫ

1. Выявлена тесная связь между показателями апоптоза эпителия бронхов и уровнем экспрессии СВ-95/Раз/АРО-1 рецепторов, фосфатидилсерина на поверхности лимфоцитов периферической крови, а также активностью каспазы-3 в них, что отражает универсальность механизмов регуляции процесса апоптоза. Кроме того, выявлены корреляционные связи между показателями апоптоза лимфоцитов и показателями ремоделирования слизистой оболочки бронхов, что указывает на единство регуляции процесса апоптоза как на клеточном, так и на органном и организменном уровнях.

2. При аллергической бронхиальной астме выявлено снижение интенсивности апоптоза лимфоцитов периферической крови, что проявляется снижением экспрессии СО-95/Раз/АРО-1 рецепторов и фосфатидилсерина на поверхности лимфоцитов и уменьшением активности каспазы-3, а также повышением экспрессии ингибитора апоптоза Вс1-2 и снижением экспрессии индуктора апоптоза Вах в эпителиальных клетках бронхов.

3. Неаллергическая бронхиальная астма характеризуется активацией апоптоза лимфоцитов, как на этапе готовности клетки к нему, так и на этапах раннего и позднего апоптоза, а также снижением экспрессии ингибитора апоптоза Вс1-2 и повышением экспрессии индуктора апоптоза Вах в эпителиальных клетках бронхов. Как при аллергической, так и при неаллергической бронхиальной астме глюкокортикостероиды индуцируют процессы апоптоза.

4. Показатели ремоделирования бронхов тесно коррелируют с активностью генов-регуляторов апоптоза - Вс1-2 и Вах - в эпителии, при этом значимые корреляции наблюдаются не только с показателями повреждения эпителия, но и с другими морфологическими показателями, что может указывать на участие апоптоза эпителия в комплексном процессе ремоделирования бронхов.

5. Ремоделирование эпителия при аллергической бронхиальной астме характеризуется преимущественно шеддингом эпителия, при неаллергической бронхиальной астме - преимущественно метаплазией эпителия. Особенностью ремоделирования при аллергической бронхиальной астме, по сравнению с неаллергической бронхиальной астмой, является более выраженные утолщение и гиалинизация базальной мембраны, гипертрофия мышечных клеток, васкуляризация, эозинофильная и лимфоцитарная инфильтрация. Под влиянием ГКС у больных БА наблюдается уменьшение выраженности процессов ремоделирования.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Для дифференциальной диагностики аллергического и неаллергического

вариантов бронхиальной астмы в качестве дополнительного критерия рекомендуется

определение активности каспазы-3 лимфоцитов периферической крови.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛЕКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Минеев В.Н., Несгерович И.И., Трофимов В.Н., Рыбакова М.Г., Грозов Р.В., Кашинцева Т.В., Эмануэль В.Л., Луговая А.В. Экспрессия Вс1-2 и Вах генов регуляторов апоптоза клеток бронхиального эпителия и активность каспазы-3 в лимфоцитах у больных бронхиальной астмой // Сборник Трудов X Международного конгресс "Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии", посвященный 100-летию со дня рождения акад. АМН А.Д.Адо. - Казань. -2009. - С.292-293.

2. Минеев В.Н., Трофимов В.И., Нестерович И.И., Луговая А.В., Кашинцева Т.В., Эмануэль В.Л., Тафеев А.Л. Экспрессия фосфатидилсерина на лимфоцитах, окрашенных Аннексином-5, и активность каспазы-3 в лимфоцитах у больных бронхиальной астмой // Сборник Трудов X Международного конгресса "Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии", посвященный 100-летию со дня рождения акад. АМН А.Д.Адо. - Казань. -2009. -С.293.

3. Минеев В.Н., Нестерович И.И., Трофимов В.Н., Кашинцева Т.В., Рыбакова М.Г., Грозов Р.В. Оценка активности генов-регуляторов апоптоза по экспрессии Вс1-2, Вах, активности каспазы-3 в бронхиальных эпителиальных клетках у больных бронхиальной астмой // Архив патологии.-2011. - Том 73, №1. -С.11-14.

4. Нестерович И.И., Кашинцева Т.В., Минеев В.Н., Мирошкина А.В. Модуляция аллергического воспаления эпителием бронхов // Вестник Санкт-Петербургского университета. Сер.11.-2011.-Вып.4.-С.18-25.

5. Mineev V.N., Nesterovich I.I., Trofimov V.I., Rybakova M.G., Grozov R.V., Kashinceva T.V., Emanuel V.L., Lugovaya A.V. Activity of Bcl2 and Bax genes in bronchial epithelium and annexin-V binding of phosphatidylserine in lymphocytes in bronchial asthma // Europ. Respir. J.-2009.-V. 34, Suppl. 53.- P.902 (Abstracts XlXth ERS Annual Congress, Vienna, Austria, 2009).

6. Mineev V.N., Nesterovich I.I., Trofimov V.I., Kashinceva T.V., Rybakova M.G., Grozov R.V. Estimation of activity apoptosis genes based on expression of Bcl2, Bax,

CPP32 in bronchial epithelium in asthma // Europ. Respir. J.-2010.-V. 36, Suppl. 54.-E5687, 1040s (Abstracts XXth ERS Annual Congress, Barcelona, Spain, 2010).

7. Mineev V.N., Nesterovich I.I., Trofimov V.l., Kashinceva T.V., Emanuel V.L., Lugovaya A.V. Estimation of lymphocyte apoptosis based on annexin-V binding of phosphatidylserine and caspasa-3 activity in bronchial asthma // Europ. Respir. J.-2010.-V. 36, Suppl. 54.-P1359, 245s (Abstracts XXth ERS Annual Congress, Barcelona, Spain, 2010).

Формат бумаги 60*90 1/16. Бумага офсетная. Печать ризографическая. Тираж 100 экз. Отпечатано в ПК «Объединение Вента» с оригинал-макета заказчика. 197198, Санкт-Петербург, Большой пр. П. С., д. 29а, тел.718-46-36.